（遗传学专业论文）不同玉米自交系的遗传和表观遗传多态性.pdf

摘要 d n a 胞嘧啶甲基化作为一种重要的表观遗传修饰，广泛存在于高等动植物中，并在 维持基因组稳定性、调节基因表达等方面起着重要作用。研究发现固有d n a 甲基化水平 和模式的变化会导致生物的表型异常甚至致死。但一定范围内的甲基化变异也可能为物 种的适应和进化提供机遇。 本文利用a f l p 及m s a p 分子标记技术，研究了2 4 个玉米( 锄册筘l ) 自交系彼此 间遗传分化的模式和程度，以探索d n a 甲基化多态性在玉米基因组d n a 中的分布、规律 性及各材料彼此之间的遗传和表观遗传亲缘关系。结果表明，基于a f l p 分析，可以将 2 4 个品种之间的亲缘关系大致分类，但是各亲缘关系之间的差异不显著。通过m a n t e l s 检测，分析所选的2 4 个玉米自交系品种之间甲基化敏感与甲基化不敏感性，甲基化敏 感同品种之间的遗传亲缘关系，及甲基化不敏感同遗传亲缘关系之间的关系，发现彼此 成不相关性或相关性不显著。 以上结果说明在所选的玉米品系之间，甲基化多态性与品种之间亲缘关系之间不相 关，即表观遗传与遗传多态性之间没有明显的相关性。 关键词：表观遗传；多态性；m s a p ；玉米；自交系 a b s 仃a c t d n a m e t l l y l a t i o n 嬲锄i m p o r t 褫t 印i g e n e t i ci n o d i f i c a t i o np l a y sa i li m p o r t a i l tr o l ei i l c o n 仃o l l i i l gg e n ee x p r e s s i o n 锄dl n j 湎t a i l l i n gg e n o 血cs 切b i l i t ) ri na 1 1 i m a l sa i l dp l a l l t s nh 硒 b e e nw e ud o c u r n e n t e dt l l a td i s t u r b 锄c eo f 蛳n s i cd n a m e t l l y l a t i o np a t t e m sm a yl e a dt 0 f i l n c t i o n a l 觚dp h e n o t ) 7 p i ca b n o m 谢i 吼b u ta l s oe v 0 1 u t i o n a 巧o p p o 枷够o nt l l eo m e rh a i l d m ei i l l l e r i t a 】eo fs p e c i f i cm e t l l y l a t i o np a t t e mi n 锄i m a l sa i l dp l a n t s ，a i l dv 撕a t i o no f i n e t h y l a t i o ni i l d u c e db yb i o t i co ra b i o t i cf 犯t o r sm a yp r o v i d e1 1 0 v e l i n s i g h ti i l t o l eb i o l o 百c a l s i g 【l i f i c a n c eo f t h j se p i g e n e t i cm a r k e r i i lo r d e rt oe x p l o r et l l ed i s t r i b u t i o n 趾dm eg e n e t i cr c g u l a t i o no f c y t o s i n em e m y l a t i o n ，w e i n v e s t i g a t em ee x t e n ta n dp a t t e mo fg e n e t i cd i 仃e r e n t i a t i o na n l o n g2 4m a i z ei n b r e dl i n e sb y 锄p l i f i e d 衄g n l e n t1 e n g t l lp 0 1 ) ，i n o 印l l i s m ( a f l p ) a n dm e m y l a t i o n - s e n s i t i v e 锄p l i f i e d p 0 1 y m o 巾l l i s m ( m s a p ) r e s u l t ss h o w e dt h a tb 嬲e do nt h ea f l pd a 协，m e2 4i n b r e dl i n e sc a i l b ed i v i d e di i 】【t 0s e v e r a l 星o u p ，t l l o u g l lt l l ed i 仃e r e n t i a t i o nb e t w e e ne a c ho t h e ri sr 1 0 ts t a t i s t i c a n y s i 弘i f i c 觚t w ea m l y z e dt h cv a r i o u sc o 仃e l a t i o n so f 恤a f l pa 1 1 dm s a pd a t ai n c l u d i n g i n e t h y l a t es e n s i t i v ep 0 1 y m o r p l l i s m 。( m s p ) a n dm e t h y l a t ei n s e n s i t i v ep 0 1 y m o 甲l l i s m ( m i s p ) ， l ec o r r e l a t i o no fm s pa n da f l p 龇1 dt 1 1 ec o r r e l a t i o no fm i s pa 1 1 da f l p a 1 1 df o u n do u tm a t n o n eo fm ec o r r e l a t i o n sw 嬲s i 咖f i c 锄t t 敬e nt o g e t l l e r i tc a i lb ec o n c l u d e dt h a tm ed n a i n e m y l a t i o nl e v e la n dp a t t 锄s 锄o n g t h e2 4m a i z ei n b r e d1 i n e sa r en o tc o r e l a t e dt ot h e i f g e n e t i c r e l a t i o n s l l i p s ，o rl 【i n s m p ， 跚g g e s t i l l gi n d 印e n d e n c yo f 印i g e n t e t i c 础北e r si nm a i z e k e y w o r d s ：e p i g e n e t i c ；p o l y l n 0 印l l i s m ；m s a p ；m a i z e ；h l b r e dl i n e s 独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下独立进行研究工作所取 得的成果。据我所知，除了特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果。对本人的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作 了明确的说明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：日期：硼多6 学位论文使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：东 北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许 论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、 汇编本学位论文。同意将本学位论文收录到中国优秀博硕士学位论文全文数据库 ( 中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社) 、中国学位论文全文数据库( 中国科学技 术信息研究所) 等数据库中，并以电子出版物形式出版发行和提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 日期： 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 指导教师签名： 电话： 邮编： 东北师范大学硕士学位论文 引言 表观遗传学 表观遗传学( e p i g e n e t i c s ) 是指在没有发生d n a 序列变异的情况下，基因表达发 生改变的现象，这种改变可随细胞的有丝分裂和或减数分裂遗传下去【l 】。表观遗传主要 通过对d n a ( 甲基化) 和组蛋白的共价修饰( 甲基化、乙酰化、磷酸化等) 以及染色质 改构来实现表观遗传变异【2 1 ，它通过调控基因表达进而参与细胞的许多基本生命活动。 目前表观遗传学涉及到许多生命科学的基础研究和应用：如肿瘤的发生和形成【3 】；植物 【卅和动物【5 】生长发育；动植物的克隆和转基因研列6 ，7 】；基因组印记【8 】；基因组中转座子 激活【9 】等方面。表观遗传学机制在真核生物的生命活动中扮演着重要的角色，它已成为 生命科学研究的热门课题之一。 1 甲基化 d n a 甲基化( d n am e t h v l a t i o n ) 作为表观遗传学的一个重要研究领域是真核生物 基因组最常见的一种呵a 共价修饰形式。这种修饰现象广泛存在于多种生物体中并且 是最早发现的修饰途径之一【l o 】，其主要形成5 甲基胞嘧啶( 5 i n c ) 和少量的n 6 甲基腺嘌 呤( n 6 i n a ) 及7 甲基鸟嘌呤( 7 m g ) 。其中n 6 甲基腺嘌呤主要存在于原核生物中，真核 生物中较少。在真核生物中，d n a 甲基化主要以5 甲基胞嘧啶的形式存在。 植物中，核基因组d n a 胞嘧啶大约有2 0 3 0 处于甲基化状态【1 1 1 ，其中对称的 c p g 和c p a ( t ) p g 被证明甲基化频率最耐1 2 】。基因组内c i p c p g 中也有外侧胞嘧啶甲 基化，但频率低于以上两种模式【1 3 1 4 1 。不同种属植物的甲基化差异程度较大【1 5 】。烟草 中胞嘧啶约3 0 是甲基化的【1 6 1 ，而拟南芥中只占约5 【l 刀。虽然目前还不完全清楚植物 基因组中c p g 甲基化和c p n p g 甲基化是否具有相同的生物学功能，但基于拟南芥的研 究表明，它们均参与了基因表达调控和对转座子活性的抑制。由于在异染色质化中c n g 甲基化具有重要作用，因此推测其在维持基因组完整性和抑制转座子活性方面可能发挥 重要的作用【l 列。 虽然大多数d n a 甲基化发生于富含转座子的异染色质区，但对全基因组范围内甲 基化图谱的研究表明，有2 0 3 3 的重要基因区也发生甲基化。拟南芥中甲基化通常集 中于基因内部，5 端和3 端则较少，说明5 端和3 端的甲基化可能不利于基因功能发挥 m 2 0 1 。 东北师范大学硕士学位论文 1 1d n a 甲基化和去甲基化的机制 d n a 甲基化是指在d n a 复制后，在d n a 甲基转移酶催化作用下，将s 腺苷甲硫 氨酸( s a m ) 上的甲基连接到d n a 分子的胞嘧啶碱基或腺嘌呤碱基上的过程。d n a 是否 发生甲基化和甲基化水平的高低主要受到d n a 甲基化酶的影响。d n a 有两个甲基化系 统，一个系统负责在有诱导物存在的情况下，从头甲基转移酶( 如刀d m e t h y l 仃a 1 1 s f e r a s e ) 作用于非甲基化的d n a 链开始甲基化，产生半甲基化的d n a 。另一系统以半甲基化的 双链d n a 为底物负责维持( m a i n t e n a l l c e ) 甲基化的存在，维持型甲基转移酶( m a i n t e n a n c e m e t h y l 缸趾s f e r a s e ) 将未甲基化的d n a 链的对称位点( 如c g ) 甲基化。该酶的催化特异 性极强，对半甲基化的d n a 有较高的亲和力，使新生的半甲基化d n a 单链迅速甲基 化，从而使d n a 甲基化模式在复制及细胞分裂后保持一致。 植物基因组中编码有关d n a 甲基化的酶种类较多。在拟南芥中，d n a 甲基转移酶 1 ( m e m v l 缸锄s f e r a s e l ，m e t l ) 维持c g 位点甲基化， 纪刀的突变或表达受抑制并不 直接影响发育，而是在连续回交之后才出现出非正常表现型。拟南芥有一套植物特有的 甲基转移酶，称为染色质甲基转移酶3 ( c h r o m o m e m y l 仃趾s f e r a s e 3 ，c m t 3 ) ，属于维持 型甲基转移酶，可能负责c n g 位点的甲基化【l8 1 ，对异染色质的甲基化有重要作用拉引。 拟南芥d n a 脱甲基化酶1 基因( d c c r e 弱e di i ld n a i n e t h y l a t i o n ，d d 2 l 打) 编码染色 质结构重建复合体( c h r o m a t i nr e m o d e l i n gc o m p l e x e s ) 的一个组成部分。因此d d 打的 突变也能够导致甲基化降低和表达与砸刀突变类似的表现型。 关于d n a 去甲基化( d e m e m y l a t i o n ) 的研究较对d n a 甲基化的研究相对少。d n a 去甲基化的机制，可以是被动过程，也可以是主动过程，也可能是两者作用共同存在【z 引。 在d n a 复制过程中维持型d n a 甲基化酶被抑制或缺乏造成d n a 被动去甲基化，而需 要特异的酶促反应【2 4 。2 5 】才能发生d n a 主动去甲基化。在拟南芥中靠d e m e t e r ( d m e ) 和r e p r e s s o ro fs i u n c i n g l ( r o s l ) 实现d n a 主动去甲基化。我们称无嘌呤 ( a p i l r i l l i c ) 或无嘧啶位点( a p ”i i n i d i i l i cs i t e ) 为a p 位点，d m e 具有d n a 糖苷酶 ( 酉y c o s y l 嬲e ) 和a p 裂解酶( a pl y 嬲e ) 双重功能【2 6 l 2 7 l2 8 3 0 1 。d n a 糖苷酶以碱基切除 修复( b 豁ee x c i s i o nr 印a i r ，b e r ) 方式进行修复，d n a 糖苷酶切开n 糖苷键，特异切 除5 甲基胞嘧啶并留下无碱基位点( a b a s i cs i t e ) ，a p 裂解酶切开无碱基位点，切开d n a 链，然后d n a 聚合酶添加未甲基化的胞嘧啶，d n a 连接酶将链连上。d m e 无论在生 物体内和体外都具有5 甲基胞嘧啶d n a 糖苷酶裂解酶活性，它能将含c g 、c n g 和 c n n 的序列中5 甲基胞嘧啶切除【2 7 l2 8 1 。在拟南芥胚乳发育过程中依赖d m e 的去甲基 化作用是建立基因组印记的一种途径【2 & 2 。h3 1 1 1 2d n a 甲基化的遗传和变异 1 2 1d n a 甲基化的遗传 植物中d n a 的甲基化主要发生在c g 和c n g 对称序列的胞嘧啶上，5 m c 位点对称出 现在d n a 双链的c g 和c n g 片段中，确保了这种修饰的遗传1 2 l3 2 1 。f i i l i l e g a i l 等3 4 1 根据甲 基化序列的对称性推测d n a 甲基化的模式主要通过周期性的细胞分裂进行传递，但非对 2 东北师范大学硕士学位论文 称位点的甲基化可能无法通过周期性的d n a 复制进行传递，而重新甲基化和由于维持甲 基化失败引起的被动去甲基化则引起表达模式的改变。 在植物中，通过配子体，d n a 的甲基化模式信息可以稳定传递给有性后代【1 8 ；3 3 。5 1 。 这些表观遗传信息在植物世代之间的遗传，在减数分裂、单倍体减数分裂后的有丝分裂、 配子体分化、受精、胚胎形成以及在植物营养生长和分化过程中的多次有丝分裂过程中 必须保持下去。而且，由于需要一定比例的父本基因组与母本基因组保证三倍体胚乳的 均衡发育，这一过程必定存在表观遗传的调节作用。长期以来，人们不断地探索哪些体 现遗传性的d n a 甲基化以及其他表观遗传标记是遗传做出的贡献【3 6 】。 o a e v 等( 1 9 9 7 ) 【了7 钡0 定了d n a 甲基化在烟草雄配子形成过程中的变化，他们观察 到处于萌发前夕花粉核的甲基胞嘧啶总体水平约下降至营养核的2 0 。但是，其他人未 能成功重复此实验，因此也未能在其他植物种类中证实其结果。 通过抑制拟南芥 伍刀的表达( 征刀础) 以及对各种表观遗传突变体的研究很好地 证明了d n a 甲基化的传递现象【强3 9 】。d n a 去甲基化突变体 伍刀船植株的去甲基化主要 在c g 位点，并且这种去甲基化的模式能够遗传给下一代【3 8 】，这说明至少在被检测位点 从头甲基化活性很弱。d n a 甲基化的稳定遗传在人工诱导产生的去甲基化突变体拗”j 中体现出来幽“1 1 。比砌j 与野生型回交产生的子代f l 杂合体( d d 膨，腻锄j ) 的甲基胞嘧 啶水平介于两亲本之间。在对随后的多次重复回交产生的株系或其自交后代的进行研究 中，证明在纯系拗 j 突变体中在减数分裂、配子体形成以及体细胞有丝分裂等过程中去 甲基化状态都表现稳定的传递。因此，在类似尬 础的植株中，在发生去甲基化缺失 d d m l 的位点上，再次进行甲基化是极其缓慢的过程，有些位点的已经不存在甲基化可 能了。这种去甲基化现象的“遗留”( c 踟y o v c r ) 效应以及转录抑制现象表明一旦d n a 甲基化发生变异，就不容易再重建。 m e s s e g 眦e 等【4 2 】比较番茄甲基化多态性在不同品种间及后代中的结果，表明亲本中 观察到的甲基化的多态性可以以孟德尔遗传的方式稳定传递给后代。通过异型杂交使转 基因的反义植株或突变体失去突变和转基因后，其后代还是不能恢复正常的甲基化水 平，这也说明甲基化是可以遗传的。 拟南芥不同生态型基因组中很多区域，包括两个主要的核仁组织区( n u c l e o l u s o 玛a n i z e rr e 西o n s ，n o r ) ，自然发生的胞嘧啶甲基化变异大部分以孟德尔遗传的方式从 亲本传递给其种内杂交种【4 3 1 。 5 氮胞苷( 5 a z a c 砸d i n e ，5 a c ) 诱导的水稻矮化、小黑麦( t r i t i c a l e ) 的许多特征 的变化【删以及甘蓝许多表型及发育的异常】都可以遗传给后代。加m d 0 等( 1 9 9 7 ) 用5 氮胞苷对不同发育阶段的小黑麦进行去甲基化处理，结果表明由5 氮胞苷处理导致的甲 基化变异可从m 1 代传递到m 2 代，并引起基因表达的改变【4 5 堋。 1 2 2d n a 甲基化变异 真核生物可以通过特有的方式将d n a 甲基化修饰传递给后代。但是这种相对稳定的 表观遗传状态在某些情况下外界因素的影响下会发生甲基化水平和模式的改变。在一些 情况下，如有些植物的种间杂交种、同源多倍体、渐渗系( 砷舻s s i o nl 妣s ) 以及某 3 东北师范大学硕士学位论文 些特化器官如胚乳( e n d o s p e m ) 【4 m 8 】中，亲本甲基化模式发生明显的重塑( r e 。m o d e l i n g ) 或变异( n o n i i l l l e r i t a n c e ) 。导致高等植物基因组发生广泛的甲基化变化的因素很多，例 如转基因可导致基因抑制或沉默原因在于其自身和同源基因重新甲基化【4 9 | 。对烟草 s a h h 转基因植株的甲基化的研究，发现在d n a 重复序列出现了甲基化降低垆o j 。 植物组织培养也可引起基因组广泛的甲基化变化【5 1 1 ，首先在玉米体细胞无性系再生 植株中发现离体培养再生植株的甲基化的变化，与供体相比玉米幼胚再生植株的某些无 性系发生了甲基化升高的现象。在胡萝卜、番茄、马铃薯等多种植物的培养细胞或再生 植株中，也发现了由d n a 甲基化改变而引起的体细胞变异【5 2 1 。离体培养也可导致d n a 甲基化程度的降低，典型的例子是由于甲基化的减少，油棕体细胞胚植株而造成了雄蕊 雌性化变异【5 3 】。p e r a z a - e c h e v e 仃i a 利用m s a p 技术研究经组织培养的香蕉植株的甲基化 变异情况，发现从雄性花序得到的再生株甲基化变异百分率为3 ，而从根得到的再生 株的甲基化变异百分率为1 7 俐。 植物的种间或种内杂交也可能导致大量的胞嘧啶甲基化变异。o n g 等( 1 9 9 9 ) 通 过m s a p 分析将两个籼稻品系珍汕9 7 和明辉6 3 杂交得到杂交种汕优6 3 ，结果表明杂 交种的旗叶总带数为1 0 7 6 ，幼苗的为7 2 1 条，其中甲基化变异( 升高或降低) 的带数分 别为1 6 条及1 3 条，这说明水稻品系间杂交可导致基因组发生不同程度的甲基化变异【5 5 1 。 l i u 等( 1 9 9 9 ) 对利用渐渗杂交的方法所得到的5 个渐渗系进行i 江l p 分析，以9 个菰 专化序列和3 个已知功能的基因作为探针进行杂交，结果表明同3 个探针杂交后全部的渐 渗系均表现出甲基化变异，一个渐渗系同6 个探针杂交都出现了甲基化变异。同时还发 现在每个渐渗系都存在甲基化增加和减少变异【5 6 】。其他研究发现基因组渐渗也可在基因 和转座子区域发生广泛的甲基化变异【5 染色体数目的变化，包括整个基因组复制及单个染色体的增加或减少也可能导致 d n a 甲基化的变化【5 6 8 】。l i u 等( 2 0 0 0 ) 以2 1 个低拷贝的d n a 序列与一系列多倍体小麦 和其二倍体祖先物种进行s 0 u 胁e m 杂交，发现多倍体小麦发生了广泛的胞嘧啶甲基化变 异。在人工合成的六倍体小麦中也得到了同样的结果，其甲基化变异发生在较早的s 5 、 s 6 、s 7 世代，而且这种变异在3 个世代间能稳定遗传。这些结果说明，广泛的基因组胞 嘧啶甲基化变异也可发生在二倍体物种之间杂交后在多倍体物种的形成过程中【5 引。 逆境影响也会造成基因组的甲基化变异。s t e w 矾等( 2 0 0 2 ) 发现低温条件下能够诱 导甲基化模式的改变，玉米幼苗遭受低温胁迫时，根组织基因组发生广泛的去甲基化【2 。 l o n g 等研究发现高压可以导致水稻基因组中与转座子相关的区域发生甲基化变异，而且 这种甲基化变异状态可以遗传给后代。 在高等真核生物基因组中存在广泛的d n a 甲基化变异为物种的多样性和进化提供 了新的契机，也为扩大遗传资源和培育新品种提供了良好的途径。 1 3d n a 甲基化与植物生长发育 d n a 胞嘧啶甲基化是特异的程序化的，它对各种各样的生物体在发育过程中的基 因表达和基因组完整性的维持是必不可少的。常染色质中启动子区高度甲基化的基因往 4 东北师范大学硕士学位论文 往沉默，而异染色质常常高度甲基化，活跃的基因表达常表现d n a 的去甲基化。对甲 基化转移酶突变体的研究证明了在生物体生长和发育过程中d n a 甲基化保持合适状态 的重要性。在植物中能通过减数分裂将胞嘧啶的甲基化模式通常稳定遗传递给子代。对 拟南芥的研究表明，胞嘧啶甲基化被破坏的植株虽然能够维持生长，但在形态上往往会 发生明显的变异。通过对反义d m 协e ( m e t l ) 的异位表达或将d d m l 基因敲除的突 变都导致了拟南芥在形态和发育上的改变。以上研究说明在植物的生长发育进程和其它 过程中d n a 甲基化起着重要的调控作用。 自1 9 9 6 年首次发现拟南芥反义m e t l 突变之后，相继发现了很多其他突变植株。突 变植株出现顶端优势减弱，开花时间改变，广泛的花结构异常以及卷曲叶片等异常表型 现象。烟草的反义m e t l 植株和自交系d d m l 突变体植株也出现了类似的表型异制他3 2 】。 这些反义植物d n a 甲基化水平与对照相比显著降低。由于甲基化水平的降低，反义植物 及后代的营养器官和生殖结构均表现异常，而且不正常表型的类型和去甲基化的程度有 关，甲基化水平越低，表现出的异常现象越严重。除了外部形态发生改变外，反义植物 从营养生长向生殖生长转变的时间也发生改变。这些研究结果可以推测植物正常生长发 育需要d n a 甲基化。 最近一项研究也表明，c g 和非c g 甲基化都缺失的植株当代不能生存，其正在发 育过程中的胚出现细胞分裂方式和极性的异常并死亡【5 6 】。从胚胎发育到生殖生长时期甲 基化突变体都会出现多种生长发育上的异常现象，由此可以认为d n a 甲基化对植物正 常生长发育是必须的。 在植物不同组织之间甲基化总体水平存在差异。有研究表明，番茄成熟的叶片、果 实，种子比未成熟的茎、叶片和根甲基化程度高。利用m s a p 技术发现拟南芥子叶、叶 片和花的甲基化水平和模式存在差异畔】；甲基化情况在水稻幼苗和成长植株之间也不同 【d 7 】；水稻幼苗的甲基化水平高于旗叶甲基化水平【5 们。研究表明玫瑰的愈伤和再生植株 之间甲基化也有差异【6 8 】。虽然目前还不清楚这些研究工作的意义，但至少对已经完成测 序的拟南芥和水稻基因组来说，人们将会越来越了解其整个基因组的甲基化状态，包括 哪些序列在不同组织或细胞类型之间存在甲基化差异等现象。 1 4d n a 甲基化在基因表达调控中的作用 植物在其生活周期中，常常随着遗传性及环境变化进行不同的发育反应，这些不同 的反应取决于基因的转录表达而不是原初核苷酸序列的改变。在植物这种调节中，d n a 甲基化水平的变化起着重要的作用。基因的甲基化可抑制基因的表达，当基因处于表达 状态时，甲基化水平往往很低，随着生长发育的进行需要将该基因关闭时，就会在该基 因的启动子或编码区发生重新甲基化，使基因转录受到抑制基因失活，从而终止其表达 u 。一些处于关闭状态的基因由于生长发育的需要进行活化，开启表达时，某些因子在 活化过程中，识别甲基化的序列，导致该基因的启动子区域去甲基化，去甲基化的启动 子有利于同某种反式作用因子相互作用，使得启动子区域的染色质偏离正常的高级结 构，变得对d i n a s e i 高度敏感，这时基因进一步活化，直到转录表达开始启动。这样植物 5 东北师范大学硕士学位论文 就可以在不同的环境条件和不同的生育期调控基因的时空表达。 2a f l p 和m s a p 分子标记系统 a f l p ( a m p l i f i e df r a 鲫e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 是近年来迅速发展起来的一种 分子标记技术。随着该技术的不断进步和完善，m s a p ( m e t h y l a t i o ns e n s i t i v ea m p l i f i e d p 0 1 y m o r p h i s m ) 作为对a f l p 进行改良的分子标记技术也应运而生，并在动植物遗传多样 性和分子标记研究中得到迅速发展和广泛应用。 2 1a f l p 这项标记技术是一种检测d n a 多态性的标记技术，也是继r f l p 、s s r 和r a p d 之后发展 最快最适用的d n a 指纹检测技术。a f l p 实际上是r f l p 与p c r 相结合的产物，其基本原理 为：首先用成对的限制性内切酶( 一个酶为多切点，另一个酶的切点较少) 将基因组d n a 进行双酶切，然后将人工合成的双链接头( a d a p t e r ) 连接到d n a 片段的末端上。随后以 其接头序列和相邻的限制性酶切位点序列作为引物结合位点设计引物，对酶切片段进行 连续2 次p c r 扩增，即预扩增反应和选择性扩增反应。预扩增反应引物只含有1 个选择性 核苷酸，以连接后的酶切片段为模板，其反应条件与常规p c r 反应条件大致相同。而选 择性扩增反应引物一般含有2 3 个选择性核苷酸，以适当稀释后的预扩增反应产物为模 板，采用温度梯度p c r 进行扩增。最后，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测选择性扩增 的d n a 片段，多态性即以扩增片段的长度不同而被检测出来。因此，a f l p 标记所检测的 多态性与r f l p 一样，是由于限制性酶切位点的变化或酶切片段的变化造成的。 a f l p 兼有r f l p 的稳定性和p c r 技术的高效性、安全性及方便性，同时又避免了r f l p 受探针限制的因素，因而可产生丰富而稳定的遗传标记，被认为是一种非常理想有效的 分子标记技术，现已被广泛应用于遗传图谱构建、遗传多样性评估和种群结构分析、系 统进化及分类学、遗传育种和种质鉴定以及基因定位等方面研究。7 2 zm s a p m s a p ( m e t h y l a t i o ns e n s i t i v ea m p l i f i e dp o l y m o r p h i s m ，甲基化敏感扩增多态性) 技术，是在a f l p 技术基础上建立起来的检测d n a 甲基化的方法。其基本原理是：用甲基 化敏感的同裂酶枷i i 和坳i 代替a f l p 高频内切酶施pi ，首先将每个d n a 样品分别用 屁徕i 坳i i 和屁珠i 胍pi 两组内切酶同时酶切，再加上特定的双链接头。然后同 a f l p 一样，对连接后的酶切片段进行预扩增和选择性扩增反应，最后利用聚丙烯酰胺凝 胶电泳分离检测选择性扩增产物。由于助i i 和脚i 识别相同的酶切位点c c g g ( 真核生 物中主要的甲基化位点) ，但对c c g g 位点上内侧和外侧胞嘧啶甲基化的敏感程度不同。 i i 对d n a 双链c c g g 位点内或外侧对应胞嘧啶都被甲基化( 完全甲基化) 敏感，即不能 切割完全甲基化的气c g g ，c 气g g 和气气g g ，但能切割只有一条链上胞嘧啶被甲基化( 半 甲基化) 的序列；而脚1 只对外侧胞嘧啶甲基化敏感，可以识别仅内侧胞嘧啶完全甲 6 东北师范大学硕士学位论文 基化或半甲基化的序列，但不能切割含有完全或半甲基化的气c g g 序列，因此c c g g 位点 甲基化模式不同将导致屁徕i 坳i i 和屁0 ri 施pi 的酶切、扩增产物产生多态性。反 之，通过比较电泳谱带的差异，也可以推测出c c g g 的甲基化情况 目前，m s a p 已广泛应用于棉花、水稻、苹果、拟南芥、胡椒和香蕉等植物基因组d n a 胞嘧啶甲基化程度和模式的评估。同时，应用m s a p 分析植物体细胞克隆甲基化变异也日 益受到人们的重视。在植物种群研究和克隆指纹鉴定等方面，也已开始应用m s a p 进行d n a 甲基化变化模式研究。 本研究目的和意义 玉米( 历a 肋声l ) 起源于玉米属玉米种，作为世界上种植面积位于第3 位的粮 食作物，其在农业生产上起着举足轻重的作用。目前玉米在生产上的主要利用途径是杂 种优势。本试验拟通过对自交系亲本的甲基化情况及序列变异情况进行研究，分析其遗 传变异与表观遗传变异的相关性及规律，进一步从分子水平上探讨玉米变异的机制。 东北师范大学硕士学位论文 1 实验材料 材料和方法 本研究中选取了2 4 个优良的玉米自交系品种，m 0 1 7 、杂c 5 4 6 、合3 4 4 、a 8 7 、4 4 4 、 吉8 5 3 、昌7 2 、f 3 4 9 、丹3 4 0 、c 8 6 0 5 、9 0 4 6 、农大3 6 4 母本、b 7 3 、5 0 0 3 3 、7 8 8 4 7 高、吉8 1 8 、8 1 1 6 2 、郑5 8 、齐3 1 8 、6 6 6 、5 2 1 0 6 、黄早4 、7 9 2 2 、吉v 2 2 等。其中m s l ( m o l 7 ) 是国外的优良品种而m s 2 ( 杂c 5 4 6 ) 是由m 0 1 7 改良而来( 较m 0 1 7 早熟) ，m s 3 ( 合3 4 4 ) 更是由杂c 5 4 6 改良而来( 由吉林农业大学杨伟光教授提供) 。 2 、实验方法 2 1 材料的准备 将种子水浸7 8 小时后用5 0 乙醇处理3 0 6 0 秒，无菌水冲洗一遍后用0 1 升汞溶 液中悬动数次除菌消毒，放入灭菌水冲洗数次，每次约5 分钟，取出放入1 2 m s 培养基 中，三叶期收取叶子 2 2 植物基因组d n a 的提取与纯化 玉米总d n a 提取采用用改良的c t a b 法提取实验材料的基因组d n a 。 提取缓冲液的配方如下： 1 d n a 提取缓冲液( d n ae x t r a c t i o nb u 仃e r ) ( 5 0 0 l i l l ) s o r b i t o l o 3 5 m ( 31 8 5 9 ) 0 5 me d t a 5 m m ( 5 m 1 ) l m t r i s - h c l ( p h 7 5 ) o 1 m ( 5 0 m 1 ) 2 核裂解缓冲液( n u c l e il y s i sb u 仃e r ) ( 5 0 0 1 1 1 1 ) 1 mt r i s - h c l ( p h 7 5 ) o 2 m ( 10 0 m 1 ) 5 m n a c l 2 m ( 2 0 0 m 1 ) 0 5 me d t a 0 0 5 ( 5 0 m 1 ) c t a b 2 ( 1 0 9 ) 3 5 十二烷基肌氨酸钠 以上3 种溶液配制后进行高压灭菌( 1 2 1 ，1 5m i l l ) 。使用前，在溶液2 中加入将 要配制d n a 提取缓冲液总体积1 重量的p v p ，p ，完全溶解后，将1 、2 、3 溶液按 8 东北师范大学硕士学位论文 1 ：1 ：o 4 的比例混合，用前把提取混合液预热到6 0 6 5 。 提取步骤为： 1 采集o 2 o 4g 植物幼嫩叶片，液氮中研磨成粉末状，装入到预冷的2m l 离心管 中； 2 加入等体积预热的d n a 提取混合液( 4 0 0 6 0 0 肛l ) ，立即混匀，置于6 5 恒温水 浴摇床上，于4 0 5 0r p m 下摇匀9 0m i n 。 3 冷却到室温，加入等体积的氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) ，轻轻上下颠倒l o 1 5i n i n ，常温 条件下于5 0 0 0 呻离心1 5i n i n ； 4 立即转移上清液到新的2i n l 离心管中，加入预冷的2 3 体积的异丙醇，上下颠 倒51 1 1 i n ，在1 0 4 下静止3 0i n i n 后，常温条件下于5 0 0 0 掣离心l oi n i l l ； 5 轻轻倒掉上清，使异丙醇挥发净，加入6 0 0 “l7 5 乙醇，在4 漂洗过夜； 6 在常温条件、5 0 0 0 印m 下离心1 0m i l l ，弃乙醇，将d n a 风干( 不可太干燥) ， 加入l t e5 0 0 此，放在6 5 水浴中助溶1 01 1 1 i n ，常温条件下使d n a 完全溶解； 7 加入1 此r n a 酶( 1 0m 酌：n 1 ) ，3 7 温育3 0i n i n ； 8 重复第3 步； 9 立即转移上清至新的2 i n l 离心管中，加总体积2 3 体积的预冷异丙醇，再加入 总体积1 1 0 的3m o 儿醋酸钠，上下快速颠倒2 i n i n ，1 0 4 静置3 0m i n ，1 0 0 0 0r p m ， 1 0 m i i l ： 1 0 重复第5 步，弃乙醇，风干，加5 0 皿1 t e 溶解d n a ； 1 1 用1 的琼脂糖凝胶电泳检测d n a 质量，并据已知的九d n am a r k e r 估计 其浓度。调整浓度后的d n a 置于2 0 备用。 2 3 玉米a f l p m s a p 分析标记体系的建立 本试验采用了改良的a f l p m s a p 体系，主要包括：酶切连接、预扩增、选择性扩增、 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测。 2 3 1 限制性酶切和连接 在限制性酶切和连接前，先把两个单链的接头( 表3 1 ) 复性为双链结构，即1 0 0 变 性5 分钟，缓慢冷却至室温，一2 0 冷冻保存备用。a f l p 酶切连接体系如下： t 41 0 xr e a c t i o n b u 行e r 2 5 山 b s a ( 1 0 m g l )o 1 m 上汜d ria d 印t o r ( 5 p m ) 1 m 尬p i a d a p t o r ( 5 0 p m )1 m 髓础i ( 2 0 u 肛1 )l m 坛p i ( 1 0 u 山)o 2 肛l t 4l i g 嬲e o 1 m 9 东北师范大学硕士学位论文 d n a 5 0 0 n g a f l p w a t e r 补足到总反应体积为2 5 “l m s a p 限制性酶切和连接体系如下： t 41o r e a c t i o nb u f f e r2 5u l b s a ( 1 0 m g l ) o 1 “l 删a d 印t o r ( 5 0 p m ) l “l 五概坡ia d a p t o r 1 “l ( 5 p m ) d 尺i ( 2 0 u “l )0 2 5 “l 坳口i i 脚ij ：勿口i i ( 1 0 u l ) o 5 “l 脚i ( 1 0 u 肛l ) 0 2 5 “l t 4 l i g a s e o 1 “l d n a3 0 0n g a f l p w a t e r 补足到总反应体积为2 0 p l 混匀体系，3 7 ，5 小时，8 ，4 小时，4 保存。 2 3 2 预扩增 a f l p 预扩增体系如下( 预扩增引物见表3 - 1 ) ： 1 0 xp c rr e a c t i o nb u 毹r 2 5 m d n t p s ( 2 5 m m )1 肛l 口尺ia d 印t o r + a ( 5 “m ) 1 p l 尬pia d 印t o r + c ( 5 肛m ) 1 肛l t a qd n ap o l y m e r a s e ( 5 u 仙1 )o 2 “l p c r w a t e r 1 7 3 山 d n a 模板( 酶切连接产物)2 p 1 t o t a lv 0 1 u m e 2 5 “1 表3 1 ：a f l p m s a p 所用的连接接头和预扩引物 a d a p t e r ss e q u e n c e s 蠡pi - a d 印t e r i5 g a c g a t g a g t c c t g a g 3 厶ei a d a p t e r l i 5 t a c t c a g g a c t c a t - 3 & d r i a d 印t e r i 5 c t c g t a g a c t g c g t a c c 3 l o 东北师范大学硕士学位论文 积i - a d a p t e r l i 5 a a t t g g t a c g c a g t c 3 h m - a d a p t e r - l 5 g a t c a t g a g t c c t g c l l - 3 h m - a d a p t e r - r 5 c g a g c a g g a c t c a t g a 一3 预扩引物 e c d ri + a5 g a c t g c g t a c c a a t t c a 3 坛pi + c5 一g a t g a g t c c t g a g t a a c 3 h m + 05 c a t g a g t c c t g c t c g g l - 3 m s a p 预扩增反应体系如下( 预扩增引物序列见表3 1 ) ： 1o p c rr e a c t i o nb u f f e r 2 5 “l d n t p s ( 2 5 m m )1 “l 艮根ia d 印t o r + a ( 5 p m ) 1 “l 删a d 印t o r + o ( 5 p m ) l “l t a qd n ap 0 1 y m e r a s e ( 5 u 肛l )o 2 l d n a 模板( 酶切连接产物)2 肛l p c r 水补足至2 5 p l 混匀反应体系，按下列参数进行p c r 扩增反应： 9 4 预变性2 曲，9 4 变性3 0s ，5 6 退火3 0 s ，7 2 延伸6 0s ，共进行3 0 个循环， 最后7 2 延伸l o n 血。用1 5 琼脂糖凝胶电泳检测，在2 0 0b p - 1 0 0 0b p 范围内d n a 呈 弥散状分布为最佳酶切连接结果。根据d n a 弥散带的亮度，用o 1 t eb u 虢r 稀释预扩 增产物l o 倍至4 0 倍，作为选择性p c r 扩增的d n a 模板。 2 3 3 选择性扩增 玉米a f l p 选择性扩增体系如下：( a f l p 选择性扩增引物见表2 ) 1 0 xp c rr e a c t i o nb u h e r 1 5 l d n t p s ( 2 5 m m )0 6 “1 上c 出ip r i m e r ( 5 m ) 0 6 肛l 么eip r i m e r ( 5 “m ) 0 6 “l t a q d n a p o l y t n e r a s e ( 5 u 山)o 1 2 p l d n a 模板( 预扩增稀释产物)2 p l | p c r w a t e r 补体系到1 5 肛l m s a p 选择性扩增体系如下( m s