乙肝丙肝核酸检测的新平台(临床).ppt

乙肝丙肝核酸检测的新平台COBASAmpliPrep/COBASTaqMan全自动荧光定量分子诊断系统,顾剑罗氏分子诊断,自动化程度,199219961998200120032006,MWP,COBASAMPLICOR,COBASAMPLIPREP,COBASAMPLICORMONITOR,罗氏分子诊断,标准化自动化重复性,COBASTAQMAN48,COBASTAQMAN96,一直以来，罗氏分子诊断对临床核酸检测市场提供完善可靠和创新性的产品及解决方案,目前乙肝和丙肝临床治疗过程中遇到的主要问题,治疗终点无法准确判定有些病人经一段时间治疗后DNA/RNA检测结果忽阴忽阳，但临床症状依然明显不能及时预测耐药（病毒学突破）核苷（酸）类似物治疗后病毒DNA/RNA快速下降至检测限以下，不久却发现病毒出现反跳疗效的准确监测？治疗后12或24周病毒DNA/RNA下降幅度直接决定预后,问题的根源在哪里？,内容,HBV核酸检测的现状与需要HCV核酸检测的现状与需要罗氏的CAP/CTM能带来什么益处总结,HBVDNA监测在抗病毒治疗中的临床应用,HBVDNA是监测抗病毒治疗响应和时间的关键标志物HBV治疗的路线图理念，为HBVDNA监测用于临床实践提供了指导对用药耐药性的监测（拉米夫定YMDD，）肝移植HBV复发风险的降低（术前，术后）,HBVDNA监测的临床应用HBV治疗路线图,KeeffeE.ClinGastroHepatology2007;5:890-897.侯金林等，慢性乙型肝炎抗病毒治疗方案优化，中国肝脏病杂志,国产试剂现状,目前使用的国产试剂能解决的问题，不能解决的问题：HBV试剂盒说明：5005107IU/mL较可信的测试范围：1045107IU/mL对部分发生HBV病毒突变的病人无法准确检测注：1IU/mL=1copy/mL,内容,HBV核酸检测的现状与需要HCV核酸检测的现状与需要罗氏的CAP/CTM能带来什么益处总结,HCVDNA监测在抗病毒治疗中的临床应用,HCV病毒感染是可治愈的疾病HCVRNA检测可以有效指导临床用药治疗的终点是核酸检测为阴性（核酸检测可以直接指导停药时机）,慢性HCV治疗方案,慢性HCV治疗方案,用药,12周早期病毒学反应,HCVRNA下降2log,继续治疗至48周,继续治疗至24周,考虑停药,国产试剂现状,目前使用的国产试剂能解决的问题，不能解决的问题：HCV试剂盒说明：5005107IU/mL较可信的测试范围：1045107IU/mL注：1IU/mL=1copy/mL,内容,HBV核酸检测的现状与需要HCV核酸检测的现状与需要罗氏的CAP/CTM能带来什么益处总结,全世界第一台用于体外诊断的全自动荧光定量分子诊断系统真正实现“样品进，结果出”全球安装超过2,000台，国内安装超过40台,COBASAmpliPrep/COBASTaqMan系统,COBASAmpliPrep/COBASTaqMan48系统,COBASAmpliPrep/COBASTaqMan96系统（带连接系统）,COBASAmpliPrep/COBASTaqMan96系统（无连接系统）,COBASAmpliPrep仪器简介,全自动系统，自动进行核酸提取纯化和PCR反应体系配制基于MGP磁珠分离技术，确保高质量的核酸提取纯化最多72个样品可以同时上机，运行中可连续装载上架，提高工作效率包括耗材、样品、试剂均可以连续上样,DNA或者RNA,1.裂解、稳定和去蛋白,2.核酸捕获,病毒或细胞,3.冲洗,4.洗脱,37C孵育,COBASAmpliPrep仪器MGP磁珠分离技术,室温,80C孵育,2019/12/13,17,可编辑,取SPU枪头样本管/反应管管盖抓手样本初始体积感应器取试剂钢针,CAP机械臂介绍,样本管/反应管结构,COBASTaqMan/COBASTaqMan48分析仪简介,检测通量可达4*24测试独立的24孔热循环仪TaqMan48有2个模块，TaqMan96有4个模块最多可同时进行4个不同的分析检测操作简单，核酸扩增和检测全部自动完成实时定量PCR检测技术，卓越的检测性能，灵敏度高和特异性好，动态范围宽,HBV-DNA定量测试用于药品FDA注册试验,INTRONA(Interferonalfa-2b)packageinsert.Schering-PloughCorp.Kenilworth,NJ2.EPIVIR-HBV(Lamivudine)packageinsertGlaxoSmithKline,ResearchTrianglepark,NC3.HEPSERA(Adefovirdipivoxil)packageinsertGileadSciences.FosterCity,CA4.Pegasys(Peginterferonalfa-2a)packageinsert.Hoffmann-LaRocheInc.Nutley,NJ5.TYZEKA(Telbivudine)PackageInsert.NovartisPharmaceuticalsCorp.EHanover,NJ6.MarcellinPetal.HepDART2007MeetingAbstract63,Dec9-132007,Lahaina,HI,国外发表的文献,Evaluationofinitialvirologicalresponsetoadefoviranddevelopmentofadefovir-resistantmutationsinpatientswithchronichepatitisB.Gallegoetal.,JournalofViralHepatitis,2008,15,392398Evaluationofanautomated,highlysensitive,real-timePCR-basedassay(COBASAmpliprepTM/COBASTaqManTM)forquantificationofHCVRNA.ChristophSarrazinaetal.,JournalofClinicalVirology,2008,43,162168COBASAmpliPrep-COBASTaqManHepatitisBVirus(HBV)Test:aNovelAutomatedReal-TimePCRAssayforQuantificationofHBVDNAinPlasma.TizianoAlliceetal.,JournalofClinicalMicrobiology,Mar.2007,p.828834EvaluationoftheCOBASAmpliPrep-totalnucleicacidsolation-COBASTaqManhepatitisBvirus(HBV)quantitativetestandcomparisontotheVERSANTHBVDNA3.0assay.RonsinCetal.,JournalofClinicalMicrobiology2006vol.44(no.4)ComparisonoftheCOBASTaqManTMHBVTestWiththeCOBASAmplicorMonitorTMTestforMeasurementofHepatitisBVirusDNAinSerum.SimonSiu-ManSumetal.,JournalofMedicalVirology2005,77:486490HepatitisBvirus(HBV)genotypedeterminationbytheCOBASAmpliPrep/COBASTaqManHBVTest,v2.0inserumandplasmamatrices.GoedelSetal.,JournalofClinicalVirology2009Jul;45(3):232-6ComparisonofVersantHBVDNA3.0andCOBASAmpliPrep-COBASTaqManassaysforhepatitisBDNAquantitation:Possibleclinicalimplications.GARBUGLIAA.R.etal.,Journalofvirologicalmethods2007,vol.146,no1-2,pp.274-280PerformanceoftheCobasAmpliPrep/CobasTaqManReal-TimePCRAssayforHepatitisBVirusDNAQuantification.StephaneChevaliezetal.,JournalofClinical,May2008,p.17161723,HBV的定量检测性能指标,注：国产试剂1IU/mL=1copy/mL,HCV的定量检测性能指标,定量原理外标法定量（国产试剂）,使用一组（4管）外部标准品定量，分别为5104到5107IU/mL未考虑各患者血液成分间的差异性对结果的影响,定量原理内标定量InternalQuantitationStandard(CAP/CTM),内标是已知拷贝数的人工构建核酸，加入每一反应管，与靶核酸竞争扩增，管内定量可提示反应是否存在反应抑制，避免假阴性结果充分考虑管间反应效率的差异，得到可靠精确的结果,COBASAmpliPrep/COBASTaqMan系统封闭样品管输入，封闭PCR管输出标准化，重复性,纯化好的核酸,主反应液,PCR反应体系的配制,试剂、样品和耗材的装载上机,样品处理单元,K-枪头,K-管,样品,试剂,Branchburg生产厂房罗氏投资超过1.5亿美金，建成全球最大分子诊断试剂生产基地目前每月生产14万套试剂,罗氏分子诊断严格的生产和质控体系为整个行业设定了高标准,1.原料严格把关,3.GMP生产,2.原料质检,4.GMP生产,6.成品质检,5.试剂盒成品,7.资料入档,COBASAmpliPrep/COBASTaqMan全自动荧光定量分子诊断系统的应用,抗病毒治疗评估和监测（HBV/HCV），为临床医生和病人提高更准确的结果，指导用药。可针对疑难病例、低病毒载量、长期用药或高端病人肝移植的术前术后监控全国药物、诊断试剂临床评估实验基地CAP室间质评时有与国际接轨的平台，评价更科学基础研究的工具，文章可信度大大增加,国内部分用户,国内用户现已超过40家,国内HBV核酸检测实例,共检测21份国产试剂HBV均为阴性的标本其中CAP/CTMHBV仍为阴性者共9份，CAP/CTMHBV为阳性者共12份。阳性