（生物化学与分子生物学专业论文）壳寡糖与巨噬细胞结合特性的研究(1).pdf

新江大学硕士学位论文 壳寡糖与巨噬细胞结合特性的研究 浙江大学湖滨校区生物化学与分子生物学专业 0 i 级硕士生冯洁 导师赵鲁杭 摘要 背景和目的几t 。质是由n 一乙酰葡萄糖胺组成的多糖，它是世界上除纤维素之 外含量最丰富的天然多聚物。壳聚糖是几丁质不完全脱乙酰的产物。几丁质和壳 寡糖具有多种生物效应，包括抑瘤、抗菌和免疫增强等。但是它们的高粘度和在 水溶液中的不溶性极大的限制了在体内的应用。于是低分子量、水溶性好、无毒 日生物适应性好的壳寡糖逐渐得到了重视。 巨噬细胞( m a c r o p h a g e ) 既是免疫细胞，又是辅佐免疫应答细胞，可通过吞 噬、抗原呈递、分泌细胞因子、激活淋巴细胞和产生活性氧、n o 等作用而行使 抗感染、抗肿瘤、免疫应答和免疫调节作用，是机体免疫系统的重要组成部分。 整体动物实验表明壳寡糖能激活巨噬细胞，增强巨噬细胞的杀伤活性，诱导如白 介索一1 ( 儿一1 ) 、肿瘤坏死因子a ( t n f o ) 、粒单核集落刺激因子( g m c s ? ) 、 白介索一6 ( i i 一6 ) 等细胞因子的分泌，增加t 细胞和n k 细胞的活性。但壳寡糖 在巨噬细胞表面的受体及壳寡糖对巨噬细胞免疫功能的调节机理报道甚少。 本实验通过体外研究荧光标记壳寡糖与小鼠巨噬细胞的结合情况r 揭示巨噬 细胞壳寡糖结合组分的糖结合特异性，为进一步阐明壳寡糖对巨噬细胞的免疫调 节机理和分离臣噬细胞壳寡糖结合组分提供一定的实验依据，为壳寡糖抗肿瘤药 物和功能食品的开发提供理论依据。 材料和方法i _ 1 m w 2 6 4 7 臣噬细胞的培养：1 诅w 2 6 4 7 巨噬细胞于r p m l1 6 4 0 培养 液( 劫l l ：1 0 灭活的小牛血清，2 m m 0 1 ll - 谷氨酰胺，t o o u m l 青霉素和l o o u m l 链霉索) 中培养。2 2 一氨基吖啶酮标记壳寡糖：取5 u l2 0m m o l 1 壳寡糖j ：0 5 m le p p e n d o r f 管，离心冷冻干燥，加1 0 u ll o o r r f i o l l2 - 氨基吖啶酮，1 0u l 【0 m o l 乙硼氢氰化钠，混匀，离心，置于4 5 水浴反应5 小时，取出，离心冷冻 干燥。3 在激光扫描共聚焦显微镜下观察2 一氨基吖啶酮标记壳寡糖与两噬细胞 的结合，用流式细胞仪分析荧光强度。 结果和讨论1 2 - 氨基吖啶酮标记的壳寡糖与巨噬细胞的结合情况；2 一氨基吖啶 浙江大学硕士学位论文 酮标记的壳寡糖先与巨噬细胞膜有结合，然后分布于整个细胞质，最后进入细胞 核，随时间的进展而呈现了一个内在化过程。2 2 - 氨基吖啶酮标记的壳寡糖与巨 噬细胞的结合是一个依赖时间、温度和浓度的过程，s c a t c h a r d 分析后发现它对 阻噬细胞的作用是通过膜上特异性的受体( k d 为2 1x1 0 。5 m ) 进行的。3 不同的 壳寡糖组成结构单位对巨噬细胞摄取壳寡糖产生不同的影响，说明壳寡糖的结构 是受体识别的关键。4 竞争试验表明甘露糖能抑制壳寡糖的摄取，脂多糖、9 一 碗聚糖则不能，提示巨噬细胞壳寡糖结合组分可能为甘露糖受体。5 甘露糖一b s a 、 岩藻糖一b s a 、n - 乙酰葡萄糖胺- b s a 都能抑制壳寡糖的摄取。 结论1 壳寡糖可与巨噬细胞膜结合，并随时间的延长逐步进入巨噬细胞内。2 壳寡糖在巨噬细胞膜表面有特异性结合的受体( k d 为2 1 x 1 0 。5 m ) ，可能为甘露 糖受体。 t h er e s e a r c ho nc o m b i n a t i o nc h a r a c t e r so f o l i g o c h i t o s a n t om a c r o p h a g e h u b i nc a m p u s b i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y p o s t g r a d u a t e o lj i ef e n g s u p e r v i s o rl u h a n g z h a o a b s t r a c t ib a c k g r o u n d a n d o b j e c t i v e c h i t i ni s h o m o p o l y m e r o fb e t a 。1 ，4 一l i n k e d n a c e t y l g l u c o s a m i n e c h i t o s a ni st h ep r o d u c to fp a r t i a ld e a c e t y l a t i o no f c h i t i n t h e y a r et h es e c o n dm o s ta b u n d a n t p o l y s a c c h a r i d e s i n n a t u r e ，c o m p r i s i n g t h e h o r n y s u b s t a n c ei nt h ee x o s k e l e t o n so fc r a b s ，s h r i m p ，a n di n s e c t sa sw e l la sf u n g i c h i t i n a n dc h i t o s a nh a v eb e e np r o v e dt ob en o n t o x i c ，b i o d e g r a d a b l e ，a n db i o c o m p a t i b l ea n d a r ek n o w nt o h a v ev a r i o u s b i o l o g i c a l a c t i v i t i e s i n c l u d i n g a n t i t u m o r a c t i v i t y , a n t i m i c r o b i a la c t i v i t y , a n t i f u n g a la c t i v i t y , i m m u n o e n h a n c i n ge f f e c t s h o w e v e r , t h e i r h i g hv i s c o s i t ya n di n s o l u b i l i t yi nn e u t r a la q u e o u s s o l u t i o n sr e s t r i c tt h e i ru s e si nv i v o r e c e n ts t u d i e so nc h i t o s a nh a v ea t t r a c t e di n t e r e s tf o ro l i g o c h i t o s a nw h i c h i sn o to n l y w a t e 卜s o l u b l e ，n o n t o x i c ，b i o c o m p a t i b l e b u ta l s o p o s s e s s v e r s a t i l e f u n c t i o n a l p r o p e r t i e s ， 一 一 堕望查堂堡主堂丝堕兰 m a c r o p b a g e i sak i n do f i m m u n ec e l la sw e l la sa c c e s s o r y c e l li tc a r lf u n c t i o na s a n t i i n f e c t i o n ，a n t i c a n c e r , i m m u n er e s p o n s ea n di m m u n o r e g u l a t i o nb yp h a g o c y t o s i s ， a n t i g e np r e s e n t a t i o n ，c y t o k i n e ss e c r e t i o n ，l y m p h o c y t ea c t i v a t i o n ，r e a c t i v eo x y g e na n d n o p r o d u c t i o n i t sa ni m p o r t a n tp a r to f b o d yi m m u n e s y s t e m o l i g o c h i t o s a nh a sb e e n o b s e r v e dt ou p r e g u l a t et h e p r o d u c t i o no f i n t e r l e u k i n i ( i l d ，t u m o rn e c r o s i sf a c t o r - o ( t n f a ) ，g r a n u l o c y t em a c r o p h a g ec o l o n ys t i m y l a t i n gf a c t o r ( g m c s f ) ，i n t e d e u k i n 一6 ( i l 一6 ) b ym a c r o p h a g ea n di n d u c ei m m u n o l o g i ca d j u v a n te f f e c t sm a n ya s p e c t so f o l i g o c h i t o s a n sf u n c t i o n sh a v eb e e nd i s c o v e r e db yr e s e a r c h e r s ，b u tt h em e c h a n i s mi s s t i l iu n c l e a r o u r e x p e r i m e n to b s e r v e dt h eb i n d i n go f f l u o r e s c e n c el a b e l e do l i g o c h i t o s a nw i t h r a w 2 6 4 7 m a c r o p h a g ea n de x p l o r e dt h es p e c i f i cb i n d i n ga c t i v i t yo fo l i g o c h i t o s a n w i t ht h ec o m p o n e n to fm a c r o p h a g et h i sw o r kp r o v i d e saf o u n d a t i o nf o rf u r t h e r r e s e a r c ho ns e p a r a t i o no fc o m b i n d i n go l i g o c h i t o s a nc o m p o n e n to fm a c r o p h a g ea n d e l u c i d a t i o no nt h ei m m u n o r e g u l a t i o nm e c h a n i s mo fo l i g o c h i t o s a nw i t hm a c r o p h a g e ， f r o mt h i sw o r kw ee n d e a v o rt of i n dt h et h e o r e t i c a l g r o u n d f o r d e v e l o p m e n t o f a n t i t u m o rd r u g sa n df u n c t i o n a lf o o df r o mo l i g o c h i t o s a n l m e t h o d s l 1 c e l lc u l t u r e ：r a w 2 6 47 ，am u r i n em a c r o p h a g e l i k ec e l ll i n e ，w e r e c u l t u r e di nr p m l l 6 4 0m e d i u mw i t h1 0 h e a t i n a c t i v a t e df e t a lb o v i n es e r u m 2 r a m l - g l u t a m i n e ，1 0 0 u m l p e n i c i l l i n a n d10 0 “g m l s t r e p t o m y c i n e a t37 。ci na h u m i d i f i e da t m o s p h e r ec o n t a i n i n g5 c 0 2 2 l a b e lo l i g o c h i t o s a nw i t h2 - a m a c ：5 uio fa n a q u e o u s 2 0 r a ms o l u t i o no f o l i g o c h i t o s a n w a s l y o p h i l i z e d i na m i c r o c e n t r i f u g e t u b ea1 0u1 s a m p l e o fl o o m ms o l u t i o no f 2 - a m i n o a c r i d o n e ( m o l e c u l a rp r o b e s ) i ng l a c i a la c e t i ca c i d d m s o ( 3 1 7 ，v v ) a n d1 0 ul o fi ms o l u t i o no f n a c n b h 3 ( s i g m a ) i n t e t r a h y d r o f u r a nw e r ea d d e dt h e m i x t u r ew a s i n c u b a t e da t4 5 0 cf o r5h o u r st h e n l y o p h i l i z e d ，a t l a s td i s s o l v e di n 4 0 0u1 d m s o d e i o n i z e dw a t e r ( 1 l ，v v ) c o n t r o la s s a y , i nw h i c hn oo l i g o c h i t o s a nw a su s e d ， w a sc a r r i e do u ts i m u l t a n e o u s l y 3o b s e r v et h eb i n d i n go fo l i g o c h i t o s a nl a b e l e dw i t h 2 - a m a cw i t h m a c r o p h a g e su n d e r c o n f o c a ll a s e r m i c r o s c o p e a n d a n a l y s i s t h e f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yb yf l o wc y t o m e t e ru s i n gt h ec e l lq u e s ts o f t w a r e i r e s u l ta n dd i s c u s s i o n l 1 c o m b i n a t i o nb e t w e e n2 - a m a cl a b e l e do l i g o c h i t o s a n 1 塑里查堂堡圭兰堡丝奎 a n d m a c r o p h a g e ：2 - a m a c o l i g o c h i t o s a n f i r s tb o u n d t h e c y t o m e m b r a n e o f m a c r o p h a g e ，a n dt h e nd i f f u s e di nt h ew h o l ec y t o p l a s m ，a tl a s te n t e r e dt h en u c l e o l u s a n dd i f f u s e di nt h ew h o l ec e l lf l u o r e s c e n c e i n t e n s i t yi n c r e a s e dw i t ht i m et h e i n t e r n a l i z a t i o no fo l i g o c h i t o s a ni n m a c r o p h a g ei s at i m e - c o u r s e p r o c e s s 2i n i t i a l e x p e r i m e n t s t e s t e d t i m e ，t e m p e r a t u r e ，a n d c o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n c e o f 2 - a m a c o l i g o c h i t o s a nu p t a k ei nm a c r o p h a g e s s c a t c h a r da n a l y s i so fi n t e r n a l i z a t i o n o f2 - a m i n o a c r i d o n e o l i g o c h i t o s a ni n m a c r o p h a g e s i n d i c a t e di t si n t e r n a l i z a t i o n i s m e d i a t e db ya s p e c i f i cr e c e p t o ro nm a c r o p h a g em e m b r a n ew i t hk do f21x1o m 3d i f f e r e n to l i g o c h i t o s a nf r a g m e n t ss h o w e dd i f f e r e n te f f e c to no l i g o c h i t o s a nu p t a k e , s u g g e s t i n gr e c o p t o rr e c o g n i t i o nd e p e n d e n t o nt h es t r u c t u r eo f o l i g o c h i t o s a n 4c o m p e t i t i o ns t u d i e ss h o w e dt h a tm a n n o s ei n h i b i t e do l i g o c h i t o s a ni n t e r n a l i z a t i o n w h i l el p sa n d p g l u c a nc o u l dn o t 5i n h i b i t i o no fm a n n o s e - b s a f u c o s e b s aa n d n - a c e t y l g i u c o s a m i n e b s ao no l i g o c h i t o s a ni n t e r n a l i z a t i o nf u r t h e rd e m o n s t r a t e dt h a t m a n n o s e r e c e p t o rm a y b et h er e c e p t o ro f o l i g o c h i t o s a no nm a c r o p h a g em e m b r a n e i c o n c l u s i o n s l 1 t h e r ei sc o m b i n a t i o nb e t w e e no l i g o c h i t o s a na n dm a c r o p h a g e ，a n d o l i g o c h i t o s a nc a ne n t e rm a c r o p h a g ea sc o i n c u b a t i o n t i m e c o u r s ei n c r e a s e s 2t h e r e i sa s p e c i f i cr e c e p t o r o f o l i g o c h i t o s a n o n m a c r o p h a g e m e m b r a n e ( k d = 2 1 1 0 。5 m ) ，m a yb em a n n o s er e c e p t o r f 4 浙江大学硕士学位论文 壳寡糖与巨噬细胞结合特性的研究 浙江大学湖滨校区生物化学与分子生物学专业 0 1 级研究生冯洁 导师赵鲁杭 一】一 洳舌 几r 质又称甲壳素，在昆虫、甲壳类动物外骨骼、真菌细胞壁及某些绿藻- 1 t 广泛存在，是自然界中最丰富的生物资源之一。它是由n 一乙酰氨基葡萄糖经d i ，4 一糖苻键连接形成的聚合物，其不完全脱乙酰化产物是壳聚糖( c h i t o s a n ) 。 近卜几年来对其生理功能进行了较广泛的研究，包括免疫调节功能、抗感染作用 n ，2 、抗肿瘤作用 3 ，4 、双歧杆菌促生长因子活性、植物调节剂功能和降血脂 作用等。但是几丁质、壳聚糖不溶_ j ：水故对其开发利用受到一定的限制。为_ _ r 克服这一、缺陷，众多学者通过辐射法、化学法或酶降锯法等各种措旌将多糖降解 成相应的寡糖一一几丁寡糖( c h i t o o l i g o s a c c h a r i d e ) 和壳寡糖 ( o l i g o c h i t o s a n ) 。这些寡糖水溶性好，易于被机体吸收分散，可以很好地被利 用，同时仍具有多种生理功能，对其研究受到广泛的重视。其中。对于免疫调节 功能的研究是个重点。 几丁寡糖( o l i g o c h i t i n ) 和壳寡糖可以提高机体免疫力。n o 作为信息分子， 在免疫系统中起介导细胞毒性、调节细胞免疫功能的作用，壳寡糖可以通过对它 的影响而调节机体免疫功能。g o r b a c h 5 】等合成了一种壳寡糖的衍生物，实验 表明能增强免疫活性细胞产生白介索- i ( i l 1 ) 和肿瘤坏死园子( t n f ) 。壳寡糖 对免疫系统的调节功能是十分复杂的，其作用具体的作用途径和机制有待进一步 的研究。从目前的研究结果看，由于免疫功能细胞表面存在糖链残基受体，壳寡 糖川能通过这螳受体与免疫功能细胞结合并激活后者。s u z u k i 6 等认为多型核白 细胞表面有n 乙酰一d 葡萄糖胺残基受体存在几丁寡糖与这些受体结合后可激 活细胞。深入研究发现，儿丁寡糖可以激活花生四烯酸代谢系统，从而增强对中 性粒细胞的趋化作用。所产生的前列腺素p g e 2 还能增强中性粒细胞对几r 寡糖 的识别。免疫功能细胞活化后，释放各种免疫效应分子，在整个免疫网络体系中 互相影响、调节使免疫应答加强。免疫系统中的活性细胞、介质发挥生理功能， 可以提高机体抗感染、抗肿瘤等能力。特别是对巨噬细胞，刘艳如【7 】等发现壳 浙江丈学硕士学位论文 寡糖能明显提高正常小鼠巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数，对绵羊红细胞诱导 的瓜凝索抗体和溶血素的生成有显著影响，衷明壳寡糖对正常机体的非特异性免 疫及体液免疫均有增强作用。几丁寡糖和壳寡糖的免疫增强作用在抗肿瘤、抗感 染等方面显示r 重要意义。 几 寡糖和壳寡糖有抗肿瘤生长和转移效应。几丁寡糖和壳寡糖能通过各种 途径提高机体抗肿瘤能力。儿丁寡糖和壳寡糖是双歧杆菌促生长因子b f 的种 曛要种类，不仅促进双歧杆菌生长，改善肠道微环境，还能分解致癌物质 8 】。 s u z u k i 3 等用儿丁六糖和壳六糖静脉注射负瘤小鼠时，发现几r 六糖和壳六糖对 s 1 8 0 瘤细胞、m m 4 6 实体瘤细胞、m e t h a 瘤细胞的生长有明显抑制作用，而儿 丁人糖和壳六糖并无直接杀伤瘤细胞作用。进一步阐明作用机理，认为壳寡糖与 巨噬细胞l j 的糖基受体结合后，激活巨噬细胞释放l l 一1 ，这又加速了t 细胞成 熟而释放i l 2 ，同时引起t 淋巴细胞表面i l 一2 受体的表达，i l 2 与i l - 2 受体结 合后，进。步加速t 细胞分化成熟为细胞毒性t 细胞，从而产生抗肿瘤作用。 壳寡糖体外对肝癌细胞生长有明显抑制作用，抑制率平均达7 6 ，对高淋巴道转 移癌细胞株h c a f 具较强的体外杀灭能力。王芳宇等【9 】用2 0 0 m g k g 壳寡糖腹腔 注射荷s 1 8 0 昆明小鼠，发现壳寡糖可使荷瘤小鼠n o 、t n f 、i f n y - 显著增高。 壳寡糖和i f n y 联合应用对小鼠腹腔巨噬细胞产生n o 和巨噬细胞介导的杀肿 瘤细胞作用具有协同效应，据分析该协同作用是通过壳寡糖促使巨噬细胞分泌 t n f a 增加而产生。n o 、t n f q 和 f n 各自的功能和相互作用对激活机体免疫 系统，抑制肿瘤细胞生跃都起到了重要作用。另外壳寡糖对人肝癌细胞、子宫内 膜癌细胞、红白血病细胞、淋巴瘤细胞、小鼠肝癌腹水细胞也有明确的抑制作用， 抑瘤率高达7 9 。除了抑制肿瘤细胞生长，几丁六糖还可抑制植入c 5 7 b l 6d 、 鼠的l e w i s 肿瘤细胞的肺转移( 4 0 5 0 ) 【1 0 。目前普遍认为壳寡糖是通过激活 免疫系统发挥抑癌作用，但也有实验发现壳寡糖体外可赢接抑制肿瘤细胞的繁 殖，壳寡糖究竟如何进入肿瘤细胞及抑制瘤细胞的生长的过程机制有待进一步研 究。 此外，几丁寡糖和壳寡糖还具有抗细菌、抗病毒、抗真菌及其他病原体的作 用，及增强植物的抗病性、调节植物基因的关闭和开放、促进植物细胞的活化、 刺激植物生长的作用。 6 浙江大学硕士学位论文 壳寡糖具有多种功能己被人们所普遍认同，其作用机理也有所报道，但确切 的免疫调节机制却仍待进一步的探讨。 臣噬细胞在无论是先天性还是获得性免疫反应中都起着重要作用。巨噬细胞 广泛的分布于机体的每一个器官，它们在肠道、肺、肾和皮肤的上皮细胞f 面形 成叫格状的结构，以阻止火的抗原性物质进入。壳寡糖能刺激巨噬细胞释放生物 活，陆因，这些生物活性因子进一+ 步作用于淋巴细胞、成纤维细胞等，其结果加 强r 机体免疫力。奉实验观察荧光标记壳寡糖在体外与小鼠巨噬细胞的结合情 况，r 解臣噬细胞壳寡糖结合组分的糖结合特异性。 浙江大学硕士学位论文 材料和方法 、材科 ( ) 实验材料 1 r p m i 1 6 4 0 培养基：i n v i t r o g e n 公司出品 2 新生小牛血清；杭州四季青生物材料研究所出品 3 壳寡糖：实验室制各 4 2 - 氨基吖啶酮( 2 - a m a c ) 、硼氰氢化钠( n a b h 3 c n ) ：中科院一 ：海生化 细胞研究所王克夷研究员馈赠 5 n 己酰葡萄糖胺、葡萄糖胺、甘露糖：购于上海化学试剂采购供应站 6 1 3 - 葡聚糖、脂多糖：均购于s i g m a 公司 7 连接甘露糖的牛血清白蛋白、连接岩藻糖的牛血清白蛋白及连接n 乙酰葡 萄糖胺的牛血清白蛋白由中科院上海生化所王克夷教授馈赠 8 h e p e s ；吉泰科技有限公司出品 9 t r i s ：l 海生工生物工程有限公司出品 1 0 其余试剂均为国产分析纯 ( 二) 主要仪器 1 y j 一8 7 5 医用净化r 作台：浙医大净化厂出品 2 w j 1 2 f c 0 2 孵箱：日本h i r s a w a 公司出品 3 相差倒置显微镜3 7 x a ：上海手术器械厂出品 4 流式细胞仪：b di 。s r 5 激光扫描共聚焦显微镜：l e i c a 公司，u s a 出品 6 f r d r y e r 8 冷冻真空干燥箱：c e b l o n c o 公司出品 7 ，l n g t 8 3 台式快速离心浓缩干燥机；江苏太仓医疗器械厂出品 8 8 0 0 型离心沉淀器：绍兴医疗器械厂出品 9 w s 2 1 3 3 6 5 电热恒温水浴锅：上海医疗器械三厂出品 1 0 f i q 2 型旋涡混合器：江苏泰县医疗器械厂出品 ( 一：) 试剂溶液和缓冲液 l 有血清r p m i 一1 6 4 0 培养液 1 2 l r p m i 1 6 4 0 粉 】o4 9 8 浙江大学硕士学位论文 1 0 灭活新生小牛血清 谷氨酰胺 青霉素 链霉索 h e p e s 粉 碳酸钠 2p b s 缓冲液 n a c l k c i n a 2 h p 0 4h 2 0 k h 2 p 0 4 3 ，t r i s 缓冲液 t r i s h c l n a c l c a c l 2 ( 四) 细胞 2 0 0 m l 2 r e t o o l 几 1 0 0 u m i 1 0 0 u m 1 23 8 5 9 0 3 4 9 】l 80 0 g o2 0g 15 6 g ， o2 0 g 【p h 72 】 l l 00 5 m o i l 00 5m o i l 2 0m m o l l 【p h 7 2 】 巨噬细胞：r a w 2 6 47 巨噬细胞，从中科院上海生化细胞所购得 一方法 ( 一) r a w 2 6 47 巨噬细胞的培养： 在1 0 0 m l 细胞培养瓶中加入有血清的r p m i 1 6 4 0 培养液8 m 1 振荡。经台 吩蓝染色法染色后可见细胞活率达9 5 以上。用白细胞计数板计数，调整细胞浓 度至1x1 0 6 m l 。将2 0 0 u l 细胞悬液按实验需要接种到盖玻片或载玻片上，置于 3 7 。c 、5 c 0 2 孵箱中培养3 - 4 小时后细胞即可贴壁。弃去上清液，用无血清 r p m l 1 6 4 0 培养液冲洗3 次，洗去未贴壁细胞，然后每片载玻片或盖玻片中加 入2 0 0 u l 有血清r p m i 一1 6 4 0 培养液，即可供进一步实验之用。 ( ：二) 荧光试剂2 氨基丫啶酮( 2 一a m a c ) 标记壳寡糖； 参照p e t e rj o c k s o n 采用的2 。氨基吖啶酮标记糖方法。 荧光试剂2 氨基吖啶酮标记壳寡糖合成步骤如下：取5 u l2 0 m m o l l 壳寡糖 】二o5m le p p e n d o f f 管，离心冷冻干燥，加1 0 u l1 0 0m m o l l2 - 氨基吖啶酮( 用3 门7 9 浙江大学硕士学位论文 冰己酸一二甲亚砜溶解) ，1 0 u l10m o l l 硼氢氰化钠( n a b h 3 c n ，用四氢呋哺溶 解) 。混匀，离心，置于4 5 。c 水浴反应5 小时，取出，离心冷冻干燥溶于4 0 0 u l5 0 ：甲亚砜一水。另取1 0 u l1 0 0m m o l l 2 - 氨基吖啶酮( 用3 1 7 冰乙酸一j 甲 哑砜溶解) ，1 0 u l10 m o l 硼氧氰化钠( 用四氢呋喃溶解) ，混匀，离心，置于 4 5 水浴反应5 小时，取出，离心冷冻干燥，溶于4 0 0u l5 0 二甲亚砜水， 作为卜步实验的空白对照，以排除2 氨基吖啶酮与巨噬细胞结合所带来的实验丁 扰。 ( ：) 激光，e 聚焦娃微镜f 观察2 。氨基吖啶酬( p d v i a c ) 标记的壳寡糖与小鼠巨 噬细胞的结合情况： 将两组2 0 0 u l 巨噍细胞悬液置，二盖玻片或载玻片上，于3 7 、5 c 0 2 孵箱 t ，培养2 4 小时，用p b s 缓冲液冲洗3 遍后，每片盖玻片中加2 0 0 u lp b s 缓冲液。 组为2 。氨基吖啶酮标记的壳寡糖实验组，加上述方法制备的2 一氨基吖啶酮标 i d 的壳寡糖2 0u 卜 二盖玻片中，继续避光培养1 分钟、5 分钟或3 0 分钟；另一组 为空白对照组加上述处理过的2 氨基吖啶酮2 0u l 寸：盖玻片中，继续避光培养 1 分钟、5 分钟或3 0 分钟。两组细胞用p b s 缓冲液冲洗3 遍后，于激光扫描共 聚焦显微镜下( 激发波长4 5 0n m ，发射波长5 2 0n m ) 观察经2 分钟、5 分钟、 3 0 分钟处理后实验组2 ，氨基吖啶酮标记的壳寡糖和对照组2 一氨基吖啶酮与巨噬 细胞的结合情况。 ( 四) 流式细胞仪分析2 氨基吖啶酮( p d v i a c ) 标记壳寡糖与巨噬细胞结合显示 的荧光强度： 巨噬细胞在3 7 。c 下用2 m l0 0 2 5 的t r y p s i n 消化后，1 1 0 6 c e l l s m l 的细 胞悬液( 悬浮于冷的p b s 缓冲液) 与0 1 m g m l 的2 - a m a c 一壳寡糖孵育适当时问， 1 0 0 0 r p m 离心5 分钟将细胞与游离的2 - a m a c 一壳寡糖分开。标记上2 - a m a c 一壳寡 糖的细胞的荧光和游离的2 - a m a c 一壳寡糖的荧光用b dl s r 流式细胞仪的c e l l q u e s t 软件检测。特异性结合的荧光通过减去有1 0 0 倍过量来标记壳寡糖存在条 件下的荧光而得到。 ( - i i ) 分j 5 i j 用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪分析n 乙酰葡萄糖胺和葡萄糖胺 对2 一氨基吖啶酮( a m a c ) 标记壳寡糖与巨噬细胞结合的影响： 将巨噬细胞悬液分为三组：一组为空白对照组，单独与0 1 m g m l 的2 - a m a c 浙江大学硕士学位论文 壳寡糖孵育；一组为n - 乙酰葡萄糖胺组，与l m g m ln 一乙酰葡萄糖胺和0 1 m g m l 的2 a 姒c 一壳寡糖一起孵育；一组为颧萄糖胺组，与l m g m l 葡萄糖胺和0 1 m g m l 的2 - a m a c 一壳寡糖起孵育。将三组巨噬细胞贴壁于盖玻片或载玻片 ：，用t r i s 缓冲液冲洗3 遍后在激光扫描共聚焦显微镜( 激发波长4 8 8n m ，发射波艮5 2 0 n m ) 卜观察各组巨噬细胞形的荧光强弱差异。三组巨噬细胞悬液在1 0 0 0 r p m 下 离心5 分钟将细胞与游离的2 - a m a c 一壳寡糖分开。标记上2 - a m a c 一壳寡糖的细胞 的荧光和游离的2 - a m a c 一壳寡糖的荧光j 铂b dl s r 流式细胞仪的c e l 1q u e s t 软件 检测。 ( 六) 分别用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪分析甘露糖、脂多糖和1 3 葡聚糖 刈2 氨基吖啶酮( a m a c ) 标记壳寡糖与巨噬细胞结合的影响： 将巨噬细胞悬液分为四组：一组为空白对照组，单独与0 1 m g m 的2 - a m a c 一 壳寡糖孵育；组为脂多糖组，与1 0 m g m l 脂多糖和0 1 m g m l 的2 - a m a c 一壳寡 椭起孵育；饵【为b 葡聚糖组，与1 0 m g m lb 一葡聚糖和0 1 m g m 的2 - a m c 一 壳寡糖一起孵育；组为t 4 露糖组，与0 1 m g m l 甘露糖和0 1 m g m l 的2 - a m a c 一 壳寡糖一起孵育。将四组巨噬细胞贴壁于盖玻片或载玻片上，用t r i s 缓冲液( t r i s 缓冲液的配法：o0 5m o l lt r i s h c i ，o0 5m o l in a c l p h7 2 】t 2 0m m o l lc a c l 2 ) 冲洗液冲洗3 遍后在激光扫描共聚焦显微镜( 激发波长4 8 8n m ，发射波长5 2 0 n m 下观察各组巨噬细胞形的荧光强弱差异。四组巨噬细胞悬液在1 0 0 0 r p m f 离心5 分钟将细胞与游离的2 _ a m a c 一壳寡糖分开。标记上2 - a m a c 一壳寡糖的细胞 的荧光和游离的2 - a m a c - 壳寡糖的荧光用b dl s r 流式细胞仪的c e 1q u e s t 软件 检测。 ( 七) 分别用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪分析n 乙酰葡萄糖胺一b s a 、甘露 糖一8 s a 和岩藻糖b s a 对2 一氨基吖啶酮( a m a c ) 标记壳寡糖与巨噬细胞结合 的影响： 将巨噬细胞悬液分为四组：一组为空白对照组，单独与0 1 m g m l 的2 - a r a c 一 壳寡糖孵育：一组为n 乙酰葡萄糖胺b s a 组，与1 0 m g m ln 一乙酰葡萄糖胺- b s a 和0 1 m g m l 的2 - a i a c 一壳寡糖一起孵育；一组为甘露糖- b s a 组，与1 0 m g m l 甘嚣糖b s a 和0 1 m g m l 的2 - a m a c 一壳寡糖一起孵育；一组为岩藻糖b s a 组， 与1 0 m e d m i 岩藻糖b s a 和0 1 m g m l 的2 - a m a c 一壳寡糖一起孵育。将四组巨噬 浙江大学硕士学位论文 细胞贴壁。j 盖玻片或载玻片上，用t r i s 缓冲液冲洗3 遍后在激光扫描共聚焦显 微镜( 激发波跃4 8 8a m ，发射波长5 2 0n m ) 下观察各组巨噬细胞形的荧光强 弱差异。四组巨噬细胞悬液在1 0 0 0 r p m 下离心5 分钟将细胞与游离的2 - a m a c 一壳 寡糖分开。标记上2 - a m a c 一壳寡糖的细胞的荧光和游离的2 - a m a c 壳寡糖的荧光 川【 1 ) i ，s r 流式细胞仪的c e llq u e s t 软件检测。 沙j 、学坝i ：- ：佃【t 一一 实验结果 ) r a w 2 6 47 1 1 嗷细j 】f ! i n 勺i 乔：r a w 2 6 47 咏细选川r p m l 1 n 4 ( ) j 拜液 世 j 呲“v 牛【乏培乔，7 i 二k 状7 圮良好，j 眵态仆，帔jl 人小m2 0 5 0l 1 ，j 4 ，0 小f | ! j a | | j 也l _ 幺l | 】1 此f f f ( ( , j - f l lj j t j , j 霓，呈i o u 仆；、j l ! j | ；! r k 梭r ； l 孥ii1 1 i 伽j | l ! 微镜pf i 勺r a w 2 6 47 卜i i 壤a l l 肚 ( ) 2 - 氩脚r r 啶酮标屯的壳寡糖_ 巨噬细胞的结合情况： 1 为排除2 一氧缺m 睦酮对实验的干扰，将2 一氨基吖啶酮r 弘独与巨憷细胞作 用作为2 - 氮基j 】丫蜓酮丰，、记的壳寡糖! i 巨噬细胞作用的对照。在激光麸聚焦盥微镜 下规察2 氨錾吖啶酮标记的壳寡糖及2 - 氨基吖啶酮与巨噬细胞的结合情况。 2 氧麟吖啶酮标记的壳寡糖j 旺【噬鱼i j j 魁住川、e 小i 卜f 2 一氮基吖啶酮与乒 l 崾纲f 旭竹：1 17 卜小时 浙江大学瑚一l 学位论文 流式细胞仪分析得到巨噬细胞与2 一氨基吖啶酮标记的壳寡糖结合后显示的荧 光强度为4 0 6 5 6 4 8 ，而与2 一氨基吖啶酮结合显示的荧光强度为3 1 4 o 8 5 。 2 激光共聚焦显微镜下观察巨噬细胞对2 氨基吖啶酮标记的壳寡糖的摄取 图3 abc 巨噬细胞分别与2 氨基吖啶酮标记的壳寡糖孵育1 分钟( a ) 、5 分钟( b ) 、 2 0 分钟( c ) 后，在激光共聚焦显微镜下观察其形态和荧光。 3 巨噬细胞对2 一氨基吖啶酮标记的壳寡糖的摄取是一个时间依赖的过程 流式细胞仪分析显示巨噬细胞与2 氨基吖啶酮标记的壳寡糖结合后所显示的荧 光强度随着时间的延长逐渐增强，3 0 分钟后变化不大，说明2 - 氯基吖啶酮标记 的壳寡糖与巨噬细胞的结合在3 0 分钟达到饱和。 4 4i 一。i i 敞a i l i 地j2 tj ；l l i t i n m 轫、；已f i j ，t 寡书l f 一摄l 汉j 个“t t lj 蔓依4 m 彤j j ：i f l ，、 6 ( ) i 5 0 ；兰4 0 ：弓3 0 i 石2 0 ii o 2 三0 4 2 0 。c3 7 、| c l e m p e l a l i n e 2 氯枷吖啶州标记的壳寡精分别在4 0 、窀滞2 0 。c 、3 7 。c b 1 簸细胞作川3 0 分 钟侨，流式细胞仪分析显示巨噬细胞的荧光强度，发现3 7 。c 是最佳结合温度。 5 ，未标汜的壳寡柑对2 - 氨基吖啶酮标记的壳寡糖与巨噬细胞结合的j ；i ；响 巨嗽细j 尬与2 。氨基吖啶利标记的壳寡 觏g 孵汀、卜小i i , j 经未标记的壳寡糖作用的同嗽细胞与 2 一氨基吖i 定酮标记的壳寡糖孵育、卜小时 浙江大学硕：e 学位论文 流式细胞仪分析得到巨噬细胞与2 一氨基吖啶酮标记的壳寡糖结合后显示的荧 光强度为3 6 2 7 + _ 4 2 7 ，而经未标记壳寡糖作用后的巨噬细胞与2 氨基吖啶酮 标记的壳寡糖结合显示的荧光强度为9 3 9 4 - 2 7 1 ，说明壳寡糖能抑制自身与巨 噬细胞的结合。