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浙江地区虎纹蛙遗传多样性与遗传结构研究 摘要 虎纹蛙( h o p l o b a t r a c h u sr u g u l o s u s ) 是广泛分布于我国南方地区的大型无尾两栖类。 由于生境片段化和丧失以及人为过度的捕猎，其种群分布范围和数量都急剧的缩小，目 前已被列为国家二级保护珍稀濒危动物，i u c n 和中国物种红色名录均将其列为易危种， 并被载入c i t e s 附录i i 。浙江省是虎纹蛙的重要分布区，然而近年来的种群数量也在极 速的下降。本文从基本的珍稀濒危两栖类的非伤害性取样入手，分别通过用近缘物种来 跨种扩增和磁珠富集法来筛选虎纹蛙具有多态性的微卫星位点，并对浙江地区的虎纹蛙 遗传多样性和遗传结构进行研究，从而以期为该物种在浙江省的保护提供重要的理论依 据。本文的主要研究结果如下： 1 通过非伤害性对虎纹蛙的血液和趾取样获得的d n a 与通过处死后对虎纹蛙肌肉取 样获得的d n a 进行分子遗传学的检测并相互比较，结果显示三种取样方法所获得 的d n a 质量相当。因而，在无尾两栖类的研究中，采用非伤害性的取样策略完全 能够替代伤害性的取样策略。 2 通过引用3 0 对近缘物种的外源微卫星位点在虎纹蛙进行跨种扩增研究，结果显示仅 有3 3 3 的位点在虎纹蛙能够获得扩增结果，有4 6 7 的位点完全没有产生任何扩 增产物。认为在进行跨种扩增时，所引用的物种与所需研究物种的亲缘关系远近和 所研究物种的基因组长度将会对跨种扩增结果起到极大的影响。 3 利用磁珠富集法从虎纹蛙c a 富集的文库中成功筛选出9 对具有多态性的微卫星位 点。这9 个微卫星位点的等位基因数目在6 到1 1 个之间( 平均8 5 6 ) ，观察杂合度 和期望杂合度分别在0 5 7 1 到0 9 3 5 之间( 平均0 7 9 6 ) 和在0 7 6 5 到0 8 8 8 之间( 平 均o 8 3 7 ) 。同时由于h r u 9 0 7 位点存在无效等位基因，因而该引物表现出明显的偏 离哈温平衡( 尸 0 5 ) 。 5 通过对各种群瓶颈效应的检测，结果显示：仅有丽水种群在近期没有经历种群瓶颈 效应，而其它各种群则在i a m 、t p m 或s m m 三种突变模型下检测到在近期曾经历 了种群瓶颈。 6 对各种群之间的遗传分化进行检测，结果显示在总共2 1 对样本中，有1 3 对( 6 1 9 ) 出现了明显的遗传分化( 尸 0i na l l s a m p l e ds i t e s ，s ot h e r em u s tb em o r ei n b r e e d i n gb e t w e e ni n d i v i d u a l s t h e r e a r e p r o b a b i l i t i e so c c u r r i n gg e n e t i cd i f f e r e n t i a t i o ni nf u t u r e k e yw o r d s ：h o p l o b a t r a c h u sr u g u l o s u s ；m i c r o s a t e l l i t e ；g e n e t i cd i v e r s i t y ；b o t t l e n e c k ； g e n e t i cp o p u l a t i o ns t r u c t u r e ；g e n ef l o w i v 符号说明 v i i i 浙江地区虎纹蛙遗传多样性与遗传结构研究 浙江师范大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其他机构已经 发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作 了明确的声明并表示了谢意。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 作者签名： 砂噜 n 日期。矽年j 月2 莎日 学位论文使用授权声明 本人完全了解浙江师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并 向国家有关机关或机构送交论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采 用影印、缩印或扫描等手段保存、汇编学位论文。同意浙江师范大学可以用不同方式在 不同媒体上发表、传播论文的全部或部分内容。 保密的学位论文在解密后遵守此协议。 作者签名： 参戽 、一 导师签名： 日期：弘嘭 年上月磅日 微卫星分子标记简介 第一章文献综述 1 1 分子标记定义、特点及分类 分子标记( m o l e c u l a rm a r k e r ) 是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传 标记，是d n a 水平遗传多样性的直接反应。与其它的遗传标记方法相比较，大多数d n a 分子标记为共显性；基因组变异极其丰富、数量可达1 0 8 1 0 9 个；在生物发育的不同阶 段、不同组织的d n a 都可以用于标记分析，因而也不会受到生理期和环境的影响；大 多数呈中性突变，遗传较为稳定，符合孟德尔遗传规律，不影响目标性状的表达，同时 与不良性状无连锁，并在群体中具有高度的多态性和较高的杂合度；并且其检测手段简 单、迅速。现在d n a 分子标记技术已经比较成熟，有数十种之多，其中包括基于分子 杂交技术的限制性片断长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) 和 数目可变串联重复多态性( v a r i a b l en u m b e ro ft a n d e mr e p e a t s ，v n t r ) ；基于p c r 技术 的随机扩增多态性( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ，r a p d ) 、d n a 指纹图谱( d n a f i n g e r p r i n t ) 、简单重复序歹1 ( s i m p l es e q u e n c er e p e a t ，s s r ) 和d n a 单链构象多态性( s i n g l e s t r a n dc o n f o r m m i o np o l y m o r p h i s m ，s s c p ) 等；基于限制性酶切和p c r 技术的扩增片段 长度多态性( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，a f l p ) 等以及基于d n a 芯片技术 的核苷酸多态性( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ，s n p ) 。这些分子标记技术将广泛的应 用于基因组作图和基因定位研究、基于图谱克隆基因的研究、物种亲缘关系和系统分类 的研究以及用于疾病诊断和遗传病连锁分析。 1 2 微卫星分子标记 1 2 1 定义 微卫星( m i c r o s a t e l l i t e ) 又叫简单重复序列( s i m p l es e q u e n c er e p e a t s ，s s r ) 或短串 联重复序列( s h o at a n d e mr e p e a t s ，s t r s ) ，也是d n a 分子标记的一种，它是广泛分布 文献综述 于真核生物基因组中的一种特殊序列，在整个真核基因组中主要由1 - 6 个核苷酸的串联 重复单元组成，大多数位点定位于基因之间或内含子上【1 1 。w e b e r 等【2 】将微卫星分为3 类：完全重复( 无间隔) 、不完全重复( 有非重复单位的碱基间隔) 和复合重复( 2 个 或更多重复单位彼此比邻连续出现) 。这些短的、串联排列的重复序列经常在复制过程 中通过核苷酸链的滑动错配( s l i p p e d s t r a n dm i s p a i r i n g ) 或者其它方式改变长度【3 1 ，由于 重复单元数目及重复程度不同而造成微卫星d n a 片段长度的差异 4 1 。 1 2 2 微卫星分子标记的优点 具有高度的多态性，在基因组中含量丰富、呈共显性标记、有选择中性的特点；采 用单位点d n a 指纹技术，检测容易，重复性较好；取材简便易行、能用p c r 方法进行 扩增；此外微卫星包含高质量的信息、并且微卫星的引物具有通用性。 1 2 3 微卫星的应用 1 2 3 1 种群遗传结构分析 遗传结构是指基因或基因型在空间和时间上的非随机分布，种群的遗传结构包括种 群内的遗传变异和种群间的遗传分化；对遗传结构及其影响因子的研究是探讨生物适应 意义、物种形成过程及其进化机制的基础；研究物种的遗传变异不仅能够深入了解该物 种现在和过去的进化历史，而且能探明其遗传多样性现状和进化潜力，制定有效的保护 策略和措施必须建立在对遗传结构充分了解的基础上【5 1 。而微卫星d n a 是进行种群遗 传结构和遗传多样性研究有效的分子标记。 1 2 3 2 基因流程度分析 基因流是指任何携带有遗传物质的物体在种群内和种群问的流动。地理与生态障碍 能够限制种群间基因流动并导致种内遗传多样性水平下降，而合适的栖息地将有利于新 等位基因的扩散。对于那些呈数个群体分布的濒危动物，各群体间的遗传多样性程度可 能随遗传漂变而不同，并受群体大小和栖息地容量的影响【6 1 。因此了解遗传多样性在时 间和空间上的分布及其原因，并确定相应的进化显著单元，对科学合理地制定保护管理 策略，更加经济有效地保护濒危物种尤其重要。微卫星作为一种高度多态性的分子标记， 能够有效地用于物种系统地理研究种趋异尺度的衡量和种群分化的研究r 7 1 。 1 2 3 3 种群进化史 种群动态和物种进化历史揭示有效种群大小受到种群个体数量的影响，种群大小的 剧烈变化。微卫星标记可以从年代久远的馆藏历史标本中获取相应d n a 的遗传信息【8 1 。 2 文献综述 通过分析这些陈旧d n a 并与现存种群的遗传组成比较，对监测由于种群大小波动而造 成的遗传结构在时间上的变化以及其他进化事件，这些都将有助于推测种群历史上经过 的变动或预测将来的种群动态变化，揭示种群的重要历史进程【9 】 1 2 3 4 物种的判定和种群数量的调查 在野外环境中许多动物尤其是近缘物种间，在形态、生活习性方面都十分相似，仅 仅依靠野外的观察和形态学的特征对物种进行鉴定是很难获得正确的理解的，特别是在 两栖类，有很多具有相似生态位的物种常常生活在一起，这都大大的影响了我们对物种 的判断。借助于微卫星等位基因频率的不同可以很好的区分出不同的物种【l o l ，不管是近 缘物种还是杂交个体，采用微卫星分子标记技术均可以提高鉴定的准确性。 1 2 3 5 亲缘关系的鉴定 在野外，我们很难获得准确的个体之间的亲缘关系，为了在人工圈养和对物种进行 迁地保护中更好的分开有亲缘关系的个体，以更好的避免近交衰退对物种产生的影响， 因而很有必要对个体之间的亲缘关系进行鉴定。微卫星分子标记技术便能很好的解决这 一问题，该方法可以从动物个体的粪便、毛发、组织、血液、皮张等部位取样来检测个 体所携带的遗传信息，从而判断出个体与个体之间的亲缘关系。 1 3 微卫星位点的获得方法 要以微卫星位点作为分子标记对科学问题进行研究，首先必须获得该物种的含有微 卫星核心序列的碱基片段，然后根据核心序列两旁的侧翼序列设计出能够扩增该核心序 列的微卫星引物，进而通过以物种的d n a 作为模版，以p c r 扩增出包含微卫星核心序 列的位点。下面将分别详述各种方法： 1 3 1 从数据库或相关文献中获得 从公共的d n a 序列数据库g e n b a n k 、e m b l 、d d b j 或已发表的相关物种的文献中 获得物种的微卫星位点或微卫星引物，这将是最经济、最快速的方法。然而该方法的一 个最重要的限制就是已经记录或发表的物种资源有限，并且在这些已经记录或发表的物 种中，更多的是模式物种、常见的农作物物种以及人类的微卫星序列。 1 3 2 从近缘物种获得 微卫星位点序列被认为在属内种间、甚至是科内属间都是保守的、相似的。在研究 物种没有直接相关的微卫星位点序列的情况下，研究者只需通过在数据库或已发表的文 文献综述 献中获得研究物种的近缘物种的微卫星位点即可对研究物种的微卫星位点情况进行研 究。然而该方法的一个很大的不足是近缘物种的微卫星位点并不是完全等同于研究物种 的微卫星位点，因而在使用该方法时，通常会使用较多的近缘物种的微卫星位点来对研 究物种的微卫星位点进行筛选。物种的这种跨种扩增获得微卫星位点的方法已在多种物 种的研究中获得成功 1 1 , 1 2 ，然而该方法的成功率在各类群的物种中却并不一致，这也成 为该方法在某些类群研究中效果并不显著的主要原因【1 3 】。 简单序列重复f 司( i n t e r s i m p l es e q u e n c er e p e a t ，i s s r ) 是一种基于s s r 的分子标记。 它直接利用s s r 序列为引物( 1 6 1 8 b p ) ，扩增反向排列的间隔不太长的两个s s r 之间的 序列。一组i s s r 引物可通用于不同的物种。在物种微卫星引物的开发中，即是将i s s r 引物的获得方法反向使用来获得s s r 引物。该方法已成功应用在多种植物物种的研究中 1 4 , 1 5 ，然而在动物物种的研究中应用还不常见。该方法的步骤如图1 1 和1 2 所示 1 4 , 1 6 1 ： ( 1 ) 正向引物分离：( 2 ) 反向引物分离： 豢攀訾鼬雀攘穆 + 一黝燃煮兰兰= = 了= z = = = 三= i 飘 亡嚣= = = = = = i i 著三i = = = 趣 臻锪。 鬟履揪 群， l 强凳囊攀。o毡 謦磊掌围一 一 二。兰竺 缴矿蚓糍l 黝引徽黝嘎稳 固国烹= = = 蔗= = e 贮翘兰鬟兰= 薰黧= 黧兰笙4 1 3 4 从构建的基因组文库中获得 从构建的基因组文库中获得微卫星序列是一种经典的分子生物学方法，该方法主要 包括d n a 文库的构建、筛选克隆片段、测序和根据序列设计p c r 引物以进行微卫星位 点的扩增。近年来，该方法得到了极大的发展，使得该方法被广泛的应用于各类物种的 4 文献综述 微卫星序列的研究中。下面将详述该方法及其发剧1 7 】： ( 1 ) 传统方法：一直以来，微卫星位点都是从目标物种的部分基因组中分离得到的， 其主要步骤如下：将高质量的基因组d n a 使用限制性内切酶或超声波切割成大小不 定的片段；选择3 0 0 7 0 0 b p 大小的片段；将d n a 片段直接链接到载体上或者将d n a 片段链接上特异的接头后再链接到载体上；将链接后的载体和d n a 片段转导进细菌 的细胞中培养，可获得极多的重组克隆子；通过使用含重复序列的探针进行s o u t h e r n 杂交，选择阳性克隆子；测序、设计引物、检验引物。由该方法发展出来的的另一种 方法，被称做p i m a ( p c r i s o l a t i o no fm i c r o s a t e l l i t ea r r a y s ) ，它略去了上述从d n a 片段到 克隆的步骤，而是使用r a p d 的引物来获得随机扩增的产物，将产物进行克隆和转导， 并通过p c r 方法使用特异的重复序列引物来筛选阳性克隆子，最后再测序、设计引物 和检验引物。 0 矿0 0 $ 啦 撬l 五，t z 蹦 擘一 l 一一 o p 一1 一啼 |铆一 j l1 一唏一 l = 竺一( = 三广一 _ fj i1 i 臣至蔓亟 i l 图1 3 传统方法分离微卫星的步骤解析 f i g1 3t r a d i t i o n a lp r o c e s sa b o u ti s o l a t i n gs s r 一 连卜l 文献综述 ( 2 ) 富集方法：o s t r a n d e r 1 8 1 和p a e t k a u l l 9 】分别于1 9 9 2 年和1 9 9 9 年提出了富集方法及 其改进方法。两种方法都需要首先建立一个初级的基因库，而后再将片段d n a 转导进 质粒以获得单链d n a ，然后再以单链d n a 为模板，以特异的重复核苷酸为引物，获得 含微卫星的产物。两种方法的步骤和差异如下：在o s t r a n d e r 的方法中，初级基因库中 的片段通过l b 培养基克隆出4 0 0 0 0 6 0 0 0 0 个克隆子与含有特定物质的载体结合，以获 得特异性，然后再选择保守性的单链d n a 通过( c a ) 。或( g t ) n 的引物复性成双链d n a ， 之后再与感受态的细菌细胞结合，这样就能获得富含微卫星的文库。而p a e t k a u 的方法 中，初级基因库是通过m 1 3 噬菌体来获得的，在获得单链d n a 后使用5 端生物素探针 标记的( c a ) n 或( g t ) 。的单核苷酸链来获得富含微卫星的文库，之后再进行转导和克隆。 两种方法在挑选阳性克隆以后，都需要测序、设计引物和检查引物特性。两种方法的步 骤解析如图1 4 和1 5 所示： i 一稍 。毒篓篓尹- | 搬一 l 一辫一湖一 d 一叩 图1 4 富集方法初级基因库构建步骤解析 f i g1 4p r i m a r yg e n ep o o lc o n s t r u c t e dp r o c e s s b yr i c h n e s s 鐾耘。 薯一占 一一门 6 图1 5 富集方法分离微卫星的步骤解析 f i g1 5i s o l a t i o ns s rp r o c e s sb yr i c h n e s s 硅 文献综述 2 两栖类现状 2 1 世界两栖类现状 全世界到目前为止一共发现并命名的两柄类物种有6 4 5 3 种，其中蚓螈目 ( g y m n o p h i o n a ) 1 7 6 种、有尾日( c a u d m a ) 5 7 8 种、无尾日5 6 9 9 种【2 0 】。根据i u c n 已 评估过的6 2 6 0 种两栖类来看，其中胄3 8 个物种已绎灭绝( e x ) 、1 个物种野外灭绝( e w ) 、 4 8 9 个物种极危( c r ) 、7 8 7 个物种濒危( e n ) 、7 1 5 个物种易危( v u ) 、3 8 1 个物种受 胁( n t ) 、2 3 1 6 个物种较少关注( l c ) 、1 5 3 3 个物种数据缺乏( d d ) 2 1 i 。 2 2 我国两栖类现状 我国有记录的两牺类物种共3 4 5 种，其中蚓螈目1 种、有尾目4 4 种、无尾目3 0 0 种。在3 4 5 个物种中，i u c n 已对其中3 2 4 个物种进行了评估，其中包括已经灭绝的物 种1 种、极危物种8 种、濒危物种3 0 种、易危物种4 7 种、受胁物种3 2 种、较少关注 的物种1 4 5 种、数据缺乏的物种6 1 种【2 0 l 。 图16 i u c n 红色名录评估的6 2 6 0 种 两栖类物种濒危情况分布图 f i g l6w o r l d w i d ee n d a n g e r e da m p h i b i a n a s s e s s e db yi u c nr e dl i s t 。删 u4 矾 一 盯 图17 i u c n 虹色名录评估的3 4 5 种 我国两栖类物种濒危情况分布囝 f i gl7e n d a n g e r e da m p h i b i a na s s e s s e db y i u c nr e dl i s ti nc h i n a 暴、嗲 鼢丁 h n一一瓢i罐 文献综述 2 3两栖类致危因素分析 两栖类作为从水生进化到陆生的过渡性动物类群，目前其种数已经达到6 4 5 3 种之 多。然而，最近二十年来，全球的两栖类都出现了较快的种群下降【2 2 】。究其原因，莫不 是因为如下几个方面：生境破碎及片段化、外来种的入侵、过度的捕猎、全球气候的变 化、紫外辐射、环境的污染、自身的疾病与畸形、以及这些因素之间的相互作用【2 3 1 。然 而，生境的破碎被认为是导致全球两栖类种群下降最主要的因素【2 0 , 2 4 1 ，下面将对以上因 素进行逐一分析： 生境的破碎、改变以及片段化是导致两栖类种群下降的最主要也是最直接的原因 2 5 1 。两栖类的适栖水环境干涸，或被用于城市化改造或开垦农田，都将使两栖类的适栖 生境受到破坏 2 6 1 。森林的砍伐能够剧烈的改变两栖类的生境，并极大程度的影响两栖类 物种的丰富度和多度【2 7 l 。生境的改变不仅影响当地的环境，反过来也影响到了当地生态 系统的功能【2 引。如放牧生态系统中的小池塘，由于牛羊等的啃食或取水，将加快草原生 态系统中两栖类生存环境的改变，导致两栖类生境的改变。生境片段化被认为是继生境 破碎化对两栖类物种的影响之后的次级影响。生境的破碎使得物种种群数量极大的下 降，而栖息地的片段化更使得物种在斑块间的扩散和迁移受到阻断【2 9 】，物种种群间的基 因流也随之受到阻断，因而造成物种的遗传多样性下降，种群数量减少甚至出现灭绝。 此外，生境破碎会产生过多的边界，为外来种提供更可能多的适居场所，使得外来种更 易于侵入斑块的内部【3 0 1 ，从而改变当地生物的捕食和竞争关系，也能够导致两栖动物种 群生存能力的下降和灭绝。 外来种通常是指对出现在其过去或现在的自然分布范围以及扩散能力以外的物种。 外来种种群的建立和广泛的传播被认为是对全世界生物多样性的一个主要的威胁3 1 l 。对 于两栖动物来说，外来的入侵种对本地种是具有负作用的。本地物种由于缺乏与外来种 长期共同进化的历史因素而表现出对外来种的不适应，导致了本地物种种群的下斛3 2 1 。 此外，外来种通过和本地物种竞争【3 3 , 3 4 】、携带疾病菌进入本地种群1 3 5 1 、与本地物种杂交 【3 6 】以及捕食本地物种【3 7 1 来影响本地物种的种群。许多的两栖类物种还表现出明显的对生 态位相似的外来种缺乏适应，导致了本地物种在外来种的面前非常的脆弱，其竞争能力 低，最终导致物种种群的下降甚至灭绝【3 2 1 。 两栖类的物种被广泛的捕捉于各种各样的用途，包括作为：食物、宠物、制药、教 文献综述 育、科研以及钓鱼时的诱饵等【2 0 】。蛙腿作为一种美食，在欧洲、加拿大以及美国都相当 的盛行。在1 9 8 1 年到1 9 8 4 年的4 年间，美国每年要进口3 百万千克的蛙腿用于消费， 这相当于2 千6 百万个个体【3 8 】。小鲵、蝾螈、蟾蜍等两栖类物种，由于其安全、容易饲 养，因而被当作宠物每年都大批的贩卖到美国去。其中某一年中，仅仅只是韩国就有超 过3 4 0 0 0 只东方铃蟾( b o m b i n ao r i e n t a l i s ) 通过香港贩卖到美国，而香港还有9 3 5 0 只赤腹蝾 螈( c y n o p s p y r r h o g a s t e r ) 被出口卖到美国当作宠物【3 9 1 。在教育和科学研究方面，从曾经调查 过的1 4 个机构来看，仅有1 家是使用的养殖的两栖类，其它的都是野生的【3 8 1 ，这对野 生的两栖类种群又是一起重大的伤害。在制药方面，现有的研究表明某些两栖类的皮肤 会分泌生物碱，同时两栖类储藏有丰富的肽类物质，这使得两栖类的应用更加广泛【3 羽。 两栖类在人们日常生活中起到的作用越大，对其的捕捉就会越厉害，以致使得某些物种 过度捕捉，而使得该物种难以恢复种群正常水平，最终导致灭绝。 全球气候变化这一客观事实得到了世界上各国科学家的广泛认同。不管是厄尔尼诺 还是基于厄尔尼诺上的南方涛动都对全球气候产生了极显著的影响。全球的气候对于生 物体来说最直接的影响就是温度和湿度，特别是对于两栖动物来说更是有着极为显著的 影响 4 0 】。两栖类由于皮肤的透性，身体的温度直接被环境中的空气、水、土壤和太阳光 能温度所决定。同时身体的温度又决定了生物体体内包括新陈代谢、呼吸作用、排泄、 消化以及物质能量循环的效率【4 。更重要的是受精卵的发育速度也完全受到外界环境的 影响1 4 2 】。水的作用相较于温度来说对两栖类的影响更为显著，由于在两栖类生活史的各 个阶段水都扮演了关键的角色，因而常常可以把水的分布现状看为决定两栖类分布的关 键因子【4 3 】。此外，天气的变化通常还与两栖类的种群下降有着间接的关系。例如出现长 时间的干旱，可能会使得某种两栖类的致病菌大爆发，从而影响到两栖类的种群。 紫外光波是一组波长介于2 0 0 n t o 到4 0 0 n m 的光波，它包含三个特殊的波长区，波 长介于3 1 5 4 0 0 n m 的u v - a 是不会被生物分子吸收的，而波长介于2 0 0 2 8 0 n m 的u v - c 则被臭氧层吸收了，仅波长介于2 8 0 n m 到315 n m 的u v - b 是一种对生物体有伤害的光 波】。由于两栖类的卵缺乏保护性的外壳，而成体和蝌蚪的皮肤极薄，因而对u v - b 的 吸收比其它物种更为明显，这导致了两栖类物种种群的下斛4 5 1 。紫外辐射对生活于陆地 表面的生物体的伤害极为严重，主要表现在减缓个体的生长速率、导致免疫机能障碍和 亚致死损伤【4 6 】。在两栖类中，紫外辐射主要是通过引起两栖类的胚胎或幼体死亡而导致 种群数量下降【47 1 。此外，紫外辐射对一些两栖类物种的亚致死效应还表现在对该物种的 9 文献综述 胚胎、卵以及成体产生影响，比如说紫外辐射改变了个体或种群的行为、减缓生长发育、 或者造成身体或形态上的畸形。不同的两栖类物种对环境中的紫外线辐射敏感程度不一 样，这主要是因为不同种的光解酶活性不一样，活性高的物种比活性低的物种能更有效的 修复紫外线导致的d n a 损伤，因而光解酶活性高的物种对紫外线辐射的抵抗力强，它 们的胚胎或幼体死亡率也较低，而光解酶活性低的物种胚胎或幼体的死亡率则较高【4 7 1 。 另外，通过分子水平的检测发现，两栖动物体内的d n a 光敏裂合酶的多少与两栖类种 群的大小成正比【4 7 1 。 环境污染物包括各类杀虫剂、灭草剂、杀菌剂、化肥和工业废弃物都对两栖动物产 生了很大的影响【4 8 l 。这些污染物不仅能对当地的物种起到影响，而且还能影响到距离遥 远的地方m j 。对两栖动物的影响可以是直接的杀死，也可以是通过影响其行为、降低其 出生率、阻断内分泌以及引起免疫抑制而间接影响两栖类的种群数量【4 9 1 。此外严重的环 境污染还产生了大量的类激素化合物，这些化合物导致了许多雄性两栖动物个体的性腺 异常发育，出现雌性化现象，阻碍个体发育。具体说来杀虫剂可以阻碍生活于其中的两 栖类生长和发育，导致形态及行为变形；重金属和酸化水体同样会有致死效应以及半致 死效应，例如减缓生长和发育以及使得形态和行为变形，其中在p h 小于5 0 时一些物 种的繁殖会成为问题，两栖类、卵及成体的分布和存活都受到了影响，进而影响到两栖 类的多样性。农田中所施加的氮肥也会降低蝌蚪的摄食活力，并导致蝌蚪的活动减少、 表现出一种不平衡的状态，甚至引起个体发育畸形和死亡。 物种疾病的爆发对于物种来说都是毁灭性的。然而近来有研究表明，在两栖类中存 在的致病原如：壶菌、蛙病毒、霉菌等都是由于两栖类本身缺乏该类抗体，因而极易导 致种群下降甚至灭绝【5 0 1 。此外，外来种中所携带的两栖类的致病原更是能够在极短的时 间内使得本地种群崩溃。此外，越来越多畸形的无尾两栖类在野外被发现，此前曾认为， 这些畸形的无尾类与当地环境的污染、紫外辐射和寄生虫病有关系【5 l 】，近来的一项研究 表明，无尾类的畸形还与一种吸虫有关【5 2 1 。上述诸因素的综合作用直接导致了两栖类种 群的快速下降。 两栖类微卫星研究现状 利用微卫星分子标记技术对野生濒危两栖类的遗传多样性、遗传结构、近缘物种鉴 1 0 文献综述 定与分类以及种群间的遗传分化等研究已经广泛的开展起来。 p r o h l 等【5 3 】以南北部哥斯达黎加和巴拿马的p h y s a l a e m u s p u s t u l o s u s 为研究对象，开 发设计了该物种的8 对微卫星引物，并且获得了高于其它两栖类物种微卫星的多态性， 并认为这种多态性之间的差异是由于南北哥斯达黎加或北部哥斯达黎加与巴拿马之间 的长达2 0 0 k m 的中部哥斯达黎加太平洋沿岸的距离产生的种群遗传分化所造成的。 s a r a h 等【5 4 】以微卫星分子标记技术研究了由于城市化进程使得生境片段化和破碎化的加 拿大魁北克省的p l e t h o d o nc i n e r e u s ，结果显示在片段化或破碎化生境中生活的该物种其 等位基因的丰富度和杂合度都比连续性生境低；同时经过确切性检验和配对f s t 检验表 明了在破碎化和片段化生境中该物种出现了遗传分化。l e s b a r r e r e s 等【5 5 】则用微卫星分子 标记技术来研究r a n at e m p o r a r i a 的遗传变异与个体变态时的大小和年龄适合度之间的 相关性。结果显示：该物种个体变态的大小与个体的杂合度之间存在着正相关性；而个 体变态的年龄则只能由环境因素来解释。该研究更进一步揭示出遗传变异在该物种中是 个体适合度的重要组成部分，而环境的变化则是起着强大的选择压力。此外，在不同的 地理区域雄性两栖类有着不同的求偶呜叫特征，j u l i a 等【5 6 】因此以r a n al e s s o n a e 为例研 究了欧洲不同地区该物种的鸣叫特征与遗传特征之间的关系。通过微卫星分子标记揭示 出的不同地区之间该物种的遗传变异能够很好的解释雄性两栖类地理鸣声的问题，同时 也指出在两栖类可以使用地理区域呜叫特征作为研究物种历史分布的系统地理学方法。 e i 砌a 【57 j 以微卫星分子标记技术研究了分布于澳大利亚东海岸的l i t o r i aa u r e a ，结果显 示出尽管该物种近年来种群持续下降，但是各隔离种群的等位基因的多样性和杂合度仍 处于比较高的水平，同时各地理种群也没有出现明显的瓶颈效应。因而认为只要采取合 理的保护措施，该物种的种群是可以恢复的。e l m e r 等【5 8 】则通过大尺度的对厄瓜多尔 e l e u t h e r o d a c t y l u so c k e n d e n i 的微卫星遗传多样性进行研究后指出：池塘或洼地中的两栖 类种群是不能随机交配的，而缺乏随机交配的现象并不能作为无效等位基因或亲缘样本 偏差的合理解释。 此外，还有多位科学家使用磁珠富集法等方法对各种两栖类的微卫星位点进行了研 究阻7 1 1 ，并且开发出具有物种特异性的微卫星引物。这些微卫星引物的合理应用及其研 究将为两栖类的保护遗传学提供更多的理论支持和保护实践指导。 而在利用扩种引物进行p c r 扩增来研究两栖类的遗传结构和遗传多样性方面， c r a i g 等【l3 】在蛙科中使用了来自于不同物种的3 3 9 个不同的微卫星位点，然而只有9 3 个 文献综述 ( 2 7 ) 位点能够获得明显的扩增结果，而这其中仅有3 8 个( 1 1 ) 位点的引物的扩 增结果具有多态性。这与兽类和鸟类的研究结果相差甚远。在鸟类中，燕子在9 1 的近 缘种中能够获得大概7 3 左右的微卫星多态性。而兽类中的牛和羊能够获得微卫星多态 性的也占到了5 6 和4 2 。这种差异的造成被认为可能与蛙科的平均基因组是兽类和 鸟类的2 倍和4 倍有关。 4 虎纹蛙属( h 矽肠6 口抛c 办螂) 及虎纹蛙饵印肠6 口办竹如螂r u g u l o s u s ) 研究 现状综述 4 1 虎纹蛙属( h o p l o b a t r a c h u s ) q 寺征及其研究现状 4 1 1 虎纹蛙属物种的形态鉴别特征 虎纹蛙属的蛙类