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摘要 骨骼肌细胞凋亡与运动方式、运动负荷量和骨骼肌的亚细胞结构 有关。l i b e m 等也曾对哪种类型的肌纤维更易于发生凋亡的问题进行 过研究，他们认为慢肌的凋亡倾向要小于快肌。周婕等人的研究结果 则显示慢肌纤维比快肌纤维更易于发生凋亡。本研究采用不同强度的 跑台运动模型，以大鼠腓肠肌内侧头为研究对象，对运动诱导的骨骼 肌细胞凋亡和肌纤维类型的关系进行研究。 研究方法：成年雄性s d 大鼠3 0 只随机分为安静对照( c ，i 产1 0 ) 、 中等强度运动组( p m e ，n = l o ) 和大强度运动组( s 肛，n = 1 0 ) 。p m e 组跑台速度为1 8m m i n _ 1 ( 相当于6 0 一7 0 v 0 2 一) ，运动1 0 0 m i n ， 唧组跑台速度为2 8 m m i n 。( 相当于9 0 v 0 2 。) ，运动2 0 r n j n 。安 静组和运动组大鼠分别于安静状态和运动后即刻断头处死，取大鼠后 肢腓肠肌内侧头，分别以原位末端标记法( t u n e l ) 测试细胞凋亡， a t p 酶染色法鉴定i 型和i i 型骨骼肌纤维，s d s p a g e 凝胶电泳分离 m 正 ci 、m h c i i a 、m h c i i b 和m h c i i x 。 研究结果： ( 1 ) 在安静对照组大鼠腓肠肌内侧头检测到少量t u 屹l 阳染 细胞核；中等强度运动组，出现了散在的t 【j n e l 阳染细胞核，凋亡 指数为1 9 6 0 6 1 8 ；大强度运动组也检测t 切姬l 阳染细胞核，凋 亡指数为1 1 7 0 4 6 1 。 ( 2 ) 中等强度运动组( p m e ) ，细胞凋亡指数与i i 型肌纤维的面 积百分比的相关系数r 为07 7 6 ，p o 0 5 ：大强度运动组( s h e ) ，细 胞凋亡指数与i i 型肌纤维的面积百分比的相关系数r 为0 7 3 7 ， p 0 0 5 。 ( 3 ) 中等强度运动组细胞凋亡指数与m h c i i a 亚型百分比呈高 度正相关，相关系数r 达o 7 8 6 ，p d ；与m h c i i b 亚型百分比呈 低度正相关，相关系数r 为0 2 5 4 ，p o 0 5 ，无统计学意义；与m h c i 亚型百分比呈高度负相关，相关系数r 为一o 8 1 7 ，p 0 。大强度 运动组的结果与中等强度运动组基本一致。 结论：i i 型肌纤维百分比高的骨骼肌在大强度跑台运动和中等强 度跑台运动中更易于出现细胞凋亡，即跑台运动更容易诱导快肌纤维 比例高的骨骼肌出现细胞凋亡。 关键词：运动骨骼肌细胞凋亡肌纤维类型 、 & ab s t r a c t t h ea p o p t o s i so fs k e l e t a lm u s c l ec e l l si sc o r r e l a t e dw i t ht h e s 哆l e ， v o l u m eo ft l 。a i n i n ga n dt 1 1 es u bc e uc o n s 仃u c t i o n l i b e r ae f 口正h a v ed o n e s o m er e s e a r c h e so nt h eq u e s t i o n ，w h i c ht y p eo fm u s c l ef i b e ri se a s i e rt o a p o p t o s i s t h er e s u l to ft h e i r r e s e a r c hs h o w e dt h a tt y p e is k e l e t a l m u s c l ei se a s i e rt o 印o p t o s i sm a nt y p ei i d o e s h o w e v e r z h o uj i e8 f 口z a r g u e dt h a tt y p e i is k e l e t a lm u s c l ei se a s i e rt o a p o p t o s i st h a nt y p e i d o e s i nt h i sr e s e a r c h ，山ee x e r c i s et r a i n i n gm o d e l so fd i 缳；r e n t i n t e n s i t y w e r e a d o p t e d ， r a t s g a s t r o c n e m i u s e sw e r es t u d i e d ，a n dt h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e nt h ea p o p t o s i so fs k e l e t a lm u s c l ec e l l sa n dt h e s k e l e t a lm u s c l ef i b e r 帅ew a sa n a l y z e d m e t h o d ： 3om a l ea d u l ts p r a g u e - d a w l e yr a t sw e r er a n d o m l yd i v i d e di n t ot h r e e g r o u p s ：c o n t r o l ( c ，n = 1 0 ) ，m i d d i ei n t e n s i t ye x e r c i s e ( p d 征，n = 1 0 ) a n d h i g hi n t e n s i t ye x e r c i s e ( s 髓，n = 1 0 ) t h er a t so fp m ea n ds h eg r o u pr a n o nt h e 仃e a d m i l lt of a t i g u ew i t ht h es p e e do f18n l m i n ( 6 0 70 v r 0 2 m a x ) a n d2 6 8r i l m i n ( 9 0 v 0 2 l n a x ) r e s p e c t i v e l y t h er a t si nc o n t r 0 1g r o u pa n d i ne x e r c i s eg r o u pw e r ek i l l e db yd e c a p i t a t i o nr e s p e c t i v e l yi nq u i e ts t a t u s a n di m m e d i a t e l ya r e re x e r c i s e ；t h eg a s t r o c n e m i u s e sw e r er e m o v e d a n dt e s t e df u r t h e r t h en u c l e ii n a p o p t o s i sw e r el a b e l e db y t u n e l t h et y p eim u s c l ef i b e r sa n dt y p ei im u s c l ef i b e r sw e r e d i s t i n g u i s h e dt h r o u g ha r p a s ec o l o r a t i o na n dt h ei s o f o r m so f cw e r e s 印a r a t e di n t om h ci 、m h ci ia 、m h ci i ba 1 1 dm h ci ixt k o u g h s d a p a g ee l e c t r o p h o r e s i s r e s u i t s ： ( 1 ) f e wt u 愿l p o s “i v em y o n u c l e iw e r ef o u n di nt h ec o n t r o lg r o u p t u n e l p o s i t i v em y o n u c l e is c a t t e r e di np m eg r o u pa n ds h e 殍o u p t h e a p o p t o s i si n d e xo fp m 哐g r o u pw a s1 9 6 0 6 1 8 ；t h es 髓g r o u pw a s 1 1 7 0 4 6 1 ( 2 ) i i lp m e 野o u p ，t h ec o e m c i e n to fa p o p t 6 s i si n d e xa n dt h e p e r c e n t a g eo ft y p e i im u s c l e6 b e r si s o 7 7 6 ( p 0 0 5 ) ：i ns h eg r o u p ， t h ec o e 珩c i e n to fa p o p t o s i si n d e xa n dt h ep e r c e n t a g eo f b ，p e i im u s c l e 舶e r si s0 7 3 7 ( p o 0 5 ) ( 3 ) i n p m e 铲o u p ，m e 印o p t o s i si n d e xi sh i g hp o s i t i v ec o l l r e l a t e dw i t h t h ep e r c e n t a g eo f c i ia ( r = 0 7 8 6 ，p o 0 5 ) ；t h ec o e 伍c i e mo fa p o p t o s i s i n d e xa n dt h ep e r c e n t a g eo f m h c i ibi so 3 6 4 ( p o 0 5 ) ；t h ep e r c e l l t a g eo f t 、m cii s h i g hn e g a t i v ec o n l a t e dw i t ht h e a p o p t o s i si n d e x ， t h e c o e f j e i c i e n ti s - o 8 7 7 ( p o 0 5 ) t h er e s u l t so fs 髓g r o u pi si na c c o r d e d w i t ht h ep 髓g r o u p c o n c l u s i o n ： t h es k e l e t a lm u s c l e sw i t hh i g h e rp e r c e n t a g eo ft y p e i im u s c l e6 b e r a r ee a s l e rt o a p p e a ra p o p t o s i s ，廿1 a t st os a y ，t h et r a i n i n go nt r e a d m i l l s m o r ee a s i l yi n d u c es k e l e t a lm u s c l e sw i t hh i g hp e r c e n t a g eo ff a s t t w i t c l l m u s c l ef i b e r st 0o c c u ra p o p t o s i s k e y w o r d s ： e x e r c i s e ；s k e l e t a lm u s c l e ；a p o p t o s i s ；m u s c l ef i b e rt y p e t v 运动诱导的大鼠腓肠肌细胞凋亡与肌纤维类型百分构成的研究 1 前言 细胞凋亡是目前生命科学和医学领域的研究热点，但是对于骨骼 肌细胞凋亡的研究，尤其是生理状态下骨骼肌细胞凋亡的研究并不 多，其中可能有一部分原因是由于骨骼肌细胞是多核细胞，因此其凋 亡的表现形式与单核细胞凋亡会有所区别，它的检测难度也更大一 些。而随着细胞凋亡研究的进一步深入，各种形态学、生化、细胞生 物学检测方法的完善，骨骼肌细胞凋亡的神秘面纱逐渐被人们揭开。 动物实验研究显示，运动后无论是在正常肌肉中还是病理状态下 的肌肉中，骨骼肌细胞都出现了凋亡，凋亡的形态学表现与普通凋亡 细胞相似，即核固缩、质膜发泡、细胞器的紧缩，凋亡小体形成，同 时出现了c a n + 浓度增加、s o d ( 超氧化物歧化酶) 活性下降、a ( 丙 二醛) 数量上升。b o m 等【l 】对纯种马进行3 个月跑台训练，在肌肉活检 中，使用原位末端标记法( t l n 江l ) 和d n a 琼脂糖凝胶电泳的研究 后发现，运动训练组的肌细胞凋亡数量显著高于控制组，并推测新生 的更具生命力的细胞不断代替凋亡的异常肌细胞、是训练导致体能增 长的原因。p o d l l o r s k a o k o l o w 【2 j 在成年小鼠上进行运动性肌纤维损伤 细胞凋亡分析，未经运动的小鼠在进行一夜轮形笼自发跑步后，凋亡 肌细胞明显高于对照组，在4 天后减少。这些说明由运动训练造成的 肌肉损伤有肌细胞凋亡成分存在。j i l l 【3 j 报道了力竭运动后骨骼肌中 s o d 活性下降。b r a d v 【4 j 报道了力竭游泳后大鼠骨骼肌和红细胞中 a 值升高。近几年来国内也有不少研究，周未艾等【5 】通过不同跑 步速度训练大鼠发现，凋亡的肌细胞出现率略呈随跑速增加而增高的 趋势，用旧a 作为指标检测氧自由基的作用，发现各运动组a 值均比安静组略有增加，各运动组之间m d a 值接近，同时，a 值与细胞凋亡出现率一样有随运动强度增加而增高的趋势。金其贯、 刘丽萍等【6 】对大鼠进行不同负荷的游泳训练，结果发现，长期大运动 量训练可导致骨骼肌细胞凋亡，引起骨骼肌细胞的微细结构损伤，运 动能力和恢复能力下降。郑师陵等【7 】利用t u n e l 法测游泳运动后， 大鼠骨骼肌中凋亡细胞明显增多，第一周比例最高，第二周开始下降， 硕士学位论文 但第二、三周与对照组比仍有显著差异，同时骨骼肌线粒体膜电位发 生相应改变，第一周下降，第二周明显升高，第三周逐渐降低，但仍 高于对照组。 以上结果在某种程度上说明，骨骼肌细胞凋亡与运动方式、运动 负荷量和骨骼肌的亚细胞结构有关。周婕【8 】等人的研究结果显示中等 强度的运动比大强度运动更易诱导比目鱼肌细胞凋亡，并且在相同运 动组，比目鱼肌中检出的凋亡率明显高于胫骨前肌。大鼠的比目鱼肌 是典型的慢肌( 8 7 为i 型肌纤维) ，胫骨前肌则是快肌的代表( 只 含1 2 的i 型肌纤维) 9 】。众所周知，快、慢肌的亚细胞结构、代谢 特征和运动特性是有差异的。那么周婕等人的研究结果是否意味着， i 型肌纤维百分比高的骨骼肌在运动中更容易出现细胞凋亡呢? 而 l i b e r a 等人【1 0 j 的实验证明快肌纤维( i i 型肌纤维) 比慢肌纤维( i 型肌纤维) 更易于发生凋亡。因此本研究采用不同强度的运动模型， 以大鼠腓肠肌内侧头为研究对象，对运动诱导的肌细胞凋亡和骨骼肌 百分构成的关系进行研究。 运动诱导的大鼠腓肠肌细胞凋亡与肌纤维类型百分构成的研究 研究对象与方法 2 。1 研究对象及运动模型 2 1 1研究对象 成年雄性s d 大鼠3 0 只，由中南大学湘雅医学院动物学部提供， 为清洁级实验动物。体重2 5 9 2 1 9 5 9 ，分笼饲养，自由饮食，国家 标准啮齿类动物饲料饲养( 中南大学湘雅医学院动物学部提供) 。室 温2 0 2 4 ，光照时间为7 ：o o 1 9 ：0 0 。 2 1 2运动方式 将3 5 只大鼠进行6 天运动跑台适应，速度为l o m m i n ，时间为 1 0 m i n - d 。在适应性训练期间，淘汰了5 只最不肯跑的大鼠，余下的 3 0 只随机分为安静对照( c ，n = 1 0 ) 和运动( e ，n = 2 0 ) 两大组，运 动组又分为中等强度运动组( p 皿，n = 1 0 ) 和大强度运动组( s 艇， n = 1 0 ) 。休息两天后，第8 天进行正式实验。正式实验时，其运动强 度根据b e d f o r d 的最大摄氧量确定，运动强度超过9 0 最大摄氧量为 大强度运动，运动强度相当于6 0 7 0 最大摄氧量为中等强度运动。 根据动物运动速度和运动时间的不同将运动组分为短时间、大强度运 动组( s 砸组，速度：2 8 1 1 1 m i n ，2 0m i n ) 、长时间、中等强度运动组( p ， 速度：1 8 r i l m i n ，1o om i n ) ，运动中采用声音刺激或毛刷机械刺激鼠尾 部，以使鼠保持持续性运动，在整个运动过程中，未使用电刺激【l 。 2 1 3疲劳标准 动物在熟悉跑台后，即可进行一定强度的跑台运动，表现出较强 的运动能力。在实验中主要根据下列指标判定动物的运动能力【l l 】： ( 1 ) 能否维持原强度工作：动物刚进入跑台时，一般都可进行 规定强度的运动，但一段时间后，则需靠额外刺激( 声音或毛刷刺激) 才能维持原强度的工作； ( 2 ) 刺激频率：刺激频率用每分钟刺激动物的次数表示。动物 由于运动能力下降会触及跑台后档板，因而需要给予声音或毛刷刺激 ( 动物刚进入跑台时，有意对抗运动而触及挡板的情况除外) ，以便 使动物继续运动，在刺激动物时，一般先给予声音刺激，后给毛刷刺 硕士学位论文 激。动物疲劳程度越深，刺激频率越高： ( 3 ) 刺激时间：是指每次刺激动物的持续时间，动物的运动能 力越低，每次刺激的时间越长，我们在本研究中将刺激时间分为3 个 等级，即短时间刺激( 1 s 之内) 、较长时间刺激( 1 2 s ) 和长时间刺激( 2 s 以上) 。 规定，在运动过程中，每次刺激时间在1 2 s 以上、刺激频率在4 次m i n 以上，不能维持原强度工作的动物为疲劳。个别运动不能持续 规定的运动时间时，中间可休息2 4m i n ，但总休息时间不超过l o m i n 。连续刺激或休息时间超过1 0m i n 仍不能维持原强度工作的动物， 视为力竭。 2 2 实验仪器与试剂 2 2 1仪器 ( 1 ) 匝m 1 2 3 0 透射电子显微镜日本电子公司 ( 2 ) 8 2 0 轮转组织切片机美国a o 公司 ( 3 ) n i l ( o ne 6 0 0 显微照相图像采集系统日本尼康公司 ( 4 ) 7 2 2 型光栅分光光度计上海第三分析仪器 ( 5 ) p t 跑台浙江省杭州立泰科技有限公司 ( 6 ) a e 2 6 0 s 电子分析天平梅特勒托利多仪器( 上海) 有限 公司 ( 7 ) s 衄w 2 1 6 0 0 型三用电热恒温水箱天津市莱斯特仪 器有限公司 ( 8 ) h h b s t - 1 a 型恒温培养箱长沙医疗器械厂 ( 9 ) t g l 1 6 c 台式高速离心机湖南星科科学仪器有限公司 ( 1 0 ) s k 1 快速混匀器江苏中大仪器厂 ( 1 1 ) d y v l o 三恒多用电泳仪北京六一厂 ( 1 2 ) p h s 4 c t 精密酸度计上海精密仪器仪表有限公司 ( 1 3 ) i m a g e m a s t e r2 dp l a t i n u m ( 双向凝胶扫描仪) a m e r s h a m b i o s c i e n c e sa bb j6 r k g a t a n3 0 ，s e 一75l8 4u p p s a l a ，s w e d e n 2 2 2 试剂 运动诱导的大鼠腓肠肌细胞凋亡与肌纤维类型百分构成的研究 ( 1 ) 原位末端标记细胞凋亡检测试剂盒( t u 忆l 试剂盒) ：产 自武汉博士德生物工程有限公司，购于长沙丽欣生物工程有限公司； ( 2 ) 考马斯亮兰试剂盒皆购于南京建成生物工程有限公司； ( 3 ) 甲醇、无水乙醇、冰醋酸、二甲苯、多聚甲醛、磷酸氢二 钠、氯化钠、氯化钙、氯化钴、硫化铵、磷酸二氢钾，a t p n a 2 ，h c l 等分析纯分别产自上海化学试剂厂及湖南师范大学化学试剂厂。 2 3组织取样 对照组和运动组大鼠分别于安静状态和运动后即刻断头处死，取 左后肢腓肠肌内侧头，并切割为上、中、下三部。下部投入4 的多 聚甲醛缓冲固定液中固定4 8 h 后进行常规石蜡包埋。中部和上部立 即置于液氮中保存备用。 2 4指标检测 2 4 1 细胞凋亡检测 一、切片 将大鼠腓肠肌下部置4 的多聚甲醛缓冲固定液中固定4 8 h 后， 常规石蜡包埋，然后进行石蜡切片，切片厚度5 0um ，载玻片粘贴。 二、d n a 原位末端标记法 采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的d u t p 缺口末端标记法 ( 1 b r m i n a ld e o x y n u c l e o t i d yt r a n s f e r a s em e d i a t e dd u t pn i c ke n d l a b e l i n g ，t u n e l ) 对凋亡细胞进行检测。按细胞凋亡检测试剂盒说 明书操作。5um 厚切片常规脱蜡入水，3 乙酸( p h 2 5 ) 室温1 0 m i n ， 蒸馏水洗涤2 m i n 2 次；t b s 洗1 0 m i n ，加蛋白酶k 3 7 消化3 0 m i n ， 蒸馏水洗涤2 m i n 2 次；t b s 洗涤2 m i n 3 次，加标记液2 0ul 片， 置湿盒中3 7 标记l 小时；t b s 洗涤2 m i n 3 次，加封闭液5 0ul 片，室温3 0 m i n ，甩掉封闭液，不洗。加入生物素化抗地高辛抗体， 置湿盒中3 7 反应5 0 m i n ，t b s 洗涤2 m i n 3 次；加s a b c a p ，置 湿盒中3 7 反应6 0 m i n ；t b s 洗涤5 m i n 4 次，用b c i p n b t 显色 4 0m i n ，放入双蒸水充分清洗，再用核固红复染3m i n ，双蒸水洗， 最后脱水、封片。 三、摄像和分析 硕士学位论文 封片后的t u n e l 标记切片用n i k o ne 6 0 0 显微照相图像采集系统 进行照相。用l a b w o r k s 4 o 图像分析系统进行分析，并计算凋亡指数 ( a p o p t o s i si n d e x ，a i ；凋亡阳性细胞核数目及其占总细胞核数目的 比例即为细胞凋亡指数) 。 2 4 2 肌纤维类型检测 2 4 2 1a t p 酶染色 基本参照朱道立等人所报道的改良的a t p 酶染色法进行【1 2 】，部 分溶液的配制略有改动。 一、切片 从液氮中取出大鼠腓肠肌内侧头，先后置入低温冻箱( 4 0 ) 1 5 2 0 m i n 、冰箱( 1 0 ) 1 0 1 5 m i n 复温。随即分别上冰台作冰冻切 片，切片厚度1 0 “m ，盖玻片粘贴后，置室温干燥3 0 6 0 分钟。分别 将做出的切片应用4 多聚甲醛进行固定和非固定切片染色对照分 析。 二、配制溶液 选用t r i s h c l ( 三羟甲基氨基甲烷盐酸) 缓冲液作为碱预孵液，孵 育液和碱性洗液中的缓冲液。分别配制以下溶液： ( 一) 4 多聚甲醛固定液( 5 0 m l ，p h 7 6 ) ：多聚甲醛2 9 ，磷酸缓 冲液( o 2 mp h 7 2 ) 5 0 m l ，蔗糖5 7 6 9 ，用l n h c l 调至p h 7 6 。 ( 一) t r i s 洗液( 5 0 0 m l ，p h 7 8 ) ：三羟甲基氨基甲烷6 0 5 9 ，氯化 钙( o 1 8 m ) 5 0 m l ，双蒸水3 5 0 m l ，用3 nh c i 调节至p h7 8 ，不能低于 p h 7 5 ，加双蒸水至5 0 0 m l 。 ( 三) 碱预孵液( 5 0 m l ，p h l 0 4 ) ：三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液 ( 0 3 5 mp h1 0 4 ) 3 0 m l ，氯化钙( 1 0 1 8 m ) 5 m l ，双蒸水1 5 m l ，用3 nk o h 和0 1 nh c l 调节至p h l o 4 。 ( 四) 酸预孵液( 1 6 7 m l ，p h 4 3 5 ) ：冰醋酸0 5 m l ，氯化钙 ( 0 1 8 m ) 1 7 i i l l ，双蒸水1 4 7 i i d ，用3 nk o h ，调节至p h 4 3 4 4 。 ( 五) 孵育液( 5 0 m l ，p h 9 4 ) ：三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液 ( o 3 5 mp h l o 4 ) 4 7 m l ，氯化钙( o 1 8 m ) 5 m l ，氯化钾2 9 6 m g ，a t p 二钠 盐1 2 1 6 m g ，双蒸水1 3 m l ，用3 nh c i 调节至p 1 1 9 4 。 运动诱导的大鼠腓肠肌细胞凋亡与肌纤维类型百分构成的研究 ( 六) 1 氯化钙洗液( 3 0 0 m 1 ) ：氯化钙3 9 ，双蒸水3 0 0 m l 。 ( 七) 碱性洗液( 3 0 0 m l ，p h 9 4 ) ：三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液 ( o 3 5 m ，p h l 0 4 ) 1 7 2 5 m 1 ，双蒸水1 2 7 5 m l ，用3 nh c i 调节至p h 9 4 。 ( 八) 2 氯化钻溶液( 1 0 0 m 1 ) ：氯化钻2 9 ，双蒸水1 0 0 m l 。 ( 九) 1 硫化溶液( 1 0 0 1 1 1 1 ) ：硫化铵，双蒸水9 9 “。 三、操作步骤 ( 一) 非固定切片染色 干燥冰冻切片一酸预孵液5 分钟_ t r i s 洗液冲洗2 3 次，每次1 分钟一孵育液3 7 ，4 0 分钟一1 氯化钙冲洗3 次，每次半分钟_ 2 氯化钻3 分钟_ 碱性洗液冲洗4 次，每次半分钟_ l 硫化按溶液3 分钟一自来水冲洗3 5 分钟一顺次用7 0 、9 5 和l o o 酒精脱水各 2 次，每次5 分钟一二甲苯2 次，每次5 分钟_ 封固。 ( 二) 固定切片染色 干燥冰冻切片_ 固定液( 4 ，5 分钟) 一用t r i s 洗液冲洗2 3 次，每次1 分钟一碱预孵液5 分钟_ t r i s 洗液冲洗2 3 次，每次1 分 钟_ 孵育液3 7 ，4 0 分钟一1 氯化钙冲洗3 次，每次半分钟_ 2 氯化钻3 分钟_ 碱性洗液4 次，每次半分钟_ 1 硫化按溶液3 分钟 一自来水冲洗3 5 分钟一顺次用7 0 、9 5 和1 0 0 酒精脱水各2 次， 每次5 分钟_ 二甲苯2 次，每次5 分钟_ 封固。 四、摄像 封固后，切片用n i k o ne 6 0 0 显微照相图像采集系统进行照相， 用l a b w 0 r k s 4 o 图像分析软件进行分析并计算i 型肌纤维和i i 型肌纤 维的面积百分比。 2 4 2 2s d s p a g e 凝胶电泳 一、提取肌凝蛋白 ( 一) 配制溶液 1 、g u b s 仃a u b 溶液( 5 0 m l ，p h 6 5 ) ：o 3 mk c l ，o 1 mk h 2 p 0 4 ， o 0 5 mk 2 肿0 4 ，调至p h 6 5 ； 7 硕士学位论文 2 、肌凝蛋白提纯液【1 4 j ( 5 0 m l ，p h 6 5 ) ：1 m mk c l ，1 m mn a 2 c 0 3 ， 0 1 mk h 2 p 0 4 ，o 0 5 m 败阳? 0 4 ，调至d h 6 5 ； ( 二) 多次离心法提取肌凝蛋白 1 、取保存于液氮中的大鼠腓肠肌内侧头中部，约o 2 9 ，用研钵 加液氮研磨成粉状，然后置入1 0 m l 离心管，加5 0 0 “lg u b s t r a u b 溶 液，4 过夜。 2 、4 ，1 0 0 0 0 9 离心1 0 m i n ，取上清液，以7 m 1 预冷无离子水 稀疏，充分混合后，再4 ，1 0 0 0 0 9 离心1 0 瓶n 。 3 、倒掉上清，沉淀用肌凝蛋白提纯液1 3 0ul 溶解，再加1 2 m 1 预冷无离子水稀疏，充分混合后，将溶液转移至1 5 i i l l 离心管。 4 、4 ，1 2 0 0 0 9 离心1 2 m i n ，沉淀用肌凝蛋白提纯液1 0 0ul 溶 解，低温保存备用。 二、s d s p a g e 凝胶电泳 ( 一) 配制溶液 1 、2 0 s d s ：s d s ( 十二烷基硫酸钠) 1 0 9 ，双蒸水5 0 m l ，充分 溶解后，室温保存。 2 、样品缓冲液( 1 0 m 1 ) ：o 5 mt r i s h c l 缓冲液( p h 6 8 ) 2 m l ， 一 甘油2 m l ，2 0 s d s2m l ，0 1 溴酚蓝o 5 m l ，加双蒸水至9m l ，冰 箱保存，使用前加巯基乙醇1 m l ，混匀。 3 、电极缓冲液( 1 0 0 0 m 1 ) ：t r i s3 9 ，甘氨酸1 4 4 9 ，2 0 s d s5 m l ， 加双蒸水至1 0 0 0m l 。 4 、3 0 凝胶储液a ：丙烯酰胺( a c r ) 3 0 9 ，n ，n 甲叉双丙烯酰胺 ( b i s ) 0 5 9 ，双蒸水1 0 0 m l ，溶解后，棕色瓶内冰箱保存。 5 、3 0 凝胶储液b ：丙烯酰胺( a c r ) 3 0 9 ，b i so 6 9 ，双蒸水1 0 0 m l ， 溶解后，棕色瓶内冰箱保存。 6 、浓缩胶缓冲液( 1 0 0 m l ，p h 6 8 ) ：t r i s6 9 ，双蒸水7 0 m l ，用 3 nh c i 调节至p h 6 8 ，加双蒸水至1 0 0 1 1 1 l ，冰箱保存。 7 、分离胶缓冲液( 1 0 0 m l ，p h 8 8 ) ：t r i s1 8 2 9 ，双蒸水7 0 m l ， 用3 nh c i 调节至p h 8 8 ，加双蒸水至1 0 0 m l ，冰箱保存。 8 、1 0 过硫酸铵( a p ) ：过硫酸铵1 9 ，双蒸水1 0 m l ，以新鲜配 制为好。 8 运动诱导的大鼠腓肠肌细胞凋亡与肌纤维类型百分构成的研究 ( 二) 配胶 1 、配制分离胶( 1 5 m 1 ) ：3 0 凝胶储液a4 m l ，分离胶缓冲液3 7 5 m l ， 甘油4 5 m 1 ，2 0 s d s0 3 m l ，双蒸水2 3 5 m l ，t e d1 0ul 。混合均匀 后，抽气约1 0 m i n ，灌胶前，加入1 0 过硫酸铵1 0 0ul 。 2 、配制浓缩胶( 5 m 1 ) ：3 0 凝胶储液b0 6 7 m l ，浓缩胶缓冲液 1 2 5 m l ，甘油1 5 m l ，2 0 s d s0 1 m l ，双蒸水1 5 m l ，t e 姬d5ul 。混 合均匀后，抽气约1 0 m i n ，灌胶前，加入1 0 过硫酸铵5 0ul 。 ( 三) 凝胶液的灌注和聚合 灌注凝胶液之前，先用滴管吸取少量的、用电极缓冲液配制的、 浓度为1 3 的热琼脂糖溶液，滴入凝胶腔与电极下槽底部之间所形 成的凹形小槽内，待琼脂糖凝固后，凝胶腔下口的2 3 m m 缝隙即被 堵住( 通电时可作为盐桥) 。将所配制的分离胶胶液沿着凝胶腔的长 玻璃板的一面缓缓倒入或用滴管滴入凝胶腔内，直至8 c m 左右的高 度处为止，然后用滴管沿凝胶腔内壁缓缓加入少量正丁醇( 约3 0 0u 1 ) ，2 0 分钟左右，即可见分离胶顶端出现明显的三层界面，表示分离 胶的聚合完成。倾去正丁醇，用双蒸水清洗三次，然后用无毛边的滤 纸吸去胶面上残留的水液。以同样的灌注方式将所配配制的浓缩胶胶 液注入凝胶腔内的分离胶上面，浓缩胶的高度约为2 5 c m ，或将浓缩 胶胶液加至距凝胶腔短玻璃板上沿约1 c m 处为止( 短玻璃板的高度 约为1 1 5 c m ) 。立即将梳形样品槽模板插入胶液顶部，插入梳形样品 槽模板的目的是在胶液聚合后，使凝胶顶部形成数个相互隔开的凹 槽，电泳前将样品液加在这些凹槽内( 所以称之为加样孔) 。梳齿的 宽度以及齿与齿的间隔可随需要而选定。浓缩胶胶液的聚合时间约为 6 0 分钟，聚合完成后即可拔去梳形样品槽模板。仔细用双蒸水清洗 加样孔三次【”j 。 ( 四) 加样与电泳 1 、考马斯亮兰法测定各样本的蛋白含量：蛋白质分子具有一n h 3 + 基团，当棕红色的c b b g 2 5 0 显色剂加入蛋白质标准液或样品中时， c b b g 2 5 0 染料上的阴离子与蛋白质一n h 3 + 结合，使溶液变为蓝色， 通过测吸光度可计算出蛋白含量。具体操作按照试剂盒说明书进行， 硕士学位论文 计算公式为：蛋白含量( g l 1 ) = ( 测定管吸光度标准管吸光度) 标准管浓度。 2 、蛋白质样品的处理：将各样本用肌球蛋白提纯液稀释成o 2 ug ul 。分别取稀释后的蛋白样品液和样品缓冲液各1 5pl ，混合， 在1 0 0 沸水浴中，保温3 6 m i n ，使蛋白质充分变性。 3 、加样：在垂直板型电泳装置的两个“半池”即正电极槽和负 电极槽内分别加入电极缓冲液，用微量注射器依次在各个样品槽内加 样，每个样品凹槽只加一个样品，加样量为3 0 u l ( 含蛋白质3 u g ) 。 4 、电泳：插好电源线( 注意正负极) ，打开电源，恒压7 0 v 【1 6 】， 电泳3 8 小时。 ( 五) 剥胶、染色与脱色 1 、配制染色液( 5 0 0 m 1 ) ：考马斯亮兰( g 2 5 0 ) o 5 9 ，甲醇2 2 5 m 1 ， 冰乙酸5 0 m l ，双蒸水2 2 5 m 1 。 2 、配制脱色液( 5 0 0 m 1 ) ：甲醇1 2 5 m l ，冰乙酸3 7 5 m l ，双蒸水 3 3 7 5 m 1 。 + 3 、剥胶和染色：电泳结束后取下凝胶模，卸下凝胶模上的橡胶 框，用镊子将短玻璃板撬开后取出凝胶板。用双蒸水轻柔洗涤，小心 地将凝胶取出，置染色液中染色1 小时。 4 、脱色：染色完毕的凝胶用自来水充分清洗后，置脱色液中， 脱色摇床上反复脱色。此过程需多次更换脱色液，直至凝胶的蓝色背 景褪清、蛋白质色带清晰为止，一般需1 2 小时以上【1 5 】。 ( 六) 扫描和分析 凝胶脱色干净后，用i m a g e m a s t e r ( 双向凝胶扫描仪) 生物凝胶 扫描仪扫描，2 dp l a t i n u m 4 9 凝胶图像分析软件计算m h ci 、m h c i ia 、m h ci ib 、m h ci ix 的百分构成。 2 5质量控制 2 5 1 实验中所用玻璃仪器均用洗涤液刷洗后，用重铬酸钾洗液浸泡 2 4 小时以上，清水冲洗，再用蒸馏水清洗3 次。 运动诱导的大鼠腓肠肌细胞凋亡与肌纤维类型百分构成的研究 2 5 2 所有手术所需器具，于手术前进行高温蒸汽灭菌。 2 5 3 大部分试剂于测试当天配制，使其充分溶解。其它试剂的配制 均在测试前一天进行，配好后放入4 下保存，测试前从冷藏箱中拿 出在室温下静置3 0 分钟后再用。 2 5 4 实验中样本都是及时测定，且每份样品测两次以上，求平均值。 2 6 统计学分析 所有的数据用平均值标准差( j s ) 表示，组间差异采用方 差分析法，显著性水平为q = o 0 5 。；并对组内细胞凋亡指数与肌纤维 百分构成进行积矩相关分析，双侧检验。所有数据分析均使用专业统 计软件s p s s l l 0 英文版进行。 硕士学位论文 3 1 大鼠运动情况 运动组的2 0 只大鼠都较好地完成了运动，整个运动过程中基本 未出现拒跑的现象。观察结果与田野1 1 1 等人的基本一致。 表3 1s d 大鼠运动基本情况表 t 由l e3 1t h ec h a r to fe l e m e n t a d ，e x e r c i s ec o n d i t i o n si 1 1s dr a t s 如表3 1 所示，中等强度运动组( p 砸) 的运动时间为1 0 0 1 8 0 5 m i n 。运动后，动物的运动能力明显下降，不给予声音和毛刷刺 激，多数动物基本不能维持原强度工作，在后2 0m i n 运动时，刺激 频率增多，一般在6 次m i n 以上，而且每次刺激时间延长。观察到动 物在运动过程中随运动时间的延长，动物的运动能力逐渐下降。在 1 0 0m i n 的运动时间里，动物平均休息o 5 次，时间约为2m i n 。在适 当休息一定时间或降低运动强度后，动物仍可维持一定时间的原强度 工作，表明动物在中等强度运动后虽表现为明显的疲劳特征，但并未 力竭。 大强度运动组( s 髓) 的力竭运动时间为2 0 5 0 2 m i n 。在运动 的前1 0 m i n ，动物在没有任何刺激的情况下基本可维持原强度工作， 但在后1 0m i n 运动时间里，运动能力逐渐下降，动作频率减慢，声 音刺激次数增多，刺激频率基本达到4 次m i n ，说明大强度运动后， 动物产生疲劳，但动物在接受刺激后立即运动，当降低运动速度后， 动物仍可继续进行运动，而且，每次刺激的时间较短，说明动物在 s 脏运动后虽然产生疲劳，但疲劳程度较轻。 运动诱导的大鼠腓肠肌细胞凋亡与肌纤维类型百分构成的研究 3 2 骨骼肌细胞凋亡及组织学改变 3 2 1 t 切她l 阳性标记细胞核结果 细胞凋亡时，d n a 双键断裂或只要一条链上出现缺口而产生的 一系列d n a 的3 。0 h 末端，就可在t d t 的作用下，将脱氧核糖核苷 酸( d i g d u t p ) 标记到d n a 的3 末端，然后在一抗( 生物素化抗 地高辛) 、二抗( s a b c a p ) 的作用下，通过b c i p n b t 显色，使凋 亡的细胞核呈现出紫蓝色，而正常的细胞核会被核固红复染为红色 ( 见附录图1 ) 。经过l a b w 0 r k s 4 0 图像分析系统分析，结果如表3 2 、 图3 1 所示，中等强度运动组细胞凋亡指数( ) 明显高于大强度运动 组和安静对照组( p m h c i i x m h ci i a 【1 8 】。经过3 8 小时电泳后，肌凝蛋白重链被分离成四条 清晰的条带( 见附录图3 ) 。2 dp l a t i n u m 4 9 凝胶图像分析软件分析结 硕士学位论文 果如表3 4 、图3 3 所示。 此结果与a t p 酶染色结果基本一致，间接证明了肌凝蛋白重链 亚型与根据肌纤维a t p 酶在不同酸碱环境中的活性所划分的i 型、 i i 型肌纤维存在对应关系，即m h ci 对应于i 型肌纤维，m h ci ia 、 m h ci ib 、ci ix 对应于i i 型肌纤维。从各组的肌凝蛋白重链亚 型的构成百分比来看，各组间无明显差异。 表3 4s d 大鼠腓肠肌内侧头m h c 亚型s d s p a g e 凝胶电泳结果