（水生生物学专业论文）中国明对虾雌性蛋白的纯化方法及性质研究.pdf

摘要 摘要 利用常规层析法( s e p h a d e x g 1 5 0 和d e a e c e l l u l o s e 一3 2 ) 以及一种改进方法( e d t a - - m 9 2 + 沉淀、电沈脱) 两种途径纯化了中国明对虾的成熟卵巢中的卵黄蛋白，利用电洗 脱法纯化了其卵和幼体中的卵黄蛋白。对卵巢中卵黄蛋白的研究表明：该蛋白是一种糖 脂磷类胡萝h 素蛋白，总分子量为4 0 9k u ，等电点为5 4 ，含糖量8 7 ，具有5 个亚基 ( 2 0 2k u 、1 7 1k u 、1 0 5k u 、8 0k u 和7 3k u ) ，亚基之间有1 个二硫键。卵中的卵黄蛋白 总分子量为4 0 4 k u ，有6 个亚基 ( 2 0 2 k u 、1 8 8 k u 、1 7 1k u 、1 0 5k u 、8 0 k u 和6 6 k u ) ： 幼体( n 4 期) 体内卵黄蛋白总分子量为3 9 0k u ，有5 个亚基( 2 0 2k u 、1 8 8k u 、1 7 1k u 、 1 0 5k u 、8 0k u ) 。从卵巢到卵再到无节幼体n 4 期，卵黄蛋白的亚基组成是变化的，其间 可能经过了亚基重排或者其他修饰过程。 制各了中国明对虾卵黄蛋白的抗血清并运用免疫学方法从成熟雌性中国明对虾血 淋巴中检测到了卵黄蛋白原。利用层析( d e a e - c e l l u l o s e - - 3 2 ) 或改进方法e d t a - - m g ”法对中国明对虾血淋巴处理后再用电洗脱法纯化了中国明对虾的卵黄蛋白原。中 国明刑虾卵黄蛋白原是一种糖脂磷类胡萝h 素蛋白，总分子量为4 7 6k u ，等电点5 2 ， 含糖量11 6 ，具有3 个亚基( 1 7 1k u ，9 4k u ，8 0k u ) ，亚基之间未发现二硫键。卵黄 蛋白原比卵黄蛋白更加不稳定。 分别用柱层析( d e a e - - c e l l u l o s e - - 3 2 ) 和电洗脱法提纯了克氏原螯虾卵巢的卵黄 蛋白。克氏原螯虾卵黄蛋臼也是一种糖脂磷类胡萝h 素蛋白，总分子量为4 8 1k u ，等电 点为5 6 ，含糖量1 9 8 ，具有6 个亚基( 1 9 8 k u 、1 7 6 k u 、1 3 2k u 、1 1 lk u 、9 2 k u 、8 2 k u ) ，亚基之间有1 个二硫键。比较了中国明对虾卵黄蛋白和克氏原螯虾卵黄蛋白部分 生化性质的异同。 关键词：中国明对虾；卵黄蛋白原；卵黄蛋白；纯化：性质 p u r i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no f t h ef e m a l es p e c i f i cp r o t e i ni nt h e m a r i n ep r a w n ，f e n n e r o p e n a e u sc h i n e n s i s a b s t r a c t ap u r i f i e dv i t e l l i nw a sf s o l a t i e df r o mt h em a t u r eo v a r i e so ft h em a r i n e p r a w n ，f e n n e r o p e n a e u sc h i n e n s i s w i t ht w om e t o d s ：c h r o m a t o g r a p h y ( s e p h a d e x g 一1 5 0a n d d e a e c e l l u l o s e 一3 2 ) a n dam o d i f i e dm e t h o d ( e d t a m 9 2 + p r e c i p i t a t i o na n de l e c t r o e l u t i o n ) ， t h ev i t e l l i n si no v aa n dn a u p l i u sl a r v a e ( n 4s t a g e ) w e r ep u r i f i e dw i t he l e c t r o e l u t i o n t h ev i t e l l i n i no v a r i e sw a sal i p o - g l y c o p h o s p h o c a r o p r o t e i no nt h eb a s i so fe x p e r i m e n t a lr e s u l t s ，w i t ha n a p p a r e n tm o l e c u l a rw e i g h to f4 0 9k u i t sp 1w a s5 4 c o n t a i n i n g8 7 o l i g o s a c c h a r i d e s f i v e s u b u n i t s ( 2 0 2k u ，1 7 1k u , 1 0 5k u ，8 0k u 和7 3k u ) a n do n ed i s u l f i d eb o n dw e r ed e t e c t e d s i x s u b u n i t s ( 2 0 2k u ，1 8 8k u ，1 7 1k u ，1 0 5k u , 8 0k u ，6 6k u ) w e r ef o u n di nt h ev i t e l l i no fo v a ，a n dt h e a p p a r e n tm o l e c u l a ro ft h i sp r o t e i nw a s4 0 4k u ，h i g h e rt h a nt h ev i t e l l i no fl a v a e ( 3 9 0k u ) i n w h i c hf i v es u b u n i t s ( 2 0 2k u ，1 8 8k u ，1 7 1 k u ，1 0 5k u ，8 0k u ) w e r ed e t e c t e d s u b u n i t so ft h e v i t e l l i n so ft h eo v a r i e s ，o v aa n dn a u p l i u sl a r v a ev a r i e si nn u m b e r t h i sp h e n o m e n o nm i g h tb e r e l a t e dt ot h es u b u n i t sr e a r r a n g e m e n to ro t h e rm o d i f i c a t i o n s i nt h i se x p e r i m e n t ，t h ep u r i f i e dv i t e l l i nw a su s e da sa n t i g e nt op r o d u c ea n t i s e r u mf r o ma r a b b i t w i t ht h ea n t i s e r u m ，v i t e l l o g e n i nw a sd e t e c t e di nt h eh a e m o l y m p ho ft h em a t u r ef e m a l e p r a w n t h e v i t e l l o g e n i n i nt h e h a e m o l y m p h w a s p u r i f i e d w i t h c h r o m a t o g r a p h y ( d e a e c e l l u l o s e 一3 2 ) o re d t a ：m g ”p r e c i p i t a t i o na tf i r s t ，a n dt h e np u r i f i e d v i t e l l o g e n i nw a so b t a i n e dw i t ht h em e t h o do fe l e c t r o e l u t i o n t h ev i t e l l o g e n i no fe c h i n e n s i s w a sa l s oc o n s i d e r e dal i p o g l y c o p h o s p h o - c a r o p r o t e i n i t sm o l e c u l a rw e i g h tw a s4 7 6k u ，p 1 w a s 5 2 ，c o n t a i n i n g1 1 6 o l i g o s a c c h a r i d e s t h r e es u b u n i t s ( 1 7 1k u ，9 4k u ，8 0k u ) w e r e d e t e c t e d n o n d i s u l f i d eb o n d sw e r ef o u n di nt h eb i n d i n go fp o l y p e p t i d es u b u n i t s v i t e l l o g e n i n w a sm o r eu n s t a b l et h a nv i t e l l i nd u r i n gt h ew h o l el a bp r o c e s s t h ev i t e l l i no ft h ec r a y f i s h p r o c a m b a r u sc l a r k i i 愠5a l s op u r i f i e dw i t ht w om e t h o d ss u c h a s c h r o m a t o g r a p h y ( d e a e - c e l l u l o s e 一3 2 ) a n d e l e c t r o e l u t i o n i tw a st h o u g h tt ob ea l i p o g l y c o p h o s p h o c a r o p r o t e i nt o o ，a n dt h ea p p a r e n tm o l e c u l a rw e i g h tw a s4 8 1k u ，p 1w a s 5 6 ，c o n t a i n i n g1 9 8 q l i g o s a c c h a r i d e s s i xs u b u n i t s , ( 1 9 8k u ，1 7 6k u ，1 3 2k u ，1 1 1k u ，9 2k u ，8 2 k u ) a n do n ed i s u l f i d eb r i d g ew e r _ ef o u n di nt h eb i n d i n go fp o l y p e p t i d eu n i t s a n dt h e n c o m p a r i s o no f p a r t i a lb i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c sb e t w e e nt h ev i t e l l i no f e c h i n e n s i sa n d 1 1 a b s t r a c t i i i i i i i i _ i i i i i i i i i i _ i i ；i i i i i _ _ 1 1 1 1 1 , i i i _ i i i i i i i i i i i p c l a r 蔚fw a sa j s oc o n d u c t e d k e yw o r d s ：f e n n e r o p e n a e u sc h i n e n s i s ，v i t e l l i n ，v i t e l l o g e n i n ，p u r i f i c a t i o n ，c h a r a c t e r i z a t i o n 1 i i 河北大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教育机构的学位或证书所 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示了致谢。 作者签名：誓h 觐皇晕一 一日期：冱止年上月卫日 学位论文使用授权声明 本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布 论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年月同解密后适用本授权声明。 2 、不保密留。 ( 请在以上相应方格内打“4 ”) 作者签名：皇墨! 鳖监 导师签名：蝴掐 日期：翌些年上月! ! 同 e t 期：竺年二l 月里1 9 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1 研究现状 雌性蛋白，又称雌性特异蛋白( f e m a l es p e c i f i cp r o t e i n ，f s p ) ，包括卵黄蛋白( v i t e l l i n ， v n ) 及其前体卵黄蛋白原( v i t e l l o g e n i r t , v g ) ，特异地存在于某些雌性卵生动物的体内。 一一t - 1 1 1 ：纪氍十年代，t e l l e r t l l 从惜古比天蚕蛾( h y a t o p h o r ac e c r o p i a ) 的血淋巴中发现了 种雌性特异蛋白，该蛋白和卵母细胞中的卵黄物质有相同的抗原性质，提出卵内的卵 黄物质来源于卵巢外组织。v i t e l l o g e n i n 最初是p a n 等人【2 】对雌性昆虫血液淋巴蛋白的一 种特称，厉来这一名称被广泛用于特指雌性动物衄浆中的卵黄蛋白原。_ 二十世纪六十年 代w a l l a c e 在对两栖类，爬行类进行研究时，也发现了雌性特异蛋白 3 1 。卵黄蛋白原为 卵生动物在性腺成熟时所产生的一种蛋白，只存在于雌性动物体内，是卵黄蛋白的前体 物质。卵黄蛋白和卵黄蛋白原为正在发育的胚胎提供氨基酸、脂肪、碳水化合物、维生 素、磷和硫等营养和功能性物质h 。6 1 。卵黄蛋白可以作为肛胎发育及其早期幼体发育 的内源性营养物质，并具有携带转运脂肪的功能1 5 , 6j 。卵黄蛋白和卵黄蛋白原之间存在着 免疫交叉反应1 。 就目前掌握的资料来看，有关对虾雌性蛋白的研究报道相对较少。在对虾的繁殖时 期，卵黄发生是一个很重要的生理过程。卵黄蛋白原是卵黄蛋白的前体，存在于对虾的 血淋巴中。在卵黄发生时期，卵黄蛋白原由血淋巴携带而进入卵巢，经过剪切、加工而 形成卵黄蛋白，成为卵黄的主要组成部分”。卵黄的发生是不连续的，在非生殖季节受 到抑制【1 1 。 卵黄是对虾卵巢以及卵中的主要物质，卵黄蛋白是构成卵黄的最主要的部分；而且， 在对虾的无节幼体时期，卵黄囊中卵黄蛋白是维持其生命的物质基础】。因此，研究卵 黄蛋白及其前体卵黄蛋白原有着十分重要的理论意义和现实意义。 1 11 卵黄蛋白和卵黄蛋白原的性质研究进展 国内科研工作者对一些鱼类的雌性蛋白进行了研究。鲤( c y p r i n u sc a r p i o ) 的卵黄 蛋白原可能由两个不同的亚基( 1 7 0k u 和1 6 5k u ) 组成；而团头鲂( m e g a l o b r a m a a m b l y c 耐d k ) 的卵黄蛋白则可能只含有两个大小相同的亚基( 1 5 0k u ) 1 2 】。香鱼 a m b l y c 咖d a ) 的卵黄蛋白则可能只含有两个大小相同的亚基( 1 5 0k u ) 【1 2 j 。香鱼 河北人学理学硕士学位论文 ( p l e c o g l o s s u s a l t i v e l i s ) 的雌性特异蛋白的分子量为4 6 5k u ，等电点为6 9 ，为糖脂磷蛋 白【1 3 】。大阪鲫鱼( c a r a s s i u s a u r a t u sc u v i e r i ) 雌性特异蛋白的分子量为4 6 6 0 0 0 4 0 0 0 k u l l 4 】。 目前已经从一些甲壳类动物中分离出了卵黄蛋a , n 卵黄蛋白原” 2 5 1 ，其分子量为 3 5 1 0 s u 2 6 1 。雌性蛋白为一种糖脂蛋白似乎是公认的1 5 吨5 1 。 中国明对虾( f e n n e r o p e n a e u sc h i n e n s i s ) j 目黄蛋白原含有两个亚基( 1 9 1k u 和8 5 k u ) ， 总分子量在2 7 6k u 以上，是一种糖脂磷蛋白，未检测到类胡萝h 素，半胱氨酸的含量很 低，亚基之间没有二硫键2 们。柳峰松等人从成熟的中国明对虾卵巢中纯化得到了一种卵 黄蛋白，并认为该蛋白具有类胡萝h 素，但是结合不紧密【2 4 1 。c h a n g 等在研究斑节对虾 ( p e n a e u sm o n o d o n ) 卵黄蛋a 原时没有能检测到类胡萝h 素【l 。日本囊对虾 ( m a r s u p e n a e u s j a p o n i c u s ) 2 7 1 卵黄蛋白的分子量约为5 3 0k u ( n z j 5 1 0k u 8 1 ) ，有3 个亚基，分 子量分别为9 lk u ，1 2 8k u ，1 8 6 k u 。罗氏沼虾( m a c r o b r a c h i u mr o s e n b e r g i f ) 卵黄蛋a 原 为糖脂蛋白1 2 6 ，其总分子量为7 0 0k u ，具有3 个亚基，分子量分别是1 7 0k u ，1 0 0k u ，8 9k u ( 也有报道为1 9 9k u ，1 0 2k u 和9 0 k u p s ) 。卵黄蛋白有2 个皿基，分子量分别为1 0 0k u 和8 9k u ，亚基之间没有二硫键交联。在卵黄蛋白和卵黄蛋白原中的只8 9 k u 亚基是糖多 肽。卵黄蛋白原和卵黄蛋白的氨基酸组成有稍微的不同。1 7 0 k u 亚基n 末端7 个氨基酸 序列与1 0 0k u 亚基也是相同的【2 。凡纳滨对虾( l i t o p e n a e u sv a n n a m e i ) 卵黄蛋白的总 分子量为3 8 8k u ( 或者5 4 0 k u 2 9 1 ，其总脂肪含量接近4 3 8 ，由3 个亚基组成，分子量 分别为8 7k u ，7 8k u 和4 6k u 。8 7k u 和7 8k u 的亚基能够被短沟对虾( p e n a e u ss e m i s u l c a t u s ) 以及斑节对虾卵黄蛋白的多抗识别。此外，7 8 k u 亚基n 末端的氨基酸序列和f | 本囊对 虾卵黄蛋白原及短沟对虾的卵黄蛋白十分类似，相似度达7 6 。圆二色法显示卵黄蛋白 中1 3 螺旋有2 5 ，而相应的0 折叠为3 7 ，不规则二级结构为1 4 。这些特点与昆虫 的微卵黄蛋白原( m ic r o v i t e l l o g e n i n ) 相似3 。 运用w e s t e r n b l o t t i n g 对处于卵黄发生时期的短沟对虾卵巢进行研究，显示有3 条高 分子量的条带( 2 1 0k u ，1 1 0k u ，7 8k u ) 【3 ”。斑节对虾的卵黄蛋白是一种糖脂蛋白， 有四个亚基，其分子量分别是1 6 8k u ，1 0 4k u ，8 3k u 和7 4k u f 3 2 1 。红螯光壳螯虾( c h e l o xq u a d r i c a r i n a t u s ) 卵黄蛋白的卵黄磷蛋白是一个分子量为3 6 9k u 的多聚体，山分子 量为8 5 4k u ，8 0 6 k u ，7 6 6 k u ，7 3 7k u 的四个亚基组成。染色分析其为糖一磷一类 胡萝h 素结合的复合蛋白【2 引。u c ap u g i l a t o r 卵黄蛋白的两个亚基的分子量分别为1 0 0 6 第t 章绪论 o o u 和1 2 3 5 0 0 u ，是糖多肽。虽然卵黄蛋白通常都是类胡萝h 素脂蛋白( c a r o t e n o l i p o p r o t e i n ) ，但是亚基组成数目因种而异。p r o c a m b a r u ss p ，的卵黄蛋白亚基数目是5 个，p a c h y g r a p s u sc r a s m p e s 的卵黄蛋白亚基数目是4 个，o t v h e s t i ag a m m a r e l l a 卵黄蛋白亚基数 目是8 1 1 个【3 4 1 。 目前对卵黄蛋白原形成卵黄蛋白的过程研究很少。l o u s i a 等对p o t a m o np o t a m i o s 卵黄蛋白原的加工修饰进行了研究。用 s 标记的甲硫氨酸对正常的处于卵黄发生期的 动物进行实验，结果表明1 8 1k u 和8 5k u 的多肽最先出现放射性，揭示了1 1 5k u 和 1 0 5 k u 的卵黄蛋白与卵黄蛋白原的多肽链源于1 8 1k u 多肽3 3 1 。 1 1 ，2 卵黄蛋白及卵黄蛋白原的产生部位 目前，人们对雌性蛋白的合成位置有不同的看法，但总的来说，有三个可能的部位： 卵巢、月 胰腺、脂肪体。对低等和高等的脊椎动物如鱼类、两牺类和鸟类的研究表明， 其卵黄蛋白是由肝合成的卵黄蛋白原的衍生物。卵黄蛋白原通过血液循环系统转运到卵 细胞而形成卵黄蛋 3 5 , 3 6 。 ，1 ，2 卵巢 卵巢是日本囊对虾卵黄蛋白原的合成位置。在体外培养( i nv i t r o ) 实验中，肝胰腺 合成的蛋白和卵黄蛋白抗血清之间不形成沉淀线。滤泡细胞是卵黄蛋白原的合成位置 l 3 7 。滤泡细胞也为卵黄形成提供了外源物质1 3 8 3 9 , 4 0 。y a a o 和c h e i n z e i l 3 7 j 认为日本囊对虾 的卵黄蛋白原是由滤泡细胞合成的，经血淋巴转运，被卵巢吸收并积累。他们未发现肝 胰腺合成卵黄蛋白原。短沟对虾卵巢中卵黄的合成效率是肝胰腺的2 3 倍，卵巢外组织 对卵黄发生的贡献是次要的【4 ”。 但是也有不同的观点：虽然卵黄蛋白的合成发生在卵巢，但是卵黄蛋白原在卵巢开 始成熟的时候由肝胰腺合成。在卵巢发育和卵黄蛋白原的积累之间没有十分紧密的联 系。在卵巢发育的不同时期罩，血淋巴和肝胰腺中蛋白的积累保持恒定 蚴。s h a f i r 等 4 3 指山卵黄蛋白原出卵巢外合成，被卵巢所吸收，成为合成卵黄蛋白的原料。到目前为止， 甲壳类中有关卵母细胞本身能够合成卯黄蛋白原的报道很少h 4 1 。线虫( c a e n o r h a b d i t i s e l e g a n s ) 的卵黄蛋白原是在肠细胞内合成，被卵母细胞i 吸收，但并不裂解；而海胆卵黄 蛋白原则是由消化道细胞和体腔细胞合成，分泌到体腔液被卵母细胞吸收并裂解为卵黄 蛋白【4 5 】。 间北大学理学硕士学位论文 1 1 2 2 肝胰腺 肝胰腺被认为是卵巢外主要的卵黄蛋白原合成位置，卵黄蛋白原分泌到血淋巴中， 由发育过程中的卵巢吸收后，在细胞内产生卵黄蛋白1 4 6 , 4 7 | 。通过从卵黄发生时期斑节对 虾肝胰腺m r n a 的c d n a 转录实验，发现斑节对虾其诱导产生的氨基酸序列与罗氏沼 虾卵黄蛋白原的相似度达到了4 8 。两个种类染色体d n a 中内含予有着相似的位置【4 8 1 。 但是也有不同的观点。通过酶联免疫分析( e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n t a s s a y , e l i s a ) 确认雌性印度明对虾( f e n n e r o p e n a e u si n d i c u s ) 的卵黄蛋白和卵黄蛋白原 集中于血淋巴，肝胰腺和卵巢中。在卵巢发育早期，血淋巴和肝胰腺中的卵黄蛋白原积 累增长，在卵巢发育后期，其含量明显下降。除了肝胰腺中卵黄蛋白原积累量较低之外， 在整个卵母细胞发生期，卵巢中的卵黄蛋白增长很明显。这些结果表明，肝胰腺中合成 的卵黄蛋白原不能满足处于卵黄发生期的印度明对虾卵母细胞发育之用1 4 9 1 。用3 5 s - m e t 标记的方法研究发现短沟对虾整个肝胰腺卵黄蛋白原的合成率达到卵巢合成卵黄蛋白 量的4 3 5 。凡纳滨对虾和短沟对虾卵黄蛋白原的合成量在肝胰腺蛋白合成总量中所占 的比例也很低【4 3 1 。 1 1 2 3 脂肪体 昆虫脂肪体能够合成卵黄蛋白原的报道已经很多f 5 0 4 1 ，但是目前有关对虾脂肪体能 够合成卵黄蛋白原的报道还很少。皮下脂肪组织和血淋巴是卵黄蛋白的卵巢外合成位置 1 5 5 1 。脂肪体可能是端足类和等足类的卵黄蛋白卵巢外合成部位1 5 6 1 。目前认为脂肪体和肝 胰腺最有可能是对虾卵母细胞之外的合成卵黄蛋白及卯黄蛋白原的位置。 1 1 2 4 双重来源 据目前的报道，甲壳动物卵巢中雌性蛋白的来源至少有两种方式：，卵黄蛋i ；t 黄蛋 白原在肝胰腺和卵巢中表达；仅在肝胰腺中表达 4 6 , 4 7 , 5 _ 7 】。也有人提出卵黄蛋白可能的两 个来源( 1 ) 可能在卵巢中合成；( 2 ) 可能以卵黄蛋白原的形式合成，之后通过血淋巴 进入卵巢，在这里被卵母细胞吸收d 4 1 。 洪水根3 9 j 对长毛明对虾( f e n n e r o p e n a e u sp e n i c i l l a t u s ) 的卵子发生进行了研究，指 出卵黄发生期间，卯质形成和积累了大量的卵黄粒、脂肪粒等营养物质。其所需要的原 料一是靠卵母细胞本身合成，另一个是细胞外来源。卵母细胞中的大量核糖体是合成卯 黄蛋白的场所，也是卵黄蛋白一个重要的细胞内来源。而且推测卵黄发生期间，卵黄蛋 第1 零绪论 白的细胞外来源是依靠滤泡细胞提供的。 堵南山等人【5 8 j 于旨出中华绒螯蟹( f r i o c h e i rs i n e n s i s ) 卵黄的来源是双重的：一方面 在蟹卵内由内质网和高尔基体产生卵黄原，然后卵黄原再融合成卵黄体；另一方面，蟹 卵以胞吞方式直接从血淋巴中接纳卵黄原，同时又通过指状小道由卵泡细胞间接接纳卵 黄原。肝胰腺可能会产生卵黄原，这些卯黄原随即进入血淋巴内，再直接或间接由蟹卵 接纳。 李朝军等通过研究大阪鲫鱼，指出卵黄蛋白发生的原料来源有二：一是由卵母细 胞以外的地方合成，称为异体合成，二是由卵母细胞自体合成。他们的研究表明，大阪 鲫鱼的滤泡细胞内存在大量的卵黄蛋白原和或卵黄脂磷蛋白，卵黄蛋白原可能是在滤泡 细胞内分解、重组成卵黄脂磷蛋白。他们认为，大阪鲫鱼卵黄蛋白原在肝细胞的粗面内 质网上合成，然后运送至卵巢，首先被滤泡细胞吸收，经裂解、重组后进入透明带。重 组后的产物( 卵黄脂磷蛋白) 在某种纤维的协助下到达卵母细胞表面，与受体结合后被 卵母细j 尥吞入。 通过研究p o l a m o n p o t a m i o s ，发现肝胰腺和卵巢合成5 个多肽，其总分子量为2 2 4k u ， 1 8 1k u ，1 1 5k u ，1 0 5k u 和8 5k u ，肝胰腺有可能分泌1 8 1k u ，1 1 5k u ，1 0 5k u 和8 5k u 多肽。主要的多肽1 1 5k u ，1 0 5k u 和8 5k u 是卵中卵黄蛋白的组成部分，然而2 2 4 k u 多 肽在肝胰腺和卵巢提取物中的卵黄蛋白原和卵黄蛋白组分中是较为次要的。由卵巢产生 的卵黄蛋白可能类似于由肝胰腺产生的卵黄蛋白。肝胰腺和成熟过程中的卵巢能够合成 卵黄蛋白原。在体外条件下，肝胰腺和卵巢能合成相同的卵黄蛋白原和卵黄蛋白亚基 ( 2 2 4 k u ，1 8 1k u ，t 1 5k u ，1 0 5k u 和8 5 k u ) 1 3 3 。 1 1 3 卵黄蛋白与卵黄蛋白原的营养价值 1 1 3 1 营养价值 虽然不同种类的卵黄蛋白原产生的方式不同，同源性也较差。但是所有卵生动物， 邑括蠕虫、海胆、鱼类、两栖类和鸟类，其卵黄蛋白原在结构和功能上是非常相似的。 它们在不同的生物体内行使着相似的生物学功能。卵黄蛋白原可以为正在发育着的胚胎 提供氨基酸、脂肪、碳水化合物、维生素、磷、硫等营养物质，还可以促进培养中的动 物卵母细胞生长和分化【4 】o 刘荣臻等在罗氏沼虾幼体食谱中添加卵黄蛋白原，经过3 2 天的饲养，发现实验 河北大学理学硕士学位论文 组幼体的发育较之对照组领先大致两个时期，当实验进行1 6 天后，两组已经有了明显 的差别。在解剖镜下，发现实验组有三种类型，即仔虾，十或十一期蚤状幼体和九或十 期蚤状幼体。对照组只有- - k o 类型，即全是九或十期蚤状幼体。由此可见，f s p 可以显 著促进幼体的发育。此外，刘荣臻等【6 0 】还对鱼类雌性特异蛋白对鱼类的繁殖能力的影响 也进行了研究。他们用雌鱼的性腺中提出的雌性特异蛋白对成熟的鲫、鳙等雌鱼进行了 腹腔注射，发现雌性特异蛋白( 复合物) 能够促进性腺的发育。实验组性腺的重量高于 对照组性腺的重量。此外，他们还发现，通过对青、草、鲢、鲤、鳊、梭、黄鳝、对虾 等进行腹腔注射雌性特异蛋白( 复合物) 的实验，其孵化率能提高2 0 以上。 1 1 3 2 生理功能 雌性蛋白的生理功能的研究主要集中在对某些鱼类的研究上。 朱洗等【6 l j 在研究蟾蜍离体排卵时发现，雌性特异蛋白比蟾蜍的脑垂体、绒毛膜促性 腺激素以及释放素激素的效果都明显。多次实验证明，雌性特异蛋白( 复合物) 刺激蟾 蜍跌卵的效果最好。同时，他们还发现，注射雌性特异蛋白能加速脂磷蛋白和高磷蛋白 的合成。 刘荣臻等对雌性特异蛋白复合物促进鱼类性腺发育以及提高孵化率的机制进行了 研究。他们利用向鱼体内注射雌性特异蛋白复合物的方法。注射之后，鱼体的代谢速度 加快，蛋白质及核酸含量都成倍增加，进而促进了亲鱼性腺在良好营养条件下迅速达到 了成熟状态，使得产卵顺利且一次产完。亲鱼的死亡率也因此而降低【1 3 1 。该蛋白复台物 不仅有促卵成熟及提高受精率，孵化率，且增加亲鱼和幼苗的活力，使产卵后的亲鱼大 大减少死亡，该物质是从鱼体内分离出来，无毒副作用，也不引起免疫排斥反应。该蛋 白与激素混合使用催产，可以调节和消除激素对鱼体的副作用。他们发现：( 1 ) 雌性特 异蛋白能够显著促进蟾蜍跌卵，并且其浓度越高，促跌卵效果越快。( 2 ) 雌性特异蛋白 腹腔注射后造成鱼血清高钙效果，有促高钙效应3 0 左右。( 3 ) 以阪鲫和草鲫为材料， 经雌性特异蛋白复合物注射后其肝脏中g 6 p d 酶的活性平均上升了5 8 4 3 1 6 2 】。 刘荣臻等通过对几种鱼和对虾注射雌性特异蛋白，发现( 1 ) 雌性亲鱼注射雌性特 异蛋白后，腹部膨大柔软，卵巢轮廓明显；卵粒大小整齐、有光泽、饱满，好于对照雌 鱼。( 2 ) 注射雌性特异蛋白后，雌鱼产卵顺利，产后亲鱼死亡率低，产出的卵游离度好。 对照组雌亲鱼产卵很不顺利，产卵后死亡率也较高。( 3 ) 雌鱼注射雌性特异蛋白后，卵 第1 章绪论 子的受精率和受精卵孵化率都有提高。总之，雌性特异蛋白可以作为催产剂用于鱼类的 人工繁殖生产中【6 3 j 。 王浩等人实验组黄鳝腹腔注射雌性蛋白复合物，1 0 天后注射释放素，对照组只注射 释放素。发现实验组的雌黄鳝的性腺重量比对照组重，所产的卵质量好，游离度也好， 并且受精率，孵化率也高，出膜时间比对照组提前2 3 天，缩短了孵化时间”i 。 卵黄蛋白原还有一些特殊的功能。s h y u 等发现，两种性别的海胆( p s e u d o c e n t r o t u s p u r p u r a t u s ) 性腺中都具有卵黄蛋白原f 6 5 1 。u n u m a 等用免疫组化方法证明，在海胆( p s e “d o c e n t r o t u sd e p r e s s u s ) 两种性别的性腺中都含有卵黄蛋白原【4 5 1 。在性腺的成熟过程中， 精巢中卵黄蛋白原含量降低，该蛋白转变称卵黄蛋白。这就首次证明了精巢中的卵黄蛋 白原为精子发生提供营养物质。m o n t o z i 等【6 创证明卵黄蛋白原除具有营养功能外，还可 以结合钙离子、锌离子、铁离子、镍离子等并运到卵母细胞。此外，k o m a t s u 等人6 7 1 报道甲壳类的螯虾( s a n dc r a y f i s h ) 以及鳗鱼的卵黄蛋白具有潜在的钙离子依赖蛋白酶 活性。卵黄蛋白原不仅可以转运金属离子，还可转运甲状腺素、维生素a 、类胡萝h 素 以及核黄素入卵母细胞。 1 2 研究目的 中国明对虾属于节肢动物门、甲壳纲、软甲亚纲、十足目、游泳亚目、对虾科，又 名中国对虾，东方对虾，俗称对虾、明虾、大虾、青虾( 雌性个体) 、黄虾( 雄性个体) 等，主要分布在黄海、渤海和东海北部，国外分布在朝鲜，是我国和朝鲜的特有种。成 体的雌虾大于雄虾。雌虾体色青灰，因此又称青虾，体长为1 8 2 3c l r l ，体重6 0 8 0g ； 雄虾体色黄，又称黄虾，体长1 5 2 0c m ，体重3 0 4 0g 。中国明对虾适应能力强、生 氏速度快，耐低温，其壳薄，可食比例大，肉质鲜美，在国际市场销路较广且售价高， 是亚热带和温带沿海优良的养殖品种。1 9 9 2 年，中国明对虾的产量曾约占我国养殖虾类 总产量的7 8 ，世界产量的2 0 。卵黄蛋白作为其幼体发育的重要营养源已经受到人 们的重视，对于其卵黄发生的过程及机理也有了一定认识，但是目前尚未有人系统研究 卵黄蛋白原与卵黄蛋白的性质，以及卵和幼体中卵黄蛋白的相关性质。由于人们对甲壳 动物的雌性蛋白研究较少，故尚未比较过其中一些种属之间卵黄蛋白的性质。 本论文拟从研究卵黄蛋白原及卵黄蛋白的生化性质入手，对中国明对虾体内的雌性 7 河北大学理学硕十学位论文 蛋白的生化性质做一个比较系统的研究，进而横向比较了中国明对虾和克氏原螯虾卵黄 蛋白的提纯方法和部分生化性质，阐明它们在纯化方法和生化性质方面的异同点，使得 我们对中国明对虾卵黄蛋白及卵黄蛋白原自身的性质有一个较为深刻的认识。 1 3 研究意义 在人工养殖条件下，多数对虾种类卵巢很难发育，必须通过切除跟柄才能促使亲虾 性成熟。该方法对于大多数甲壳动物是有效的，但是也有副作用：因切除r 艮柄后失去性 腺抑制激素对性腺的抑制，亲虾的卵巢会不断地成熟，不断地产卵，导致产卵质量越来 越差直至衰竭死亡。并且由于卵中没有充足的卵黄，质量差，易造成孵化率降低。只有 弄清卵黄蛋白原和卵黄蛋白的产生机理，才可以最终有效的解决该问题，真正实现人工 控制亲虾卵巢成熟1 6 剐。对于卵黄蛋白原及卵黄蛋白的生化性质研究是解决该问题的第一 步。 中国明对虾是一种经济价值比较大，人们对其养殖也进行的比较早，有关卵黄蛋白 原和卵黄蛋白的提纯以及一些性质的研究也有一些报道，但是目前尚没有人对中国明对 虾的卵黄蛋白以及卵黄蛋白原进行系统研究和比较。我们认为对中国明对虾的卵黄蛋白 原和卵黄蛋白进行系统的研究比较将会有较大的理论意义。 对中国明对虾血淋巴中的卵黄蛋白原、卵巢中的卵黄蛋白、卵以及无节幼体中的卵 黄蛋白进行研究比较可以使人们更加清楚的了解从卵黄蛋白原到卵黄蛋白的变化，以及 卵黄蛋白从卵巢、卵最后到幼体时期的成分变化；将中国明对虾的卵黄蛋白的性质与甲 壳动物其他种类的卵黄蛋白进行比较，可以发现中国明对虾卵黄蛋白本身的一些特性和 甲壳动物卵黄蛋白的一些共同性质。 对虾对蛋白质的需求量较大，故在饵料的配制中，首要考虑的就是其中蛋白质的含 量。幼体饵料到成虾饵料，其含量变化较大的就是蛋白质的含量。在目前饵料的配制过 程巾，人们考虑的只是蛋白质的含量，但是对其中氨基酸的组成合适考虑的较少。目前 人们对于虾类氨基酸需求的研究主要是在饵料中添加一种或者几种游离氨基酸，来研究 某些氦基酸对对虾幼体生长的影响。t e s h i m a 等【叫曾对日本囊对虾幼体进行过研究，发 现添加精氨酸盐酸盐能够提高酪蛋白饵料的营养价值。麦康森等7 0 1 曾对中国咀对虾的幼 体饲喂添加必需氨基酸的饵料，但未收到预期效果。有关幼体饵料或者添加剂的研究还 第1 章绪论 需要深入。在水产养殖中，卤虫的无节幼体是一种较好的开口饵料。m i t s u y o 等【7 l 】认为 这些饵料有很高营养价值的原因是由于其体内残存有大量的卵黄蛋白。目前有关卵黄蛋 白氨基酸含量( 尤其是必需氨基酸含量) 与卵、幼体氨基酸含量的比较研究尚未见报道。 卵黄蛋白与胚胎及幼体生长发育之间的关系还需要深入研究。本文通过研究卵黄蛋白和 卵黄蛋白原的提纯方法以及生化性质，以期刘阐明卵黄蛋白的生物学作用打下基础。 对于某些低等脊椎动物，卵黄蛋白原通常是雌体在1 7t 3 一雌二醇( e 2 ) 的诱导下产 生，雄性动物或未成熟的雌性动物在岛或其类似物的诱导下也可大量合成。随着人们 对杀虫剂、去污剂或者其他化工产品对人类及野生动物内分泌危害程度的关注，非正常 表达的卵黄蛋白原已经作为一种生物指标用来检测环境中的污染物质 7 2 , 7 3 1 。 河北大学理学硕士学位论文 第2 章中国明对虾卵黄蛋白的纯化及卯黄蛋白原的鉴定 2 1 引言 甲壳动物的卵黄蛋白主要存在于其成熟雌性个体的卵巢中，卵黄蛋白主要存在于成 熟雌性个体的血淋巴中。目前人们已经分离出同本囊对虾、斑节对虾、儿纳滨对虾、短 沟对虾、罗氏沼虾、红壳光螯螫虾等种类的卵黄蛋白睁1 8 ，2 卜2 5 , 2 l 2 9 1 ；也对中国明对虾、 罗氏沼虾的卵黄蛋白原进行了纯化2 0 2 6 j 。目前，提纯卵黄蛋白及卵黄蛋白原的方法主 要有以下几种：蔗糖一e d t a 一硫酸铵沉淀法【7 4 1 、大柱制各电泳法、密度梯度离心法 1 9 , 7 6 1 、电洗脱法州、电泳浓缩器与高效液相色谱仪法 7 7 】、凝胶过滤法 2 5 , 7 8 1 、凝胶过滤一 阴离子交换层析法1 1 7 3 8 1 等。 在本章中，我们采用s e p h a d e x g 一1 5 0 凝胶过滤和d e a e - - c e l l u l o s e 一3 2 层析法纯化了 中国明对虾卵巢中的卵黄蛋白；同时还采用改进的选择沉淀法和电洗脱法纯化出了该蛋 白。后者的纯化过程十分简捷，是纯化中国明对虾卵黄蛋白的最好途径。通过免疫家兔 得到了卵黄蛋白的抗体。由于卵黄蛋白与卵黄蛋白原有着相同的免疫原性，在得到卵黄 蛋白的抗体之后，我们通过双向扩散初步确定了中国明对虾成熟雌性个体的血淋巴中存 在着卵黄蛋白原i 然后通过电泳找到了卵黄蛋白原在电泳图谱中的位置，为进一步研究 卵黄蛋白原的性质打下了基础。 2 。2 材料与方法 2 2 1 材料 中国明对虾雄虾于1 1 月份采自山东荣成海珍育苗场，雌虾于4 月份采自黄骅海水 养殖原良种场。雌虾的卵巢饱满，呈墨绿色。用注射器抽取雌雄虾的血淋巴( 加入最终浓 度为5 0 0u m l 的肝素及0 5mm o l l 的苯甲基磺酰氟( p m s f ) ) ，1 00 0 0r m i n 高速冷冻 离心后取上清液，于一8 0 。c 冰箱中保存；卵巢剥离后装入离心管中，也于一8 0 。c 冰箱中保存 备用。 免疫动物为健康雄性新西兰大白兔，体重约3 虹。 第2 罩中国明对虾卵黄蛋自的纯化及卵黄蚩自坂的鉴定 2 2 2 仪器 d y y - 2 c 型电泳仪、d y c z 2 4 d 型垂直电泳槽、d y y - i i l 4 3 型蛋白质回收槽( 北京 六一仪器厂) ，t l g 1 6 g a 型高速冷冻离。t l , 机( 上海安亭科学仪器厂) ，8 8 2 3 a 型紫外 检测仪( 北京新技术研究所) ，l g j 1 0 型冷冻干燥机( 北京四环科学仪器厂) ，层析柱， 蠕动泵( 保定蓝格蠕动泵厂) 。 2 2 3 方法 2 ，2 3 1 卯巢粗提液的制备 取成熟的中国明对虾卵巢o 5g ，加入5m l t r i s h c t 缓冲液( o 5m o l l ，p h 7 0 ) 及p m s f 蛋白酶抑制剂，玻璃匀浆器匀浆；未成熟卵巢也按上述方法制成匀浆。两种 匀浆液置入离一1 1 , 管中用高速冷冻离心机于1 00 0 0r p m 离心2 0r a i n 。离心完毕后，除去 上层脂肪，耿上清液贮存于1 5m l 离心管中备用。 2 2 3 2 卯黄蛋白的鉴定 1 ) 对比电泳 用成熟和未成熟卵巢粗提液进行不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳( p a g e ) ，浓缩胶浓度 4 ，p h6 8 ，分离胶浓度为6 ，p h8 9 。电泳结束后，考马斯亮蓝r 2 5 0 染色，7 乙 酸中脱色。 2 ) 脂蛋白染色 山于中国明对虾卵黄蛋白是一种脂蛋白，故可用相关的方法进行染色。 成熟卵巢粗提液在结束p a g e 后，用用6 0 乙醇饱和苏丹黑溶液进行染色，5 0 乙 醇中脱色【7 引。 2 23 3 色谱法纯化卯黄蛋白 1 ) s e p h a d e x g 一1 5 0 凝胶过滤先用t r i s h c i ( 1 0mm o l l ，p h 7 0 ) 缓冲液对 s e p h a d e x g 1 5 0 柱( 8 0c m 0 5o m ) 进行平衡，加入卵巢粗提液l m l 后开始用同种缓冲 液沈脱，流速1 2m l h ，蛋白核酸检测仪于2 8 0 砌处检测洗脱液，收集各洗脱峰，用蔗 糖浓缩并用电泳检测。将含有卵黄蛋白的洗脱峰经透析除去蔗糖后