（遗传学专业论文）aflp银染法及其在植物基因组多态性研究中的应用.pdf

摘要 仓 增 性 ， 切 片 段 长 度 多 态 性 amplified fragment length polymorphism,简 称 a f l p ) 是1 9 9 3 年由z a b e a u等人发明的一项新的d n a指纹技术。 该方法结 合了 r f l y ( r e s t r i c t e d f r a g m e n t l e n g t h p o l v m o r p h i s m ) 技术与p c r 技术的 特点，具 有检 测的多态性多，对模板浓度不敏感，扩增结果稳定，不需要了解序列信息等优 点，是目前一种比较理想的 d n a指纹技术。该技术现已广泛用于高密度遗传图 ie 构建、基因定位，以及遗传多样性研究等诸多领域。 但是，目前 a f l p技术一般采用同位素标记的方法进行检测，由于同位素放 射性强，操作不便，而且曝光时间长，限制了该方法的推) 、 一 。本文采用银染的 方法检测 扩增产物，取得了 很好的效果。而且 使用银染法能够降低试验成 本， 缩 短 试 验 周 期 ， 提 “ 了 a f l p 技 术 的 “ 用 性 。 卜 利用 a f l p 一 银染法，本文探讨了a f l p 技术在以下三个方面的应用: l . 指纹图谱的构建: 利用a f l p - 银染法， 构建了1 2 种玉米杂交品 种的 指纹 图谱。以此为基础，筛选到玉米杂种09抗 5号 特异性的分子标记，井将标 记 t k 4 - 2 0 0 转化为共显 性的p c r标记。为 今后利用a f l p技术进行品种鉴定 作了 有益的尝试。 2 ，抗病分子标记的筛选:以花椰菜 一 对划蓝黑腐病抗、感近等位荃因系为 材料，利用 a f l p 一 银染法筛选与抗 甘蓝黑腐病连锁的分子标记。共筛选了 1 3 对 引物，得到 4个抗病连锁标记。标记 r x c - 4 0 0的测序分析及同源性比较表明， 它与 拟南 芥的 b a c克隆 f 7 n 2 2巾部分序列 有 7 5 % 的同 源性。该克 隆位于 拟南 芥5 号 染色体的甘蓝黑腐 病抗性苏因 r x c 2 附近，这说明标记 r x c - 4 0 0 很可能 与抗性基因连锁。 3 .亲缘关系分析:利用 a f l p - 银染法，分析了 1 0梨属植物间的亲缘关系， 为梨属植物的传统分类学、育 种学 及 遗传 多样性研究提供 了 分子水平的依据 关键词;a f l p 银染d n a;纹图谱甘蓝黑腐病亲源关系 ab s t ract a f l p i s a n e w d n a fi n g e r p ri n t i n g t e c h n i q u e d e v e lo p e d b y z a b e a u a n d v o s in 1 4 9 3 t h i s m e t h o d c o m b in e s t h e s t r e n g t h s o f r f l p a n d p c r . d u e t o h a v i n g m a n y a d v a n t a g e s , s u c h a s d e t e c t in g la r g e n u m b e r o f p o l y mo r p h i s m i n a s i n g l e a s s a y , i n s e n s i t i v e t o t e m p la t e d n a c o n c e rt r a t i o n , a m p l if i c a t i o n s t a b i li t y , an d n o s p e c ifi c p ri o r i k n o w l e d g e o f t h e s e q u e n c e , i t h a s b e e n a p p l i e d i n t o w i d e a r e a , s u c h a s h i g h - d e n s it y g e n e t i c m a p p i n g , g e n e l o c a t io n , a n d g e n e t ic d iv e r s it y . h o w e v e r , u p t o n o w a f l p i s g e n e r a ll y d e t e c t e d b y i s o t o p e l a b e l l in g m e t h o d b e c a u s e i s o t o p e t e c h n o l o g y h a s h ig h l e v e l s o f r a d i o a c t i v i t y , a n d is t i m e c o n s u m in g , a f l p h a s li m i t e d a p p l i c a t i o n f o r la r g e - s c a l e u s e s . w e d e v e lo p e d a f l p w i t h s i l v e r - st a i n i n g m e t h o d . t h e r e s u lt d e m o n s t r a t e d t h a t u s i n g s il v e r s t a i n i n g m e t h o d w e c a n a l s o g e t t h e c l e a r d n a fi n g e r p ri n t i n g p a tt e rn . c o m p a r e d w it h i s o t o p e d e t e c t i o n m e t h o d , i t i s e a s y , s a f e , an d t i m e s a v in g we a p p l ie d a f l p - s i lv e r s t a i n i n g m e t h o d in t o t h e f o ll o w in g t h r e e a s p e c t s : 1 . c o n s t r a c t io n o f d n a fi n g e r p r i n t in g m a p : u s in g a f l p - s il v e r s t a i n i n g m e t h o d , w e c o n s t r u c t e d t h e d n a fi n g e r p ri n t i n g m a p o f 1 2 m a i z e h y b r i d s . b a s e d t h i s m a p , w e s c r e e n e d t h e s p e c ifi c m a k e r s o f t a n g k a n g 5 , o n e o f t h e h y b ri d s . a m o n g t h e s e m a r k e r s , t k 42 0 0 w a s c o n v e rt e d i n t o a c o d o m i n a n t , p c r - b a s e d m a r k e r , w h i c h c a n b e e n u s e d t o i d e n t i fi e d t h e s p e c i a l l i n e i n t h e f u t u r e 2 . s c r e e n i n g t h e d n a m a r k e r l i n k e d t o p a t h o g e n r e s i s t anc e : u s i n g b u l k e d n e a r is o g e n i c c a u l i fl o w e r l in e s , o n e o f w h i c h i s r e s i s t an t t o b la c k r o t , an o t h e r i s s u s c e p t i b i l i t y , w e i s o l a t e d 4 m a r k e r l i n k e d t o th e r e s i s t a n c e w it h s c r e e n i n g 1 3 p ri m e r c o m b i n a t io n s . o n e o f t h e s e m a r k e r , r x c - 4 0 0 h a s a l r e a d y b e e n s e q u e n c e d .t h r o u g h g e n b a n k s e a r c h , i t h a s 7 5 % h o m o l o g y w i t h a p a i l o f a . t h a l i a n a b a c c lo n e f 7 n 2 2 . w h i c h w a s lo c a t e d o n c h r o m o s o m e v . and n e a r th e b l a c k r o t r e s i s t an c e g e n e r x c 2 . i t d e m o n s t r a t e d t h i s s e q u e n c e m a y b e l i n k e d t o t h i s g e n e 3 . e x a m i n a t io n o f g e n e t ic r e l a t e n e s s : u s i n g a f l p - s i lv e r s t a i n i n g m e t h o d , w e a n a l y s i s t h e g e n e t i c r e l a t i o n s h i p o f 1 0 p e a r s . t h i s w o r k w i l l p r o v i d e t h e m o l e c u l a r d a t a f o r t h e t a x o n o m y , b r e e d i n g an d g e n e t ic d iv e r s i t y i n t h e p e a r . k e ,% + o r d s : a f l p - s il v e r s ta r ti n g d n a f m g e g r r i n f n g m a p . b la c k ro t , m o l e c u la r m a r k e r . g e n e ti c r e l a b o a d r i p !1 j o 第一部分前言 d n a分子标记的研究历史及现状 d na 分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组某种差异特征的 d n a 片段，它是近年来在遗传学研究领域中所广泛采用的一种遗传标记。在 d n a分 子标记出现之前，遗传标记最早来自于形态学标记和细胞学标记。前者是主要 以生物体的外部特征为依据，后者则是以细胞学特性如染色体核型 ( 包括染色 体数目、大小、随体、着丝粒位置等)和带型 ( c带、 n带、g带)为基础。但 是由于这类标记数目极其有限，而且有些标记容易受到环境因素影响，所以具 有很大的局限性 ( 张德水等，1 9 9 8 ) 。从 1 9 5 9年 ma r k e t 和 mo l l e r 首次提出同工 酶的 概 念以 来， 将同 工 酶应 用 到 遗 传 标记 领 域的 研 究 得到了 迅猛 发 展 ( 刘 华 ， 1 9 9 7 ) 。由 于 同 工 酶的 差异 主 要 是由 编 码 该 酶的 等 位 基 因的 差 异造 成 的， 因 此 可 以 通过蛋白电 泳所产生的谱带差异来 标记不同 的基因 型。同 工酶标记比形 态学 和细胞学标记要稳定，反应的多态性位点也多，而且表现为共显性，可以将亲 本的等位基因在后代个体中同时反映出来，因 此曾为 许多遗传学家广泛采 用。 同 工酶标记虽然较形态学和 细胞学标记前进了 一大步， 但是它自 身同样也 存在 着一定的局限性。同工酶作为 基因的 表达产物， 其特异性在一定程度也要 受到 环境和发育阶段等多种因素的影响，而且到目 前为止，由同 工酶所提供的多 态 性位点的数 目 还是远远不能满足遗传学家的要求。 随着分子生物学技术的迅猛发展，尤其是 d n a重组、克隆、d n a测序、 分子杂交技术的发展， 人们逐渐认识 到遗传物质d n a本身蕴藏着丰富的多 态 性。这些多态性大多数是由于d n a分子的突变、缺失、插入、易位、倒位、重 排或是由于存在长短与排列不一的d n a重复序列而产生的，如果能用适当的方 法检测到完全可以做为遗传标记。 1 9 8 0 年 ， 美 国 科 学 家b o t st e i n :;_ 首 次 利 用r f l p c r uc t io n f r a g m e n t l e n g t h p o l y m o r p h i s m )技术检测由 于d n a分子 中限制性内切 酶酶切 位点突变 或由 于 酶 切位点之间 d na长度变化所造)如1 勺 多态性，从而开创了直接应用d n a本身的 多态性作为标记进行遗传研究的 新时 代。d n a分子标记 较传统的遗传 标记和同 工酶标记具有非常显著的优越性:首先它直接 以d n a的形式表现，在植物体的 前 言 各 个组 织、各发育时期 均可检测到， 不受 季节、 环境限制，不 存在表达与否的 问题;其次，它的数量极多，理论上是无限的;第三，多态性高，自 然存在着 许多等位变异，不需要专门创造特殊的遗传材料。正是这些优点推动了d n a分 子标记技术的迅速发展和广泛应用。在短短十几年中，相继有数十种名称各异 的分子标记技术问世，并广泛地应用于植物基因组研究，生物起源进化及遗传 多 样性 研究、动植物育 种、 疾病早期诊断与 预防及法医学研究 等诸多 方面， 成 为现代分子遗传学和分子生物学研究与应用的主流之一。 目前，常用的 d n a分子标记技术可以分为两大类。 第一类是以 分子杂 交为基础的分 子标记技术，其代表是r f l p 技术。 该 技 术是利用放射性同位素或其他非放射性物质标记的探针，与经过特定限制性内 切 酶消 化的基因组d n a 进行s o u t h e rn杂交，通过显示限制性酶切片段的大 小差 异， 来检测不同 基因 组之间的多态 性。r f l p 技术的 优点是稳定性高， 所得标记 为 共显性 ( c o d o m i n a n t ) ， 属于 经典的 分子标记技术，许多动、 植物的遗传图 谱 都是以该 技术为基础构 建。 但是r f l p 技术由于是以分子杂交为基础，因 此对样 品d n a 的 需 要 量 较 大 ( 5 - 1 o ltg ) ， 而 且 所 需 仪 器 设 备 较 多， 操 作 比 较 繁 琐， 同 时 它一次检出的多态 性位点也比 较少。这 些缺点限制了r f l p 技术在大规 模遗传 分 析上的广泛应用。 第 二类是以p c r 技术为基础的分子标记技术。 p c r技术自 发明以 来，以 其 灵 敏、 高效、 快捷的 特点迅速 渗透到分子生 物学研究的各个领域。目 前， 以p c r 为基础的分子标记技术也己 经成为分子标记技术中的主力军，常用的技术包括 r a p d ( r a n d o m a m p l i fi e d p o l y m o r p h i c m d n a ) ( w i l l i a m s j . g . k e t a l , 1 9 9 0 ; w e l s h e t a l , 1 9 9 0 ) , s s r s ( s i m p l e s e q u e n c e r e p e a t s ) ( t a u t z d , 1 9 8 9 ) , a f l p ( a n i p h f l唐抗 5 号。 母本 d b丹，父本 八苏:f l黄玉 5 号。 杂交品种 沈单 7 号，冀单 1 7 号，津鲜 1 号， 唐1 5号，唐单 5 号，沈单 1 0号，中夏 2 号， 以上种子均由天津市种子公司提供。 农大6 0 ，京早 8 号。 农大 1 0 8 . 花椰菜: 等位基因系花椰菜品 种 ( b r a .r s i c a o l e r a c e a 伍. ) v a r b o tr y l i s ) c 7 1 2 和 c 7 3 1 . c 7 1 2 为 抗性系， c 7 3 1 为感病系，由 天 津农科院蔬菜 所提供。 梨: 麻 梨( p y r u s s e r r u la te r e h d . ) ， 白 梨( 乃 r u s b r e ts c h n e id e r i r e h d . ) ， 沙 梨 ( p y r u s p y r if o l i a b u r m ) , 褐梨( p y r u s p h a e o c a r p a r e h d) ， 杏叶梨( p y r u s a r m e n i a c a e f o l i a y o ) ， 木梨( p y r r r s x e r o p h i l a y u ) ， + . l 梨( p y r u s b e t u l a e f o li a b g e ) ， 巴梨( p y r u s c o m m u m s l ) ，秋f - 梨 ( l 沙 ， 、 ， 、， 、 、 ， ， ， : 。 ， ， 、 ， 、 m a x i m ) , ) . 梨 ( l 加 r u s c a l l e r y u u a d c n e ) 。 均由中国农业科学院兴城果树研究所提供。 2 . a f l p分析试剂及引物 a f l p试剂盒购自g i b c o- b r l公司，本文所涉及的 a f l p接头和引物序列 见表一 2 主要试剂 c t a b ( - 卜 六 烷 基 三 甲 基 嗅 化 胺) ， 丙 烯 酞 胺， 甲 叉 双 丙 烯酞 胺 ， 过 硫 酸 钱 ( 购 自 血研所科技公司， 进口 分 装) ， t e ie d ( p r o m e g a ) , p u c 1 9 , 氨节青 霉素( 华 美 生物i程公司) ，c i p ( 牛小 肠碱性磷酸酶) ，k l e n o w f r a g m e n t , 1 p t g , x - g a l 材d ! 和才 法 ( p r o g e m a ) , d i g - d n a标记 检测试剂盒 ( b o e h r i n g e r m a n n h e i n ) , 硝酸银染色试剂 盒( p r o m e g a ) o 4 .应用数件乃仪器 引 物设计 软件p r i m e r d e s ig n e r , 聚类分析软件n t s y s( 由l 卜 国农科ij l ii 1 1 质 所惠赠) ，高压电泳仪mo d e l 4 0 0 0 1 p 购自g i b c o公司，垂直板电泳槽 ( 购自比 京东方特力科贸中心) 。 二、实 验方法 1 .植物总体 d n a的提取 ( 1 ) 单粒种子 法 参照郭景伦等 ( 1 9 9 7 )发表的方法提取玉米总体 d n a， 稍做改动:将单 粒玉米种子的胚小心地剥出，放入匀浆器中，加入 1 0 0 曰 氯仿充分研磨。然 后加入5 0 0 11 i d n a提取缓冲液和4 0 0 u 1 氯仿， 混匀后 i 0 0 0 0 r p m离心2 分钟， 取上 清，加 入等体 积无水乙醇， 混匀 后静置1 5 分钟，1 2 0 0 0 r p m离心5 分钟， 7 5 % 乙醉洗沉淀，凉干后， 溶于 3 0 u i t e ( 5 0 m m t r i s - h c i p h 8 .0 , l o m m e d t a )中。 加入2 % ( v / v ) r n a s e ( 1 o m g / m l ) 除去r n a . 0 .7 % 琼脂 糖凝 胶电 泳检查 d n a质量。 ( 2 ) c t a b法提取植物总体 d n a 参照m u r ry 等 ( 1 9 8 0 )发表的方法 提取花椰菜和梨的 总体d n a : 取 。 2 g新鲜植物叶片， 在液氮中 研成粉末， 加入 2 m 1 c t a b提取缓冲液 0 . 7 m n a c l, % c t a b( +六烷基嗅 化按) , 5 0 m m t r i s - h c i p h 8 .0 , l o m m e d t a ，充 分混匀，5 6 保温3 0 分钟，5 0 0 0 r p m 离心 1 0分 钟， 取上清。 加 等体积酚/ 氯仿 / 异戊醇 ( 2 5 : 2 4 :日 混匀，5 0 0 0 r p m离心 1 0分 钟， 取上清。 再加等体积 氯仿 / 异 戊醉 ( 2 4 : 1 ) 混 匀， 5 0 0 0 r p m 离心 1 0分 钟， 取上清。 加 入等体积c t a b沉淀缓冲液 ( 1 % c t a b , i o m m e d t a , 5 0 m m t r i s - h c i p h 8 . 0 ) 。室温放 置 3 0分钟， 3 0 0 0 r p m离心 5分钟收集沉淀。 晾干沉淀后， 溶 于4 0 0 u 1 1 m n a c l 中， 再加入2 倍体 积无水乙 醉， - 2 0 沉淀半小时， 1 2 0 0 0 r p m 离心 1 5 分钟收集沉淀， 7 5 %乙醉洗涤沉淀， 室温晾干， 溶于 5 0 u i t e ( 5 0 m m 材群和方居 t r i s - h c i p h 8 . 0 , 1 0 m m e d t a )中 。加入2 % ( v / v ) r n a s e ( 1 0 m g / m l ) 除去 r n a. 0 . 7 % 琼脂糖凝胶电泳检查 d n a质量。 2 . a f l p分析 参照g i b c o - b r l公司生 产的a f l p a n a l y s i s s y s t e m试剂盒说明书， 稍有 改动: ( 1 ) 总体d n a限制 性酶切反应 在 2 5 11 1 反 应体系中含有 5 u 1 5 x酶切反应缓冲液 ( 5 0 n - ,4 t r i s - h c 1 p h 7 . 5 , 5 0 m m m g a c 2 , 2 5 0 m m k a c ) , 2 5 0 n g总体d n a , 2 . 5 u e c o r i 酶， 2 . 5 u m s e i 酶，3 7 c 酶切 3 小时。 ( 2 ) 接头连 接 限制性酶消 化后，再加入 1 u i t 4 d n a连接酶 ( l u n i t / i i 1 ) , 2 4 u i 接头 混 和液 ( 0 a m m a t p . l o m m t r i s - h c i p h 7 . 5 , l o m m m g a c , , 5 0 m m k a c , 5 p m o l e c o r i 接头，5 0 p m o l m s e l 接头) ，3 7 连接过 夜。 接头序列见表2 . ( 3 ) 预扩 增 取5 v 1 连接产 物， 加入4 0 u i 预 扩增混和液 ( 1 5 0 n g m o o引 物， 1 5 0 n g e 0 0 引 物， 0 .2 5 m m d n t p s ) , 5 u i l o x p c r缓冲液( 2 0 0 m m t r i s - h c i p h 8 .4 , 1 5 m m m g c l , , 5 0 0 m m k c d 。进行p c r扩增，反应条件为: 9 4 c 3 0 秒，5 6 c i 分 钟，7 2 c 1 分钟， 共进行2 0 个循环。引 物序列见表2 . ( 4 ) 选择 性扩增 将预扩 增产物稀释 1 0 倍 后， 取5 v i ， 加入0 1 8 u i e c o r i 引 物( 2 7 .8 n g / 11 1 ) , 4 . 5 u i m s e i引 物 ( 6 .7 n g / u i , 1 m m d n t p s ) , 2 u 1 i o x p c r缓冲液 ( 2 0 0 m m t r i s - h c l p h 8 . 4， 1 5 m m m g c l , , 5 0 0 m m k c 1 ) , l u t a q酶， 补 水至2 0 1 1 i o p c r 反 应条件为: 9 4 0c 3 0秒， 6 5 0c 3 0秒，7 2 c 1分 钟，以 后每个 循环复 性温度 减 0 7 0 c ，共计 1 3个循环。然后 9 4 c 3 0秒.5 6 0 c 3 0秒，7 2 c 1分钟，再进 行 2 3个循环，引物序列见表_ 2 材 挥 柳 万 蘑 3 .变性聚丙烯f ft 胺凝胶电泳 配制 6 %的变性聚丙烯酞胺凝胶( 6 %丙烯酸胺， 0 .3 2 %甲叉丙烯酞胺， 7 m o l/ l 尿素，1 x t b e ) ， 采用国产 d f - 6型电 泳 槽， 恒功率3 0 w 预电 泳 3 0分钟。 将 扩增产物加入等体积的 样缓冲液 ( 9 8 %甲酞胺，l o m m e d t a , 0 . 2 5 %嗅酚蓝) 9 5 变性 5分钟后，立即转移冰浴中冷却，然后每个样品 4 曰 上样至凝胶上， 恒功率 3 0 w，电泳 2 小时。 4 银染 参照p r o m e g a 银染 试剂盒说明书 进行 ( 1 ) 凝胶制备 用热水加洗涤剂 清洗短玻璃和长 玻璃，并 用干净的 吸水纸浸 透 9 5 %乙 醇， 擦洗玻璃， 凉干备 用。 配制i m l 粘和硅烷溶 液( 9 5 %乙 醇， 。 5 % 冰醋 酸， 5 u i b i n d in g s il a n e 。 然后用吸水纸浸透i m l 粘和硅烷溶 液， 均匀地涂满长玻 璃。 4 - 5分钟 后， 用干净的吸水纸浸透 9 5 %乙 醇轻轻沿一 个方向 擦洗玻璃，并 重复 3次。同时， 用 浸 透 剥离 硅 烷 ( s ig m a c o t e , 购自s ig m a 公 司) 的 吸 水 纸 均 匀 地 涂 满短 玻 璃， 5 一1 0分钟后用干净的吸水纸擦去多 余的剥 离硅 烷，用这 种方 法处理玻璃后， 凝胶能够牢固地附着 在长玻 璃上， 便于以 后银染操 作。 硅化后的玻璃， 用。 . 3 m m 的边条装配好，并 用医 用胶布将底边和侧边封牢，用夹子夹紧备用。灌胶时将 板4 0 度倾斜放置，用5 0 m l 注射t 3 将配好 的凝胶溶液4 0 m l( 4 0 m l 6 %变 性聚丙 烯酸胺凝胶，2 0 0 u 1 1 0 % 过硫酸服， 5 0 u i t e m e d) 连续 灌入，注意要 避免出 现气泡。灌满后将板水平放置，并插入梳子。凝胶应在 3 0分钟内聚合，过长时 间不聚合说明 试剂质量较差， 会影 响电 泳结果， 应更换 试剂。 凝胶聚合 2小时 后即可使用。 注意上 述操作必须 戴 上 橡胶手 套进行。 ( 2 ) 银染显色反 应 电泳结束后，将两块玻璃小心分开， 把附 着于长玻璃上的 凝胶放入 1 0 %的 乙酸中固定，直至7q酚蓝颜色褪尽然后用双蒸水洗涤三次，每次两分钟，空 千 水后，转至 染色液 ( 2 g硝酸银，3 m 3 7 %甲 醛溶于2 l双蒸水中) 中染 色 3 0 分 钟， 在用双蒸水洗涤5 - 6 秒， 转 a . 1 1 影液( 6 0 g 碳酸钠、 3 m 1 3 7 %甲 醛， 4 0 0 e t 1 1 0 % 材 7 4和 方 居_ _ 硫代硫酸钠 溶于2 l双 蒸水中) 显色，至电泳条带清晰， 加入 等体 积 1 0 %乙 酸停 影。将凝胶用双蒸水洗涤后，自 然千燥。 上述过程毋需在暗室进行，除显影外均在室温 下 操作显影液需冷却至 1 0 一1 2 以降低染色后的背景 差异片段的回收、再扩增与克隆 ( 1 )差异片段的回收与再扩增 将差异片段用刀片从 银染 胶上准 确地切下 ，转至 0 . 5 m 1 离心 管中，加入 3 0 。 i 无菌水， 1 0 0 0c 煮 沸 1 5 分钟， 1 2 0 0 0 r p m 离心 1 0 分钟， 吸取上清。 取 5 u 1 回 收产物用于 p c r扩增，扩增条件和选择性扩增札f l 。 1 5 % a 琼脂糖凝胶电泳检测 p c r结果 ( 2 ) p c r产物平末端克隆 ( 2 . 1 )连接反应 取2 0 泌 扩增 产物，加1 u d n a聚 合酶i k l e n o w大片 段， 3 7 0 c 保温3 0 m i n . 从中 取出2 p l 直 接 用 于 连 接。 连 接 反 应体 系 为2 0 tl , 内 含p u c 1 9 /s m a i 酶 切 载体2 0 0 n g , t , d n a 连接酶4 u 华美) 。1 6 连接过夜。 ( 2 . 2 ) 感受态的制备 取一环冻冷保藏的 大肠杆菌d h 5 。 菌液，接种于5 m l l b培养 基中。 3 7 0 c 振荡过夜。 取出0 . 5 m l 培养 物接 种于5 0 m l l b培养液中，3 7 0 c剧 烈振荡2 h . 然后， 冰浴1 0 m i n , 5 0 0 0 r p m离心 0 m i n 收 集菌体。 侄 ( 出 培养液， 到 置 1 m i n 后， 加 入1 / 3 体 积 的 冰 冷 的0 . 1 m c a c 二 it 悬 沉 淀。 冰浴3 0 m in ,5 0 0 0 rp m离 心5 m in 收集菌体。 倒出上 清液，再加入2 m l 预冰冷的0 . 1 m c a c l . 屯 悬沉淀。悬液分 装 于e p p e n d o f 管中，每 管分装2 0 0 p l . 4 0 c 保有，在保存 1 2 - 2 4 h 内 转化效率 最 no ( 2 . 3 )连接产物的转化 取一管 制备好的2 0 0 u l 感受态细胞，加入5 u l连接产 物充 分混匀。 冰浴3 0 材澎和方忍 m i n . 4 2 c热冲击9 0 s e c 。再 冰浴2 m i n 。在超净台上 加入0 . 4 m l l b液体 培养 基。 3 7 0 c 轻轻振荡4 5 m i n 使 细菌复 苏。 以2 0 0 p l菌 液/ 每 皿涂布于 含有x - 咧 ( 5 0 p g / m l ) , i p t g ( 8 0 l r g / m l ) , a m p ( 5 0 t g / m l )的l b固 体培养基上。 静置3 0 m i n ， 使 培养基充分吸收菌液。3 7 0 c倒置培养过夜 。 ( 2 . 4 )重组克隆的筛选和鉴定 用 p c r方 法筛选重组子。 随机挑 取白色重组菌 落于 少量 l b液体培养 基过 夜 培养 或画线于l b固体 培养基) 过夜培养。 取少量菌液 ( 或刮取少量菌体 加 2 5 匹 水) 煮沸5 m i n . 8 0 0 0 r p m离 心3 m i n a取2 u l 上清液作为模板， 2 0匹 体系 进行p c r 扩增。 9 4 下变性1 m i n , 5 6 下退火1 m i n . 7 2下 延伸1 m i n , 进行3 0 个循环。最后 7 2下延伸 5 m i n 。电泳检测插入片段的大小。 其 中 所 用上 、 下 游 引 物为p u c 1 9 多 克 隆 位 点 两 侧的 序 列 : 引物 i 为 5 a c a g g a a a c a g c t a t g a c c a 3 引 物1 1 为5 c g t t g t a a a a c g a c g g c c a g 3 ( k a o , f . - t . e t a l . , 1 9 9 1 ) 0 6 . s o u t h e rn 杂交分析 利用 d n a在中 性条件下的虹 吸法进行 s o u t h e r n印迹 转膜， 分子克 隆实 验 指南， 金冬雁等，1 9 9 5 ; 现在分子 生物学实验技术， 卢圣栋等，1 9 9 3 ) 5 0 u g 基因 组d n a加入1 0 闰1 0 、 限制内切酶b u ff e r , 4 0 u限制内切酶，补 水至 1 0 0 闪 ，3 7 0c 消化 3 h ，必要时消 化过夜。电泳检测结果后， 凝胶切f 一 角用于定 位， 放于变性液 ( 1 , 5 m n a c l , 0 . 5 m n a o h )的表面皿中， 室温变性l h 。 用h , 0 漂 洗 后 中 和 液 ( 1 m t r is - h c i(p h 8 .0 ) , 1 .5 m n a c l) 摇3 0 分 钟， 换新 鲜配 制 的 中 和 液 浸 泡 1 5 m in 。 做 好盐 桥， 注 意 : 排 净 气 泡。 剪 一 块 尼 龙 膜 ， 漂 浮 在 去 离 子 水 中 ， 完 全浸湿。 然后置于转移液中 ， 至少浸泡 5 m i n 。将中 和好的凝胶倒置于盐 桥平台 l ， 排净气泡。在凝胶四周用 p a r a f i l m封好， 防止 转移时 短路。 把尼龙 膜剪去 一 小角 相 应平 铺在凝胶上，赶 净胶 、 膜之间的气泡。 将两 张预先用 2 x s s c湿润 过 的 滤 纸 ( 大 小 与 膜 相 伺 ) ， 盖 在 尼龙 膜 上 ， 排 净 气泡 ， 再 在 上面 放 一叠 普 通 吸 水 纸 ( 5 -8 c m厚) ， 顶部放一 玻璃板，压 上重物( 如 5 0 0 g 4 1 -码) 。 静置转移 8 2 4 小 时， 其间换纸 1 2 次。 将凝胶和尼 龙膜置于一张干燥的滤纸上 ， 用软铅笔标明加 样 材群掀方法 孔位置。 尼龙膜泡在 6 x s s c中去 除凝胶碎块。取出尼 龙膜， 并将其匕 的 溶液滴 尽后， 平放在滤 纸上， 于室温下 晾 干3 0 m i n以上。将尼龙 膜携带d n a的一面 暴露 于 一紫外光源( 2 5 4 n m ) 之下 ， 照射几分 钟， 将d n a固定在 膜上。 然后， 将p c r扩 增出的克隆抽 入序列以随机引物法标记探针进行基因组 s o u t h e r n杂交分析。取 5 m l 预热的预 杂交液( 含 5 x s s c , 。 i %肉 桂酸钠， 0 . 0 2 % s d s , 1 % 封阻剂 、 5 0 去离子甲 酞胺) ， 放入 杂交 膜， 4 2 0c 预 杂交 2 h以上 ， 另 取5 m 1 4 2 预热的杂交 液， 按5 - 1 0 n 留 m l 力 a 入探针标记液， 放 入杂交膜， 3 7 0c 杂交1 6 h , 2 x s s c 溶液( 含。 . 1 % s d s ) 室温洗膜 l 0 m i n , 两次， 0 5 x s s c溶液( 含0 . 1 % s d s ) , 5 0 0 c 洗膜2 0 m i n o 按照 b o e h i n g e r m a n n h e i m地高 辛随 机引物标记试剂盒说明书进行杂交信号检 测 杂交信号的 检测则参见 一 d ire c tio n o f d ig d n a l a b e lin g a n d d e t e c t io n k it ( b o e h r i n g e r ma n n h e i n ) d n a测序和序列同源性分析 d n a序列 测定由t a k a r a b io t e c h公司完成。 通过g e n b a n k b l a s t 2 .0 进行 序列同源性比较分析。 玉米杂交品种唐杭 5 号特异性引物p c r扩增 将1 2 5 n g 总 体d n a用 限 制 性 内 切 酶e c o r i 和m s e l 进 行 双 酶切 ， 总 体 系 为 1 0 匹。 3 7 0 c 酶切3 小时后， 加入a f l p 接头和t 4 连接酶， 3 7 连接过夜。 取5 匹 连接产物，以p 1 , p 2 为引 物进行p c r 扩增。扩增体 系包括: l o x p c r反应缓冲液2 . o l t l d n t p( i o m m) 0 .4 1a l p 1 , p 2 ( 1 o p m o l 单 l ) 各0 . 5 4 l t a q 酶l u 补无菌水至总系为2 0 1 k l p c r扩增条件与 a f l p 选择性扩增条件相同。 所用引物序列为:p i : 5 - c c t g a g 丁 a a c a g a t 丁 t c c a a - 3 p 2 : 5 - ci g t t a ggt ggc t g aa t t gg- 3 9 .梨属 植物a f l p 结果聚 类分 析 材 ! 4和 方 层_ _ _ 一 将 a f l p电泳谱带进行统计，有带处赋值为 1 ，无带则赋值为 0 。把统计 结果输入计 算机， 用 n t s y s软 件进行数据处理。 计算出 1 0 种梨的 相似系 数。 然后，用不加权成对群算术平均法 ( u p g ma)进行聚类分析。 表一 a f l p 接头、预扩增引物及选择性扩增引物序列表 e c 4 rl接 头 5 - c tc gt agac tg cg 几 0. c c- 3 3 - ca t ct gac gca t ggtt aa- 5 ms e l接头 5 - gacga tgagt cc t gag- 3 3 - t ac tc aggac tca t - 5 预扩增引物 预扩增引物 引物 el 弓 物 e 2 引物e 3 引物 e 4 引物 es 引物 e6 引物 e7 引物e i o 引物 e s 引物 e 9 弓 物 mi 引物 m2 引物 m3 弓 ! 物m4 引物 ms 引物m6 引物 m7 引物 ms e 0 0 5 - gactgc gt ac caa ttc - 3 m 0 05 - ga tgagt cc t gag 几 4 a- 3 5 - gact gcgt ac ca at t cacg- 3 5 - gact gcgt ac ca at t cagc- 3 5 - gact gcgt ac ca at tcagg- 3 5 - gact gcgt a cca at c cac c- 3 - gact gcgt ac caa t t caac- 3 5 - gact g c gt ac caa t tc act- 3 5 - gact gc gt ac caa t tc aca- 3 5 - gact gcgt ac caa t t cag- 3 5 - g a ctgcg t acc aa tt c a ac - 3 - g ac tgcgt acc aa tt c aag- 3 5 - ga tgagtc c tgagt aacag- 3 5 - ga tgagt cc tgag t aact c- 3 - ga tgagt cc tgag t aact g- 3 5 - - ga tgagt cc tga gt aacac- 3 5 - ga tgagtc ct gagt aaca t- 3 5 - ga tgagtc c tgag t aact a- 3 5 - ga tgagt c ct gagt a ac aa- 3 5 - - ga tgagt c ct gagt a ac t t- 3 i t ie 第四部分讨论 一、a f l p - 银染 法的 优点 及影响因素 对聚丙烯酞胺凝胶中的d n a进行银染的方法始于 8 0年代。最初采用的是与 蛋白质银染相似的银氨溶液法。由于银氨溶液稳定性差，银实际的消耗比较大。 现在已很少使用。目前常用的方法是从光化学方法发展出来的选择还原法。其 原理是特定试剂将与核酸碱基结合的银离子还原生成不溶的银，从而显示 d n a 条带的 位置。与 银氨溶液相比，选择还原法所用的药品都是稳定试剂，灵敏度 高，并能 适用于 小片段 d n a的检测。目 前经常采用的 银染方法有 b a s s a m法和 s a n g u i n e tt i 法。 其中b a s s a m i 法的灵 敏度要稍高 一些， 可达l p g / m m 3 , s a n g u i n e tt i 的染色方法灵 敏度在3 p g / m m ， 水平， 但优点是所用时间要少， 可在 1 5 分 钟内 完 成银染程序。目 前银染法已在 d n a测序、s s c p ( s i 叼e s t r a n d c o m f o r m a t i o n p o ly m o rp h is m ) , d d - p c r , r a p d等 分 析 技术中 得到了 广 泛 的 应用 ( 石 锐等 ， 1 9 9 8 ) . 表6 常用的两种银染方法比较 步骤 b a s s a m法 s