（麻醉学专业论文）不同方法控制性降压对大鼠认知功能的影响.pdf

目录 秽 一、摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要3 二、英文缩略语6 三、论文 前言7月u 昌。7 材料与方法8 实验结果1 4 讨论1 7 结论2 0 四、本研究创新性的自我评价2 1 五、参考文献2 2 六、附录 综述j 2 5 在学期间科研成绩3 8 致谢3 9 个人简介4 0 中文论著摘要 不同方法控制性降压对大鼠认知功能的影响 目的 观察不同方法控制性降压对大鼠脑海马a 8 、s 1 0 0 b 表达和学习记忆的影响， 研究围术期控制性降压对术后认知功能障碍的影响和可能机制。 方法 运用y - 型电迷宫测试，记录大鼠训练后测试正确反应率( r i g h tn u m b e r ，r n ) 和全天总反应时i n ( t o t a lr e a c t i o nt i m e ，t r t ) ，计算其均值，筛选学习记忆功能正 常的雄性s d 大鼠1 2 8 只。随机分为四组：对照组( a 组) ，异氟烷i 组( b 组) ， 异氟烷i i 组( c 组) ，异氟烷+ 硝普钠组( d 组) ，每组3 2 只大鼠。分四个时间点： 麻醉后即刻( a 组为麻醉前) 、麻醉后1 、3 、7 天，以下标0 、1 、3 、7 表示，各 取8 只大鼠。上述四组分别于行水合氯醛腹腔注射麻醉后，套管针气管插管，动 物呼吸机控制呼吸，使用动物无创血压测试仪监测大鼠尾动脉血压，待血压稳定 2 0 分钟( m i n ) 后开始降压。a 组不做降压处理，采用0 9 氯化钠注射液连续泵 注；b 组0 9 氯化钠连续泵注，1 1 5 异氟烷吸入麻醉，血压维持在大鼠正常 生理范围，持续4 小时( h ) ，麻醉后即抽取动脉血0 6 m l 行血气分析；c 组0 9 氯化钠连续泵注，3 4 异氟烷吸入1 0 - - - 1 5 m i n 达到目标血压，即m a p5 0 m m h g ， 控制性降压持续4h ，降压结束后即抽取动脉血0 6 m l 行血气分析；d 组0 9 氯 化钠液配制成4 0 0 l - tg m l 硝普钠( s n p ) ，1 - 1 5 异氟烷吸入麻醉，1 0 - - - 1 5 m i n 达到目标血压，即m a p 5 0 m m h g ，降压过即程中根据血压变化调整泵速，控 制性降压持续4h ，降压结束后即抽取动脉血0 6 m l 行血气分析。上述四组采用 白炽灯直接照射大鼠，保持肛温3 7 0 士o 5 。控制性降压组术后即刻断颈取 脑海马组织( n = 8 ) 、控制性降压术后1 ( n = 8 ) 、3 ( n = 8 ) 、7 ( n = 8 ) 天利用y 迷 宫进行认知功能的测定，测试后各时间点随机取4 只大鼠断颈取脑海马组织7 0 冻存，采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验，检测海马内a 8 抗体表达水平；4 只以4 多聚甲醛1 5 0 - - 2 0 0 m l 灌注固定后颈取脑海马组织，采用免疫组化观察 s 1 0 0 1 3 免疫反应阳性细胞表达并进行阳性细胞计数。 结果 麻醉前四组大鼠生理指标和学习记忆功能组间无显著性。麻醉后1 天正确 反应次数为：b 1 1 2 4 3 4 - 3 2 9 次、c 1 8 3 9 4 - 2 8 7 次、d 1 1 0 8 9 4 - 3 6 5 次，小于a 1 组 1 3 6 4 4 - 2 7 6 次；全天总反应时间为：b 1 7 4 8 3 4 - 4 4 3 7 秒、c 1 9 3 3 8 4 - 5 1 3 5 秒、 d 1 8 1 4 14 - 4 3 2 4 秒，大于a 1 6 8 4 2 _ + 3 3 2 7 秒。麻醉后3 天、7 天四组问正确反应 次数和全天总反应时间无显著差异。麻醉后即刻a 8 抗体：c o o 0 9 7 4 - 0 0 0 4 5 ， 明显高于b 0 0 0 7 2 0 0 0 7 3 、d o o 0 7 4 4 - 0 0 0 5 5 、a 0 0 0 6 8 4 - 0 0 0 6 2 ：麻醉后1 天a b 抗体c 1 0 0 9 84 - 0 0 0 7 5 ，明显高于a 1 0 0 6 6 + _ 0 0 0 6 9 、b 1 0 0 7 34 - 0 0 0 5 2 、d 1 0 0 7 5 0 0 0 5 7 ，差异有非常显著性，a l 、b l 、d 1 组间无显著差异( p 0 0 5 ) ；麻醉后3 天、7 天四组a b 抗体组间无显著差异。麻醉后即刻c o 组大鼠海马各区s 1 0 0 8 阳性细胞均明显增多，密度高于、b o 、d o 组，差异有非常显著性，、b o 、 d o 组密度无显著差异；麻醉后1 天c 1 组海马各区s 1 0 0 1 3 阳性细胞均明显增多， 密度明显高于a 1 、b l 、d 1 组，差异有非常显著性，a l 、b 1 、d 1 组间无显著差异 ( p 0 0 5 ) ；麻醉后3 天、7 天b 、c 、d 组海马各区s 1 0 0 1 3 阳性细胞密度降低， 四组间无显著差异。 结论：口己 1 以单纯吸入3 - 4 异氟烷4 小时控制性降压，影响大鼠脑海马a b 及s 1 0 0 1 3 的表达水平，对其认知功能产生一定影响。 2 异氟烷+ 硝普钠用于控制性降压安全可行，对大鼠认知功能没有明显影 响。 关键词 大鼠；控制性降压；异氟烷；认知功能障碍；y - 型电迷宫；a 8 ；s 1 0 0 b 2 英文论著摘要 d i f f e r e n tm e t h o d so fc o n t r o l l e dh y p o t e n s i o no n c o g n i t i v ef u n c t i o ni nr a t s o h ie c t i v e t oo b s e r v et h ee f f e c t so fd i f f e r e n tm e t h o d so fc o n t r o l l e dh y p o t e n s i o no nt h e a b i l i t yo fl e a r n i n ga n dm e m o f y a n dt h ee x p r e s s i o no fa ba n ds 一1 0 0 bo nh i p p o c a m p u s i nr a t s ，s t u d yt h ee f f e c t sa n dm e c h a n i s m so fp e r i o p e r a t i v ec o n t r o l l e dh y p o t e n s i o no n p o s t o p e r a t i v ec o g n i t i v ed y s f u n c t i o n m e t h o d s w er e c o r d e dt h ef i g h tn u m b e r ( r n ) a n dt o t a lr e a c t i o nt i m e ( t r t ) o ft h er a t sa f t e r t r a i n i n gw i t hy - t y p em a z e ，t h e na c c o r d i n gt ot h ea v e r a g ew es e l e c t e d1 2 8m a l es d r a t sw i t hn o r m a ll e a r n i n ga n dm e m o r yf u n c t i o n ，w h i c hw e r er a n d o m l yd i v i d e di n t o f o u rg r o u p s ：c o n t r o lg r o u p ( g r o u pa ) ；i s o f l u r a n eg r o u p i ( g r o u pb ) ；i s o f l u r a n eg r o u p i i ( g r o u pc ) ；s n pa n di s o f l u r a n eg r o u p ( g r o u pd ) ；e a c hg r o u pc o n t a i n e d3 2r a t s w e t o o kf o u rp o i n t si ne a c hg r o u p ：r i g h ta f t e ra n e s t h e s i a ( b e f o r ea n e s t h e s i ai ng r o u pa ) ，1 ， 3 ，7d a y sa f t e ra n e s t h e s i a ，a n d8r a t sf o re a c hp o i n t a f t e ra n e s t h e s i ai n d u c t i o nw i t h c h l o r a lh y d r a t ei n j e c t e dp e r i t o n e a l l ya l lg r o u p sw e r ei n t u b a t e dt r o c a ra n da n i m a l v e n t i l a t o rc o n t r o lv e n t i l a t i o n ，t h e nm o n i t o r e dt a i la r t e r i a lb l o o dp r e s s u r es h o w e do n a n i m a ln o n i n v a s i v eb l o o dp r e s s u r et e s t e r c hb e g a nt op e r f o r m e n c ea f t e rb l o o d p r e s s u r es t a b l e d2 0m i n u t e sl a t e r i ng r o u pa r a t sw e r ec o n t i n u o u s l yp u m p e dw i t h 0 9 n a c lw i t h o u tc ht r e a t m e n t ；i ng r o u pb ，0 6 m la r t e r i a lb l o o dw a sc o l l e c t e df o r b l o o dg a sa n a l y s i sr i g h ta f t e ra n e s t h e s i a ，t h e nr a t sw e r ec o n t i n u o u s l yp u m p e dw i t h 0 9 n a c la n du n d e r1t o1 5 i s o f l u r a n ei n h a l a t i o nt om a i n t a i nb l o o dp r e s s u r ea t n o r m a lp h y s i o l o g i c a lr a n g ef o r4h o u r s ( h ) ；i ng r o u pc ，r a t sw e r ec o n t i n u o u s l y p u m p e dw i t ho 9 n a c la n du n d e r3t o4 i s o f l u r a n ei n h a l a t i o n 1 0 1 5 m i nl a t e r 3 r e a c h e dt a r g e tb l o o dp r e s s u r eo fm a p5 0 m m h ga n dm a i n t a i n e d4 h ，t h e n0 6 m l a r t e r i a lb l o o dp r e s s u r ec o l l e c t e df o rg a sa n a l y s i s ；i ng r o u pd ，r a t sw e r ec o n t i n u o u s l y p u m p e dw i t h4 0 0 z g m ls o d i u mn i t r o p r u s s i d e ( s n p ) p r e p a r e df r o m0 9 n a c la n d u n d e r1 1 5 i s o f l u r a n ei n h a l a t i o n ，1 0 1 5 m i nl a t e rr e a c h e dt ot a r g e tb l o o d p r e s s u r eo fm a p5 0 m m h g ，d u r i n gt h ep r o c e s sa d j u s t i n gt h ep u m ps p e e da c c o r d i n gt o b l o o dp r e s s u r e ，4hl a t e r0 6 m la r t e r i a lb l o o dp r e s s u r ew a sc o l l e c t e df o rg a sa n a l y s i s a l lt h ef o u rg r o u p se x p o s u r e di ni n c a n d e s c e n tl a m p sa n dm a i n t a i n e dr e c t a l t e m p e r a t u r ea t3 7 0 0 5 w eb r o k e nt h en e c k so f8r a t s ( n = 8 ) o fe a c hc hg r o u pt o g e th i p p o c a m p u si m m e d i a t e l yp o s t o p e r a t i v e l y , a n dt e s to t h e r sc o g n i t i v ef u n c t i o nw i t h ym a z e1 ( n = 8 ) ，3 ( n = 8 ) ，7 ( n = 8 ) d a y sp o s t o p e r a t i v e l y , t h e nb r o k e nn e c ko f4r a t s r a n d o m l yp i c k e da t4m e n t i o n e dt i m ep o i n t st og e th i p p o c a m p u st i s s u e ，w h i c h f r o z e n e di n - 7 0 f o ra 8e x p r e s s i o nl e v e ld e t e c tb yd o u b l ea n t i b o d ys a n d w i c h e n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y a f t e r1 5 0 - 2 0 0m l4 p a r a f o r m a l d e h y d ef i x e d ， h i p p o c a m p u sf r o mt h eo t h e r4r a t sw e r eu s e df o ro b s e r v a t i o np o s i t i v es - 1 0 0 8 i m m u n o r e a c t i v ec e l lo fb yi m m u n oh i s t o c h e m i c a lt e s ta n dc o u n t i n gt h en u m b e r r e s u l t s t h e r ew a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e ng r o u p sa b o u tp h y s i o l o g i c a li n d e x a n dl e a r n i n ga n dm e m o r yf u n c t i o nb e f o r ea n e s t h e s i a t h en u m b e ro fc o r r e c t r e s p o n s e s1d a ya f t e ra n e s t h e s i aw a s ：g r o u pb l1 2 4 3 3 2 9t i m e s ，g r o u pc 1 8 3 9 土 2 8 7t i m e s ，g r o u pd 1 1 0 8 9 3 6 5t i m e s ，s m a l l e rt h a n1 3 6 44 - 2 7 6t i m e si ng r o u pa 1 ； 唧o fe a c hg r o u pw a s ：g r o u pb 1 7 4 8 3 4 4 3 7s e c o n d s g r o u pc 1 9 3 3 84 - 51 3 5 s e c o n d s ，g r o u pd 1 8 1 4 1 4 3 2 4s e c o n d s ，l o n g e rt h a n6 8 4 2 3 3 2 7s e c o n d so fg r o u p a 1 t h e r ew e r en os i g n i f i c a n td i f f e r e n c ea b o u tt h en u m b e ro fc o r r e c ta n d 唧 b e t w e e ng r o u p sa t3d a y so r7 d a y sa f t e ra n e s t h e s i a t h el e v e lo fa ba n t i b o d i e s r i g h ta f t e ra n e s t h e s i a ：g r o u pc o0 0 9 7 0 0 0 4 5 ，s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a n0 0 7 2 0 0 0 7 3i ng r o u pb 0 ，0 0 7 44 - 0 0 0 5 5i ng r o u pd oa n d0 0 6 84 - 0 0 0 6 2i ng r o u p ；a b a n t i b o d y1d a ya f t e ra n e s t h e s i ai ng r o u pc 1o f0 0 9 84 - 0 0 0 7 5w a sh i g h e rt h a ng r o u p a 1o f0 0 6 64 - 0 0 0 6 9 ，g r o u pb 1o f0 0 7 34 - 0 0 0 5 2a n dg r o u pd 1o f0 0 7 5 0 0 0 5 7 ， t h ed i f f e r e n c ew a ss i g n i f i c a n t ；t h e r ew e r en os i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e ng r o u p sa 1 ， 4 b 1a n dd 1 ( p 0 0 5 ) ；t h el e v e lo fa ba n t i b o d yw a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e n t h ef o u rg r o u p s3d a y so r7 d a y sa f t e ra n e s t h e s i a h i p p o c a m p u ss 一1 0 0 1 3p o s i t i v e c e l l sw e r es i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e di ng r o u pc or i g h ta f t e ra n e s t h e s i a ，h i g h e rt h a nt h a to f i ng r o u pa o ，b oa n dd o ，t h ed i f f e r e n c ew a ss i g n i f i c a n t ，a n dt h e r ew a sn od i f f e r e n c e s b e t w e e ng r o u pa o ，1 3 0a n dd o ；h i p p o c a r n p a ld i s t r i c ts 一1 0 0 8 - p o s i t i v ec e l l sw e r ea l s o s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e di ng r o u pc 1 1d a ya f t e ra n e s t h e s i a ，t h ed i f f e r e n c ew a s s i g n i f i c a n t ，t h e r ew a sn od i f f e r e n c e si ng r o u pa 1 ，b 1a n dd 1 ；( p 0 0 5 ) ；p o s i t i v ec e i l s d e c r e a s e di ng r o u pb ，ca n dd3d a y so r7d a y sa f t e ra n e s t h e s i aw i t hn os i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e sb e t w e e ng r o u p s c o n c l u s i o n s 1 i n h a l a t i o ni s o f l u r a n ea l o n ef o ral o n gt i m et oc o n t r o lh y p o t e n s i o nw o u l da f f e c t p o c da n dt h ee x p r e s s i o no fa ba n ds 1 0 0 1 3 ，w h i c hc o u l dr e t u mt on o r m a l3d a y s l a t e r 2 i s o f l u r a n ea n ds o d i u mn i t r o p r u s s i d ec a l lb es a f e l ya n df e a s i b l e l yu s e df o r c o n t r o l l e dh y p o t e n s i o n ，a n dt h e r ei sn os i g n i f i c a n te f f e c to np o c d k e vw o r d s r a t ；c o n t r o l l e dh y p o t e n s i o n ；i s o f l u r a n e ；c o g n i t i v ei m p a i r m e n t ；y - t y p ee l e c t r i cm a z e ； a s ；s 1 0 0 1 3 s 英文缩略语 6 论文 不同方法控制性降压对大鼠认知功能的影响 刖吾 控制性降压( c o n t r o l l e dh y p o t e n s i o n ，c h ) 是指采用降压药物或( 和) 一定 技术有目的降低血压，并根据手术需要控制降压程度和持续时间的方法。随着控 制性降压技术的成熟，在近代外科手术中应用日益广泛。但是不同的降压措施和 降压水平对生理产生非常复杂的影响，因此它对生命重要脏器影响的研究也在不 断深入。 硝普钠是控制性降压最常用药物。而异氟烷是临床常用吸入性麻醉药，在异 氟烷吸入麻醉时，由于周围血管阻力下降，会出现血压降低，且随吸入浓度的增 加，心排量明显减少，血压大幅度下降，临床根据这一特性常将其单纯或联合其 它降压药用于控制性降压。 b e d f o r d 【1 】于1 9 5 5 年首次报道部分老年患者全身麻醉后可出现类似痴呆现 象，逐渐引起了医患相关人员的重视，对其研究也越来越多。现将手术麻醉后数 天至数周出现的定向、思维、记忆力、精神集中能力、语言理解能力的受损，同 时伴有社会活动能力减退，称为术后认知功能障碍( p o s t o p e r a t i v ec o n g n i t i v e d y s f u n c t i o n ，p o c d ) 2 卅。有关研究探索术后认知功能障碍，应用最多的测试是 韦氏记忆量表和简易精神状态量表( m m s e ) ，也有作者选用瑞文测验、明尼苏达 多项人格调查表( m m p ) 、津医精神运动量表( j p b ) 等。近年来多研究的脑脊液或 血液内生化物质( 如a b 和a b 前体蛋白、载脂蛋白e 、t a u 蛋白等) 的变化，作 为p o c d 诊断的生物学标记。 以往对c h 研究多集中于降压过程中，而对降压后的学习记忆功能评价研究 较少。学习记忆属予脑的高级功能，它是高等动物和人类最具特色的生理特征之 一。国内外多采用建立条件反射的方法检测动物的行为和高级脑功能，其中y 型电迷宫法可同时观察动物的逃避条件反射能力、空间辨另i j 能力和评价其学习记 忆能力，因而在国内合理地运用y 型电迷宫对动物进行学习记忆能力测试和评 7 价。研究结果1 5 删显示c h ( m a p 5 0 6 0 m m h g ) 不会影响术后患者的认知功能。仅有 一两例1 9 】研究认为c h 可轻微影响术后脑功能。动物实验中，仅有少数观测了c h 术后脑功能情况【1 0 l 。但对于c h 所致学习记忆等高级神经功能生化物质变化和学 习记忆能力缺乏评价。因此我们选择检测大鼠海马内a b 抗体表达水平和观察 s 1 0 0 b 免疫反应阳性细胞表达作为评价认知功能的生物学标记，y 型电迷宫作 为学习记忆能力的观察指标，研究围术期控制性降压对术后认知功能障碍的影响 和可能机制。为寻求降低麻醉手术后认知功能障碍发生提供理论指导。 一、材料 材料和方法 1 主要试剂 试剂名称生产商 异氟烷雅培公司( 中国上海) 硝普钠北京双鹤现代医药技术有限责任公司 1 0 水合氯醛辽宁中医药大学自制 4 多聚甲醛辽宁中医药大学自制 抗大鼠s 1 0 0 1 3 蛋白抗体丹麦d a k o 公司 s a b c 免疫组化染色试剂盒武汉博士德生物工程有限公司 d a b 显色试剂盒武汉博士德生物工程有限公司 大鼠抗1 3 淀粉样蛋白抗体丹麦d a k o 公司 柠檬酸钠缓冲液( c b ，p h 6 0 ，1 0 0 0 m 1 ) ：柠檬酸三钠3 9 ，柠檬酸0 4 9 。 p b s 缓冲液：n a c i1 3 7 m m o l l ，k c i2 7 m m o l l ，n a 2 h p 0 44 3 m m o l l ， k h 2 p 0 41 4 m m o l l 。p h7 2 7 6 其他试剂均为国产分析纯 2 主要仪器设备 b p 6 动物无创血压监测仪 h x 3 0 0 动物呼吸机 d e a t e x o h m e d a 气体监测仪 成都泰盟科技有限公司 成都泰盟科技有限公司 d i v i s i o no ft h eb o c g r o u p ( 美国) 8 y 型电迷宫 m g 2 c 3 c 迷宫刺激器 全自动血气分析仪 c m l 8 5 0 冷冻切片机 静脉微量输液泵 电子天平 二、实验方法 张家港市生物医学仪器厂 张家港市青松生物医学仪器有限公司 美国g e 公司 德国l e i c a 北京思路高高科技发展有限公司 德国赛多利斯集团 1 实验动物筛选及分组 雄性1 4 月龄s d 大鼠，均订购于辽宁省中医药大学动物养殖中心，体重 3 2 5 - 3 7 5 9 。 1 1 筛选：将大鼠放人y 型电迷宫箱中适应3 5 m i n 后，给予适当电刺激，参 数是：延时5 s ：电流0 5 - - 0 7 m a ；电压5 0 v 一7 0 v 。达到大鼠对3 臂均探索进入为止， 选择活跃，对电击反应较敏感，逃避反应迅速者供测试用。淘汰反应过于迟钝或 特别敏感的大鼠。预选出达到连续2 次正确反应、电击次数3 次，对电击反应 较敏感的大鼠供实验用【1 1 , 1 2 】。在上述初步筛选的基础上，通过正式迷宫训练， 淘汰达不到学会标准( 以连续2 0 次测试中有1 8 次或以上、正确反应率 9 0 为达 学会标准【1 1 1 。) 的大鼠。 1 2 分组：筛选学习记忆功能正常的雄性s d 大鼠1 2 8 只。随机分为四组，每组 3 2 只大鼠，分四个时间点：麻醉后即刻( 对照组为麻醉前) 、麻醉后1 、3 、7 天， 各取8 只大鼠。 对照组( a 组) ：水合氯醛麻醉后不做降压处理，采用0 9 氯化钠注射液连 续泵注，最高泵速不超过3 5 m l h 。麻醉前、麻醉后1 、3 、7 天，分别记录为a o 、 a x 、a 3 、a 7 。 异氟烷i 组( b 组) ：0 9 氯化钠连续泵注，最高泵速不超过3 5 m l h 。1 1 5 异氟烷吸入麻醉，血压维持在大鼠正常生理范围，持续4 小时( h ) ，异氟烷吸 入麻醉停止即抽取动脉血0 6 m l 行血气分析。麻醉后即刻、麻醉后1 、3 、7 天， 分别记录为b o 、b l 、b 3 、b 7 。 异氟烷i i 组( c 组) ：0 9 氯化钠连续泵注，最高泵速不超过3 5 m l h 。3 - 4 异氟烷吸入1 0 - - 。1 5 m i n 达到目标血压，即m a p5 0 m m h g ，控制性降压持续4h ， 9 续4h ，降压结束后即刻抽取动脉血0 6 m l 行血气分析。麻醉后即刻、麻醉后1 、 3 、7 天，分别记录为d o 、d l 、d 3 、d 7 。 上述四组分别于行1 0 水合氯醛( 按3 5 m l k g 剂量) 腹腔注射麻醉后，套 管针气管插管，动物呼吸机控制呼吸，d e a t e x o h m e d a 气体监测仪分析气体浓度， 使用b p 6 动物无创血压监测仪，监测大鼠尾动脉血压，待血压稳定2 0 m i n 后开 始降压。以4 5 号头皮针大鼠尾静脉穿刺，连接静脉输液泵。采用白炽灯直接照 射大鼠，保持肛温3 7 0 士0 5 。控制性降压术后1 、3 、7 天利用y 迷宫进行 认知功能的测定。各时间点随机取4 只大鼠断颈取脑海马组织7 0 。c 冻存，采用 双抗体夹心酶联免疫吸附试验，检测海马内a b 抗体表达水平；4 只以4 多聚甲 醛1 5 0 - 2 0 0 m l 灌注固定后颈取脑海马组织，采用免疫组化观察s 1 0 0 1 3 免疫反应 阳性细胞表达并进行阳性细胞计数。 2 大鼠学习记忆功能的y 型电迷宫测试及观察指标 y - 型电迷宫也称三等分辐射式迷路箱，由等长的i 、i i 、个支臂和三者的 交界区组成。三臂间夹角均为1 2 0 。，臂长4 5 c m ，箱底铺设直径0 2 c m ，长1 4 c m ， 间距l c m 的铜制电栅。臂的内壁均贴有可导电的薄层铜片。顶端各装一盏1 5 w 的 刺激信号灯，其中一盏信号灯打开指示该臂不通电( 安全区) 。另外两臂及交界 区均带有刺激电压。 将大鼠放入y - 型电迷宫箱中，适应5 m i n ，采用“固定次数随机法 ：安全区 以无规则次序变换；大鼠逃到安全区后，灯光继续作用1 0 1 5 s ，熄灯后结束一次 测试，大鼠所在支臂作为下一次测试的起点，休息4 5 6 0 s 后再予以第2 次测试， 依次重复，每天固定测试3 0 次。记录正确反应率( r i g h tn u m b e r ，r n ) 和全天总 反应时间( t o t a lr e a c t i o nt i m e ，t r t ) 。正确反应率( 行为正确率) ：正确反应数占总 测试数的百分比。全天总反应时间：动物的反应时( 潜伏期) 指从信号灯亮开始至 大鼠第一次逃至灯亮区为止所耗的时间，全天总反应时是一个实验日( 全天) 完成 1 0 所有反应( 包括正确反应和错误反应) 所需时间。r n 反映大鼠反应的正确程度； t i 玎则反映大鼠反应时间的长短，可综合评价大鼠的学习记忆能力。为避免测定 上存在主观误差，测试均每天上午的固定时间进行，y 型电迷宫测试训练由专人 负责进行，并且采取单盲方法，使训练人员不了解所训练测试大鼠的组别，尽量 减少了测试中参数判断上的人为误差。 3 e l i s a 检测a b 抗体表达 3 1 组织标本制备 y - 型电迷宫测试后断颈取大鼠脑海马组织，称取重量。加入一定量的p b s 。 用液氮迅速冷冻保存备用。 标本融化后仍然保持2 8 的温度。加入一定量地p b s ( p h7 4 ) ，用手工将 标本匀浆充分。离, l , , 2 0 m i n 左右( 2 0 0 0 3 0 0 0 转分) 。仔细收集上清。分装后一份 待检测，其余冷冻备用。 3 2 操作步骤： 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔1 0 孔，在第一、第二孔 中分别加标准品1 0 0 # 1 ，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液5 吮l ，混匀；然后 从第一孔、第二孔中各取1 0 0 z 1 分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分 别加标准品稀释液5 吮l ，混匀；然后在第三孔和第四孔中先取5 毗l 弃掉，再各取 5 咄1 分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液5 吮l ， 混匀；混匀后从第五、第六孔中各取5 叽1 分别加到第七、第a c l 中，再在第七、 第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液5 吮l 。混匀后从第七、第八 孔中分别去5 毗l 加到第九、第十孔中，再在第九、第十孑l 分别加标准品稀释液5 毗l ( 稀释后各孔加样量都为5 毗l ，浓度分别为3 6 毗g l ，2 4 毗g l ，1 2 毗g 1 ，6 0 肛g ， 3 0 m g 1 ) 。 加样：分别设空白孔( 空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步骤相同) ， 待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液4 叽i ，然后再加待测 样品1 吮l ( 样品最终稀释度为5 倍) ，加将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔 壁，轻轻晃动混匀。 温育：用封板膜封板后置3 7 温育3 0 分钟。 配液：将3 0 倍浓缩洗涤液用蒸馏水3 0 倍稀释后备用。 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，没孔加满洗涤液，静置3 0 s 后 弃去，如此重复5 次，拍干。 加酶：每孔加入酶标试剂5 吮l ，空白孔除外。 温育：同 洗涤：同 显色：每孔先加入显色剂a 5 毗l ，再加入显色剂b 5 毗l ，轻轻震荡混匀，3 7 0 避光显色1 5 分钟。 终止：没孔加终止液5 m l ，终止反应( 此时蓝色变转黄色) 测定：以空白孔调零，4 5 0 n m 波长依序测量各孔的吸光度( o d 值) ，测定 应在加终止液后1 5 m i n 以内进行。 计算：用标准物浓度与o d 值计算出标准曲线的直线回归方程，将样品的o d 值代入方程式，计算出样品浓度再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。 4 免疫组化检n s 1 0 0 b 4 1 标本的石蜡包埋 y - 型电迷宫测试后，用1 0 水合氯醛( 3 5 m ! k g ) 腹腔注射麻醉大鼠，将大鼠 仰卧于固定台上，剪开胸腔暴露心脏，经左心室插入6 5 号套管针至主动脉，剪 开右一t l , 耳，先快速灌注生理盐水2 0 0 m l ，见肝脏发白，右心耳流出液为清亮色时， 换为4 。c 4 多聚甲醛3 0 0 m l ，其中前1 3 量快速灌注，后2 3 量缓慢灌注，共在2 0 r a i n 内灌注完毕，至大鼠呈僵直状态。然后断头取脑，分离海马，放入4 多聚甲醛 溶液中固定2 4 h 。 冲洗：以p b s 溶液冲洗标本3 次，并在p b s 溶液中浸泡过夜。 脱水：经上行梯度酒精脱水，6 0 、7 0 、8 0 、9 5 及无水酒精中各浸 泡1 h 。 透明：将标本浸泡透明剂二甲苯溶液中1 5 m i n 透明，共两次，以彻底替换 组织中的酒精。 石蜡包埋：将已透明的组织块置于已融化的石蜡中，放入熔蜡箱保温，待 石蜡完全浸入组织块后进行包埋。在切片机上冠状切取海马靴m 厚的连续切片， 贴于干净的载玻片上，6 0 。7 0 c 烤片4 h ，以备h e 染色。 4 2h e 染色 两次二甲苯脱蜡，各1 0 r a i n 经1 0 0 、9 0 、7 0 梯度酒精水化，各2 m i n 蒸馏水洗1 0 m i n 后入苏木精染色5 r a i n 自来水洗1 0 m i n 后0 5 伊红染液染色1 5 s 自来水洗1 5 m i n 依次经7 0 、9 0 、1 0 0 梯度酒精脱水，各2 m i n 两次二甲苯透明，各1 0 r a i n 封片：擦去切片周围多余二甲苯，迅速滴加适量中性树胶、封片。 4 3 免疫组化染色( s a b c 法) 脱蜡：脱蜡前组织切片在6 0 恒温箱中烘烤2 0 r a i n 。两次二甲苯脱蜡，各 1 0 m i n 。 水化：经下行梯度酒精水化，无水酒精、9 5 、8 0 、7 0 及6 0 酒精中 各浸泡5 m i n 各浓度酒精水化后均p b s 洗2 次各5 m i n 用p b s 配制新鲜的3 i - 1 2 0 2 ，室温封闭5 1 0 m i n ，用蒸馏水洗3 次 抗原修复：在微波炉里加热0 0 1 枸橼酸钠缓冲液( p h 6 o ) 至沸腾后将切 片放入，断电，间隔5 1 0 m i n ，反复1 2 次。根据切片情况可参考采用微波加热 “3 5 3 法 ：3 m i n 温火沸腾后静止5 m i n ，再温火沸腾3 m i n f l p 可。 p b s 洗5 m i n 滴加正常山羊血清封闭液，室温2 0 r a i n ，甩去多余液体 滴加i 抗( s 1 0 0 b1 ：2 0 0 ) 5 吮l ，室温静置1 h p b s 洗3 次各2 m i n 滴加生物素化i i 抗( 山羊抗小鼠i g g1 ：4 0 0 ) ，3 7 。c 孵育2 0 r a i n p b s 洗3 次各2 m i n 滴加试n s a b c3 7 。c 孵育2 0 m i n 固) p b s 洗4 次各5 m i n d a b 显色：取l m l 蒸馏水，加试剂盒中a ，b ，c 试剂各1 滴，混匀后加至切 片。苏木素轻度复染( 镜下掌握显色程度) 。 脱水、透明、封片，各步间p b s 洗3 次各2 m i n 胞浆内出现棕褐色颗粒为阳性标准。在低倍镜( 4 0 x 、1 0 0 x ) 下在脑海马内寻 找阳性表达细胞，并在高倍镜( 2 0 0 x ) 下计数阳性细胞数，每只大鼠计数5 张切片， 用阳性细胞平均数进行统计分析。 三、统计学方法 所有数据采用s p s s l 3 统计软件分析，所有实验数据均以均数标准差( i s ) 表示，组间比较采用配对t 检验( p a i r e d s a m p l ett e s t ) 及单因素方差分析( o n e w a y a n o v a ) 检验。p 0 0 5 ) 。( 见表1 ) 。 表1 ，四组血压、吸入麻醉及控制性降压比较( i s ，n = 3 2 ) 二、麻醉期间大鼠血气分析结果比较 b 组、c 组和d 组大鼠麻醉4 h 后，各组随机取2 0 只大鼠采血行血气分析，结果 各项指标均在正常范围内，三组间比较差异没有显著性( p 0 0 5 ) 。( 见表2 ) 表2 ，三组血气分析值( 聂s ，n = 2 0 ) 1 4 三、大鼠y - 型电迷宫测试结果 四组大鼠y 型电迷宫测试结果显示，c 组与a 、b 、d 组比较，麻醉后1 天在正确反应次数和全天总反应时间存在显著性差异( p o 0 5 ) ；c 组麻醉后1 与麻醉后3 、7 天在正确反应次数和全天 总反应时间存在显著性差异( p o 0 5 ) ；麻醉后7 天四组间两项观察指标差异无显著性 ( p 0 0 5 ) 。( 见表3 ) 表3 ，四组大鼠y 型电迷宫测试结果比较( 戛s ，n = 3 2 )