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摘要 双歧杆菌是专性厌氧菌,营养条件要求很高,对低p n 的抵抗能力较差,生存 期较短,这些给工业化生产双歧杆菌发酵制剂带来很大的困难。本课题针对双歧杆 菌的这些特点,以长双歧杆菌和两歧双歧杆菌为研究对象,以黄芪为主要材料,较 系统地研究了黄芪及其它中药对双歧杆菌生长的影响,以期为进一步开发利用中药 资源、双歧杆菌的培养及其制品开发提供理论依据。 本试验选取的中草药都为药食同源或对人体具有保健功能的药品,采用比浊法 和h u n g a t e 厌氧滚管技术计数从多种中草药中选取了促进双歧杆菌生长的黄芪。通 过黄芪在体外对双歧杆菌生长的影响试验表明,黄芪浸提液在体外对长双歧杆菌 b l m 和两歧双歧杆菌b b m 的生长具有促进作用,其效果随着黄芪浸提液添加量的 增加而增加,并且对不同菌种的促生长效果存在差异。研究了以黄芪浸提液为主要 原料的双歧杆菌培养基,大量试验结果表明,在黄芪浸提液中添加大豆蛋白胨、胰 蛋白胨、牛肉膏、玉米浆和磷酸氢二钾等成分,对双歧杆菌有明显的促进生长作用, 利用黄芪浸提液、大豆蛋白胨、玉米浆和牛肉膏设计了四因素三水平的正交试验, 确定了黄芪复合增菌培养基的优化配方:1 2 5 黄芪浸提液,牛肉膏0 6 ,玉米浆 0 4 ,o 5 大豆蛋白胨,0 2 磷酸氢二钾。在黄芪复合增菌培养基中,经3 7 恒 温厌氧培养1 6 h ,b l m 活菌数达到4 5 9 x 1 0 9e f u m l ,b b m 活菌数达到2 6 7 x 1 0 9 e f u m l 。 通过一种选择性双歧杆菌培养基,以健康小白鼠为实验对象,研究了黄芪在动 物肠道内对双歧杆菌的影响,动物实验结果表明,黄芪浸提液在体内对双歧杆菌的 生长有选择性促进作用,而肠道中主要致病菌一大肠杆菌的生长受到抑制,黄芪中 的多糖类物质可能对黄芪在体内选择性地促进双歧杆菌生长起了主要作用,此外, 黄芪浸提液还具有明显的整肠作用,同对照组相比,饲喂黄芪浸提液的小鼠排便顺 利,粪便颗粒大且湿润。 关键词:黄芪;双歧杆菌;增殖;培养基优化 a b s t r c t b i f i d o b a c t e r i aa r es t r i c ta n a e r o b i cg e r m s ,h a r dt on u t r i t i o n a lc o n d i f i o n , n o tt o l e r a n t t ol o w p h ,a n ds h o r ts u r v i v i b i l i t y m sr e s u l t e di nt h eg r e a td i f f i c u l t yf o rb i f i d o b a c t e r i u m f e r m e n t i n gd a i 巧p r o d u c t s i n i n d u s t r i a l i z a t i o n a i m i n g a tt h e p e c u l i a r i t yo f b i f i d o b a c t e r i u m ,t h et a s k ss t u d i e dt h ee f f e c t so fb i f i d o b a c t e r i u ml o n g u ma n d b i f i d o b a c t e r i u mb i f i d u s se x t r a c to nt h eg r o w t ho fb i f i d o b a c t e d u mi no r d e rt op r o v i d e t h e c o d t i c a lf o u n d a t i o nf o rt h eu t i l i z a t i o no f a s t r a g a l u sm o n g h o l i c u sb u n g e r e s o u r c 七,u s i n ga s t r a g a l u sm o n g h o l i c u sb u n g e a s e x p e r i m e n t a l m a t e r i a la n d b i f i d o b a c t e r i u ma ss t r a i nt e s t e d t h i se x p e r i m e n t a ls e l e c t i o n sc h i n e s em e d i c i n eh a st h eh e a l t hc a r ef u n c t i o nd r u g sf o rt h e m e d i c i n ef o o dh o m o l o g yo rt ot h eh u m a nb o d y , u s e dt h et u r b i d i m e t r i cm e t h o da n dh u n g a t ea n a e r o b i c r o l l st h et u b et e c h n o l o g yc o u n t i n gt os e l e c tt h ea s t r a g a l u sw h i c hf r o mm a n yk i n d so fc h i n e s e m e d i c i n eap r o m o t i o no fb i f l d o b a c t e r i ag r o w t h t h ei n f l u e n c ee x p e r i m e n tw h i c hg r o w st o b i f i d o b a c t e r i ai n d i c a t e dt h r o u g ht h ea s t r a g a l u si nv i t r ot h a tt h ea s t r a g a l u sl e a c h i n gs o l u t i o nh a st h e p r o m o t e ra c t i o ni l lv i t r ot ob i f i d o b a c t e r i u ml o n g u m ( b h n ) a n dt h et w ot h i n g sw h i c hd on o tt a l l y b i f i d o b a c t e r i u mb i f i d u s ( b b m ) g r o w t h , i t se f f e c ti n c r e a s e sa l o n gw i t ht h ea s t r a g a l u sl e a c h i n g s o l u t i o nr e c r u i t m e n ti n c r e a s e s ,a n dp 他s s e st h eg r o w t he f f e c te x i s t e n c ed i f f e r e n c et ot h ed i f f e r e n tm o l d m u s h r o o ms p a w n h a ss t u d i e dt a k et h ea s t r a g a l u s l e a c h i n g s o l u t i o na st h ep r i m a r yd a t a b i f i d o b a c t e r i u mc u l t u r em e d i u m , t h em a s s n et e s tr e s u l ti n d i c a t e dt h a ti n c r e a s e si n g r e d i e n t sa n ds o o ns o yp r o t e i np e p t o n e , p a n c r e a sp r o t e i np e p t o n e ,c o wm e a te x t r d c t c o lt h i c kl i q u i da n dd i p o t a s s i u m h y d r o g e np h o s p h a t ei nt h ea s t r a g a l u sl e a c h i n gs o l u t i o n , h a st h eo b v i o u sp r o m o t i o ng r o w t hf u n c t i o n t ob i f i d o b a e t e r i u m , u s i n gt h ea s w a g a l u sl e a c h i n gs o l u t i o n , t h es o yp r o t e i np e p t o n e ,t h eo o mt h i c k l i q u i da n dt h ec o wm e a te x t r a c th a sd e s i g n e df o u rf a c t o rt h r e el e v e lo r t h o g o n a lt e s t s ,h a dd e t e r m i n e d t h ea s t r a g a l u sc o m p o u n di n c r e a s e st h ef u n g u sc u l t u r em e d i u mt h eo p t i m i z e df o r m u l a :1 2 5 r a d i x a s t r a g a l il e a c h i n gs o l u t i o n s , b o o f o m a c t 0 6 哆句c o r n l i c kl i q u i d0 4 ,m a i z eh y d r o l y z a t e s0 5 k 2 i - i p 0 4 0 2 a n dt h el i v ec o u n t sc u l t i v a t e di nt h eo p t i m u me n r i c h m e n tm e d i u mf o r1 6 ha t3 7 ( 2w c r e4 5 9 x1 0 9e f u m lo fb i ma n d 2 9 1x1 0 9c f u m lo f b b m t h r o u g ho n es e l e c t i v eb i f i d o b a c t c r i u mc u l m mm e d i u m , t a k et h eh e a l t h yw h i t em o u s ea st h e e x p e r i m e n t a ls u b j e c t , s t u d i e dt h er a d i xa s t r a g a l ii nt h ea n i m a li n t e s t i n a lt r a c tt ob i f i d o b a c t e r i u m s i n f l u e n c e ,t h ea n i m a le x p e r i m e n t a t i o nr e s u l th a di n d i c a t e dt h a tt h er a d i xa s t r a g a l il e a c h i n gs o l u t i o n h a dt h es e l e c t i v i t yp m m o t e ra c t i o ni nv i v ot ob i f i d o b a c t e r i u m sg r o w t h , b u ti nt h ei n t e s t i n a lt r a c t t h em a i np a t h o g e n i cb a c t e r i ab a c k w o o d sc o l i sg r o w t hr e c e i v e ds u p p r e s s e s ,i nt h er a d i xa s t r a g a l i m u l t i - c a r b o h y d r a t em a t e r i a lp o s s i b l yg r e wt ot h er a d i xa s t r a g a l ia ti nv i v os e l e c t i v e l yp r o m o t i o n b i f i d o b a e t e r i u mt h el e a d i n gr o l e ,i l la d d i t i o n , t h er a d i xa s t r a g a l il e a c h i n gs o l u t i o na l s oh a dt h e o b v i o u se n t i r ei n t e s t i n e sf u n c t i o n , c o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o lg r o u p ,f e e d st h er a d i xa s t r a g a l il e a c h i n g s o l u t i o nt h em o u s eb o w e lm o v e m e n tt ob es m o o t h , t h ee x c r e m e n tp e l l e t 啊bb i ga n di sm o i s t k e yw o r d s :a s t r a g a l u s ,b i f i d o b a c t e r i a , m u l t i p l i c a t i o n , o p t i o n i z a t i o no f t h em e d i u m 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得亟宴堡盔些盘堂或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名:剐荔勿 签字日期:弘孤年石月仡日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑皇堡垒些盘堂有关保留、使用学位论文的规定, 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借 阅。本人授权塑宴垦盔些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名: 训隽彩 i 导师签名:习琵呀 签字日期:功t 皤年 多月) - e i 签字日期:砂寥年6 月,日 学位论文作者毕业后去向: 工作单位: 通讯地址: 电话: 邮编: 黄芪及其它中草药对双歧杆菌增菌的影响研究 1 引言 双歧杆菌( b i f i d o b a c t e r i u m ) 在1 8 9 9 年由法国巴斯德研究所的t i s s e r 博士从健康的母乳喂养婴 儿的粪便中分离出来【l 司。o r l a - j e n s e n 在1 9 1 9 年将其命名为双歧杆菌,1 9 2 4 年设立一个独立双歧 杆菌属,由于认识问题,未被人们接受 4 1 。到伯杰氏细菌鉴定手册第8 版( 1 9 7 4 ) 将其作为正式属 名列入放线菌目放线菌科下。目前,国际上公认能安全应用于食品的双歧杆菌共有5 种:两歧双 歧杆菌( b b i f i d u m ) ,青春双歧杆菌a d o l e s o e n t i s ) 。婴儿双歧杆菌i n f a n t i s ) ,长双歧杆菌( b 1 0 n g u r a ) 和短双歧杆菌( b b r e v e ) l m 。 自那以后,经过多年科学工作者努力研究,认识到该菌具有营养、延缓衰老、抑制内毒素产 生、维持肠道菌群平衡、增强人体免疫力等多重功效1 6 - s 。近年来,国内外出现了大量含双歧杆菌 和其他益生菌的活菌制剂,有乳制品、保健品和药品等。 双歧杆菌是严格厌氧菌,由于培养条件苛刻,生长十分缓慢,如何促进双歧杆菌增殖一直是 研究的热点问题。为了提高人体内双歧杆菌的水平,及促进体外培养液中双歧杆菌的增殖,目前 主要是寻找促进双歧杆菌增殖的物质。本研究选用的黄芪( a s t r a g a l u sm o n g h o l i c u sb u n g e ) 等中药, 既含有丰富营养成分,又是卫生部公布为药食同源的中药,通过将其作为双歧促生长因子( b i f i d u s f a c t o r ,简称b f ) 添加进培养基中,达到优化培养基和促进双歧杆菌增殖的目的,同时,为开发新 的中药双歧保健品提供理论基础。 1 1 双歧杆菌的特性 1 1 1 双歧杆菌的形态和生理生化特性 双歧杆菌最早归类于乳杆菌属,1 9 5 8 年日本的光冈等人根据双歧杆菌的形态和培养性状,提 议独立设双歧杆菌属f b i f i d o b a c t e r i u m ) ,确立了双歧杆菌的分类体系。伯杰氏系统细菌学手册第 9 版( 1 9 9 4 ) d 0 共载有双歧杆菌属2 4 个种,现发现2 8 种,其中l o 种是从人体分离的,1 3 种是从动 物分离的,3 种是从蜜蜂分离的,还有2 种是从水污物中分离的【9 】。 双歧杆菌的细胞呈现多种形态:有纤细杆状具有尖细末端形、短杆较规则形、长而稍弯曲状、 球形、各种分叉形、棍棒状或匙形。单个或链状、v 型、栅栏状排列,或聚集成星状。不能游动, 无芽孢、荚膜及鞭毛。其典型形态是有分叉的杆菌,故以b i f i d u s 命名,即裂开、分开之意。双 歧杆菌菌落光滑、凸圆、边缘完整、奶油色至白色、质软有弹性。 双歧杆菌革兰氏染色呈阳性,美蓝等染色菌体着色不均。不耐酸,无运动性。厌氧,对氧的 敏感性不同的种和菌株存在差异,一些菌在有c 0 2 存在时可耐受氧。起始生长最适p h 为6 5 - 7 0 , 在p h 4 5 5 0 以下或p h 8 肛8 5 以上不生长。最适生长温度为3 7 q l ,最低生长温度为2 5 2 8 , 最高生长温度为4 3 - 4 5 ,最适发酵温度为3 5 - - 4 0 。研q a 的g 屺含量为摩尔分数5 5 击7 , 异形双歧杆菌i n o p i n a t u m ) 除外,c r o c i a n i 等报导( 1 9 9 6 ) ,这个种的g 屺含量为摩尔分数 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 4 4 0 6 【1 0 1 。一般双歧杆菌过氧化氢酶呈阴性,但星状双歧杆菌和蜜蜂双歧杆菌例外。双歧杆 菌通常不还原硝酸盐,然而,在含有溶解红细胞的培养基生长时,则可能有还原硝酸盐的作用。 明胶液化阴性。吲哚反应阴性。联苯胺反应阴性。双歧杆菌对葡萄糖的代谢可归于异型发酵,但 不同于其它乳酸菌,而是经由特殊的双歧支路【1 1 j 。其中,果糖- 6 磷酸磷酸酮酶( f 6 p p k ) 起关键作 用。双歧杆菌属中大多数细菌细胞的抽提物内具有f 6 p p k ,因此检测出f 6 p p k 可作为鉴定双歧 杆菌属的重要特征。双歧杆菌分解己糖,产生乙酸和乳酸,理论摩尔比为3 :2 :产生极少的甲酸 和琥珀酸;不产丁酸和丙酸,不生成c 0 2 。 1 1 2 双歧杆菌产生的酶类 肽酶。生长迅速的双歧杆菌中发现有高的l 亮氨酸氨肽酶活力,通过作用于蛋白质或多肽 的n 端氨基酸残基,也能水解某些脂肪酸胺类。牛乳蛋白水解物通过部分来自肽酶的活力对双歧 杆菌具有促生长作用【1 2 l 。n i s h i z a w a 认为双歧杆菌等乳酸菌具有磷蛋白磷酸酶活性,分解乳中洳 酪蛋白,形成微细的凝固奶酪脂肪肽和氨基酸等,提高蛋白消化率1 1 引。 伍、 半乳糖苷酶。所有双歧杆菌都含有a 、 半乳糖苷酶,且酶活力明显高于其它肠道菌 1 1 4 1 。其中,弘半乳糖苷酶能降解特殊糖类( a - d 半乳糖苷寡糖) ,这种多糖不能被机体利用而可被 双歧杆菌消化。在乳制品加工中,p 半乳糖苷酶能分解乳糖,可提高“乳糖不耐症”患者对乳制品 的利用率i l 引。 a 、争葡萄糖苷酶。所有双歧杆菌中均存在着静葡萄糖苷酶活力,而 葡萄糖苷酶存在于 除b 1 0 n g u m 或b b i f i d u m 外的其它双歧杆菌种中。有研究表明,淀粉抵制小肠中的胰淀粉酶,从 而成为进入结肠的主要糖源,其水解物可能就是双歧杆菌生长的重要基质。b e v e r l e y 以淀粉作为 唯一的碳源和能源研究洳葡萄糖苷酶,表明双歧杆菌通过合成一个或两个弘葡萄糖苷酶,进行了 以淀粉作为碳源的代谢。目前,对p 葡萄糖苷酶的研究不如洳葡萄糖苷酶多,但也出现一些资料 的报道i 川。 与胆酸相关的酶。双歧杆菌能产生结合胆酸水解酶,尤其是甘氨酰胆酸水解酶,使结合胆 酸游离,更有效地抑制致病菌生长【1 7 1 。 其它。某些双歧杆菌含有n 乙酰- d 葡萄糖胺酶活力,以含n - 乙酰d 葡萄糖胺的多糖为 底物,参与细胞壁的合成。含此酶的双歧杆菌多来源于婴儿,但成人未发现。在某些双歧杆菌体 内,则存在微量的n 亚硝酸降解酶、n a d - 氧化还原酶和s o d 酣墙】,专门用于降解或吸收某些 特殊物质【l 们。双歧杆菌中的谷氨酰胺合成酶和谷氨酰胺脱氢酶加强氮的存留,在氮代谢中起着重 要作用。 双歧杆菌中己分离纯化的与糖代谢有关的酶,除上述之外,还有争吠喃果糖苷酶、甘露糖苷 酶,木糖苷酶,口木糖异构酶等,都是人体所不具有的,能水解人体不能消化的寡糖的酶 1 1 3 双歧杆菌对人体的功效 双歧杆菌作为一种典型的益生菌,通过改善肠道微生态区系的平衡增强宿主的健康。而肠道 菌群数量庞大、构成复杂。双歧杆菌属、消化链球菌属等专性厌氧菌约占肠道总菌量的9 9 ,肠 2 黄芪及其它中草药对双歧杆菌增菌的影响研究 杆菌科、肠球菌属等兼性厌氧菌约占1 1 2 0 1 。日本学者光冈知足认为,双歧杆菌是对人类整个生 命活动有益的肠道细菌:国内刘秉阳通过对长寿老人肠道菌群的研究发现其肠道双歧杆菌非但没 有减少,而是显著增加,这间接表明了双歧杆菌与人类健康长寿有一定的关系。欧洲食品与饲料 菌种协会( ( e f f c a ) 对益生菌的最新定义为:益生菌是活的微生物,通过摄入充足的数量,对宿主 产生一种或多种特殊且经论证的功能性健康的益处。双歧杆菌通过改善肠道微生物菌群的平衡而 发挥保健功制n - 2 3 1 。 双歧杆菌定殖在人体的肠粘膜上形成生物学屏障,维持肠道正常菌群平衡的作用。双歧杆 菌可迅速定植在肠粘膜上皮细胞,形成有益菌屏障,密布于肠粘膜上形成茵膜,使致病菌无法定 植:产生大量醋酸和乳酸,降低肠道p h 和e h ,使肠道酸化,抑制致病菌生长,收敛胃肠炎症; 能产生胞外糖苷酶,降解肠粘膜上有利于致病菌粘附的受体;增加肠道蠕动,加快致病菌排出, 刺激肠道免疫细胞,提高免疫球蛋白i g a 细胞产生能力 2 4 1 ,进而维持肠道微生态平衡,提高肠胃 及免疫系统对疾病的抵抗力。 抗肿瘤作用。双歧杆菌能非特异性增加肿瘤的局部反应,改善肿瘤患者淋巴细胞亚群分布 及增强其杀伤活性,促进细胞免疫功能,激活巨噬细胞的吞噬活性而具有抗癌作用【2 5 j 。双歧杆菌 活体、灭活菌体,以及完整的细胞壁肽多糖、胞外多糖及细菌素等,均有较高的抗肿瘤活性。双 歧杆菌能分泌一种n 亚硝胺降解酶,使亚硝胺致癌物降解,降低了肠癌的发病率 5 1 。双歧杆菌对 血管内皮抑制素抗胃、肝和消化道肿瘤均有协同增效作用【2 6 】。双歧杆菌能诱导血液中一氧化氮水 平升高,激活了巨噬细胞杀伤肿瘤细胞的活性,并与氧结合形成具有强有力杀伤性的自由基,或 通过与肿瘤代谢关键酶活性部位f e s 结合失去活性,促使癌细胞凋亡而产生抗癌作用【27 1 。双歧 杆菌能有效地抑制肠道中的p 葡萄糖苷酸酶和偶氮还原酶等细菌酶的活性,催化致癌物质转化为 粪臭素,减少了致癌物质在肠道内的形成。双歧杆菌还具有很强的吸收煮焦肉所产生的致癌物质 的能力。 营养作用。双歧杆菌可分泌多种酶类,促进食品的降解与吸收;维持肠道酸性环境,有利 合成维生素b l ,b 2 ,b 6 和k 等,由人体缓慢地吸收,b 族维生素的生成量可达1 2 0 3 u g 1 0 0 m l 双歧杆菌f 2 研;双歧杆菌可以合成丙氨酸、撷氨酸、天冬氨酸和苏氨酸等人体必需的营养物质,使 人体通过合理的膳食即可摄取足量的多种营养素,对于人体具有重要的营养作用,尤其对加强孕 产妇、哺乳妇女、儿童、老年人的营养有重要的意义:双歧杆菌可分泌多种酶类,促进食品的降 解与吸收;双歧杆菌维持肠道酸性环境,有利于c a 2 + ,f e 2 + 和维生素d 的吸收,有助于防治缺铁 性贫血和软骨病;双歧杆菌发酵乳糖产生半乳糖,是构成脑神经系统中脑苷脂的成分,与婴儿出 生后脑的迅速生长有密切关系,可提高“乳糖不耐症”患者对乳制品的利用率。 降低胆固醇和血压。双歧杆菌及其发酵乳制品均能降低总血清胆固醇含量,提高在女性血 清中高密度蛋白胆固醇占总胆固醇开发方向的比率,其机理是双歧杆菌通过影响p 羟基p 甲基戊 二酸单酰辅酶a 还原酶的活性,控制胆固醇的合成而降低血清胆固醇的含量。研究表明,一个人 的心脏舒张压高低与其粪便中双歧杆菌数占总菌数的比率呈明显的负相关。 抗衰老作用。在机体代谢过程中自由基和过氧化脂质被认为是产生的对宿主细胞有害的物 质,创口能加速细胞的衰老与死亡。双歧杆菌体内含有过氧化物酶、过氧化物歧化酶s o d 等, 有清除自由基及过氧化脂质的能力,可减少自由基等致衰老物质的产生,因而能净化人体内环境, 延缓细胞的衰老,促进人体健康。欧美和日本的微生态学家调查表明,长寿老人粪便中的双歧杆 3 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 菌数量与中、青年相当。我国科学家对广西巴玛地区长寿老人的调查也得出相同的结论。 1 1 4 双歧杆菌的营养特性 双歧杆菌以有机碳源作为能源和碳源。通常葡萄糖等单糖和一些低聚糖是作为可利用的主要 的碳源,但双歧杆菌不能直接利用纤维素、淀粉等大分子碳水化合物。双歧杆菌体内含有的许多 糖代谢酶,都是动物和人所不具有的。许多促进双歧杆菌生长的碳源大多是能被双歧杆菌利用但 不能被机体利用的糖类,除乳酮糖外,主要为寡糖,乳寡果糖、寡半乳糖、大豆寡糖。 双歧杆菌要求矿物元素如磷、硫、钠、钾、钙、镁、锰、铁和锌等。铁、铜、锌是双歧杆菌 超氧化物歧化酶的主要组成部分,其含量对菌体生长有明显的的影响。n o v i kg i 等将在加一天然 隧石粉时获得的矿物质添加到青春双歧杆菌9 4 - bi m 的培养基中,可提高菌体生长速率,降低代 时,增加代谢物诸如乙酸、乙醇和乳酸的积累及胞外蛋白酶的水平1 3 。双歧杆菌能合成维生素 b l ,b 2 ,b 6 和k 等,而它们生长需要的维生素b 2 ,b 5 ,b 6 ,b 1 2 等维生素b 是组成各种酶的活性 基本成分,如果缺失,酶类不能活动,菌体不能生长。 双歧杆菌的蛋白酶活性通常较弱,甚至缺乏必要的蛋白酶,最适氮源为蛋白质水解产物:蛋 白胨、肽类和氨基酸等,e c o l i 生长基质用蛋白酶消化后也是极好的双歧杆菌促生长物。1 9 9 3 年 k l a v e rfa 等报道培养在纯牛奶中的双歧杆菌,1 7 个菌株中有1 5 个菌株不能生长,需添加酪蛋 白降解产生的肽和氨基酸,这是因为这些菌株缺乏分解蛋白的活性。实验表明:人为添加动物性 复合氨基酸,可使双歧杆菌活菌数明显提高,而且活菌数的衰减会缓慢一些1 2 9 ,如果缺乏天冬氨 酸,则双歧杆菌的活性降低5 0 【3 0 】:酵母膏富含核苷酸、蛋白质,对活菌数有明显影响,生产中 少加或不加酵母膏,菌体停止生长或很快死亡。研究发现,这此物质均含有含硫的肽,如果它们 的二硫键被还原或烷基化则失去促双歧杆菌生长的活性。 此外,双歧杆菌还需要某些生长辅助因子:嘌呤、嘧啶及其衍生物,双歧因子等【3 2 l 。由此可 见,双歧杆菌对营养要求苛刻,这就要求人们深入研究双歧杆菌的营养需求,并寻找更多的双歧 杆菌促生长物质一双歧因子。 1 2 双歧杆菌制品的开发利用 在人体肠道中双歧杆菌作为典型的有益微生物菌群之一,对促进人体健康的有益作用远远超 过其它乳酸菌【3 粥5 1 。但由于环境污染、饮食改变、滥用抗生素、放射性化疗、机体衰老等原因, 往往使人体肠道的双歧杆菌数量剧烈变动,导致肠道微生态失调,引起菌群易位,诱发内源感染, 造成机体病变 3 s l 。因此利用外源方式( 如双歧食品和双歧制剂) ,增加并稳定人体肠道中双歧杆菌 的数量,将有利于促进人体健康。基于上述情况,国内外研究者相继开发出多种双歧杆菌微生态 制剂用于治疗因各种因素造成的菌群失调,产品包括双歧杆菌活菌制品,以及双歧杆菌和功能型 成分配合的产品,其广泛应用于食品、药品和保健品等领域 3 6 - 3 7 1 。 4 黄芪及其它中草药对双歧杆菌增菌的影响研究 1 2 1 双歧杆菌制品的种类 双歧杆菌是定植于人体内的生理性细菌。但是,随着年龄增长、饮食改变、环境污染、抗生 素使用及放射性化疗等,双歧杆菌在体内的含量下降。这将导致肠道微生态失调,引起菌群易位, 诱发内源感染,造成机体病变。因此,人们一直在寻找向肠道内补充双歧杆菌的方法。从2 0 世 纪7 0 年代以后,一些国家相继研制出双歧杆菌制剂,用于治疗各种因素引起的菌群失调。目前, 国际上双歧杆菌制品的形式主要有以下三种| 3 9 4 2 1 :双歧杆菌活菌制品。包括双歧杆菌活菌制 剂及其保健食品,在保健食品中又以发酵乳制品居多。它能够对肠道直接快速补充双歧杆菌。然 而,由于双歧杆菌具有对营养要求苛刻、专性厌氧、不耐酸等特殊生物学特性,其工业化生产和 活菌制品保藏极为困难。所以,目前只有少数技术和设备先进的工厂有能力生产。除此之外,外 源双歧杆菌还难于通过宿主胃肠屏障并在肠道中定植,因此,双歧杆菌活茵制品的活菌数有严格 规定。双歧因子( b i f i d u sf a c t o r ,b f ) 制品。b f 是一大类结构和性质各不相同的能够促进双歧 杆菌增殖的物质。研究开发b f 不存在保持活菌数的技术难关。双歧杆菌活菌和双歧因子结合 的合生元( s y n b i o t i c s ) 制品。合生元集双歧杆菌的速效性和b f 的促进生长作用与一体。由于双歧 杆菌制品的迅速发展,其研究也日趋广泛和深入。 1 2 2 双歧因子 ( 1 ) 双歧因子的化学本质。从目前b f 的研究结果分析【4 引, b f 主要包括以下6 类物质: 低聚糖类b f 在b f 中,低聚糖类占主要部分,也是目前研究开发的重点。多数低聚糖不被消化道吸收, 直至大肠才被双歧杆菌及某些乳酸杆菌利用,因而具有独特的生理功能。目前主要有低聚果糖、 低聚半乳糖、大豆低聚糖、菊糖低聚糖、低聚异麦芽糖、低聚木糖、低聚龙胆糖、低聚葡萄糖( p 型) 、魔芋低聚糖、琼脂低聚糖、乳果糖、甲壳质低聚糖、帕拉金糖等,共2 0 余种。英国剑桥临 床营养中心的研究发现,通过菊糖低聚糖的体外发酵能力与一系列参考的碳水化合物如葡萄糖等 的比较,以菊糖低聚糖为碳源对双歧杆菌生长有明显的促进生长作用。 蛋白质水解产物及一些蛋白质类物质 已知有许多能促进双歧杆菌生长的蛋白质水解产物及一些蛋白质类物质,如乳清蛋白、乳铁 蛋白、胃黏膜蛋白水解物、酪蛋白水解物等。在商业上,较便宜的有酵母提取液、牛肉浸液、大 豆胰蛋白酶水解物等,其中酵母提取液最好【4 “5 1 。无论是哪种蛋白质水解物类b f ,它们均具有 一个共同成分,即含硫的肽,如果它们的二硫键被还原或烷基化则失去活性。所以,这些物质对 双歧杆菌的生长促进作用可能与二硫键密切相关。 多糖类b f b f 中的多糖类物质有菊糖、云芝多糖、褐藻硫酸多糖嗍、胡萝卜中的含氮多糖等。s h i nh s 等研究了两个商业双歧杆菌菌株( b l 和b f - 2 ) 在含有低聚果糖、低聚半乳糖和菊糖的复原脱脂乳 中的生长f 4 7 1 。结果显示,当b h 和b f - 2 在低聚果糖存在时,生长促进和活性保存最大,其次是低 聚半乳糖和菊糖。随着碳水化合物浓度的增加,促进效果增加,在5 时最高。 5 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 天然植物及中草药提取物类 在人们研究过的天然植物及其提取物中,茶叶中的茶多酚、人参中的人参皂苷、五加科植物 的提取物、魔芋水解液【4 引、螺旋涮4 9 1 、海带【5 0 】等被证实有促进双歧杆菌生长作用。田碧文等的试 验证型5 l 】,传统中药阿胶、五味子、刺五加、枸杞能促进双歧杆菌生长。刘一尘等报导,扶正固 本类中草药如黄芪、党参等,除可增强机体免疫功能外,还可促进双歧杆菌生长p 2 1 。 短链脂肪酸类和其它类b f 短链脂肪酸类物质有费氏丙酸杆菌产生的丙酸盐( 脂) 等。其它的还有n 乙酰葡萄糖胺及其糖 类、泛肽巯基乙胺等。 1 2 2 影响双歧因子促生长作用的因素 b f 的促生长作用与其浓度和菌种密切相关1 5 3 l 。张桂兰等的研究表明,在褐藻硫酸多糖的浓 度分别为o ,1 o ,1 5 ,2 o ,2 5 时,双歧杆菌活菌数随浓度增加而呈线性增加。在浓度 增加到6 0 0 - 8 时,双歧杆菌活菌数无显著性提高,其原因可能是高浓度的褐藻硫酸多糖使培养基 的渗透压增高,反而不利于双歧杆菌生长。熊德鑫等的研究表明1 5 4 1 ,低聚葡苷糖对两歧双歧杆菌、 青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、角双歧杆菌和短双歧杆菌有促生长作用,一般以2 浓度最好,6 种双歧杆菌中对长双歧杆菌作用最好。乳果糖除了对婴儿双歧杆菌有促生长作用外, 对其它5 种双歧杆菌无作用。低聚异麦芽糖对婴儿双歧杆菌几乎无促生长作用,对其它5 种双歧 杆菌有促生长作用。张庆蕴等的研究表明【5 ”6 1 ,高浓度的低聚糖对双歧杆菌生长有抑制作用,这 可能是高渗透压的低聚糖对细菌有脱水作用。王筱兰等的研究表明p7 j 低聚半乳糖浓度在1 5 9 l 内都能促进双歧杆菌生长,半乳糖三寡糖和半乳糖四寡糖浓度为5 9 l 时对双歧杆菌生长的促进 作用最大,当低聚半乳糖浓度大于5 9 l 时对双歧杆菌生长有一定抑制作用。 1 2 3 双歧因子的作用机理 大量实验表明,双歧杆菌是通过分泌到细胞外各种酶来分解利用不同b f ,并促进其生长繁 殖 5 8 1 。目前,已分离纯化的双歧杆菌糖苷酶有:叫阻半乳糖苷酶、 d - 半乳糖苷酶、p 吠喃果糖 苷酶、d 木糖苷酶等【5 引。生长迅速的双歧杆菌中发现有较高的l 亮氨酸氨肽酶活力,此外,双 歧杆菌还有磷蛋白磷酸酶、二肽酶、羧肽酶等肽酶。另有一些b f 是通过蛋白质类的粘附素来产 生作用。有报导粘附素可使肠道上皮细胞与双歧杆菌连接在一起。b f 与双歧杆菌间的空间相互 作用关系也是目前的一个研究方面。低聚糖类b f 与双歧杆菌的空间作用机理与双歧杆菌优先利 用低聚糖促进其生长的内在机制密切相关1 6 0 1 。通过核磁共振技术,确定糖苷键的性质及位置,进 而可获得低聚糖的分子空间结构。目前这方面的研究报导较少。低聚糖不仅仅只充当一种碳源或 营养物质,其更重要的作用是参与双歧杆菌的生长调节及粘附等作用,这也是目前双歧杆菌制品 应用中所面临的急待解决的理论问题之一。 6 黄芪及其它中草药对双歧杆菌增菌的影响研究 1 3 中草药 1 3 1 中草药的优势 ( 1 ) 天然药物,有益无害 中草药在我国的应用历史悠久,疗效确实,它对我国的人类健康和畜禽的繁衍昌盛起了巨大 的作用。长期的临床应用证明,中草药很少出现上述毒副作用。因此,现在世界各国对天然药物 的研究应用也日趋广泛,日本、朝鲜、法国、美国等国家,对植物药的研究倍加重视,先后成立 了专门的研究机构。有的国家每年还派出上干名草药学者,到各大洲去寻找可供药用的植物。无 疑,中药的无公害优势是抗生素、化学药物、激素类药物等无法比拟的。 ( 2 ) 双向调节,促进康复 中草药对机体的调节功能主要表现在两个方面:一方面是“高者抑之,下者举之”,另一方面 是“抑高”与“举下”的作用同时并存【6 l 】。中药的这种双向调节作用,指药物通过调节机体在病理过 程中的亢进或低下状态,使失调的功能活动和过多过少的生理物质恢复到正常水平。在临床上很 多中药都显示出其“双向调节”作用。 ( 3 ) 祛邪扶正,标本兼治 中草药对于疾病的防治作用,不外于扶助正气和祛除病邪两大法则。扶正与祛邪,是根据疾 病反应的虚实情况来决定的。疾病的发生、发展和转归过程,是正邪双方斗争的过程,邪胜于正 则病进,正胜于邪则病退。扶助正气就是补充机体气血阴阳的不足,从现代医学观点来看,具有 增加营养、增强体质,提高机体免疫机能和抗病力的作用。如党参、黄芪、白术、何首乌、熟地 等药物均具有这种作用。 ( 4 ) 资源丰富 我国幅员辽阔,资源丰富,可就地取材,且原料价格便宜,使用方便,易于推广使用。 ( 5 ) 对有益功能人体功能 营养作用和维生素作用 许多中草药含有人体必须的营养物质,如黄芪中含糖类,多种氨基酸、蛋白质、胆碱、叶酸、 维生素b 、淀粉酶、微量元素;大枣枣肉中除含有蛋白质、脂肪、糖类外,还含有维生素a 、维 生素c 及丰富的磷、铁、钙等。这些营养成分和生物活性物质都可促进人体的生长发育,满足机 体对各种营养物质需求,促进有机体新陈代谢。某些中药有调节人体内糖、脂代谢的作用,可促 进蛋白质、d n a ,r n a 的合成,增高蛋白质及丫- 球蛋白含量。如当归可防维生素e 缺乏;刺五 加能调节血糖,促进核酸和蛋白质合成;何首乌有降低胆固醇和增加卵磷脂的功能。 增进免疫功能作用 一些中草药,特别是补虚药和复方制剂能够对人体有机体产生特异性和非特异性免疫功能, 增强细胞和体液免疫力1 6 2 1 。如党参、首乌、刺五加能升高外周白细胞,增强网状内皮系统吞噬功 能。正常动物服用黄芪后血中i g e 、i g m 含量显著增加。四君子汤、四物汤、六味地黄丸都对细 胞免疫和抗体有促进作用。 7 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 1 3 2 中药市场所面临的问题 众所周知,我国很大一部分的化学合成药、抗生素及生物制剂等都是仿制药品,不具有自主 知识产权。在过了w t o 规定的3 年保护期以后,要想继续生产势必要花巨资购买知识产权,这 样导致了我国众多中小型西药企业纷纷将目光投向了中药。在我国加入w t o 之后,中草药市场 面临着前所未有的发展机遇:欧美等国家开始逐步接受中草药,去年全球的中草药市场达3 0 0 多 亿美元以上,并且每年的增长率可望达到1 0 左右。然而不容乐观的是,我国虽然是植物药资源 和中成药生产的大国,但在国际草药市场3 0 0 多亿美元的市场份额中,仅占3 5 ,而且“洋中 药”正不断地蚕食着国内市场。国际中药市场大部分被日韩占有,日韩等国从我国大量进口中药 原料,加工后再返销我国,从中赚取大笔利润。例如日本仅“救心丹”一个品种的出口额,就相当 于我国中成药出口贸易额的总和。韩国的高丽参,一个品种的销售额相当于中药成药出口额的总 和。造成这种情况的原因之一是目前我国国内在中草药开发方面研究手段落后,中药制药产业存 在着加工生产工艺简单、技术含量低、重复投资、品种老化、单调,制剂粗糙及疗效欠佳等问题。 为了使中草药在生产中快速发展,专家呼吁,必须重视中草药的基础研究,逐步解决中药作用机 理、加工炮制、工艺改进和新资源开发等问题为研制新型的中草药制剂提供可靠的依据和保障 【6 3 。 随着中药研究的快速发展,安全有效的中草药制剂的需求量势必大幅度上升。但是目前在中 药市场上所选用的中草药制剂,多存在剂型简单、组方不合理、功能较差、资源浪费的现象,不 仅浪费了已逐步减少的中草药资源,还贻误了病情,同时造成了很大的经济损失。因此,我们必 须加大力度对中草药进行深入研究,增加科技含量,努力研制开发出防治人畜疾病的天然中草药 系列产品。 1 3 3 低聚糖的作用 ( 1 ) 低聚糖概述 低聚糖又名寡糖( o l i g o s a c c h a r i d e ) ,是近十几年国际上颇为流行的一类有营养保健功能的甜 味剂,作为功能食品( 机能食品) 的基料,应用到各类保健营养补品和食品工业中。通常,低聚 糖是2 1 0 个单糖以糖苷键连接的结合物,1 1 个单糖以上的结合物则称为大糖类,1 0 0 - 2 0 0 0 个单 糖结合物则称为多糖类,其甜度一般只有蔗糖的3 0 0 0 , , 5 0 。由于低聚糖的保健效果明显,已引 起人们的普遍重视嗍。 功能性低聚糖之所以具有生理功能,是因为它能促进人体肠道内固有的有益细菌一双歧杆菌 的增殖,从而抑制肠道内腐败菌的生长,减少有毒发酵产物的形成。由于双歧杆菌对氧、热和酸 的高度敏感性,要想直接将它添加入食品中是相当困难的,但这对于低聚糖来说却是易如反掌。 低聚糖并不只存在于母乳中,许多食物都含有低聚糖,大豆就是个典型代表。据分析,大豆 低聚糖系由棉籽糖、水苏糖和蔗糖组成,其数量约占大豆干重的1 0 左右。由于人体消化道缺乏 “洳1 ,6 糖苷键酶”,故不能分解吸收大豆低聚糖,但大豆低聚糖能被双歧杆菌等细菌所利用,并 产生一定量的气体,这就是多吃豆会出现腹胀的缘故。 8 黄芪及其它中草药对双歧杆菌增菌的影响研究 最近,由于保健功能食品营养、疗效口服液的出现,促进了各种低聚糖制品的开发与生产, 有抑制人体肠道腐败菌生成的低聚糖、促进人体肠道有益细菌双歧杆菌繁殖的低聚糖以及防止胆 固醇蓄积、抗龋齿、肿瘤等功能的低聚糖。国际上近年开发的低聚糖的成份与用途如下表所示: 表l 国际上近年开发的主要低聚糖 t a b l elt h e m a i no l i g o s a c
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