（材料学专业论文）释氧型多孔复合支架材料的制备与表征.pdf

武汉理工大学硕士学位论文 摘要 研制理想的支架材料是组织工程学和生物材料科学领域中的重要课题。组 织工程将细胞支架复合体植入到组织损伤后，由于植入体部位血管化速度非常 慢，细胞突然承受体内低氧浓度环境而导致死亡。另一方面，人工骨修复长段 骨缺损时常因两端血管不能爬行对接，骨细胞因缺乏氧气和营养物质及代谢产 物无法得到交换而不能长入人工骨内部而导致失败。因此，具有释氧功能的支 架材料有望解决这些难题。 本论文拟以聚乳酸( p d l l a ) 为基体材料，制备具有持续释氧性、孔径可 控、高孔隙率、良好生物相容性、生物降解性能、生物活性和亲水性的支架材 料，以适用于生物医学领域及组织工程领域，为设计新型的支架材料提供依据。 分别采用热致相分离法、热致相分离溶剂浇铸粒子沥滤法，在聚合物中掺 入无机过氧化物制备出释氧型多孔支架材料。采用比重法测试试样的孔隙率； 并利用三维视频显微镜和扫描电子显微镜观察试样的外观形貌、孔径大小以及 孔连通性等等。研究了两种制备方法中控制孔隙率、孔径大小和孔隙形貌的因 素，并分别对比了两种方法各自的优缺点。 研究表明，采用热致相分离法制备的多孔有机无机复合支架材料呈三维网 络结构，孔连通性好，但孔径不高，一般不超过5 0 岫，孔隙率也偏低( 7 0 左 右) ，该法制备的支架材料不存在致孔剂残留问题。而热致相分离溶液浇铸粒 子沥滤法制备出的聚合物多孔支架材料孔隙分布非常规则，孔隙率高( 9 0 ) ， 大孔之间又有微孔保持材料的连通性。宏观孔的尺寸均匀，基本为圆形。通过 选择不同尺寸的石蜡微球颗粒，可得到不同孔径大小的多孔支架。选用石蜡微 球作为致孔剂，制备过程简单、方便，整个制备过程中都避免了与水份的接触， 保证了过氧化物的稳定性。 研究表明：掺入过氧化物的支架材料能够在2 1d 内持续释放氧气，氧气的 释放量可以根据过氧化物的种类和掺入比例得以控制；当过氧化物的总含量在 4 一5 时，每天氧气的释放量可以达到0 1m g l ，降解过程中p h 值基本稳定在 7 2 7 4 ，适合细胞的生长。另外，d c p a 的加入又与过氧化物的水解产物反应生 成磷灰石，改善了材料的力学性能。 关键词：释氧，有机无机复合支架，相分离，溶剂浇铸粒子沥滤 武汉理工大学硕士学位论文 a b s t r a c t s c a f f o l dm a t e r i a l si nt i s s u ee n g i n e e r i n ga r en o to n l yu s e dt os u p p o r tc e l l sa n d t i s s u e sa n do f f e rp h y s i c a la d h e r e n c eb e t w e e nt h e m ，b u ta l s oa p p l i e df o ra d j u s t a t i o no f c e l l s v a r i o u sa c t i v i t i e s t h es t u d yo nt i s s u ee n g i n e e r i n ga n db i o l o g i c a lm a t e r i a l sh a v e f o c u s e do np r e p a r a t i o no fi d e a ls c a f f o l dm a t e r i a l s h o w e v e r , c e l l s ，b e a r i n gl o w o x y g e nc o n c e n t r a t i o ns u d d e n l y ，w o u l dd i ee a s i l yb e c a u s eo fh y p o x i aa f t e r t h e c e l l s c a f f o l sc o m p o s i t i o nb e i n gi m p l a n t e di n t ot h et i s s u ei n j u r y o t h e r w i s e ，w h e n a r t i f i c i a lb o n ew a su s e dt or e p a i rl o n gb o n ed e f e c t ，i t se f f e c t sw o u l df a i ld u et oh u g e d i f f i c u l t yo fc o n n e c t i o na n dc r a w l i n go fb l o o dv e s s e lb e t w e e nt w os i d e so fb o n e d e f e c t s t h e s ec o u l dc a u s et h el a c ko fo x y g e na n dn u t r i e n t ss u p p o r t i n gs u r v i v a la n d g r o w t ho fb o n ec e l l sa n df a i l u r eo fb o n ei m p l a n t a t i o n s o ，o x y g e nr e l e a s es c a f f o l d s a r ep o t e n t i a lt op u tt h ea x ei nt h eh e l v e i nt h i sp a p e r ，p o l y ( 1 一l a c t i ca c i d ) ( p d l l a ) w a sa d o p t e da st h em a t r i xm a t e r i a l si n o r d e rt oo b t a i nt h es c a f f o l dm a t e r i a l sw i t hs u s t a i n a b l eo x y g e nr e l e a s e ，w e l l c o n t r o l l e d p o r es i z e ，h i g hp o r o s i t y ，g o o db i o c o m p a t i b i l i t y ，b i o d e g r a d a b i l i t y ，b i o a c t i v i t ya n d h y d r o p h i l i c i t yw h i c hc a nb ea p p l i e di nt h ea r e ao fb i o m e d i c a le n g i n e e r i n ga n db o n e t i s s u ee n g i n e e r i n g m o r e o v e r ，s o m er e f e r r e n c e sc o u l da l s ob ep r o v i d e df o rd e s i g no f n o v e ls c a f f o l dm a t e r i a l s t h eo x y g e nr e l e a s es c a f f o l dw e r ep r e p a r e db yc o m p o u n d i n gi n o r g a n i cp e r o x i d e i n t op l l au s i n gt h e r m a li n d u c e dp h a s es e p a r a t i o n ( t i p s ) a n d t i p s s o l v e n tc a s t i n g a n dp a r t i c u l a t el e a c h i n g ( t i p s s c p l ) m e t h o d p o r o s i t yw a st e s t e db yg r a v i m e t r i c m e t h o d t h em o r p h o l o g y ，p o r es i z ea n dt h ep o r ec o n n e c t i v i t yw e r ei n v e s t i g a t e db y s c a n n i n ge l e c t r i c a lm i c r o s c o p y ( s e m ) a n dt h r e e d i m e n s i o n a l v i d e om i c r o s c o p y ( 3 - d v m ) a n dt h ei n f l u e n c i n gf a c t o r so fp o r o s i t y ，p o r es i z ea n dp o r em o r p h o l o g y a n dc o m p a r i s o no fa d v a n t a g e sa n dd i s a d v a n t a g e sb e t w e e nt h e s et w op r e p a r a t i o n m e t h o dw e r es t u d i e di np a p e r t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep o r o u so r g a n i c - i n o r g a n i cc o m p o s i t es c a f f o l d sw i t h t h r e e d i m e n s i o n a ln e t w o r k ，g o o dp o r ec o n n e c t i v i t ya n dn or e s i d u a lp o r o g e nw e r e p r e p a r e db yt i p s h o w e v e r , t h ep o r e - s i z eo ft h e m w a sl e s st h a n5 0 l _ t ma n dt h e p o r o s i t yw a sa l s ol o w ( a b o u t7 0 ) n e v e r t h e l e s s ，s a m p l e sp r e p a r e db yt i p s s c p l 一茎坚堡三奎兰堡主兰垡笙奎 _ 一一 h a dr e g u l a rp o r ed i s t r i b u t i o n ，h i g hp o r o s i t y ( 9 0 ) ，a n dg o o dp o r ec o 彻e c t i v i t y w l l i c ho b t a i n e db yb i gp o r e sm i x e dw i t ht i n yp o r e s p o r e sw e r eu n i f o r m e d ，s h a p e d a n dr o u n db a s i c a l l y a n dp o r o u ss c a f f o l d sw i t hd i f f e r e n ts i z eo fp o r ew e r eo b t a i n e d b vc h o o s i n gd i f f e r e n ts i z e so fp a r a f f i nm i c r o s p h e r e sp a r t i c l e s t h ep r 印a r a t l o n p r o c e s su s i n gp a r a f f i nm i c r o s p h e r e sa sp o r o g e nw a ss i m p l e a n dc o n v e n i e n ta n dc o u l d a v o i dc o n t a c t i n gt h ew a t e rd u r i n gt h em a n u f a c t u r i n gp r o c e d u r ew h i c he i l s u r e dm e s t a b i l i t yo ft h ep e r o x i d e s o t h e n i s e ，t h er e s u l t sa l s om o w e d t h a tt h es c a f f o l dm a t e r i a l sc o m p o s i t ew i t h p e r o x i d e sr e a l i z e ds u s t a i n e d r e l e a s eo fo x y g e na tl e a s t2 1d a y s t h eo x y g e n - r e l e a s i n g 锄o u l l t 锄dr a t ew a sc o n t r 0 1 1 e db yt h ek i n da n dc o n t e n t so fp e r o x i d e s w h e n t h et o t a l c o n t e n to fp e r o x i d e sw a s4 5 ，t h er a t eo fo x y g e nr e l e a s ec o u l dr e a c h0 1 m e r l e p e rd a y ，a tt h es a m et i m e ，p hk e p ta t7 2 7 4w h i c h w a sg o o df o rg r o w t ho fc e l l s a n d t h em e c h a n i c a lp r o p e r t i e sa n db i o c o m p a t i b i l i t y c o u l di m p r o v el a r g e l ya s 印a t l t e f 0 】1 i l e d 舱e rd e c l a i mp h o s p h a t ea n h y d r o u sw a sa d d e di n t ot h es y s t e ma n dr e a c t e d w i t hh y d r o l y z a t ep r o d u c t so fp e r o x i d e s k e y w o r d s ：o x y g e nr e l e a s e ，o r g a n i c - i n o r g a n i cc o m p o s i t es c a f f o l d ，p h a s es 印a r a t i o 玛 s o l v e n tc a s t i n g p a r t i c u l a t el e a c h i n g 独创性声明 本人声明，所呈交的论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得武汉理工大学或其它教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 期： 关于论文使用授权的说明 本人完全了解武汉理工大学有关保留、使用学位论文的规定，即学校有权保 留、送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 签名：左基秽导师签名：叠幽期：趔 翟讧垫日期：竺型 武汉理工大学硕士学位论文 第一章绪论 组织工程包含三个关键要素：信号分子( 生长因子、诱导因子) 、靶细胞 和支架材料( s c a f f o l dm a t e r i a l s ) 。其中，支架材料主要起以下作用：作为连 接细胞和组织的框架，引导组织生长成特定形态；作为信号分子的载体，将 其运送到缺损部位，并作为缓释体使诱导因子缓慢发挥作用；作为细胞繁殖 分化和新陈代谢的场所，为细胞生长输运营养，排除废物；支架表面特殊位 点与细胞起特异性反应，对不同类型细胞起身份识别及选择粘附的作用。支架 不仅对细胞、组织起物理连接和支持作用，而且还调节细胞的各种功能活动。 寻找合适支架材料是组织工程研究的一个重要研究内容。 1 1 支架材料的研究现状 组织工程支架材料不仅为特定细胞提供结构支撑作用，而且还起到模板作 用，引导组织再生和控制组织结构【l t 2 1 。因此，支架材料必须具有适当孔径、较 高的孔隙率和良好的连通性，以便于细胞的迁移长入、营养物质的传送及代谢 产物的交换，而支架的结构取决于多孔支架的制备方法。目前，聚合物多孔支 架的制备方法主要有：纤维粘纠3 ，4 】、溶剂浇铸粒子沥滤【5 _ 7 】、相分离乳化2 1 、 气体发泡 1 3 - 1 7 】、快速成型等 1 8 , 1 9 】。 1 1 1 气体发泡法 气体发泡技术采用气体作为致孔剂，包括物理发泡法和化学发泡法。 物理发泡法可避免在制备支架时使用有机溶剂。该法将聚合物压成片，浸 泡在高压二氧化碳中直至饱和，甚至超临界状态，然后降至常压，气体的热力 学不稳定性导致气泡成核和增长，形成多孔支架，但孔为闭孔结构。若将发泡 法与粒子沥滤法相结合，则可制得相连通的开孔结构的多孔支架。若将聚合物 粉末和致孔剂粒子混合物在室温下模压制取圆片，则可避免使用高温，有利于 在温和的条件下引入生长因子。受控释放的生长因子可保持9 0 的生物活性， 己用于平滑肌组织工程。该法中影响孔隙率和孔结构的因素主要是聚合物结晶 武汉理工大学硕士学位论文 性分子量、平衡时间、放气速率等。结晶性聚合物左旋聚乳酸( e l l a ) 2 0 2 1 】和聚 羟基乙酸( p g a ) 【2 2 】难以发泡，无定型聚合物聚( 乳酸羟基乙酸) ( p l g a ) 2 3 - 2 6 】易 发泡；聚合物分子量越高越难以发泡，孔隙率越低；在高压气体中平衡时间越 长，孔隙率越高；放气速率对孔隙率影响较小。 化学发泡法采用的化学发泡剂主要为碳酸盐类化合物。将聚合物溶液，碳酸 氢氨粒子混合物加入到模具中，待溶剂部分挥发后直接浸入热水中发泡，最后 经冷冻干燥可得到多孔支架。该法得到的多孔支架孔隙率超过9 0 ，孔连通性 好，孔尺寸约1 0 0 5 0 0 哪，并避免了表面皮层的形成，其肝细胞种植效率高达 9 5 。 1 1 2 纤维粘结法 以p g a 纤维作为支架材料是组织工程中最早采用的一种方法。由p l a 或 p g a 纤维构成骨架的优点是比表面积大，有利于细胞粘附和养分扩散，对细胞 存活和生长有利。缺点则是结构稳定性不好，力学性能不够，多用于软组织培 养，而不能用于硬组织培养。为了提高支架性能，研究者提出了两种改进方法。 一种方法是采用纤维固定技术将p g a 纤维网嵌入到p l a 中：先将p g a 和p l a 的混合物加热到两种聚合物的熔点以上，p l a 首先熔融，充满p g a 纤维网络所 有孔洞。p l a 的作用是稳定p g a 纤维和防止p g a 开始熔融时纤维网络结构塌 陷。经一定的热处理，交叉点的p g a 纤维熔融后物理结合在一起，选定一种只 能溶解p l a 的溶剂将其溶解，即可得到多孔网状结构。采用这种技术制得的多 孔网状结构的孔隙率和孔直径分别高达8 1 和5 0 0p a n 。第二种方法是通过喷雾 对纤维表面进行涂层，将p l a 或p g a 溶解于c h c l 3 中，将溶液以雾状喷涂到 p g a 纤维网表面。由于p g a 在c h c l 3 中的溶解性较差，在这一过程中纤维形态 基本保持不变。溶剂挥发后形成涂层。这种复合结构综合了纤维的力学性能和 p l a 的表面特性，但孔的尺寸与前一种方法制备的粘结纤维的孔尺寸相近。 1 1 3 致孔剂法 由m i k o s 等作为纤维粘结法的改进而提出的一种多孔支架制备方法，能够 制备出高孔隙率、高比表面积、孔隙尺寸和材料结晶度可控的组织工程用多孔 支架。该技术使用一定粒径分布的氯化钠、糖类晶体、石蜡微球等作为致孔剂， 2 武汉理工大学硕士学位论文 可制备p l a 、p g a 等可溶于有机溶剂( 如c h c l 3 和c h 2 c 1 2 ) 的高分子聚合物 多孔支架。 石蜡微球作为致孔剂的p l a 支架制备过程如下：首先通过悬浮分散法制备 尺寸不一的石蜡微球颗粒，经筛分获得所需粒度范围的石蜡微球颗粒，将石蜡 颗粒均匀地分散在p l l a 的氯仿溶液中，然后浇铸在适当的模具中，待大量氯 仿挥发后，真空干燥去除混合物中的残余溶剂，即可获得干燥的p l l a 石蜡微 球复合物。用正己烷浸出复合物中的石蜡微球，真空干燥后，即可获得p l l a 多孔支架。溶剂浇注粒子沥滤法制备的多孔支架孔隙率可达9 1 9 3 。 1 1 4 熔融成型法 该技术与粒子滤出类似，但不使用有机溶剂，所制备的支架可用于生物活 性分子的控制释放；并且可以构造结构复杂的三维骨架。如将p l g a 粉末与明 胶粒子混合物放在聚四氟乙烯模具中，将模具加热到超过p l g a 的玻璃化温度， 加压使p l g a 和明胶粒子结合在一起。冷却后将复合物放入水中，明胶粒子溶 解后得到p l g a 骨架。可通过改变明胶粒子的大小和明胶p l g a 的比例来对孔 结构加以控制。 1 1 5 相分离法 相分离是一个多组分均相系统，在特定的条件下会从稳态变成热力学非稳 态，从而趋向于分离成多相系统以降低系统自由能。相分离过程最早用于制各 多孔膜，可分为溶致相分离( s o l v e n ti n d u c e dp h a s es e p a r a t i o n ，s i p s ) 和热致相分离 ( t h e r m a l l yi n d u c e dp h a s es e p a r a t i o n ，t i p s ) 两种方法。s i p s 法是通过将聚合物溶 液( 聚合物为分散相) 浇铸成型后在非溶剂的作用下发生相转换( 转为聚合物 为连续相) ，去除溶剂和非溶剂而形成多孔膜。但是由于许多结晶的高分子材 料在室温下没有合适的溶剂，s i p s 法的应用受到限制。而t 口s 法是通过温度改 变来驱动相分离，可以制各热塑性、结晶性高分子材料多孔支架。 t i p s 是将较高温度的均相聚合物溶液置于低温环境发生相分离，即出现相 分离微区，形成聚合物富集相和聚合物贫集相。此液一液相分离聚合物溶液经冷 冻干燥去除溶剂可得到具有微孔结构的支架。溶液的冷却条件对所制备支架的 形态起着至关重要的作用。在临界温度( 或所用的多分散性聚合物的浊点) 以 3 武汉理工大学硕士学位论文 下，通过成核和生长机理形成相分离；在更低的温度( 相图上低于亚稳态曲线) 下，通过旋节线分解机理导致相分离。由成核和生长机理进行相分离可得到孔 隙为彼此分离球形的孔结构；由旋节线分解机理进行相分离则得到内部连通的 圆柱形孔结构。 对于组织工程支架，涉及相分离的方法包括乳化冷冻干燥、液一液相分离和 固液相分离。w a n g 首先采用乳化- 冷冻干燥制备出了多孔支架，先将p l g a 溶 于c h 2 c b 后，加入蒸馏水形成乳状液，再将聚合物水混合物浇铸到模具中，置 于液氮中骤冷。然后将支架于5 5 下冷冻干燥，真空蒸发掉水和有机溶剂而获 得多孔支架。采用该技术制备的支架孔隙率高达9 5 ，但形成孔的直径很小 ( 1 3 3 5 肛m ) 。孔隙率和孔直径的大小主要取决于聚合物溶液水的相对比例以 及乳状液的粘度，因为这些参数在骤冷之前可影响乳状液的稳定性。因此，对 这些参数进行调控，可望提高孔的尺寸。 液液相分离是将聚合物溶于低熔点易挥发的溶剂中，如萘、1 ，4 二氧六 环，或四氢呋喃，再加入少量水作为非溶剂形成相分离。聚合物溶液在低于溶 剂的熔点下冷却，真空干燥，使溶剂挥发完全获得聚合物多孔支架。固液相分 离不需要加入非溶剂，该法将聚合物溶于溶剂中，然后降低温度使溶剂在聚合 物溶液中结晶，再使溶剂升华或者被其它溶剂交换而形成多孔支架。 t e m p t s - a i m 争 图1 1 单组分系统三相图的示意图 f i g l - 1 t e r n a r yp h a s ed i a g r a mo fs i n g l ec o m p o n e n ts y s t e m 相分离过程一般与冷冻干燥过程联合使用。冷冻干燥的原理如图1 1 所示， 在普通的相变条件下，物质从固态溶化成为液态，再经过蒸发成为气态。而当 4 嚣氩_以复嚣攀群和。氛 飘 武汉理工大学硕士学位论文 压力低于三相点o 对应压力p o 即达到一定真空度时，物质不经过液态，直接从 固态升华到气态。 对于采用相分离过程制备的多孔支架，在成为多孔支架前样品中含有聚合 物和溶剂( 有时还有非溶剂) ，如果以普通方式比如溶剂挥发来去除溶剂，由于 溶剂从固态经液态到气态，不可避免会造成聚合物溶解而使支架软化变形；但 是如果在一定真空度下进行冷冻干燥，由于溶剂直接升华，聚合物不会发生溶 解，支架就会把冷冻时的形态保持到制备完成。 冷冻干燥法制备多孔支架的缺点是制备时间过长。最近，h o 2 7 】等人提出了 一种用冷冻萃取来代替冷冻干燥以加快多孔支架制备的方法：将p l l a 溶解于1 ， 4 二氧六环然后冷冻至2 0 ，再将冷冻的聚合物溶液放入已预冻到一2 0 的乙醇 水混合溶液中，利用1 ，4 二氧六环与乙醇和水的溶解性萃取出聚合物溶液中 的二氧六环，再常温干燥去除乙醇和水溶液以制得p l l a 多孔支架。制备的p l l a 多孔支架孔隙率大于8 0 ，孔径在6 0 一1 5 0 岬之间。多孔支架的结构形态与一般 冷冻干燥法制备的聚乳酸多孔支架无明显差异。 综上所述，各制备方法的优缺点如表1 1 【2 8 】所示。 表1 1 支架材料制备方法的比较 t a b l e1 1c o m p a r i s o no fd i f f e r e n tm e t h o d st of a b r i c a t es c a f f o l dm a t e r i a l 5 武汉理工大学硕士学位论文 1 2 热致相分离溶剂浇铸粒子沥滤法 在组织工程研究中细胞支架材料起中心作用，它不仅为特定的细胞提供结 构支撑作用，而且还起到模板的作用，引导组织再生和控制组织结构。寻找能 充分发挥组织再生潜力的细胞外基质材料支架是组织工程研究的核心内容。支 架材料不仅影响细胞的生物学行为和培养效率，而且决定复合物移植后能否与 机体很好的适应、结合，是限制组织工程能否真正应用于临床的一个关键因素。 组织工程用支架材料需要具备以下条件： ( 1 ) 较好的生物相容性； ( 2 ) 材料表面结构及性质有利于细胞吸附、增殖和分化； ( 3 ) 按可控制的速度进行降解； ( 4 ) 具有三维多孔结构，孔隙率最好达到9 0 以上，孔径至少5 01 t m 以上，控制 在1 0 0 5 0 0l , t m 最好： ( 5 ) 易加工成不规则的几何形态； ( 6 ) 具有一定的机械强度能支持生理压力； ( 7 ) 能够提供一定的养分，满足组织细胞的生长需求。 聚乳酸( p l l a ) 是组织工程中常用的支架备选材料，也是美国食品药品 管理局( f d a ) 许可的可进行临床应用的生物可降解高聚物之一。在体内降解 生成乳酸，是糖的代谢产物，与胶原壳聚糖等可降解高聚物相比，有较好的力 学性能，非常适合用作组织工程支架材料。由表1 1 可知，为了得到孔径可控、 高孔隙率的p l a 支架材料，可考虑采用溶剂浇铸粒子沥滤法和相分离法相结合 制备支架材料。 溶剂浇铸粒子沥滤法和相分离法对实验设备和实验条件要求较低，工艺参 数容易调整和控制，已成为组织工程用多孔支架的常用制备技术。溶剂浇铸粒 子沥滤法可通过控制致孔剂的形态、大小以及致孔剂与聚合物材料的比例来调 节支架的孔径和孔隙率。但这种方法不适合用于制备大体积的支架，孔隙间连 通性差；采用热致相分离法获得的多孔支架材料具有良好的孔连通性，但孔径 不易控制。采用溶剂浇铸粒子沥滤法和热致相分离相结合的方法制备组织工程 用多孔支架材料，结合了两种方法的优点，通过改变致孔剂颗粒的大小来控制 6 武汉理工大学硕士学位论文 材料的孔径大小，并通过相分离法形成的微孔保持孔与孔之间支架的连通性。 通过此法制备的支架材料的孔隙率可以高达9 0 以上，且孔的分布均匀，结构 大小可控。 热致相分离溶剂浇铸粒子滤出法制备支架材料，致孔剂的使用非常关键。 目前，常用的致孔剂2 9 。1 1 有无机致孔剂( 包括氯化钠、碳酸氢铵和冰粒子等) 与有机致孔剂( 烃、糖类和石蜡等) 。 ( 1 ) 氯化钠( n a c l ) m u r p h y 等人【3 2 1 利用氯化钠的吸潮性，预先将作为致孔剂的氯化钠粘结、干 燥成型，再通过溶剂浇铸粒子沥滤技术，制备出孔隙问相互连通、其连通通道 的尺寸可以通过粘结条件控制的多孔三维细胞支架。 l i a o 等人【” 采用粉状的高分子聚合物( p l g a ) 与致孔剂( 氯化钠) 混合均 匀，置于模具中抽至一定真空度，在压力差的驱动下用有机溶剂溶解模具中聚 合物，形成聚合物溶液与致孔剂的混合物。用不能溶解聚合物的溶剂固化和沉 积聚合物后，用去离子水浸出固化混合物中的氯化钠。真空干燥后即可获得孔 隙率为8 7 的三维多孔支架。 ( 2 ) 碳酸氢铵( a m m o n i u mb i c a r b o n a t e ) n a m 等人【3 禾3 6 1 使用n h 4 h c 0 3 为发泡剂和致孔剂，用含有气体发泡过程的方 法制备了多孔支架：将选定粒径的n h 4 h c 0 3 与p l l a 或p l g a 溶液混合均匀后， 置于模具中通过发泡获得大体积三维支架。发泡法包括真空干燥发泡法和热水 溶液诱导发泡法。真空干燥发泡是在常温、常压下挥发掉混合物中的有机溶剂 后，于高真空度下室温发泡2 周，然后在温水中( 4 0 ) 浸取出残余的n h 4 h c 0 3 ， 最终低温冷冻干燥后获得三维支架；热水溶液诱导发泡则是在常温、常压下挥 发掉混合物中的部分有机溶剂后，将半固态的混合物置于9 0 的热水( 或柠檬 酸溶液) 诱导发泡，用去离子水洗涤残余n h 4 h c 0 3 后再低温冷冻干燥。 ( 3 ) 冰粒子( i c e ) c h e r t 等人【3 7 , 3 8 1 用冰粒子作为造孔粒子制备了多孔支架：首先用毛细管将水 滴到液氮中得到冰晶粒，然后配制p l l a 或p l g a 的氯仿溶液，将一定量的冰 晶粒加到预冷( 2 0 ) 的p l l a 或p l g a 溶液中，将此分散体系置于液氮中冷 冻干燥4 8h ，再于室温下干燥4 8h 去除溶剂，得到不同孔隙率，具有连通孔结 构的多孔支架材料。 ( 4 ) 烃( h y d r o c a r b o n ) 7 武汉理工大学硕士学位论文 s h a s t r i 等人【3 9 】将固态烃类致孔剂与p l l a 或p l g a 的溶液( 二氯甲烷或二 氯甲烷溶液) 制备成均匀的混合物，置于模具中成型，利用正戊烷或正己烷等 有机溶剂浸溶出固态烃类致孔剂，同时使混合物中的p l l a 或p l g a 沉积固化， 形成多孔三维支架。该方法制备出的多孔支架孔隙率8 7 ，孔径大于1 0 0 岬， 厚度可达2 5c m 。 ( 5 ) 糖类( s u g a r ) h o l y 等人利用葡萄糖( 9 1 u c o s e ) 制备了p l g a 多孔支架：首先将葡萄糖加 入p l g a 的二甲亚砜溶液中，然后用含有炭黑丁苯胶的去离子水去除葡萄糖， 最后干燥7 2 h 至恒重而获得p l g a 多孔支架。 z h a n g 等人f 4 l 】也用糖( s u g a r ) s t 备了p l l a 多孔支架：首先将所需粒径的糖粒 子放入聚四氟乙烯模具中，用薄板压平表面后加热到5 0 ，然后滴入p l l a 的 四氢呋喃溶液，在冰箱中冻为凝胶。然后将凝胶- 糖粒子的混合物放入水中以去 除糖和溶剂。再将凝胶从水中取出并以滤纸吸除水分，在2 0 的冰箱中保持至 少2h 以保证凝胶完全冻结，最终通过冷冻干燥制备出多孔支架材料。 ( 6 ) 石蜡( p a r a f f i n ) m apx 等人【4 2 】利用石蜡微球为致孔剂，在3 3 3 4 c 的烘箱中，将石蜡微球 粘结成型，浇铸p l l a 的吡啶溶液，真空干燥后用环己烷和正己烷浸取出石蜡。 获得孔隙率高达9 6 、孔隙间相互连通、孔径尺寸可控制的三维支架。 m azw 等人f 4 3 】同样用石蜡制备了聚乳酸多孔支架：首先采用悬浮分散法制 备了石蜡微球，然后将石蜡微球与p l l a 的二氧六环溶液混合均匀，在2 5 冷 冻后冷冻干燥以去除二氧六环，再将混合物用正己烷提取石蜡微球，最后真空 干燥获得多孔支架。 在保持原始的溶剂浇铸粒子沥滤技术孔隙特征可控特点的基础上，不同致 孔剂制备多孔支架各有自己的特点，如表1 2 。从孔隙形态上来说，冰粒子和石 蜡为致孔剂制备的支架孔隙成球形，具有良好的孔隙形态；从孔连通度上来说， 石蜡制备的多孔支架孔隙连通度良好；从支架制备速度上来说，碳酸氢铵为致 孔剂可以在很短时间内制备支架，而大部分致孔剂制备多孔支架所需时间较长； 从致；l 齐u 残留上来说，冰粒子为致孔剂制备的多孔支架无致孔剂残留，氯化钠、 烃等有较明显的致孔剂残留；从有机溶剂的使用来说，烃和石蜡为致孑l 剂制备 支架需要有机溶剂进行粒子沥滤。从制备过程上说，石蜡作为致孔剂的整个过 程都避免了与水的接触，而氯化钠、冰粒子等在制备或滤出过程中都有与水的 8 武汉理工大学硕士学位论文 接触。因此，石蜡颗粒作致孔剂更加适合释氧型支架材料的制备。 表1 2 不同致孔剂制备方法上的差异 t a b l e1 - 2t h ed i f f e r e n c eo fd i f f e r e n tp o r o g e np r e p a r a t i o nm e t h o d s 1 3 论文选题的目的和意义 氧是细胞成活和调节细胞代谢的重要因素。无血管供应的软骨为缺氧组织， 因此，除软骨细胞可以在低氧环境中存活以外，人体( 包括动物) 内的其它所 有的细胞都依赖于氧。氧进入肺泡后，通过呼吸膜的弥散作用而进入血液，依 靠血液中红细胞内血红蛋白的携带，由血液通过血管网络循环运输到全身的组 织中，以供细胞代谢的需要。因此，适当的血管化对组织来说是必须的。 组织工程是将具有相关功能的自体原代细胞或干细胞种植到生物相容性好 的可降解支架材料上进行复合培养以形成组织替代物的复合物，再将复合物移 植到体内以修复人体缺损或功能衰竭的组织。正常细胞培养时，氧的浓度高于 9 武汉理工大学硕士学位论文 体内的浓度，而当将该细胞支架复合体植入到组织损伤后，由于植入体部位血 管化速度非常慢，1 0c m 厚的支架需要几个星期才能形成血管，细胞突然承受体 内低氧浓度环境而导致死亡。有文献，4 5 报道一定数量的氧可以促进细胞的存活 及血管的形成，过量的氧则起反作用。另一方面，人工骨修复长段骨缺损时常 因两端血管不能爬行对接，骨细胞因缺乏氧气和营养物质及代谢产物无法得到 交换而不能长入人工骨内部而导致失败。因此，具有释氧功能的支架材料有望 解决这些问题。 p l l a 作为组织工程支架材料，仍存在诸多的缺点：降解会造成局部p h 降 低，引起炎性反应；降解速度太快导致材料力学性能下降；疏水性导致其与细 胞的亲和性较差，这些缺点影响了p l l a 的临床应用。 为了解决上述问题，本文拟制备具有持续释氧性、孔径可控、高孔隙率， 良好生物相容性、生物降解性能、生物活性和亲水性的支架材料。为此，本论 文拟通过使过氧化物与聚乳酸复合使其在细胞复合培养过程中或植入到体内后 可以持续释放氧气，在缺氧部位满足细胞新陈代谢的需要。过氧化物均匀分散 在支架的聚合物中，可改善聚合物的机械性能，而被包裹的过氧化物可随聚合 物的降解缓慢释放氧气，释氧后的碱性水化产物可以中和聚合物降解所产生的 酸性产物。一方面，采用非离子表面活性剂调整相分离的过程和孔壁间的孔径 大小，使所得的支架材料表面具有良好的亲水性，有利于细胞的粘附和生长； 另一方面，添加少量无水磷酸氢盐中和部分碱性水化产物并调节聚合物的降解 速度，以形成磷灰石，改善p l l a 的生物相容性，提高其生物活性，促进细胞 的粘附、增殖、迁移和生长。 1 4 论文研究的主要内容 本文是结合当前组织工程支架材料的发展趋势及骨缺损修复材料目前存在 的基本科学问题及本中心的研究方向，在导师指导下确定的研究课题。旨在开 发一种释氧型支架材料，为设计新型组织工程支架材料及骨修复材料提供依据。 经查新，确认目前国内外无类似研究工作，从而确立了本课题的创新性。 研究工作将以热致相分离法为基础，对致孔剂的选择、冷冻干燥的工艺过 程进行系统研究，制备出具有释氧性能、孔径合适、亲水性好、孔径可控、孔 隙率高、孔连通性好的多孔无机，有机复合支架材料。论文的主要研究内容如下： 10 武汉理工大学硕士学位论文 ( 1 ) 聚乳酸多孔支架的制备。以p l u r o n i cf 1 2 7 作为扩孔剂，以热致相分离 法为基础，采用石蜡颗粒作为致孔剂，探索聚乳酸多孔支架制备方法的改进和 创新。 ( 2 ) 影响支架结构特性的因素的研究。通过选择不同尺寸的致孔剂，定量 表征不同工艺条件对聚乳酸多孔支架形态特征( 孔隙率、孔隙大小、孔连通性) 的影响。 ( 3 ) 释氧型多孔支架的研究。改进聚乳酸多孔支架的制备工艺，通过加入 一定量的无机物，使其能够制备出无机有机复合多孔支架，并研究不同过氧化 物和d c p a 的加入量对支架材料释氧量、释氧速度、释氧时间、降解性等性能 的影响。 ( 4 ) 降解过程中p h 值的变化。通过改变过氧化物和d c p a 的百分比，制 备出p h 值稳定的多孔支架。 ( 5 ) 多孔支架材料力学性能的研究。通过改变过氧化物和d c p a 的的加入 比例，制备出抗压强度和弹性模量较高的多孔支架。 武汉理工大学硕士学位论文 第二章释氧型复合支架材料的制备 组织工程多孔支架的制备是组织工程的核心问题之一，目前已经开展了一 些制备方法方面的研究。对于聚乳酸多孔支架，常用的方法是采用溶液浇铸- 粒 子沥滤技术，尤其是各种不同致孔剂的应用，使该方法的应用有了一些新的进 展。研究发现，冰粒子和石蜡颗粒是两种非常有特色的致孔剂。c h e r t 等人采用 冰粒子作为致孔剂制备了聚乳酸多孔支架。但是，上述研究工作还必须解决一 些关键问题，如：以石蜡颗粒作为致孔剂制备聚乳酸多孔支架时，必须解决致 孔剂是否残留的问题；而采用冰粒子作为致孔剂制备的聚乳酸多孔支架，虽直 观地被认为无致孔剂残留，但是至今尚无研究者对这一关键问题给出有效的试 验证明或理论分析。同时，采用该方法制备的聚乳酸多孔支架孑l 隙大小尚无法 控制。另外，由于采用冷冻干燥过程去除1 ，4 一二氧六环，整个过程中，制备时 间过长，冰粒子会升华成水蒸汽，会使过氧化物分解。从而失去了支架材料释 氧的目的，将限制该方法的实际应用。 本章以溶剂浇铸粒子沥滤技术作为基本方法，采用石蜡颗粒为致孔剂来制 备多孔复合支架，在此基础上研究如何充分解决上述问题。 2 1 热致相分离法制备释氧型多孔支架材料 2 1 1 原材料的选择与实验设备 表2 1 实验原材料 t a b l e 2 1e x p e r i m e n t a lm a t e r i a l s 1 2 武汉理工大学硕士学位论文 表2 - 2 实验设备 t a b l e2 - 2e x p e r i m e n t a le q u i p m e n t 2 1 2 实验流程 热致相分离法( t h e r m a li n d u c e dp h a s es e p a r a t i o n ，t i p s ) f 1 t j 备步骤如下：量取 1 0 m l1 ，4 二氧六环或四氢呋喃，加入表面活性剂p f l 2 7 ，表面活性剂与溶液的 重量体积比为3 ( w v ) 。在超声振荡器中超声1 5m i n ，使其均匀分散在有机 溶剂中，形成透明状的混合溶液，然后在该溶液中加入过氧化物和d c p a ，超声 1 3 武汉理工大学硕士学位论文 振荡，分散成均匀的悬浮液。 将p d l l a 按重量体积比为1 1 0 的比例溶解于上述悬浮液中。充分搅拌 至均匀，形成有机无机混合悬浮体，然后倒入模具中制各样品，将样品和模具 一起放在空气中粗化3h ，置入7 0 制冷机中冷冻1 2h ，进行相分离。将样品 取出，在5 0 的条件下冷冻干燥，去除有机溶剂1 ，4 二氧六环或四氢呋哺， 最终获得聚乳酸多孔支架。 图2 1 热致相分离法制备多孔支架材料 f i g 2 1f l o w c h a r tf o rp r e p a r i n gs c a f f o l d sb ys i m p l ep h a s es e p o r a t i o n 1 4 武汉理工大学硕士学位论文 2 2 热致相分离溶剂浇铸粒子沥滤制备释氧型多孔支架 2 2 1 聚乙烯醇溶液的配制 ( 1 ) 称取2 0g 聚乙烯醇( 絮状) ； ( 2 ) 量取4 0 0 m l 无水乙醇； ( 3 ) 将聚乙烯醇浸泡在无水乙醇中3h 以上，使聚乙烯醇的表面得到完全湿润； ( 4 )在上述混合物中加入1 0 0 0m l 蒸馏水，