（细胞生物学专业论文）间充质干细胞跨越分化肝细胞及其参与肝脏损伤修复的探索研究.pdf

浙江大学博士学位论文m c s e n c h y m a ls t e mc e l l s - - p o t e n t i a lf o rl i v e rr e p a i r 摘要 间充质干细胞( m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ，m s c s ) 来源于中胚层，能够分化为成骨、 软骨和脂肪，为原始造血干祖细胞在骨髓微环境中的生长和分化提供支持。近年来研究 发现m s c s 的分化潜能远超过最初的预期，甚至可以跨越分化为其他胚层来源的细胞， m s c s 也因此迅速成为干细胞领域的一个热点。本研究重点研究了小鼠骨髓m s c s 向肝细 胞的跨越分化能力，以及在体内情况下能否参与肝脏损伤修复。 研究的第一部分，我们首先建立了三套条件培养液诱导体系，成功将小鼠骨髓来源 m s c s 诱导分化为肝样细胞。诱导体系包括肝损伤条件培养液、肝细胞条件培养液和胎肝 条件培养液。诱导得到的细胞具备典型的肝细胞形态，表达肝系细胞特异性基因，具备肝 细胞的正常功能，如i c g 吞噬、自蛋白合成和糖原储存等。随后的研究发现h g f 、f g f 4 和o s m 是条件培养液诱导体系中发挥作用的关键因子，组合上述三种细胞因子即可将小 鼠骨髓m s c s 诱导成典型的肝样细胞，但诱导效率较低。此外，本研究发现使用丙戊酸钠 ( ) a ) 预处理m s c s ，可以显著提高m s c s 向肝细胞的分化效率。实验发现m s c s 在v p a 处理过程中伴随着细胞周期阻滞、组蛋白乙酰化程度增加、染色质结构疏松。表观遗传修 饰导致的f g f 受体和h g f 受体基因表达上调可能是肝细胞分化效率提高的关键因素。 研究的第二部分，我们从肝脏损伤小鼠中分离得到了外周血间充质干细胞，发现该细 胞与骨髓来源的m s c s 具备类似的细胞表面标记，可以向成骨、脂肪和软骨诱导分化，但 是增殖能力较弱，易衰老。本研究还通过活体动物分子成像等技术对骨髓腔移植的e g f p + m s c s 进行追踪，证明m s c s 在特定状态下可以从骨髓迁移到外周血继而迁移到损伤肝脏 中，提示病理状态下分离得到的外周血间充质干细胞可能来源于骨髓。此外，通过免疫荧 光染色等检测方法，发现迁移到损伤肝脏的m s c s 可以通过多种方式参与组织修复，包括 直接分化为多种细胞类型，包括a f p 阳性、a l b 阳性的肝系细胞、c k l 9 阳性的胆管类细 胞、c d l 4 6 阳性的血管内皮类细胞等，同时m s c s 还能通过分泌细胞因子调控星形细胞的 活性来改善肝脏胶原沉积和纤维化。 综上所述，本研究证明小鼠骨髓m s c s 不仅在体外可以跨越分化为肝实质细胞，而且 体内状态能够在肝脏损伤条件下，自发的迁移出骨髓，并通过血液循环向肝脏迁移，通过 跨越分化和细胞因子分泌等方式参与肝脏的损伤修复。 关键词：间充质干细胞，肝实质细胞，跨越分化，肝脏损伤修复，招募，细胞因子受体 浙江大学博士学位论文 m c s c n c h y m a ls t e mc e l l s - p o t e n t i a lf o rl i v e rr e p a i r a b s t r a c t m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ( m s c s ) w e r ei n i t i a l l yc h a r a c t e r i z e d a s p l a s t i ca d h e r e n t ， f i b r o b l a s t o i dc e l l s t h e s ec e l l sc a l ld i f f e r e n t i a t ei n t oo s t e o g e n i c ，a d i p o g e n i ca n dc h o n d r o g e n i c l i n e a g e su n d e ra p p r o p r i a t ec o n d i t i o n s i nr e c e n ty e a r s ，an u m b e ro fr e p o r t sh a v ea l s oi n d i c a t e d t h a tt h e s ec e l l sp o s s e s st h ec a p a c i t yt ot r a n s - d i f f e r e n t i a t ei n t oe p i t h e l i a lc e l l sa n dl i n e a g e s d e r i v e df r o mt h en e u r o e c t o d e r m i nt h i ss t u d y , w em a i n l yf o c u so nt h ep o t e n t i a lo fm s c sf o rl i v e rr e p a i r , w h i c hi n c l u d e st w o p a r t s ：i nv i t r ot r a n s d i f f e r e n t i a t i o no fm o u s eb o n em a r r o wm e s e n c h y m a ls t e mc e l l ( m b m - m s c s ) i n t oh e p a t o c y t e s ，a n di nv i v or e c r u i t i n ga n dh o m i n go fm b m m s c st o w a r d si n j u r e dl i v e r i nt h e 1 鞋p a r to ft h ep r o j e c t ，t h r e eo r i g i n a lp r o t o c o l sf o rd i r e c t i n gm b m m s c st r a n s d i f f e r e n t i a t ei n t o f u n c t i o n a lh e p a t o c y t e - l i k ec e l l sw e r ee s t a b l i s h e db yc o n d i t i o n a lm e d i u mo f i n j u r e dl i v e rt i s s u e s ， n o r m a lh e p a t o c y t e sa n df e t a ll i v e r ss e p a r a t e l y f u r t h e rs t u d i e sb ym i c r o a r r a ya n a l y s i sa n d a n t i b o d yb l o c k i n ge x p e r i m e n t si n d i c a t e dt h a tf g f 4 ，h g fa n do s mw e r ec r u c i a lf o rt h e s e c o n d i t i o n a lm e d i a i n d u c e dh e p a t i cd i f f e r e n t i a t i o n s ，a n dm b m - m s cd e r i v e dh e p a t o c y t e sc a n a l s ob ea c q u i r e db yt r e a t m e n to ft h e s ec y t o k i n e s f u r t h e r m o r e ，w ed e m o n s t r a t e dt h a tt h e d i f f e r e n t i a t i o ne f f i c a c yc o u l db ec o n s i d e r a b l ye n h a n c e db yp r e - t r e a t m e n to fv p a ，a n dr e g u l a t i o n o ff g f r sa n dc - m e tg e n ee x p r e s s i o nt h r o u g hp o s tt r a n s l a t i o n a lm o d i f i c a t i o no fc o r eh i s t o n e s m i g h tb et h ep r i m a r yi n i t i a t i n ge v e n tf o rt h e s ee f f e c t s i n 廿l e2 们p a r to ft h ep r o j e c t ，w e s u c c e s s f u l l yi s o l a t e da n dc h a r a c t e r i z e dc i r c u l a t i n gm s c s i nt h ep e r i p h e r a lb l o o do fl i v e r - i n j u r e d m i c e 、历t 1 1e x p a n s i o ni nc u l t u r e ，a n dp r o v i d e dd i r e c te v i d e n c et h a tm b m m s c sw e r em o b i l i z e d i n t ot h ec i r c u l a t i o na n dr e c r u i t e di n t ol i v e r sa f t e rs t i m u l a t i o no fl i v e r - i n j u r y c c r 9 ，c x c r 4a n d c - m e tw e r ee s s e n t i a lf o rd i r e c t i n gt h e s ec e l lm i g r a t et oi n j u r e dl i v e r t h er e c r u i t e dm b m - m s c s m a yp l a yd i f f e r e n tr o l e s ，i n c l u d i n gh e p a t i cf a t es p e c i f i c a t i o na n dd o w n r e g u l a t i o no ft h ea c t i v i t y h e p a t i cs a t e l l i t ec e l l s ，w h i c hi n h i b i t so fo v e r - a c c u m u l a t i o no fc o l l a g e na n dd e v e l o p m e n to f f i b r o s i s o u rr e s u l t sp r o v i d en e wi n s i g h t si n t ol i v e rr e p a i ri n v o l v i n ge n d o g e n o u sb m - m s c sa n d a d dn e wi n f o r m a t i o nf o rc o n s i d e r a t i o nw h e nd e v e l o p i n gc l i n i c a lp r o t o c o l si n v o l v i n gt h em s c s k e yw o r d s ：m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ，h e p a t o c y t e ，t r a n s d i f f e r e n t i a t i o n ，l i v e r , r e c r u i t m e n t , h o m i n g , c y t o k i n er e c e p t o r i i i 浙江火学博士学位论文m e s e n c h y m a ls t mc e l l s - p o t e n t i a lf o rl i v e rr e p a i r 缩写、符号清单、术语表 v i l 浙江大学博士学位堡壅 坚竺竺! ! 竺苎! 苎! 竺! ! ! ! ! = 呈竺竺! 型塑! ! 竺! 翌墅! _ _ _ - l _ _ l _ 一一 r e a l t i m ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r e a l t i m ep c r实时定量p c r f l o wc y t o m e t r y i n t r a - b o n em a r r o wi n j e c t i o n e n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n a - f e t o p r o t e i n a l b u m i n c y t o k e r a t i n19 c y t o k e r a t i n18 c y t o k e r a t i n8 5 - 1 a n t i t r y p s i n t y r o s i n e - a - k e t o n l u t a r a t e h e p a t o c y t en u c l e a rf a c t o r - 3j 3 h e p a t o c y t en u c l e a rf a c t o r - 4 g l u c o s e - - 6 - p h o s p h a t e f i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o rr e c e p t o r c h e m o k i n e ( c cm o t i f ) r e c e p t o r c h e m o k i n e ( c x - cm o t i f ) r e c e p t o r c h e m o k i n e ( c x 3 一cm o t i f ) r e c e p t o r c h e m o k i n e ( cm o t i f ) r e c e p t o r c h e m o k i n e ( c - cm o t i f ) l i g a n d c h e r n o k i n e ( c x - cm o t i f ) l i g a n d c h e m o k i n e ( c - x 3 一cm o t i f ) l i g a n d c h e m o k i n e ( cm o t i f ) l i g a n d d a y h o u r m i n u t e f c m流式细胞术 i b mi n j e c t i o n e g f p a f p a l b c k l 9 c k l8 c k 8 t a t 悯 h n f 一31 3 f o xa 2 h n f 一4 g 一6 一p f g f r c c r c x c r c x 3 c r x c r c c l c x c l c x 3 c l x c l d h m l n 骨髓腔移植 增强型绿色荧光蛋白 甲胎蛋白 白蛋白 角蛋白1 9 角蛋白1 8 角蛋白8 a 抗胰蛋白酶 酪氨酸c 【酮戊二酸转氨 酶 肝细胞核因子一3 d 肝细胞核因子4 葡萄糖6 磷酸酶 成纤维生长因子受体 c c 趋化因子受体 c x c 趋化因子受体 c x 3 c 趋化因子受体 x c 趋化因子受体 c c 趋化因子配体 c x c 趋化因子配体 c x 3 c 趋化因子配体 x c 趋化因子配体 s e c o n ds - - _ _ - _ l l - _ _ _ l - _ - _ _ _ - i _ _ _ _ _ - l _ _ _ - - _ _ l _ 一i _ l - - - _ _ - - - _ l - _ _ _ _ _ - - _ _ _ - _ l i - _ - - _ - - _ i _ - - - v m 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝姿盘堂或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 魏p 者呼期：枷p 7 年多月夕自 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝鎏盘堂 有权保留并向国家有关部门或 机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝姿盘 生可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 净蛔牟 期。沪7 年占月1 日f 导师签名： 捌飙川彩夕日 浙江大学博士学位论文m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s - p o t e n t i a lf o rl i v e rr e p a i r 致谢 本论文的研究和撰写工作是在导师邵健忠教授的悉心指导下完成的。导师学识渊博， 思想深邃，视野雄阔，为我营造了一种良好的氛围；其严谨的治学态度，勇于进取和创新 的精神将一直会是我学习的榜样。项黎新副教授不仅在学业和科研上给了我很大的鼓励和 帮助，在生活上也给予许多的关怀。 感谢陈汉民老师、王勇老师在激光共聚焦和流式细胞仪使用上的帮助，同时感谢郑云 老师和刘杨博士在流式细胞仪和活体动物分子成像仪使用上的支持和协助。 感谢实验室各位师兄师姐师弟师妹的支持和鼓励，首先要感谢周庆军师兄、胡若真师 姐在实验设计及操作上给我的细心指导和帮助。其次，感谢陈小永、赵晴萧、黄伟、潘若 浪、张卉、袁媛、朱亚杰、张晓蕾、王宇西等几位师弟师妹能参与到我的课题，帮我一起 承担任务；感谢师妹陈书韵和申佳在英语写作上的大力帮助；感谢金红建师兄、杨再峰师 兄、董伟仁师兄，在你们的帮助下我学到了很多东西，与你们的交流总是给我很多的启发， 不论是科研抑或是人生；感谢郭箭师兄、孟真师姐、刘欣梅师姐、潘雪霞师姐、黄洪敏师 兄、洪旭涛师兄、林慧芳师姐、李雄峰医生、孙荷医师、温轶、方玮、彭博、王惠菊、陈 颖、黄艳丹、郦佳慧、武小嫒、邢雅岚、巩永风、林爱福、胡瑜兰、金阳、施科云、肖永 陶、吴俊平、张瑞鹏、潘萍萍、王渠龙、王皓、顾一峰、熊燃、刘慧慧、潘新民、赵晶、 周杨、卢亿奇、于岱永、张晓瑜、朱律韵、王萍、何丁、杨超等师弟师妹们的无私帮助。 感谢你们对我的支持和鼓励，相信将来会有很多时候想起我们在一起度过的欢乐时光。 特别感谢我的父母和朋友，感谢你们一直以来无私的付出和坚定的支持，给予我不断 前行的动力。 最后，再次感谢所有始终关心爱护我的家人、老师和朋友。 浙江大学博士学位论文 间充质干细胞与肝脏疾病 1 文献综述 1 1 间充质干细胞的研究进展 1 1 1 引言 间充质干细胞( m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ，m s c s ) 来源于中胚层，是一类具有高度自 我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，能参与骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱、脂肪 和基质等组织再生，并且为原始造血干祖细胞在骨髓腔微环境中的生长和分化提供基本 的支持。此外，m s c s 易于分离、培养和扩增，易于导入和表达外源基因，且能够在体 外长期培养过程中保持多向分化的潜能，遗传背景稳定。因此m s c s 在组织工程、细胞 替代治疗、造血重建、基因治疗等方面具备广阔的应用前景。 1 1 2 研究背景及生物学特性 1 9 6 6 年，f r i e d e n s t e i n 和p e t r a k o v a 从大鼠骨髓细胞中观察到一类具有成纤维细胞 样形态的细胞可以分化为成骨和软骨聚集物一样的集落【。1 9 7 0 年，f r i e d e n s t e i n 等首次 从猪骨髓中分离得到了一类成纤维样细胞，并在体外进行扩增培养，这类细胞被命名为 成纤维样集落形成单位( c o l o n yf o r m i n gu n i t s f i b r o b l a s t i c ，c f u f ) ，碱性磷酸酶检测显 示大部分细胞处于分化早期的干祖细胞阶段，具有形成骨、软骨、脂肪和成肌细胞等分 化潜能，这也是首次报道体外扩增培养的间充质干细胞【2 1 。基于在组织工程和临床应用 方面的广阔应用前景，m s c s 迅速成为干细胞研究领域中的热点。在过去的十余年中， 得益于细胞分离技术的进步，m s c s 分离和培养也得到了快速的发展，大量关于m s c s 表型特征和可塑性的研究报道开始涌现。这些研究报道一方面推进了我们对于m s c s 的 理解，同时也在术语的选择和m s c s 鉴定上带来了困惑。在过去几十年中，骨髓基质细 胞( m a r r o ws t r o m a lc d l s ) 、多能基质细胞( m u l t i p o t e n ts t r o m a lc e l l s ) 、间充质基质细胞 ( m e s e n c h y m a ls f f o m a lc e l l s ) 、集落形成单位( c o l o n yf o r m i n gu n i t s f i b r o b l a s t i c ，c f u - f ) 、 骨髓基质干细胞( b o n em a r r o ws t r o m a ls t e mc e l l s ，b m s s c s ) 、基质前体细胞( s 仃o m m p r e c u r s o rc e l l s ，s p c s ) 、骨干细胞( s k e l 耐s t e mc e l l s ，s s c s ) 、以及多能成体祖细胞 ( m u l t i p o t e n ta d u l tp r o g e n i t o rc e l l s ，m a p c s ) 等都曾经被用来描述这一类细胞，但是这 l 浙江大学博士学位论文 问充质干细胞与肝脏疾病 么大量的术语中仍然没有一个能确切的描述这类细胞的发育来源以及分化潜能，目舻间 充质干细胞( m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ，m s c s ) 是最常被使用的。 m s c s 在骨髓中含量极少，大约每1 0 4 1 0 5 个单个核细胞中含有1 个m s c 。体外培 养的m s c s 能够迅速的附着在塑料培养皿底面，形成成纤维样的集落，具备向成骨、软 骨和脂肪等中胚层来源细胞分化的能力。在相差显微镜下，m s c s 形态为梭形和纺锤形， 平行排列生长或涡旋状生长，细胞核大，不规则，核仁明显，胞质内细胞器少。细胞周 期研究表明，大多数m s c s 处在g 0 g i 期。到目前为止，m s c s 的细胞表面分子标志尚 不明确，研究显示体外扩增的m s c s 表达间质细胞、内皮细胞和上皮细胞的表面标志， 但是不表达造血细胞的表面标志，也不表达与人白细胞抗原识别有关的共刺激分子及主 要组织相容性复合物i i 类分子。m s c s 表达的主要分子包括：生长因子和细胞因子受体、 趋化因子受体、粘附分子及整合素家族成员、免疫相关分子、其他分子( 表1 1 1 ) 。 表1 1 1m s c s 表达的细胞表面分子标记 l i n e a g e c h e m o k i n eg r o w t hi c a m 1 + c d 4 0 + m a r k e r s r e c e p t o r s f a c t o r i c a m - 2+t u 0 2 c d 4 5 - c x c r l+ - r e c e p t o r s i c a m 3 + t u 己9 + c d 3 4 - c x c r 2 t g f - b s r + m u c l 8 + b 7 h l c d 3 l - c x c r 3 + c d l 0 5 +c d 9 0+n e c t i n - 2 + - c d l l b c x c r 4+p d g f r + l e a 3 + p v r + c d l 9 - c x c r 5 + e g f r + a 4i n t e g r i n + u l b p 3 + g l y c o p h o r i na - c x c r 6 + i g f l r + a - 5i n t e g r i n + u l b p 1+ - s t r o 1 + c c r l + n g f r +c d 2 9+u l b p 2+ - s s e a _ 4 + c c r 2 +f g f r+b - 2i n t e g r i n - u l 】3 p _ 4| c c r 3+v e g f r+b 4m t e g r i n 一 m i c a + c y t o k i n e c c r 4 + f r i z z l e d + l - s e l e c t i n - c d 4 8 r e c e p t o r s c c r 5 + l l 强6+p s g i ，1 - n t b a 几1 r + c c r 6 - c d 2 4 - a d h e s i o nc a d h e r i n - 5 - o t h e r si l ，3 r + c c r 7 + p r o t e i n s 叫r + c c r 8 - c d 7 3 + 蹦r+c c r 9+c d 4 4+ i m m u n e - r e l s c a - 1 + 2 浙江大学博士学位论文间充质干细胞与肝脏疾病 i l ，7 r + c c r l o - v c a m 1 + a t e dp r o t e i n s i l 1 5 r + c x 3 c r l+ -p e c a m 1 - m h ci l a w - i f n - g r + x c r l 一n c a m 1+ m h c i l 2 a t n f - a l r + h c a m 1 + c d 8 0 删a 2 r +a l c a m+c d 8 6 表中总结了近年来报道的绝大多数m s c s 细胞表面抗原。不同种属来源、不同组织来源的m s c s 在细胞表面抗原表达上并不一致，同时由于分离纯化方法以及培养液和血清选择的差异，即使是对 于同一来源的m s c s ，来自在不同实验室的鉴定结果也往往存在差异。a l c a m ，a c t i v a t e d l e u k o c y t ec e l l a d h e s i o nm o l e c u l e ；e g f , e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r ；f g f , f i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r ；h c a m ， h o m i n g - a s s o c i a t e dc e l la d h e s i o nm o l e c u l e ；i c a m ，i n t e r c e l l u l a ra d h e s i o nm o l e c u l e ；i f qi n s u l i n l i k eg r o w t h f a c t o r ；i f n g ，i n t e r f e r o n - g ；i l ，i n t e d e u k i n ；l f a ，l y m p h o c y t ef u n c t i o n - a s s o c i a t e da n t i g e n ；l r p , l o w - d e n s i t y l i p o p r o t e i r t r e c e p t o r - r e l a t e dp r o t e i n ；m h c ，m a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x ；m i c a ，m i - i cc l a s s - i - r e l a t e d c h a i na ；n c a m ，n e u r a lc e l la d h e s i o nm o l e c u l e s ；n g f , n e r v eg r o w t hf a c t o r ；n t b a ，n k - ，t - ，a n db - c e l l a n t i g e n ；p d g f , p l a t e l e td e r i v e dg r o w t hf a c t o r ；p e c a m ，p l a t e l e te n d o t h e l i a lc e l la d h e s i o nm o l e c u l e ；p s g l ， p - s e l e c t i ng l y c o p r o t e i nl i g a n d ；p v r , p o l i o v i r u sr e c e p t o r ；t g f , t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r ；t l r ，t o l l - l i k e r e c e p t o r ；t n f , t u m o rn e e r o s i sg r o w t hf a c t o r ；v c a m ，v a s c u l a rc e l la d h e s i o nm o l e c u l e ；v e g f , v a s c u l a r e n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r ；u l b p , u l l 6 - b i n d i n gp r o t e i n 由于一直未能发现m s c s 特异性的细胞表面抗原，关于m s c s 的分离和鉴定的争论 依然存在，而一种新的观点正在被越来越多的研究者所接受，即过去几十年报道的“间 充质干细胞”是一个不均一的混合细胞群体，其中包含了不同的扩增能力和分化潜力的 干祖细胞，而真正的干细胞( m s c s ) 所占的比例是极少的f 3 ，4 】。另一方面，目前关于 m s c s 表型特征的研究是建立在对体外扩增培养m s c s 的分析，而对机体中的原始m s c s 的表型依然知之甚少【3 1 。然而m s c s 这一类成体细胞的存在已经是毋庸置疑，并可能成 为组织工程中重要的种子细胞来源。为了规范m s c s 的研究，2 0 0 6 年国际细胞移植治疗 学会在其官方期刊c y t o t h e f a p y 上发表意见书【5 1 ，提出了m s c s 鉴定的三点基本标准：第 一，在体外正常培养条件下可以迅速贴附到塑料培养皿底；第二，细胞表面标记特征为 c d l 4 、c d l l b 、c d l 9 、c d 7 9 a 。、c d 3 4 、c d 4 5 、h l a - d r 、c d 7 3 + 、c d 9 0 + 、c d l 0 5 + ： 第三，可以向成骨、软骨和脂肪诱导分化。但是上述标准是针对人源m s c s ，对于其他 动物来源m s c s 的鉴定，贴壁生长和中胚层方向的分化依然适用，但是其他种属来源 3 浙江大学博士学位论文 问充质干细胞与肝脏疾病 m s c s 的细胞表面抗原目前尚不明确，且往往是不同实验室的研究结果之间存在一定差 异。相信随着相关的研究有待深入及m s c s 克隆化培养技术的发展，我们将越来越接近 真实的m s c s ，更好的利用这一宝贵的成体干细胞资源。 1 1 3 来源和可塑性 m s c s 最初是在骨髓中分离得到，同时骨髓也是m s c s 最大的壁龛( n i c h e ) 。但是近 年来的研究发现，m s c s 也可以从其他组织中分离得到，包括脂肪、滑膜、骨骼肌、真 皮、骨小梁、脐带血、肺脏、牙髓、羊水、胎肝、外周血、甚至女性经血【4 “，。7 1 ，说明 m s c s 在体内广泛分布。这些报道的其他组织来源的m s c s 和骨髓来源的m s c s 相比， 在细胞形态基本一致，且都具备向中胚层方向分化的能力；但是在表面抗原、增殖能力 以及分化潜能上存在一定差异。由于对m s c s 的研究采用了多种不同的分离、扩增方法， 以及不同的表面抗原鉴定，使得各个组织来源m s c s 之间的比较非常困难。在目前的研 究阶段，骨髓仍然是最丰富最可靠的m s c s 来源，而其他组织尚难作为稳定的m s c s 来 源，但是关于其他组织来源的m s c s 的研究有助于人们更好地理解m s c s 的发生、发育 及生理学功能【8 】。 骨髓源m s c s 在体内处于一种稳定且可变的状态，在机体的生命周期中保持自我更 新和多向分化潜能。这些m s c s 在适宜的微环境下参与骨、软骨和脂肪等形成。特别是 1 9 9 9 年以来，发现m s c s 还有另外的分化途径，表现出高度的可塑性，即m s c s 除了向 上述的中胚层谱系分化外，在体外适当的条件下还能够向外胚层和内胚层的细胞跨越分 化( t r a n s d i f f e r e n t i a t i o n ) 【9 】。2 0 0 1 年t r e m a i n 等利用m i c r o s a g e 分析了人类m s c 的基 因表达谱，在未分化的单个m s c 克隆中检测到2 3 5 3 种基因【1 0 1 ，涉及软骨细胞、心肌细 胞、成骨细胞、造血基质、内皮细胞、上皮细胞和神经细胞等。体内移植实验表明，m s c s 能够整合到受体的骨、肌肉、脑、肺、心脏、肝脏、消化道和造血系统【1 1 1 。尽管这种跨 越分化不符合我们之前认定的胚层分化法则，m s c s 高度的多潜能使得其在临床应用上 具备诱人的前景。但是，由于不同研究人员在分离m s c s 方法上的差异、培养液及血清 选择上的不一致以及培养时间等参数的不确定，使得实验重复性不佳，所以不认同m s c s 跨越分化能力的观点依然存在，一些研究报道的实验数据也需要进一步核实。同时，由 于缺乏直接的证据，关于m s c s 在体内状态下的跨越分化能力仍然在激烈争论中。 4 浙江大学博士学位论文问充质干细胞与肝脏疾病 1 1 4 功能 首先，m s c s 是造血微环境的重要组成部分，在支持造血中起重要作用。现已明确 成体骨髓m s c s 为造血干细胞提供了适宜的微环境，并能够通过细胞细胞接触或者分泌 细胞因子调节造血干祖细胞的自我更新、增殖和分化。这些细胞因子和生长因子包括自 细胞介素类、粒细胞集落刺激因子( g c s f ) 、粒巨噬细胞集落刺激因子( g m c s f ) 、 基质源性因子l ( s d f 1 ) 、干细胞因子( s c f ) 、血小板生长因子( p d g f ) 、成纤维生长 因子2 ( f g f 2 ) 、血小板生成素( t p o ) 等( 表1 1 2 ) 。在多种动物模型中，联合移植 造血干祖细胞和m s c s 提高了造血干祖细胞存活率，达到良好的治疗效果【1 2 】。 表1 1 2 体外培养的m s c s 能够分泌多种可溶性细胞因子 i l 6s c ff l t - 3l i g a n d 其他可诱导的牛 i i ，7l i fm c s fi l 1 事 i l 8f g f 2b m _ 4 t p o i l 1 lh g fo s m g m c s f 幸 1 1 1 2t g f 吨t p op d g f 幸 i l 1 5 t g f - 1 3 g c s f幸 i l l 4s d f 1 i l ，i n t e r l e u k i n ，自介素；s c f ，s t e mc e l lf a c t o r ，肝细胞因子；l i f ，l e u k e m i ai n h i b i t o r yf a c t o r ， 白细胞抑制因子；f g f 2 ，f i b o r b l a s tg r o w t hf a c t o r - 2 ，碱性成纤维生长因子；h g f ，h e p a t o c y t eg r o w t h f a c t o r ，肝细胞生长因子；s d f 1 ，s t r o m a l d e r i v e df a c t o r - 1 ，问充质衍生因子1 ；f i t 3 ，f m s 1 i k et y r o s i n e k i n a s e3 ，酪氨酸激酶；m c s f ，m a c r o p h a g ec o l o n y - s t i m u l a t i n gf a c t o r ，巨噬细胞集落刺激因子；t g f ， t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r ，转化生长因子；b m p - 4 ，b o n em o 巾h o g c o d cp r o t e i n - 4 ，骨形态发生蛋白4 ： o s m ，o n c o s t a t i nm ，制瘤素m ；t p o ，t h r o m b o p o i e t i n ，血小板生成素；g m c s f ，g r a n u l o c y t e - m a c r o p h a g e c o l o n y - s t i m u l a t i n gf a c t o r ，粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子；p d g f ，p l a t e l e td e r i v e dg r o w t hf a c t o r ，血小 板衍生生长因子；g c s f ，g r a n u l o c y t ec o l o n y - s t i m u l a t i n gf a c t o r ，粒细胞集落刺激因子。 其次，m s c s 是骨、软骨和脂肪的祖先细胞。最近的研究也表明m s c s 在体外合适 的环境下( 如多种细胞因子或化学药物刺激) 能够跨越分化成为其他胚层的多种细胞， 包括神经元、神经胶质细胞、肝实质细胞、肝星状细胞、胰岛细胞、皮肤角质细胞、心 脏细胞等。研究者将m s c s 移植到发育过程中的动物胚胎，结果在动物出生后，在绝大 5 浙扛大学博学位论文问充质干细胞肝脏疾病 多数组织器官中检测到供体来源的信号，并且这些外源导入的细胞表现出多种类型的细 胞形态，说明m s c s 可咀部分的参与个体发育。 再则，越来越多的研究显示，移植m s c s 对于组织损伤修复有明显的改善作用，包 括骨缺损、脑损伤、心肌梗塞和急性肝脏损伤等。近年的研究还显示，m s c s 能够向组 织损伤部位、炎症部位和肿瘤发生部位迁移i i ”，参与组织修复、炎症抑制以及肿瘤相关 基质的生成( 图ll1 ) 。m s c s 的归巢与其分泌一系列生长因子、趋化因子和蛋白酶有关， 扩增培养的m s c s 已经被证实表达多种趋化因子受体( 图l1 2 ) 。以便m s c s 通过趋化 刺激向特定的组织迁移。但是目前还缺乏直接的证据来阐明m s c s 迁移到这些损伤炎症 部位后的命运，跨越分化、去分化( d e , - d i f f e m n f i a f i o n ) 咀及m s c s 和组织细胞的融合 ( f u s i o n ) 都可能存在( 图1 i3 ) “1 ；m s c s 也可能通过分泌细胞因子改善组织微环 境的方式参与组织修复( 图1i4 ) ，如肝细胞生长因子( h g f ) 、转化生长因子1 ( t g f 1 ) 、 白介素- 1 ( i l - i ) 、白介素- i b 、白介索- 3 、白介素6 、白介素7 、白介素i 1 以及干细胞因 子( s t e r n uf a c t o r ，s c f ) 等，这些可溶性因子能够加速损伤组织再生、刺激大部分组 织中的成体干细胞扩增与分化、抑制炎症与免疫反应【l ”。 五 圆 p e r l p 。 浙江大学博士学位论文 闻充质干细胞与肝脏疾病 图1 1 1 间充质干细胞体内定向迁移模型m s c s 选择性的向组织损伤部位、炎症部位和 肿瘤发生部位迁移，并参与组织修复、炎症抑制以及肿瘤相关基质的生成。肿瘤和损伤组织分泌 细胞因子趋化因子，形成浓度梯度；圆n i c h e 中的m s c s 被动员到外周血，向损伤部位、炎症部位和 肿瘤发生部位迁移。图片根据2 0 0 7m e n o ne ta 1 【1 7 1 、2 0 0 8w o j a k o w s k ie ta 1 【1 8 嶝改。 c c lc h e m o k i n e s c c l 2 ( m c p - 1 ) c c l 5 ( r a n t e s ) c c l 2 6 ( e o t a x i n - 3 ) c c l 3 ( m i p - 1n ) c c l 7