毕业论文-大葱叶槲皮素提取工艺及设计.doc

本科生毕业论文（设计）中 文 题 目 大葱叶槲皮素提取工艺及设计 英文题目 Extraction and Design of Quercetin from Welsh Onion Leaf 学生姓名 班级 450904 学号 学 院 生物与农业工程学院 专 业 食品科学与工程 指导教师 职称 副教授 目录第1章 绪论81.1 前言81.1.1 大葱的概述81.1.2 槲皮素的概述81.2 槲皮素的提取方法研究现状91.2.1 浸渍提取法91.2.2 碱提取法101.2.3 有机溶剂回流法101.2.4 全自动加压溶剂萃取法101.2.5 酶提取法111.2.6 超声提取法111.2.7 微波提取法121.3 槲皮素测定方法研究现状121.3.1 分光光度法121.3.2 高效液相色谱法131.3.3 动力学分析法131.4 槲皮素的生物活性131.4.1 槲皮素的抗氧化性131.4.2 槲皮素的抗肿瘤作用141.4.3 槲皮素的消炎作用141.5 本研究的意义和主要内容151.5.1 本研究的意义151.5.2 本研究的主要内容15第2章 大葱葱叶中槲皮素的提取工艺研究162.1 引言162.2 试验材料、试剂与仪器162.2.1 试验材料与试剂162.2.2 试验仪器与设备162.3 试验方法162.3.1超声辅助提取法提取大葱葱叶中槲皮素的方法162.3.2槲皮素化合物的测定162.4 单因素试验182.4.1 乙醇浓度对槲皮素提取率的影响182.4.2 固液比对槲皮素提取率的影响182.4.3 超声时间对槲皮素提取率的影响182.4.4 超声温度对槲皮素提取率的影响182.4.5 超声功率对槲皮素提取率的影响182.5工艺参数优化192.5.1设计方法192.5.2响应曲面优化法192.6 结果与分析192.6.1 检测波长的选择202.6.2 标准曲线的绘制202.6.3 单因素试验的显著性分析方法212.6.4 大葱叶槲皮素提取单因素试验结果分析222.6.5 响应面优化试验的结果分析302.6.6 最佳工艺条件的预测与检验332.7 本章小结33第3章 大葱叶提取物清除亚硝酸盐效果的研究353.1 引言353.2 试验材料、试剂与仪器353.2.1试验材料与试剂353.2.2试验仪器与设备353.3 原理353.4 试验方法353.4.1试剂的配制353.4.2试验步骤363.5结果与讨论37第4章 结论39致谢40参考文献41中文摘要槲皮素广泛分布于植物界中，是药用植物的有效成分之一，在临床上已被证明具有多种生物活性，如抗癌、抗氧化、抑菌等，而且毒副作用较小。目前，从各种植物中提取槲皮素的研究很多，且主要集中于从洋葱和槐米中提取，只有刘维信等尝试从大葱葱白中提取槲皮素，从大葱叶中提取槲皮素的研究还近乎空白。因此，本文选取大葱叶，进行槲皮素提取，以期为大葱叶的深加工提供工艺参数和理论依据。主要研究内容与结果如下：（1）通过单因素试验，研究了从大葱叶中超声提取槲皮素的工艺，确定了槲皮素提取的超声温度为50、超声功率为200W，同时选择提取时间2545min，乙醇浓度70%90%，固液比1:701:90进行后续响应曲面优化试验。在三因素三水平响应曲面优化试验中，以大葱叶中槲皮素提取率为响应值Y（mg/g）,经二次回归拟合求得回归方程：Y=6.96-0.23A-0.19B+0.18C+0.027AB+0.20AC+0.12BC-0.35A2-0.30B2+0.15C2此模型的拟合度为0.8847，可以反映出槲皮素提取率随各参数变化的规律。同时得到大葱叶槲皮素最佳提取条件为提取时间35min、乙醇浓度78%、固液比1:90，经验证试验得出结果是：大葱叶中槲皮素的提取率为(7.170.087)mg/g，实际值与理论值间的相对误差为1.81%。（2）大葱叶提取液与抗坏血酸溶液相比，抗坏血酸对亚硝酸盐的清除能力比较强，当抗坏血酸溶液达到浓度0.10mg/mL时，亚硝酸盐清除率达到最大89.64%，若抗坏血酸溶液浓度继续增大，亚硝酸盐清除率趋于稳定；而大葱叶提取液浓度为0.14mg/mL时，亚硝酸盐清除率达到最大值83.82%。关键词：大葱叶 槲皮素 超声提取 亚硝酸盐 清除ABSTRACTQuercetin is widely distributed in the plant kingdom, which is one of the effective constituents of medicinal plants. It has been clinically proved to possess a variety of biological activity, such as anticancer, antioxidant, antibacterial, and the side effects is small. At present, there are a lot of researches to extract quercetin from all kinds of plants, and mainly focus on extraction from onion and Flos sophorae. Only Liu Weixin attempts to extract quercetin from the Welsh onion stalk, and study on extraction from Welsh onion leaf is almost blank. Therefore, this paper selected Welsh onion leaf to extract quercetin, in order to provide process parameters and theoretical basis to deep processing of Welsh onion leaf.The main research contents and results are as follow:(1) The single factor experiment has studied on the ultrasonic extraction process of quercetin from Welsh onion leaf. The process parameters were as follow: ultrasonic temperature 50, ultrasonic power 200W, and at the same time, extraction time 25 45min, ethanol concentration 70% 90%, solid-liquid ratio 1:701:90 for subsequent response surface optimization test.In the response surface optimization experiment(3 factors and 3 levels), the extraction rate of quercetin from Welsh onion leaf was selected as response value: Y(mg/g). The regression equation was obtained through two times of regression:Y=6.96-0.23A-0.19B+0.18C+0.027AB+0.20AC+0.12BC-0.35A2-0.30B2+0.15C2The model fitting degree was 0.8847, which can truly reflect that the quercetin extraction rate varied with the the law of parameters. At the same time, the optimal extraction conditions of quercetin from Welsh onion leaf were extraction time 35min, ethanol concentration78%, solid-liquid ratio 1:90. The test result was (7.17 0.087) mg/g, and the relative error between the actual value and the theoretical value was 1.81%.(2) When Welsh onion leaf extract and ascorbic acid solution were compared, the nitrite scavenging ability of ascorbic acid solution was stronger. When ascorbic acid solution reached the concentration of 0.10mg/mL, its scavenging effect reached the maximum 89.64%. If concentration continued to increase, scavenging effect maintained on maximal value. While the Welsh onion leaf extract concentration was 0.14mg/mL, the nitrite scavenging rate reached maximum value 83.82%. Keywords: Welsh onion leaf quercetin ultrasonic extraction nitrite scavenging第1章 绪论1.1 前言：随着经济技术的发展，人们对于饮食的要求已不仅局限于饱腹或是单纯地满足口味，而是对食品的保健要求越来越高，由于这种市场需求的增强，研究领域正在掀起研究保健类食品的热潮。随着研究的不断深化，大葱的保健功能逐渐被人们所熟知，大葱不仅可发表通阳，用于治疗风寒感冒、恶寒发热、头痛鼻塞，还有强健脾胃的功能，常食大葱也能降低患胆固醇、癌症等疾病的风险。同时，大葱中所含槲皮素也具有良好的保健价值，由于槲皮素结构中富含酚羟基,故具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗癌变等多种生理功能，因此从大葱中提取槲皮素具有重要意义。 1.1.1 大葱的概述大葱（Allium fistulosum L.）又名葱、和事草，百合科（Liliaceae）葱属(Allium)23年生草本植物，是中国北方地区重要的蔬菜之一，其栽培面积居第三位。大葱微辛、性微温，含有挥发油，油中主要成分为蒜素，这种物质有较强的杀菌作用，不仅可以延长其自身的贮藏期，对人体而言，还能有效抑制痢疾杆菌及皮肤真菌，另外，大葱还含有脂肪、糖类、胡萝卜素、维生素B、C、烟酸、钙、镁、铁等成分。大葱产量高、栽培容易、耐储存，是一种很受欢迎的蔬菜和调味品，它同时有着强身健体和保健作用，可发表通阳，用于治疗风寒感冒，恶寒发热，头痛鼻塞，阴寒腹痛，痢疾泄泻，虫积内阻，乳汁不通，二便不利等。经国外科学家研究，大葱能促进消化液的分泌，还有强健脾胃的功能，常食大葱也能降低患胆固醇疾病的风险，对癌症的抑制也有显著的效果。由于大葱有易栽培、高产量、耐储存的优点，常常出现供过于求的局面，故而若成功开发出大葱的新型加工方法，不仅可提高其经济价值，又可合理调配，减少浪费。1.1.2 槲皮素的概述槲皮素（quercetin），又名栎精，分子式为C15H10O7，相对分子质量为302.23，是一种呈黄绿色粉末状的黄酮类化合物，具有多种生物学活性，化学名称为3,3,4,5,7-五羟基黄酮，在9597变为无水物，在314分解，几乎不溶于水1，可溶于乙醇、甲醇、乙酸乙酯等，许多植物的花、叶、果实中都含有槲皮素，洋葱中的含量尤多，在植物的生长、发育、开花、结果以及抗菌防病等方面起着重要的作用2，槲皮素分子结构见图1-1。图1-1 槲皮素分子结构图Fig.1-1 Molecular structure of quercetin研究表明，大葱中含有黄酮一类化合物，其中槲皮素含量较多，槲皮素对人体保健方面有重要意义。由于槲皮素中富含酚羟基,故具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗癌变等多种生理功能,而其抗氧化的性质又可起到抗衰老、抗突变、抗动脉粥样硬化等功能，近年来，抗氧化和抗肿瘤成为研究的热点3-6，受到普遍关注。1.2 槲皮素提取方法的研究现状学者逐渐意识到槲皮素对于人体的益处，故而对槲皮素提取的研究正在逐渐深化，目前槲皮素主要从洋葱和槐米中提取，虽然大葱中也含有含量较高的槲皮素，但从大葱中提取槲皮素的相关报道较少。槲皮素的主要提取方法：根据前人的试验发现，槲皮素的提取方法主要包括浸渍提取法、碱提取法、回流法、全自动加压溶剂萃取法、酶提取法、超声提取法、微波提取法等，其中，自动加压溶剂萃取法、酶提取法、超声提取法、微波提取法是近年来新兴的方法。1.2.1 浸渍提取法浸渍提取法操作简单，即选用适当的溶剂对提取物进行浸泡，使有效物质溶出的方法。由于其效率低效果差，很少单独用来提取化合物。刘世民7对洋葱中黄酮类物质的水提取进行了研究，他以浸提水用量、浸提时间和浸提温度为因素进行了正交试验，认为当固液比1:3，浸提时间40min，浸提水温为90时，浸提效果最好。浸渍提取法由于试验条件容易控制、操作简单、成本低廉的优点，偶尔被用来提取某些特殊的化合物。1.2.2 碱提取法碱提取法的原理是，槲皮素有4个酚羟基，呈现一定酸性，故其具有易溶于碱液而难溶于酸液的特点，因此可利用碱溶液可使植物中的槲皮素溶出，之后向溶液中添加酸性物质来降低槲皮素的溶解度，进而使之结晶析出来获得槲皮素提取物。全先高8等比较了了从槐米中提取芦丁的方法，分别采用水提取法、碱提取酸沉淀法和碱提取酸沉淀加抗氧化剂法，试验结果表明，水提取法提取物纯度高但效率低，碱提取酸沉淀法效率提高但纯度稍低，经分析认为是在提取过程中芦丁与碱发生了反应，故加入一定亚硫酸钠抗氧化剂可以减少芦丁氧化分解，提高纯度。1.2.3 有机溶剂回流法回流法指用有机溶剂提取目标物的有效成分，浸提液被加热，并不断流出再流入浸提器，直至有效成分被充分提取，该法浸提时间较长，常与微波法、超声法结合使用，可以提高其提取效率。王文清等9对比了超声提取法、回流法和浸渍提取法提取细梗胡枝子中槲皮素与芦丁，试验表明，以70%乙醇为提取剂的回流法提取效果最好，将2g样品加入30mL乙醇中，加热回流1h，可提取槲皮素和芦丁分别为5.39gg-1和37.53gg-1。1.2.4 全自动加压溶剂萃取法全自动加压溶剂萃取法是对有机溶剂回流法的改进，同样是利用有机溶剂进行萃取，只是使用了全自动加压溶剂萃取仪，在预先设定的高温高压条件下自动完成萃取过程，此法克服了普通有机溶剂回流法操作繁琐、效率低、溶剂消耗量大的缺点，大大提高了萃取效率和效果，同时具有较高的稳定性和重现性。刘新艳等10应用此法测定洋葱中芦丁和槲皮素的含量，经过石油醚去脂除杂的过程，使用甲醇提取黄酮类物质，在压力为10MPa，温度为120的条件下，萃取10分钟即可，随后利用高效液相色谱进行测定，她认为此法可作为蔬菜和水果中黄酮类物质快速测定的有效方法。1.2.5 酶提取法由于受到植物细胞壁的阻碍，使用浸渍提取法和有机溶剂回流法从大葱中提取槲皮素效果常常不够理想，基于这一点，可以利用酶的专一性，使用相应的酶对植物细胞壁得以破坏，使目标提取物更易溶出。在酶法基础上再恰当地使用浸渍提取法或有机溶剂回流法等，提取效果可被明显优化。汪元元等11就利用上述方法，选择纤维素酶与洋葱作用1h后，再用乙醇提取1h，研究了酶解pH、酶浓度、乙醇浓度及酶解温度对槲皮素提取率的影响，认为当酶解pH5.5，酶解浓度0.5mg/mL，酶解温度45，酶解时间1.5h、乙醇浓度70%时，槲皮素的提取效果最好，平均提取率可达0.046%。1.2.6微波提取法微波提取法原理是，高频电磁波有很强的穿透力，可以加速物质中分子的运动，从而使被提取物细胞内的温度升高，又由于各物质吸收微波的能力存在差异,被提取物中某些成分被明显地选择性加热,进而被选择性地提取出来。该方法是近年来比较热门的提取方法之一，王荣12等利用微波提取法对积雪草中总黄酮提取工艺进行了确定，认为当重复提取次数为3次、微波辐射时间20s、积雪草粉与甲醛比例为1:10且微波功率为480W时，提取效果最优。金艳梅等13比较了碱提取法、乙醇回流法及微波提取法提取紫花地丁中黄酮化合物的效果，认为微波提取法提取效果最好，并对该种方法的提取条件进行了优化，得到微波功率为1300W，乙醇浓度为65%、提取时间为20s、物料与乙醇之比为1:15时，提取效果最佳。1.2.7超声提取法超声波通过振动可以产生能量，从而引起共振，这种共振会为提取物提供强大的加速度，进而产生空化作用，这种空化作用具有很强的破坏力，同时可加速溶解，从而使提取物中的目标成分被有效提取出。除空化效应外，热效应及机械作用也起着辅助作用，在这些物理效应的共同作用下，提取变得更加快捷、安全、可靠。孙媛媛14分别采用有机溶剂浸渍法、有机溶剂回流法、超高压、超声四种提取法提取丁香叶中槲皮素，最终得到的结论是超高压及超声辅助提取法较传统提取方式有较大优势，特别是超声提取法，当甲醇与25%盐酸体积比为3:1，固液比为40:1，提取时间为30min并提取3次时，槲皮素提取率可达到8.6mg/g。张仁堂15等利用超声辅助提取法提取洋葱皮中黄酮类物质，最终优化工艺参数为固液比 1:10，乙醇浓度80%，超声时间20min，此时提取率已到达理论值的 0.83%。1.3 槲皮素测定方法研究现状根据前人的试验发现，槲皮素的测定方法主要包括分光光度法、高效液相色谱法及动力学分析法。1.3.1 分光光度法分光光度法是利用朗伯比尔定律对某一物质的浓度进行测定的方法，即通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内对光的吸收度或其自身的发光强度，对该物质进行分析的方法。试验者可配制一系列浓度的标准溶液，在特定波长分别测定其吸光度，并绘制标准曲线。将待测溶液在相同波长下测定其吸光度，根据标准曲线可得知其浓度。该法操作简便、快速、灵敏度高、准确度高、适用性广，因此得以广泛应用，大多无机离子和许多有机化合物都可以直接或间接地用该法进行测定。此法在测定槲皮素方面应用也较为广泛，刘维信16等应用此法测定了大葱槲皮素含量，回瑞华17等在洋葱黄酮提取液中加入铁盐，生成稳定的配合物，使黄酮的吸光带由240280nm转移至457nm，以避开洋葱中苯丙素酚类化合物、甾体、皂甙类化合物的影响。1.3.2 高效液相色谱法高效液相色谱法是一种新兴的测定方法，具有测量迅速、数值准确、重现度高的优点，可是其设备昂贵，使用受到一定的限制。但有关高效液相色谱法测定槲皮素的提取量已经成为一种趋势，研究者非常关注这种前沿的测定方法，此方法的使用也正逐渐趋于成熟。高效液相色谱法克服了分光光度法干扰多、误差大的缺点，在有高精密度要求的试验中备受青睐18。1.3.3 动力学分析法动力学分析法的原理是，由于化学反应的速率与反应物的浓度或催化剂有关，从而可以通过测量反应的速率以确定待测物的含量。由于测量的对象是含量较高的其他物质，而非微量的催化剂自身，故此法的灵敏度很高。杨慧仙19等研究了催化动力学荧光法测定洋葱中槲皮素的具体方法，认为槲皮素的检出限为0.13gL-1,其质量浓度在0.4318.0gL-1范围内, 荧光强度改变值(IF)与槲皮素浓度呈线性关系,回归方程为IF= 31.64(gL-1)-17.28，相关系数为09967。1.4 槲皮素的生物活性1.4.1 槲皮素的抗氧化性在抗氧化方面槲皮素具有清除活性氧自由基的能力，抗氧化和清除活性自由基这两种作用密切相关20，槲皮素尤其能较好的清除超氧阴离子(O2-),羟自由基(OH)和单线态氧(1O2)，还可降低脂质氧化速率，由于槲皮素能够清除自由基，便能够减少自由基对膜的攻击，这种攻击常常造成膜的脂质过氧化分解，一旦这种损害得以降低，便可延缓人体衰老。同时，当某些金属离子与槲皮素化合后，所形成的螯合物拥有超过槲皮素的抗氧化能力。Milanea21认为，黄酮类物质在碱性条件下能较好地清除自由基，槲皮素具有一、二、三钠盐，通过试验得到结论，在pH为7.4条件下，槲皮素二钠盐有最强的清除自由基的能力。1.4.2 槲皮素的抗肿瘤作用在抗肿瘤方面，槲皮素有抑制肿瘤细胞增殖的作用，即促使T细胞增殖，使癌细胞分裂减慢22，还可以通过抑制蛋白酪氨酸激酶和蛋白激酶C来抑制癌细胞的繁殖23。 槲皮素可逆转肿瘤细胞耐药性，可以作为癌细胞耐药性的调节体使用24。槲皮素可通过提高肿瘤细胞对药物的敏感性以延长其敏感周期，增强药物效果；还可以使药物在体内长期保持一定浓度，提高药物的针对性及正常组织对药物副作用的抵抗力，故而槲皮素在抗肿瘤方面表现出较好的效果6。日常食用黄酮类物质，可有效地防止化学诱导的癌症，尤其是结肠癌的发生，同时，摄入槲皮素可预防肺癌25。某些试验表明，槲皮素的代谢产物是比槲皮素更好的人类多药耐药蛋白的抑制剂26。然而，不同浓度的槲皮素对癌细胞的作用是不同的，研究表明，当槲皮素浓度较高时，有抑制癌细胞增殖的效果，当槲皮素浓度较低时，却会促进癌细胞增殖27。1.4.3 槲皮素的消炎作用“炎症”是机体对于刺激的一种防御反应，表现为红、肿、热、痛。通常情况下，炎症是有益的，是人体的自动的防御反应，但是有的时候，炎症也是有害的，例如对人体自身组织的攻击等。肠道感染时,肠道受病原微生物及其毒素刺激,化学性炎症介质分泌增加,使肠道蠕动加速,由于食物在肠道停留时间缩短,快速地被排出体外,从而引起腹泻。槲皮素具有一定抗炎活性,可以保护人体细胞，防止被沙门氏菌感染28，也可以通过改变肠道内毛细血管通透性,减少水分和电解质分泌,从而止泻。槲皮素广泛分布于植物界中，是药用植物的有效成分之一，在临床上已被证明具有多种生物活性，如抗癌、抗氧化、抑菌等，而且毒副作用较小。目前，从各种植物中提取槲皮素的研究很多，且主要集中于从洋葱和槐米中提取，只有刘维信6等尝试从大葱葱白中提取槲皮素，从大葱叶中提取槲皮素的研究还近乎空白。因此，本文选取大葱叶，进行槲皮素提取，以期为大葱叶的深加工提供工艺参数和理论依据。1.5本研究的意义和主要内容1.5.1本研究的意义 我国是大葱资源大国，一直以来都有产量大但产值低的困扰。不过近年来大葱深加工逐渐发展，而且非常迅速，加工用葱量逐年上升，很有可能改变传统的大葱消费结构。通过查阅文献，发现由于大葱叶中含有较多槲皮素，而从大葱叶中提取槲皮素尚处于空白。由于槲皮素结构中富含酚羟基,故具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗癌变等多种生理功能,而其抗氧化的性质又可起到抗衰老、抗突变、抗动脉粥样硬化等作用3，近年来，抗氧化和抗肿瘤成为研究的热点4，受到普遍关注。此外，槲皮素还具有较强的清除亚硝酸盐的能力，都是非常值得探究的方面。通过前人的试验发现超声提取方法快捷、安全、可靠，与传统提取方式比有较大优势，分光光度法操作简便、快速、灵敏度高、准确度高、适用性广，因此得到广泛应用，大多无机离子和许多有机化合物都可以直接或间接地用该法进行测定，此法在测定槲皮素方面应用也较为广泛，故本试验拟采用超声辅助提取法和分光光度法进行提取和测定。1.5.2本研究的主要内容本文将在前人研究的基础上，进行超声辅助提取大葱叶中的槲皮素，利用分光光度法对槲皮素的含量进行测定，同时将对大葱叶粗提物清除亚硝酸盐的效果进行研究。1、分别研究乙醇浓度、固液比、超声功率、超声时间、超声温度对大葱叶中槲皮素提取率的影响，用单因素试验筛选出对大葱叶槲皮素提取率影响较大的因素，同时初选较优的提取条件，再用响应曲面试验进一步确定最佳工艺条件。2、对大葱叶槲皮素清除亚硝酸盐效果进行研究，同时将其清除效果与抗坏血酸溶液清除效果进行对比。第2章 大葱叶槲皮素的提取工艺研究2.1引言槲皮素广泛分布于植物界中，是药用植物的有效成分之一，在临床上已被证明具有多种生物活性，如抗癌、抗氧化、抑菌等，而且毒副作用较小。目前，从各种植物中提取槲皮素的研究很多，且主要集中于从洋葱和槐米中提取，但从大葱叶中提取槲皮素的研究还接近空白。本文选取大葱叶，进行槲皮素提取，以期为大葱叶的深加工提供工艺参数和理论依据。2.2试验材料、试剂与仪器 2.2.1 试验材料与试剂大葱：购于长春南街超市，去杂、去梗，60烘干12h，经粉碎机粉碎后，备用；槲皮素标准品：上海源叶生物科技有限公司；无水乙醇：北京化工厂，以上试剂均为分析纯。2.2.2试验仪器与设备KQ-250DB型数控超声波清洗仪：昆山市超声仪器有限公司；AL104电子天平：梅特勒托利多仪器（上海）有限责任公司；FW177 型中草药粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；LD4-2A低速离心机：北京雷勃尔离心机有限公司；TU-1810紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。2.3试验方法2.3.1超声辅助提取法提取大葱葱叶中槲皮素的方法在提取槲皮素的过程中，常采用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等溶剂，但考虑到槲皮素的性质、有机溶剂的残留、毒性与操作的安全性、挥发性、经济性和环保性等方面的因素，乙醇无毒、易挥发、方便回收、使用较为安全，而且价格也较低，故本试验选用乙醇作为大葱叶槲皮素的提取剂。2.3.2槲皮素化合物的测定本试验采用分光光度法对槲皮素含量进行测定，在一定波长处槲皮素有最大吸收峰，且吸光强度与槲皮素含量符合朗伯比尔定律，吸光强度与槲皮素含量成正比关系，故可以通过测定吸光度值来分析其含量。2.3.2.1检测波长的选择 准确称取槲皮素标准品1.25mg，用60%乙醇溶解，移入25mL容量瓶中，用60%乙醇溶液定容（0.05mg/mL），摇匀。以60%乙醇溶液为参比液在200600 nm范围内扫描，得到其吸收光谱和最大吸收波长。计算机的具体操作步骤是：选择光谱扫描，点击测量，随后进行参数设置，包括设置扫描起点（200nm）和终点（600nm）波长，选择一号池，点击基线按钮，完成后，选择二号池，点击开始按钮，进行峰值检出。2.3.2.2标准曲线的绘制准确称取槲皮素标准品1.25mg，用60%乙醇溶解，移入25mL容量瓶中，用60%乙醇溶液定容（0.05mg/mL），摇匀，在特定波长下测定吸光度值，以槲皮素溶液浓度为横坐标（x），吸光度值为纵坐标（y），绘制标准曲线。2.3.2.3大葱葱叶中槲皮素提取率的测定称取0.500g大葱粉，置于100mL锥形瓶中，加入一定体积一定浓度的乙醇溶液，搅拌均匀，用超声波清洗仪按试验条件进行超声提取，然后将提取液在4000r/min转速下离心10min，取上清液置于50mL容量瓶中，用相应浓度乙醇溶液定容，摇匀，取2mL置于10mL容量瓶，再用相应浓度乙醇溶液定容，摇匀，测定分光度值。大葱槲皮素提取率的计算公式：（2-1）式中：Y槲皮素提取率（mg/g）；K稀释倍数；X槲皮素的质量浓度（mg/mL）；V定容后提取液的体积（mL）；M所称大葱粉的质量（g）。2.4 单因素试验2.4.1乙醇浓度对槲皮素提取率的影响称取0.5000g槲皮素5份，置于100mL锥形瓶中，分别加入50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液15mL，用保鲜膜封住瓶口，在功率为200w，温度为40条件下超声35min，然后4000r/min离心10min，取上清液分别置于5个50mL容量瓶中，分别用50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液定容，摇匀后分别取2mL溶液，再分别用50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液定容至10mL，进行检测。每组做一次重复试验。2.4.2固液比对槲皮素提取率的影响称取0.5000g槲皮素5份，置于100mL锥形瓶中，分别加入60%乙醇溶液25mL、30mL、35mL、40mL、45mL，用保鲜膜封住瓶口，在功率为200w，温度为40条件下超声35min，然后4000r/min离心10min，取上清液分别置于5个50mL容量瓶中，用60%乙醇溶液定容，摇匀后分别取2mL溶液，再用60%乙醇溶液定容至10mL，进行检测。每组做一次重复试验。 2.4.3 超声时间对槲皮素提取率的影响称取0.5000g槲皮素5份，置于100mL锥形瓶中，分别加入60%乙醇溶液15mL，用保鲜膜封住瓶口，在功率为200w，温度为40条件下分别超声5 min、15 min、25 min、35 min、45min，然后4000r/min离心10min，取上清液分别置于5个50mL容量瓶中，用60%乙醇溶液定容，摇匀后分别取2mL溶液，再用60%乙醇溶液定容至10mL，进行检测。每组做一次重复试验。2.4.4 超声温度对槲皮素提取率的影响称取0.5000g槲皮素5份，置于100mL锥形瓶中，分别加入60%乙醇溶液15mL，用保鲜膜封住瓶口，在功率为200w，温度分别为20、30、40、50、60条件下超声35min，然后4000r/min离心10min，取上清液分别置于5个50mL容量瓶中，用60%乙醇溶液定容，摇匀后分别取2mL溶液，再用60%乙醇溶液定容至10mL，进行检测。每组做一次重复试验。2.4.5超声功率对槲皮素提取率的影响称取0.5000g槲皮素5份，置于100mL锥形瓶中，分别加入60%乙醇溶液15mL，用保鲜膜封住瓶口，在功率为分别为50W、100W、150W、200W、250W，温度为40条件下超声35min，然后4000r/min离心10min，取上清液分别置于5个50mL容量瓶中，用60%乙醇溶液定容，摇匀后分别取2mL溶液，再用60%乙醇溶液定容至10mL，进行检测。每组做一次重复试验。2.5工艺参数优化通过单因素试验确定主要影响因素后，运用Box-Behnken设计(Box-Behnken Design, BBD)和响应曲面法(Response Surface Methodology)来优化大葱叶槲皮素的提取工艺，根据拟合的数学模型及方差分析的结果，并用响应面等高图直观地描绘其结果，最后通过数学模型和响应面等高图求出提取率最大时的最优提取条件。2.5.1设计方法Box-Behnken设计是一类三水平的二次回归设计，该设计可使用统计来完成数据处理，快速方便，且此方法在水平数为3时，试验次数不多，使用起来经济方便，当水平数大于3时，试验次数明显增多，故当水平数大于3时很少使用这种设计29。同时，此法可以建立曲面模型，也可对交互作用进行分析，方便有效。在单因素试验基础上，根据Box-Benhken试验设计原理，选取影响槲皮素提取率的三个主要因素：乙醇浓度、固液比、超声时间进行优化设计，因素水平设计见表2-1。表2- 1 因素水平表Tab.2-1 Levels of factors因素水平-101乙醇浓度A（%）708090固液比B（g/mL）1:701:801:90 超声时间C（min）2535452.5.2响应曲面优化法响应面优化法（Response Surface Methodology, RSM），是一种试验条件寻优的方法，适宜于解决非线性数据处理的相关问题。它涵盖了试验设计、建模、确定最优条件等技术；通过回归拟合、响应曲面、等高线，可分析出各因素及其水平的响应值，进而找出理论上的最优值响应以及相应的试验条件。根据Box-Behnke设计试验中的样品的测量结果，然后应用Design-Expert软件进行响应曲面分析，可得各因素对提取率的影响及交互作用，之后拟合回归模型，并用响应面等高图直观地描绘其结果，找出预测的响应最优值，优化试验条件。2.6结果与分析2.6.1检测波长的选择通过对以 80% 乙醇溶液为参比液，将槲皮素溶液在200600 nm 波长范围内扫描，得到其吸收光谱，其最大吸收波长分别位于 256 nm 和 374nm 附近。结合前人的研究结果，本试验采用374 nm为测定波长，光谱扫描曲线见图2-1。图2- 1 光谱扫描曲线图Fig.2-1 Curve of spectral scanning 2.6.2 标准曲线的绘制槲皮素的标准曲线见图2-2，标准曲线方程为y=52.92x+0.129，R2=0.9994，吸光度与槲皮素标准溶液浓度在0.0020.0014mg/mL范围内线性关系良好。图2- 2槲皮素标准曲线Fig.2-2 Standard curve of quercetin2.6.3单因素试验的显著性分析方法1、 由诸样本均值和样本量，计算该单因素所有n个试验数据的总平均值（2-2）2、 算得因子A的平方和 （2-3）3、 由诸样本标准差可算得组内平方和（2-4）4、 由上述计算所得的方差分析表，见表2-2表2- 2 方差分析表Tab.2-2 Variance analysis 来源平方和自由度均方和F比因子A411.39误差e5总和95、判断：当显著性水平=0.01时，查得F0.99（4，5）=11.39，若计算所得F11.39，则该因子显著，即表示该因子的不同水平之间有显著性差异，且对提取率有显著的影响，应作为主要影响因子进行进一步探究，反之则不显著，即表示该因子的不同水平之间无显著性差异，且对提取率无显著的影响，不必进行进一步探究。2.6.4 大葱叶槲皮素提取单因素试验结果分析2.6.4.1 超声时间对大葱叶槲皮素提取率的影响图2- 3 超声提取时间对槲皮素提取率的影响Fig.2-3 Influence of ultrasonic extraction time on yields of quercetin由图2-3可知，在一定试验范围内，随着超声时间的增加，槲皮素提取率逐渐升高，超声5分钟时，提取率最低，为2.4187mg/g，在超声时间为35min时，提取率达到最大值4.3509mg/g，若继续延长超声时间，会使提取率降低。这说明并非提取时间越长越好，这可能是由于长时间超声处理，槲皮素在溶液中的浓度不断上升，同时有少量胶体溶出，溶液的黏度增加，会阻碍槲皮素继续溶出，同时，由于槲皮素自身不稳定，若超声时间过长，槲皮素被破坏。在显著水平=0.01时，查得分位数F0.99（4，5）=11.39，计算所得F=29.852911.39，表明该因子显著，即不同的超声时间对提取率有显著的影响，应作为主要影响因子进行进一步探究，根据单因素结果，由于在超声时间2545min范围内，槲皮素有最大提取率，故选取超声时间2545min进行进一步探究。2.6.4.2固液比对大葱叶槲皮素提取率的影响1/50 1/60 1/70 1/80 1/90 1/100 图2- 4 固液比对槲皮素提取率的影响Fig.2-4 Influence of solid-liquid ratio on yields of quercetin由图2-4可知，随着固液比例的增大，大葱叶中槲皮素的提取率先缓慢上升，当达到1:80g/mL时，提取率增大明显，且达到最高值，为5.6217mg/mL，当固液比继续增大，达到1:90，提取率略有下降。探究其原因，可能是槲皮素提取率的高低与其向溶剂扩散的难易程度有关，固液比太低，也就是溶剂量较少，会导致液相与固相之间的浓度差太小，不利于槲皮素的扩散出来30。故随着乙醇溶液用量的增加，加大了大葱叶粉末和液体的接触面积，利于扩散，从而槲皮素的提取率得到提高，然而当固液比高于1:90时，已浸出的槲皮素抑制了未浸出槲皮素，致使提取率反而下降31。在显著水平=0.01时，查得分位数F0.99（4，5）=11.39，计算所得F=81.285711.39，表明该因子显著，即不同的超声时间对提取率有显著的影响，应作为主要影响因子进行进一步探究，根据单因素结果，由于在固液比1:701:90范围内，槲皮素有较大提取率，故选取固液比1:701:90进行进一步探究。2.6.4.3 乙醇浓度对大葱叶槲皮素提取率的影响图2- 5 乙醇浓度对槲皮素提取率的影响Fig.2-5 Influence of ethanol concentration on yields of quercetin由图2-5可知，随着乙醇浓度的上升，槲皮素提取率逐渐提高，当乙醇浓度达到80%时，提取率达到最大，即为5.6217mg/g，当乙醇浓度继续升高，达到90%时，槲皮素提取率反而下降。这可能与大葱中槲皮素的极性有关，目标物质越接近提取液的极性，提取效果将越好32，所以这里认为浓度为80%的乙醇与大葱槲皮素极性较为相似。同时，当乙醇浓度增大到90%，一些醇溶性杂质、色素、亲脂性成分溶出增加，这些干扰会与槲皮素竞争结合乙醇-水分子，从而使槲皮素得率下降33。在显著水平=0.01时，查得分位数F0.99（4，5）=11.39，计算所得F=104.714311.39，表明该因子显著，即不同的乙醇浓度对提取率有显著的影响，应作为主要影响因子进行进一步探究，根据单因素结果，由于在范围内，槲皮素有最大提取率，故选取乙醇浓度70%90%进行进一步探究。2.6.4.4 超声功率对大葱叶槲皮素提取率的影响图2- 6 超声功率对槲皮素提取率的影响Fig.2-6 Influence of ultrasonic power on yields of quercetin由图2-6可知，随超声功率增加，槲皮素提取率先增大后减小，当超声功率达到200W时，槲皮素的提取率最大，为4.7430 mg/g，在50W时提取率最小，为4.1879 mg/g，当功率达到250W，提取率下降，这可能是由于槲皮素性质不稳定，在较高的振动强度下容易发生其他反应，从而使溶液中含量降低。从总体来看，超声功率对槲皮素提取率的影响不大。在显著水平=0.01时，查得分位数F0.99（4，5）=11.39，计算所得F=10.176511.39，表明该因子不显著，即该因子的不同水平对提取率无显著的影响，不必进行进一步探究。根据单因素结果，由于在超声功率200W时，槲皮素有最大提取率，故选择功率200W进行后续的响应曲面试验。2.6.4.5超声温度对大葱叶槲皮素提取率的影响图2- 7 超声温度对槲皮素提取率的影响Fig.2-7 Influence of ultrasonic temperature on yields of quercetin由图2-7可知，槲皮素提取率在2060范围内，随温度的升高先增大后减小，当超声温度达到50时，槲皮素的提取率最大，为4.4926 mg/g，在20时提取率最小，为3.9683 mg/g，当温度升高到60，提取率下降，这可能是由于槲皮素性质不稳定，在高温下容易发生其他反应，从而使溶液中含量降低。从总体来看，温度对槲皮素提取率的影响不大。 在显著水平=0.01时，查得分位数F0.99（4，5）=11.39，计算所得F=7.89311.39，表明该因子不显著，即该因子的不同水平对提取率无显著的影响，不必进行进一步探究。根据单因素结果，由于在超声温度为50时，槲皮素有最大提取率，故选择超声温度为50进行后续的响应曲面试验。2.6.5响应面优化试验的结果分析2.6.5.1 回归模型的建立与分析在单因素试验基础上，对乙醇浓度、固液比、超声时间三个因素对大葱叶槲皮素提取率的影响进行进一步探究。令槲皮素提取率为响应