（细胞生物学专业论文）重组日本七鳃鳗口腔腺分泌l251蛋白表达纯化及活性鉴定.pdf

中文摘要 本项课题根据日本七鳃鳗口腔腺c d n a 文库中c d n a 序列和部分e s t 预测功 能基因片段，发现在日本七鳃鳗口腔腺大量存在中性粒细胞抑制因子( n i f ) 样 蛋白质，命名为l 2 5 1 。l 2 5 1 属于c a p 蛋白超家族( c r i s p s ，a n t i g e n5p r o t e i n s ， p a t h o g e n e s i s r e l a t e dp r o t e i n s ) 、p r 一1 蛋白亚家族成员，在结构上具有三个区域： p r - 1 结构域、一个铰链区，一个半胱氨酸丰富结构域( c r d ) 。通过大量相关蛋 白结构与功能的分析与比对，得出l 2 5 1 蛋白的p r 1 亚家族中n i f 具有相同的 保守序列和功能位点。 根据序列特异性和酶切位点设计特异性引物，将1 _ 2 5 1 功能基因从c d n a 文 库中钓取全长基因，并连接到p e t 2 3 b 表达载体，转化到大肠肝菌b l 2 1 表达菌 中重组表达，产物经亲和层析纯化得到蛋自质包涵体。通过蛋白质变性和复性， 用m i g r at e s t 试剂盒对抑制中性粒细胞( n e u t r o p h i l ) 跨内皮细胞迁移活性进行 检测。实验结果表明：在f m l p 诱导的中性粒细胞趋化反应中，l 2 5 1 在1 1 8 n m 浓度可抑制7 5 的中性粒细胞迁移。此外用荧光染料d h r l 2 3 标记中性粒细胞， 当用l 2 5 1 处理后，发现由f m l p 活化的中性粒细胞呼吸爆发的平均荧光强度最 大程度可由5 5 8 4 下降至1 6 0 9 。为研究l 2 5 1 抑制中性粒细胞生理活性的机理， 将中性粒细胞分别与c d l l a 、c d l l b 和c d l l cf i t c 标记单克隆抗体孵育来检测 中性粒细胞表面整合素表达情况，在l 2 5 1 蛋白存在时，中性粒细胞表面整合素 表达量有不同程度的减少( p 1 0 6 分子每个细胞) ，p e c a m 1 定位于内皮细胞连接 处。m u l l e r 等在体外用p e c a m 1 抗体进行研究证实拮抗p e c a m 1 后可明显地 阻断t n f a 活化内皮细胞单层诱导的中性粒细胞迁移，但不能阻断中性粒细胞一 内皮细胞粘附 3 4 1 。p e c a m 1 的这种作用在中性粒细胞迁移的动物模型体内已经 得到证实i 吲。p e c a m 1 调节中性粒细胞跨内皮迁移的机制目前仍不清楚。有研 究者推测可能性包括：p e ( a m 1 作为中性粒细胞通过内皮间隙的“向导分子” ( m o l e c u l a r g u i d e ) ，活化了中性粒细胞表面的粘附分子( 如8 2 整合素) 和或调节内 皮细胞内的c a 2 水平，并作为调节内皮单层连接的关键性因子，允许中性粒细胞 迁移。 1 3 中性粒细胞引发的呼吸爆发 在激活状态下，中性粒细胞能产生大量的超氧阴离子和活性氧( r e a c t i v e o x y g e ns p e c i e s ，r o s ) ，这些分子具有很高的反应性，可以与细菌的细胞膜及其它 蛋白质发生氧化还原反应，造成微生物的损伤和死亡【蚓。此外。r o s 还可上调一 些细胞因子及粘附分子如t n f 2 a 、i l - i 、i c a m 1 的表达水平，放大炎症效应。 由于该过程中性粒细胞的耗氧量激增，可达正常消耗量的2 2 嘴，因此称该反应 为呼吸爆发。在i f n - t 和t n f 刺激下，则可产生更多的过氧代谢阴离子，杀死胞 外寄生虫。中性粒细胞在杀死吞噬的细菌等异物后，自身也会死亡，死亡的中性 粒细胞称为脓细胞。 随着研究的深入，学者们对呼吸爆发过程有了更加全面的了解根据活性氧 生成次序及途径的不同，将呼吸爆发分为三部分加以阐述。 1 3 1n a d p h 氧化酶的活化 n a d p h 氧化酶主要催化0 2 从n a d p h 得到一个电子生成超氧阴离子0 ， 2 0 2 + n a d p h 2 0 2 + n a d p + + h + 两种鸟苷酸结合蛋白( g 蛋白) 也参与了n a d p h 氧化酶的活化闻。一种是r a c 2 ， 属于g 蛋白r h o 家族，存在于静息状态的中性粒细胞胞浆内，当其与g t p 结合后 随p 4 0p h o x 、p 4 7p h o x 、p 6 7 肼圮一同转移到膜上，促进p 6 7p h o x 与细胞 色素b 5 5 8 之间的相互作用i 弼1 ； 一种是r a p l a ，属于r a s 家族，定位于中性粒细胞 膜表面，与细胞色素b 5 5 8 结合。在体外实验中，r a p l a 可以被蛋白激酶a 磷酸化 8 重组日本七鳃鲤口腔腺分泌l 2 5 1 蛋白表达纯化及活性鉴定 降低其与细胞色素b 5 5 8 的结合能力1 3 9 1 。m a l y 等将r a p l a 的两种突变体 r a p l a s l 7 n 、r a p l a q 6 3 e 转染到e b 病毒转化的b 细胞内，使其分别只能结合 g d p 或g t p ，发现o 一：的产生均受到抑制。进而推测：n a d p h 氧化酶的活化需要 r a p l a 在g t p 及g d p 两种状态中不断转换，它主要介导细胞内膜系统各种蛋 白之间的交通，促进细胞色素b 5 5 8 与其它组分的结合1 3 9 , 4 0 i 。 细胞色素b 5 5 8 和r a p l a 多存在于分泌小泡及富含碱性磷酸酶的颗粒面，0 - 2 最初也在这类小泡中产生。随即，这些小泡之间或与胞饮小泡相互融合，形成更大 的二级小泡，在二级小泡内，o ：继续释放。一些二级小泡还可与中性粒细胞的质 膜融合，从而使得一部分o ：释放到胞外【4 l l 。转移到质膜上的n a d p h 氧化酶功 能及活性是否发生改变目前还不清楚，d a h l g r e n 等人发现，当细胞色素从b 5 5 8 细 胞颗粒内膜转移到质膜后，尽管颗粒组分的n a d p h 氧化酶活性降低，却并不伴随 质膜组分中该酶活性的升高1 4 2 l 。抑制n a d p h 氧化酶在细胞质膜上的功能有助于 减少o ，：在胞外的释放，防止活性氧对周围正常组织造成损害。通过包围外来微 生物，质膜内陷形成吞噬小体，这些n a d p h 氧化酶又可重新返回至胞质内。除了 从质膜上获得n a d p h 氧化酶外，吞噬小体还可直接与二级小泡融合，已经证实该 酶在这些颗粒小泡膜表面是具有活性的，0 j 借此得以在吞噬小体内释放 御, 4 t 一2 1 。 1 3 2活性氧的杀菌机制 o 。是所有活性氧分子的前身，它不能自由穿越细胞膜。0 。：可以灭活微生物体 内的铁硫蛋白和n o 反应生成过氧亚硝基阴离子( o n o o ) ：还可通过还原某些 含铁复合物释放氢氧自由基( o h ) 这些分子均具有很强的氧化性，能够有效地 杀伤入侵的病原体及肿瘤细胞。除了以上两个通路，绝大部分的0 - 2 经过超氧化物 歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，s o d ) 的作用转变为过氧化氢0 _ 1 2 0 2 ) 。h 2 0 2 也是 弱氧化剂，虽然可以通过膜系统，但只有当其浓度较高时才具有杀菌效应。在非吞 噬细胞内，多余的h 2 0 2 被过氧化氢酶( c a t a l a s e ，又称触媒) 或谷胱甘肽过氧化物 酶( g l u t a t h i o n e p e r o x i d a s e ) 分解成u 2 0 和0 2 得以清除，但在中性粒细胞内，大量的 h 2 0 2 则被一种含有血红素的髓过氧化物酶( m y e l o p e r o x i d a s e ，m p o ) 消耗掉，这些 髓过氧化物酶一般储存在嗜天青颗粒中，细胞激活后通过脱颗粒作用释放到胞外 或吞噬小体内，进而在炎症部位催化h 2 0 2 生成一系列具有广泛生物学效应的活 性氧分子 3 6 , 4 3 。根据髓过氧化物酶结合铁离子的不同可将其分为m p o ( f c 3 + 1 和 m p o ( f e 2 + ) 两种。其中m p 0 ( f c 3 + ) 是该酶的天然状态，与h 2 0 2 反应后生成一种处 于氧化还原中自j 态的复合物i ，这种复合物反应性很强，可以被有机化合物( r 哪 9 重组日本七鳃鳗口腔腺分泌 2 5 1 蛋白表达纯化及活性鉴定 还原成复合物i i 同时生成一个自由基佩) ，随后，复合物i i 继续和其它有机物反 应使得m p o ( f e 3 * ) 重新恢复到天然状态。另外，m p o ( f 矿+ ) 还可以和0 。2 直接 作用变成m p o ( f e “) ，其机制目前尚不清楚。实际上，m p o ( f c a + ) 一复合物i 一复合物i i - - m p o ( f e 2 * ) 这个系统只是髓过氧化物酶循环利用的一个替代途径。 它的经典途径是通过复合物i 氧化卤素离子( x ) 生成次卤酸( h o x ) 1 4 4 j ( 图2 ) 。 其中，a 的反应产物次氯酸( h o c i ) 对于宿主防御以及炎症的发生、发展非常 重要，因合成h o c i 而摄入的氧约占到中性粒细胞在呼吸爆发中总耗氧量的三分 之二。 复剖勿i 图2 ：髓过氧化物酶的反应链 氯胺是h o c l 氧化作用的主要产物，性质较h o c i 稳定。属于反应选择性高 的温和氧化剂。有证据表明，吞噬小体内病原体蛋白的氯化程度与中性粒细胞的 杀伤效力成正比i 矧。氯胺的作用底物主要是半胱氨酸的巯基和甲硫氨酸的硫醚 基团，通过氧化蛋白质分子上的这两种氨基酸残基，可以使许多酶、蛋白酶抑制剂 及载体蛋白失活。在正常组织中，分泌到胞外的蛋白酶会立即和a 1 - 蛋白酶抑制剂 ( a 1 p 0 或a 2 巨球蛋白这类分子结合，此时，蛋白酶的活性处于抑制状态。当微生 物侵入机体在局部组织诱发炎症反应后，激活的中性粒细胞开始不断地合成 h o c i 及其代谢产物氯胺，氯胺具有较好的膜通透性，可以扩散到胞外并在炎症 部位积累，这些积累的氯胺随即作用于a 1 p i 和a 2 巨球蛋白的甲硫氨酸残基使 其丧失与蛋白酶的结合能力，各种蛋白酶包括弹性蛋白酶、胶原酶、胰蛋白酶等 因此被激活它们不但可以降解可溶性蛋白，分解胶原，还可以清除受损细胞及病 原体的残骸。除了和胞外蛋白酶结合外，a 1 - p i 和a 2 巨球蛋白还与淋巴细胞膜表 面的蛋白酶合，抑制细胞毒效应，下调免疫反应，氯胺的生成恰好解除了这种负调 控1 4 6 j 。在生理条件下，大部分氯胺并不稳定，它们会进一步分解成醛基衍生物1 4 7 】 ( 反应式如下) 。 r c h ( c 0 0 h ) n h c i + h 2 0 r c h 0 + h c l + c 0 2 + n h 3 1 0 重组日本七鳃鲠口腔腺分泌1 2 5 1 蛋白表达纯化及活性鉴定 n o 的代谢产物n 0 - 2 目前也被认为是h o c i 的作用底物，其产物主要n 0 2 a 和n 0 2 。其中，n 0 2 c i 可以与酪氨酸( t y r ) 发生氯化及硝化反应生成c i t ”和 n 0 2 t y r 。有的蛋白经这样修饰后结构和功能会发生改变，一些金属酶类如锰过氧 化物歧化酶( m n s o d ) 会失活，酪氨酸磷酸化也受到抑制。已经证实，n o - 2 能够 增强m p o 介导的抗菌效应：在吞噬小体内病原体上的酪氨酸残基具有不同程度 的氯化及硝化现象。有报道称n o 2 还可以和m p o ( f e 3 + ) 的复合物i i 直接作用， 使该酶重新回复到天然状态i 椰j 。 除直接杀伤病原体外，r o s 还可参与细胞信号通路将活化信号由胞浆传递 至核内，诱导炎症相关基因的表达，进而上调机体炎症反应，其中研究较为广泛的 主要是n f - r 。b ，己证实，该分子在固有性免疫防御系统中起着重要的作用。n f - r b 通常以同源二聚体或与r e l 组成异源二聚体存在于胞内，通过与i k b ( i n h i b i t o r s o fk b ) 结合使其维持在非活化状态。当细胞r o s 水平升高后，l - r 。b 被泛素化， 在泛素连接酶e 3 的作用下，进入2 6 s 蛋白酶体被降解，释放的n f - r 。b 随即转移至 核内，与靶基因的转录调控元件结合起始转录。这些靶基因包括：细胞因子类( 如 i l - i 、t n f - a 、c s f ) ；细胞因子受体类( 如i l - 2 r a ) ；粘附分子类( 如i c a m - 1 、 酽选择素) 。 由此可见，h 2 0 2 m p o h o c i 系统是宿主抵御微生物入侵的一把利器，它所 释放的活性氧在炎症反应中发挥了重要的作用。尽管如此，该系统也有不利的一 面。和生物大分子不同，这些无机、有机小分子没有反应选择性，在清除病原体的 同时也会对正常组织造成损伤。许多疾病的发生均与活性氧的代谢有关，动脉粥 样硬化便是一例。众所周知，低密度脂蛋白( u l ) 的氧化是该疾病形成的关键 点。研究表明，该氧化过程主要是由h 2 0 2 m p o h o c i 以及h 2 0 m p o r h 两个 通路介导的，经h 0 a 修饰的l d l 会发生聚集并诱发巨噬细胞积累胆固醇酯。而 m p o 氧化酪氨酸生成的酪氨酸自由基主要是与l d l 蛋白上的酪氨酸残基发生 二聚化反应，这些修饰作用均有助于动脉粥样改变的形成i 翔l 。此外，m e l i s s a 等 人发现糖尿病肾病患者体内的终末糖基化产物( a d v a n c e dg l y c a t i o ne n d ，a g e ) 也 可由这一系统合成。这类物质主要是通过丝氨酸氯胺的代谢产物乙二醇醛与蛋白 质的氨基酸残基共价交连后形成的，一般可随患者病程的延长而不断积累，其作 用还有待于进一步研究【5 ll 。 n e u t r o p h i l 介导组织损伤的可能机制是：各种刺激因素- 与n e u t r o p h i l 表面相 应受体结合，通过蛋白偶联机制激活n e u t r o p h i l ；n e u t r o p h i l 和其效应细胞表达 的粘附分子以受体配体的形式相互作用，促进n e u t r o p h i l 跨内皮细胞迁移入组织 中：激活的n e u t r o p h i l 聚集于组织中并产生大量炎性介质，同时n e u t r o p h i l 大量 聚集于毛细血管中，造成机械性阻塞微循环，加重组织的缺血、缺氧；n e u t r o p h i l 重组e t 本七鳃鳗1 3 腔腺分泌l 2 5 1 蛋白表达纯化及活性鉴定 直接损伤血管内皮细胞，破坏抗凝血屏障致血管内血栓形成。它们相互联系，互 为因果，最终导致组织的损伤和多器官功能衰竭( m o f ) 的发生。因而，以效 应细胞的功能作为靶目标并对其进行合理的调控成为目前m o d s 发病机制和治 疗的研究热点。 2 1 2 5 1 蛋白的表达及纯化 2 1 材料和方法 2 1 1 材料 所用试剂：p c ra m p l i f i c a t i o nk i t 、m i n i b e s tp l a s m i dp u r i f i c a t i o nk i t 等基因克隆 所需试剂、i f r g 、琼脂糖购自大连宝生物工程有限公司， 咪唑、尿素、n a c l 、t r i sb a s e 、购自a m r e s e o 组氨酸亲和层析柱购自上海华美生物有限公司， 溶菌酶、标准分子量蛋白、甘氨酸、考马斯亮蓝购于北京经科宏达生 物有限公司 丙烯酰胺、双丙烯酰胺、t e m e d 、e d t a 、s d s 购f l s i g m a 公司 过硫酸铵：北京宝泰克生物科技有限责任公司 p e t 2 3 b 质粒、大肠肝菌b l 2 1 由本实验室保存 冰乙酸、盐酸、无水乙醇、甘油、2 一琉基乙醇、甲醇、购自大连沈联 化学试剂公司 透析袋m d 3 4 - 7 购i 与s o l a r b i o ，截留分子量7 0 0 0 ，干燥时直径2 2 m m 所用仪器：h z - 8 8 0 1 k 型台式恒温振荡器 b i o f u g ep r i m o r 冷冻离心机 t d l - 5 台式低速大容量离心机 l x 1 0 0 手掌型离心机 d g g 9 1 2 3 a 型电热鼓风干燥箱 1 6 7 1 d h a 超净工作台 v c x l 3 0 细胞破碎仪( s o n i c s m a 叮! r i a 】l s 小c ) 电泳仪购自大连竞迈电泳仪器厂 凝胶成相系统( 2 0 2 0 d ) ：美m 冷泉港公司 b i o r a d5 5 0 酶标仪：美国b d 公司 倒置显微镜：奥林巴斯 重组日本七鳃鳗口腔腺分泌l 2 5 1 蛋白表达纯化及活性鉴定 2 1 2 方法 2 1 2 1 功能基因的e s t 搜索 实验构建七鳃鳗口腔腺c d n a 文库( 2 1 x 1 0 6p f u m l ) 并随机挑选c d n a 单克 隆进行e s t 测序，建立e s t 数据库( 约1 3 0 0 条e s t 序列) 。根据c d n a 序列和 部分表达序列标签( e s t ) ，预测出功能基因片段，并翻译成蛋白质的氨基酸序 列，在n c b i 蛋白质数据库( s w i s s p r o t , g e n b a n k , p d b ) 中进行相似性搜索。依 据蛋白质序列比较中序列的相似水平，归入各蛋白质家族和超家族中，再进一步 分析代表蛋白质相同生化功能的活性位点、或具重要特征的、保守性强的氨基酸 模序是否存在；一个模序可以代表一个折叠结构或活性位点。 经上述工作得到具有中性粒细胞抑制因子( n i f ) 样活性的1 2 5 1 基因片段。 2 1 2 2 总r n a 的提取：采用g m c ob r l 的t r i z o l 试剂。具体如下： ( 1 ) 取日本七鳃鳗口腔腺迅速置于液氮中研磨； ( 2 ) 称取0 2g 腺体组织和分泌物，加1m lt r i z o l 试剂制备匀浆，4 c 孵育5 m i n ： ( 3 ) 加0 2m l 氯仿，盖紧盖后用力振摇1 5s e c o n d ，然后置于冰上5r a i n ； ( 4 ) 4 c ，1 2 0 0 0g ，离心1 5m i l l ： ( 5 ) 将上层水相移入另一离心管，加0 5m l 异丙醇，并在冰上孵育1 0m i l l ： ( 6 ) 4 c ，1 2 0 0 0 9 ，离心1 5m i l l ； ( 7 ) 弃上清，在沉淀( 含m 叮a ) 中加i m l7 5 乙醇洗涤，旋涡混匀； ( 8 ) 4 c ，1 0 0 0 0 9 离心5 m i n ，得到r n a 沉淀； ( 9 ) 空气干燥后，用适量t e 或无r n a s c 水溶解备用。 2 1 2 3 调取目的基因并构建至质粒表达载体以p e t - 2 3 b 序列中n d ei h i n d i i i 酶切位点和目的片段两端序列为依据设计引物，进行r t - p c r 扩增，以获得日本 七鳃鳗口腔腺l 2 5 1 蛋白的c d n a ：为产生带有组氨酸标签的融合蛋白，选择 p e t - 2 3 b ( + ) 作为基因克隆的载体，克隆具体操作如下： ( 1 ) 按以下条件进行反转录反应： 4 2 2 0m i n ，9 9 5m i n ，5 c5m i l l 引物序列为： p i ：5 - x x c a t a t g g c g a g c g t c g t g g c g g c g a c a - 3 p 2 ：5 - x x a a g c t t c t g c a c a t c c g t c g t g c a g c t - 3 ( 2 ) 使用t a l 【a r a r n a l a p c r t mg i t ( a m v ) v e t 1 t ( c o d c n o d r r 0 t 2 a ) ，以t o t a l r n a 为模板，以o l i g od t 为反转录引物反转录合成c d n a 。 ( 3 ) 以c d n a 为模板以c t a 2 5 1 f c t a 2 5 1 r 为引物，使用t a k a r a 纠t a q 刀 l ( c o d e n o d r r 0 2 a g ) p c r 扩增的基因片段。p c r 使用t a k a r aa g a r o s cg e ld n a p u r i f i c a t i o nk i tv e t 2 0 ( c o d en o d v 8 0 5 a ) 切胶回收，命名为l 2 5 1 ( p ) ，溶于1 2 u l 重组日本七鳃鲠口腔腺分泌1 2 5 1 蛋白表达纯化及活性鉴定 d h 2 0 中，取l u l 进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图4 。 ( 4 ) 使用t a k a r a d n a l i g a t i o n k i t ( c o d e n o d 6 0 2 2 ) 0 0 的s o l u t i o n i ，将l 2 5 1 ( p ) 和p m d l 8 - ts i m p l e 载体连接后，热转化到e c o l ic o m p e t e n tc e l lj m l 0 9 ( c o d e n o i ) 9 0 5 中，涂布平板，过夜培养菌体。 ( 5 ) 挑选菌落，提取质粒。取l u l 进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图5 。 ( 6 ) 将l 2 5 1 ( t ) 1 、【2 5 1 ( t ) 2 、l 2 5 1 ( t ) - 3 、1 2 5 1 ( t ) 6 质粒用b c a b e s t l p i i m c rm 1 3 4 7 b c a b e s tp r i m e rr v m 引物进行d n a 测序。测序结果符合要求 ( 7 ) 将l 2 5 1 ( t ) 3 和p e t 2 3 b 用n d ei 册耐m 双酶切，并使用t a k a r a a g a r o s e g e ld n ap u r i f i c a t i o nk i tv e t 2 0 ( c o d en o d v 8 0 5 舢切胶回收，命名为i n s e r ti 和 v e c t o ri ，取l u l 进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图6 。 ( 8 ) 使用t a k a r ad n a l i g a t i o nk i t ( c o d en o d 6 0 2 2 ) 中的s o l u t i o ni ，将v e c t o ri 连接，热转化至e c o l ic o m p e t e n tc e l lj m l 0 9 ( c o d en o 1 3 0 0 5 孙中，涂布平板，过 夜培养菌体。挑选菌落，提取质粒。取l u l 进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图7 。 ( 9 ) 将质粒l 2 5 1 p - 3 使用n d ei 珊讥删双酶切进行酶切检测，取1 0 u l 进行琼 脂糖凝胶电泳，结果见图8 。 ( 1 0 ) 将质粒l 2 5 1 p - 3 用t 7p r o m o t e rp r i m 盯t 7t e r m i n a t o rp r i l h f r 引物进行d n a 测序，测序结果符合要求。 2 1 2 4 将获取目的c d n a 的p e t 2 3 b 载体转化入表达菌b l 2 1 后进行阳性转化子 的筛选鉴定； ( 1 ) 感受态的制备： 将b l 2 l 在琼脂平板上划线，3 7 。c 培养1 2 1 6 小时。挑取单菌落于5 m l l b 液体培养基中，3 7 。c 振荡培养1 2 1 6 小时。将培养物转移到1 0 0m ll b 培养基中，3 7 。c 振荡培养2 - 3 小时，使o d 值( 6 0 0 n m ) 达到0 4 o 6 之问。 然后将培养物冰浴1 5 分钟，4 0 0 0r p m4 。c 离心1 0 分钟，收集菌体，加冰冷 的0 1 m o l l c a a 21 0 m l ，冰上放置3 0 分钟，4 0 0 0r p m4 。c 离心1 0 分钟，收 集菌体。加冰冷的c a c l 22m l 重悬沉淀，在1 2 2 4 小时内用于转化。 ( 2 ) 转化b l 2 1 ： 取感受态细菌2 0 0 l l 加入1 0 u 质粒连接产物混匀，于冰上放置3 0 分钟， 4 2 。c 热冲击秒，立即放于冰上1 砣分钟，加入1 b a m p 一培养基8 0 0 1 1l ， 3 7 。c 振荡培养1 小时，取1 5 0 ul 涂布于l b a m p + 平板上，将平板正放于 3 7 。c 温箱1 小时，待溶液被琼脂吸收后，倒置平板，3 7 。c 过夜培养。 ( 3 ) 阳性转化子的筛选鉴定： 从平板上挑取菌落，放入装有1 0 ul 灭菌水的e p p e n d o r f 管中，1 0 0 。c 煮 沸1 0 分钟，以此作为模板进行p c r 扩增。利用t 7 通用引物法进行阳性转化 1 4 子的筛选鉴定。检菌体系为： 1 0 x p c r b u 岱日 d 舯 模板d n a p d m 盯l n 血f 2 t a k a r a 伽 叫h ，o 1 7 通用引物序列： p i ：5 a a a t a a t a c g a c t c a c t a t a - 3 p 2 ：5 g c t a g t t a t t g c t c a g c g g t g - 3 2 1 2 5 对阳性重组子进行终浓度为i m m o l l 的i p t g 诱导表达。诱导表达条件为 3 7 ，5 h 。 2 1 2 6 采用s d s - 聚丙烯酞胺凝胶电泳法对可溶性蛋白进行分析 ( 1 ) 样品制备 向t u b c 管中加入1 - 1 5 m l 菌液，室温条件离心5 o f p m ，弃上清，向沉淀中加入的 样品缓冲液1 u l ，震荡混匀后，在沸水中加热5 1 吩钟蛋白质上样量为每孔 2 0 u l 。 ( 2 ) 电泳 电泳所用浓缩胶浓度为5 ，分离胶浓度为1 0 ，电泳时间为1 2 小时。 ( 3 ) 染色 将电泳后的凝胶置于染色液中，在转速为蛳的摇床上，室温染色4 小时以上。 ( 4 ) 脱色 将染色后的凝胶放入脱色液中，在转速为5 0 r p m 的摇床上脱色，室温即可待 凝胶脱色至背景清晰透明、蛋白条带清晰为止。 ( 5 ) 结果分析 以p e l 眩3 b 空质粒诱导为对照，观察在诱导样品泳道3 1 妨处是否存在特异表达条 表达条带 2 1 2 7 对表达的重组蛋白进行变性条件下的组氨酸亲和层析纯化 ( 1 ) 1 0 0 0 0g 离心1 0m i n 收获菌体，弃上清，并使残液尽量流出。以每 1 0 0m l 的原培养液加4 0m l 冰冷的l x b i n d i n gb u f f e r 的比例重悬细 胞。 ( 2 ) 将上述样品置于冰上超声裂解细胞，强度5 0 ，1 0 r a i n ，p u l s eo n1 0 s ， u 5铷枷埘埘蟠射 重组日本七鳃鳗口腔腺分泌l 2 5 1 蛋白表达纯化及活性鉴定 p u l s eo f f 5 s 。 ( 3 ) 5 0 0 0 9 离心1 5 m i n 弃上清，每1 0 0 m l 的原培养液加2 0 m l 含1 k u m l 溶菌酶的l b i n d i n gb u f f e r 重悬细胞。 ( 4 ) 再次破碎，以释放更多的目的蛋白。 ( 5 ) 重复上述操作直至菌体充分裂解。 ( 6 ) 将破碎完全的菌体沉淀按照每1 0 0 原液加入5m l 含6 t o o l 尿素的 l x b i n d i n gb u f f e r 重悬细胞。 ( 7 ) 冰上1h ，使蛋白充分融解。 ( 8 ) 1 6 0 9 离心3 0m i n ，取上清以0 4 5 m m 的滤膜过滤。 ( 9 ) 吸去h i s b i n dc o l u m n 上室的贮液，并打开下面管口； ( 1 0 ) 用1 0n l l 的l x b i n d i n gb u f f e r 对柱子进行平衡； ( 1 1 ) 将过滤好的上清液上样；用1 0n l l 的1 b i n d i n gb u f f e r 洗柱； ( 1 2 ) 用1 0 m l 的l x w a s h b u f f e r 洗柱； ( 1 3 ) 用5 m l 的l e l u t e b u f f e r 洗脱目的蛋白； 2 1 2 8 蛋白含量测定使用碧云天b c a ( b i c i n c h o n i n i c a d d ) 蛋白浓度测定试剂盒 测定l 2 5 1 蛋白浓度，该法基本原理为：在碱性条件下，蛋白将c u 2 + 还原为c u + ， 两分子的b c a 螯合一个铜离子，c u + 与b c a 试剂形成紫颜色的络合物，测定其 在5 6 2 n m 处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。操作详 见附录3 。 2 1 2 9l 2 5 1 蛋白的复性 实验采用透析法缓慢除去变性剂。具体方法如下： ( 1 ) 把透析袋剪成适当长度( 8 - 1 0 c m ) 的小段； ( 2 ) 在2 ( w v ) n a h c 0 3 和l m me d t a ( p h 8 0 ) 中将透析袋煮 沸1 0 分钟； ( 3 ) 用蒸馏水彻底清洗透析袋： ( 4 ) 放在l m me d t a ( p h 8 0 ) 中将之煮沸1 0 分钟； ( 5 ) 冷却后存放在4 c ，必须保证透析袋浸泡在溶液中，从此时取用透 析袋时须手套； ( 6 ) 使用时取出透析袋用线绳扎紧一端； ( 7 ) 将纯化之后的包涵体蛋白质装入袋中，用绳吊于玻璃棒上，使袋 能够浸入蒸馏水中，加入磁力搅拌器； ( 8 ) 4 c 透析7 8 小时，将蛋白质样品取出。 重组日本七鳃鳗口腔腺分泌l 2 5 1 蛋白表达纯化及活性鉴定 2 2 结果 2 2 1 目的片段的调取 从日本七鳃鳗口腔腺e s t 库中调取到l 2 5 1 基因，经测序得其出序列与对应 天然蛋白的测序结果相同，证明l 2 5 1 蛋白与日本七鳃鳗口腔腺分泌蛋白相符， 1 2 5 1 的生物活性即口腔腺天然蛋白的生物活性。 l 2 5 1 蛋白c d n a 序列7 3 8b p ，其蛋白质由2 4 6 个氨基酸组成，蛋白分子量 为2 7 ，9 4 8 k d a 。 图3 ：m a m i - 1 d f m a s s ( 飞行时间质谱) 分析，获取主要蛋白肽指纹图谱 和精确分子量 由于所设计的引物分别带有 i 和h i n di i i 酶切位点，这两个酶切位点也是 p e l 2 3 b 的多克隆位点，这使得将目的基因d n a 片段与载体p e l 2 3 b 的连接成为可 能。 m ：d n am a r k e rd i d ，0 0 0 1 ：l 2 5 1 ( p ) 图4 ：1 2 5 1 扩增片段 m ： 一h i n dmd n a m a r k e r i l 2 5 1 1 3 ( t ) - l 质粒 2 ：l 2 5 l b ( t ) 一2 质粒 3 ：l 2 5 l b ( t ) 3 质齄 4 ：1 1 2 5 l b t ) 一6 质般 幽5 ：1 , 2 5 1 ( t ) 质粒提取 1 7 重组日本七鳃鲠i - 腔腺分泌l 2 5 1 蛋白表达纯化及活性鉴定 ml ：d n am a r k e rd l 2 0 0 0 i ：i n s e r ti m 2 ：丸一h i n dmd n am a r k c f 2 ：v e c t o r l m 6 ：l 2 5 1 ( t ) 与p e t 2 3 b 刃( 酶切回收片段 m ： 一h i n d d n am a r k e r l ：l 2 5 1 - p 3 质粒 图7 ：l 2 5 1 ( t ) 与p i 丌2 3 b 连接 l 2 5 1 基因片段克隆入真核表达载体p e t 2 3 b 之后，n d ei 和颅硼m 双酶切，得 到约7 0 0 b 的目的片段 m i ：- h i n d d n a m a r k e r l ：质粒l 2 5 l p - 3 酶切产物 m 2 ：d n am a r k e r d l 2 ，0 0 0 图8 ：l 2 5 1 ( t ) 构建到p e t 2 3 b 后双酶切鉴定 p e t 2 3 b l 2 5 1 的转化在l b 平板上可见稀疏单菌落，随机挑选菌落进行 p c r ，产物行1 琼脂糖电泳检测，结果如图9 ：由l 2 5 1 基因序列与两侧通用引 物组成接近7 5 0 b p 片段。 1 8 重组日本七鳃鲠口腔腺分泌1 2 5 1 蛋白表达纯化及活性鉴定 图9 ：阳性转化子的p c r 鉴定m ：d l 2 , 0 0 0 01 - 5 ：阳性转化子 2 2 2 1 2 5 1 的重组表达及纯化 通过计算1 - 2 5 1 蛋白2 5 7 个氨基酸得1 2 5 1 分子量为2 79 4 8 k d ，重组表达质 粒中目的片段末端带有6 个组氨酸标签，在b l 2 1 中进行诱导表达时，菌体在 3 0 k d 略上方处出现特表达条带。经组氨酸亲和层析柱，得到纯化的单一目的条 带。实验结果见图1 0 9 7 1 d d 一 6 6 如一 4 5 如一 3 0 如一 2 0 如- - l - 2 5 1 特异表达条带 1 234 图1 0 ：1 2 5 1 表达及纯化电泳：1 、1 2 5 1i p t g 诱导表达2 、低分子量蛋白标准3 、1 2 5 1 纯 化蛋白4 、空质粒i f t g 诱导 1 9 重组日本七鳃镊口腔腺分泌1 2 5 1 蛋白表达纯化及活性鉴定 l 0 8 0 6 0 4 0 2 0 僵 o s o1 0 01 5 02 0 02 s 0 1 5 aq 【- l ， 图1 1 ：蛋白标准曲线图 根据蛋白标准曲线图，测得l 2 5 1 蛋白浓度为0 1 2 5 u g u l 。 2 3 讨论 选取转录载体p e t - 2 3 b 质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到带 有t 7 r n a 聚合酶基因的宿主菌( 九d e 3 溶原菌) 中表达目标蛋白。b i 2 1 便 属于此类菌种。在九d e 3 溶原菌中，t 7r n a 聚合酶基因由l a c u v 5 启动子 控制。未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无 毒害作用的一些基因。 在l 2 5 1 基因序列c 末端带有6 个组氨酸标签( 6 x h i s t a g ) ，所以表达产物 为融合蛋白。但6 h i s t a g 很小，且在生理p h 下较稳定，没有免疫原性，也不 改变蛋白质的生化特性，所以可以直接用蛋白检测生物活性。6 h i s t a g 序列作 为纯化蛋白的融合伴侣至关重要，尤其对以包涵体形式表达的蛋白来说，它可 以使亲和纯化在溶解蛋白完全变性条件下进行。 由s d s p a g e 电泳图可得出，l 2 5 1 蛋白以包涵体表达。包涵体是指细菌表 达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。一般含有5 0 以上的重组蛋 白，其余为核糖体元件、r n a 聚合酶、内毒素、外膜蛋白o m p c 、o m p f 和o m p a 等，环状或缺口的质粒d n a ，以及脂体、脂多糖等，大小为o 5 1 u m ，具有很 高的密度( 约1 3 m g m 1 ) ，无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍 等。n m r 等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性 的启动阶段中具有一定的作用。 如果在重组蛋白的表达过程中缺乏某种蛋白质折叠的辅助因子，或环境不 适，无法形成正确的次级键等原因形成的【5 2 】。一、基因工程菌的表达产率过高， 超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的d 因子的蛋白水解能力达到饱和，使 之表达产物积累起来。研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容 2 0 重组日本七鳃篡口腔腺分泌! 2 5 1 蛋白表达纯化及活性鉴定 易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠， 二硫键不能正确的配对，过多的蛋白问的非特异性结合，蛋白质无法达到足够 的溶解度等。二、重组蛋白的氨基酸组成：一般含硫氨基酸越多越易形成包涵 体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。三、重组蛋白所处的环境： 诱导温度高或胞内p h 接近蛋白的等电点。四、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白， 由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子。如折叠酶和分子伴侣等， 致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。五、蛋白质在合成之后，于中性 p h 或接近中性p h 的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键， 某些蛋白如a s p a r t a s e 和c y a n a s e ，表达产率很高达菌体蛋白的3 0 ，也不形成包涵 体，而以可溶形式出现i 卯j 。六、在细菌分泌的某个阶段，蛋白质分子间的离子 键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体的形成i 钏。 实验用b l 2 1 基因工程菌液，经离心浓缩后，超声破碎与溶菌酶破碎相结合， 即在实验室规模下( 菌量较少) 有较好效果，又可用于在较大规模纯化避免了 由于能量传递不均或局部产热等原因，部分未破碎细胞与包涵体混在一起，给 后期纯化带来困难，可显著提高包涵体的纯度和回收率。然后以1 4 0 0 0 x g1 5 r a i n 离心，可使大多数包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。 由于包涵体中的重组蛋白缺乏生物学活性，加上剧烈的处理条件，使蛋白 的高级结构破坏，因此重组蛋白的复性特别必要。通过缓慢去除变性剂使目标 蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键 正常形成一般在尿素浓度4 m 左右时复性过程开始，到2 m 左右时结束。对 于盐酸胍而言，可以从4 m 开始，到1 5 m 时复性过程已经结束。 为对l 2 5 1 蛋白进行活性测定，实验用透析复性。透析复性的好处是不增加 体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，但此法易形成无活性 蛋白质聚体，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模 3 中性粒细胞趋化活性检测 3 1 材料和方法 3 1 1 材料 健康人外周血细胞 m i g r a t e s t 试剂盒购自德国o p r e g e np h a r m a 生物有限公司。 抗凝管购自大连脉普生物试剂器材有限公司 流式细胞仪由大连市中心医院中心实验室提供 重组日本七鳃鳗口腔腺分泌1 2 5 1 蛋白表达纯化及活性鉴定 3 1 2 方法 3 1 2 1 分离中性粒细胞 用无菌技术收集5m i 健康人外周肝素化全血，不可用e d t a 或枸橼酸抗凝。 ( 1 ) 小心将1m l 肝素化全血铺在白细胞分离培养基上； ( 2 ) 室温下放置4 0 m i m ，不要摇动，全血加m i m 后自动分层，上层是白 细胞丰富血浆，含有白细胞和血小板，下层是红细胞。如果用陈旧的 血，红细胞沉淀反应需要的时间长； ( 3 ) 吸出5 0 0u l 上层白细胞丰富血浆，于细胞计数板，显微镜下进行中性粒 细胞计数，调整每份血样粒细胞终浓度至4 0 0 0 m l 在1 h 内用于中性粒 细胞趋化活性检测。 3 1 2 2 中性粒细胞的激活及跨膜迁移 ( 1 ) 将i n c u b a t i o nb u f f e r 或( 趋化三肽甲酰基甲硫氨酸一亮氨酸一苯丙氨 酸) f m l p 加入2 4 孔板的孔中，阴性对照加3 5 0u li n b u b a t i o nb u f f e r , 阳性对照加3 5 0u lf m l p 工作液； ( 2 ) 将细胞培养插件( 预先用3 0 i tm 微孔纤维素滤膜包被) 安置到每一 个孔中，并在两个对照和三个实验插件上分别加入1 0 0u l 白细胞丰富 血浆，再在三个实验孔分别加入2 0 u i ，3 0 l i l ，4 0 u l l 2 5 1 蛋白，浓度分 别为7 0 n m 、9 6 n m 、1 1 8 n m ； ( 3 ) 将2 4 孔板放入3 7 水浴3 0 m i m ，保持2 4 孔板静止勿振动；中性粒 细胞在f m l p 浓度梯度刺激下，通过细胞培养池 ( 4 ) 将细胞培养插件取出。吸出底部细胞悬液，放于冰上，同时在未刺激 的培养插件中取出2 0u i 细胞悬液于3 5 0u li n c u b a t i o nb u f f e r 中，作为 i e c a m 1 对照； ( 5 ) 在每一个孔中加入2 0 u l 荧光染料计数试剂，旋涡混匀，冰浴1 0 m i m ， 闭光； ( 6 ) 每孔加2 0 u ll v i t a ld n a 染料，冰浴5 m i m ，闭光。 在1 2 0 m i m 内进行流式细胞仪检测。 3 1 2 3 中性粒细胞跨膜数检测 流式细胞仪对中性粒细胞反应的定量分析可达到单细胞的水平。流式细胞 仪具有波长调至4 8 8 n m 的氢离子激光发射器，于5 1 5 5 4 5 n m 处对被标记的大肠 埃希菌上f i t c 所发射的光进行测量( f l l ) 。红色