（细胞生物学专业论文）纤维素酶系协同作用实验及重组酵母的同步糖化发酵.pdf

摘要 将地球上最丰富且廉价的可再生生物质资源纤维素材料转化为燃料乙 醇，具有重要的经济和生态意义。利用天然纤维素材料生物转化乙醇时，纤维 素糖化和乙醇发酵是目前两个重要的研究方向。本论文以提高纤维素糖化过程 的酶解效率和乙醇产量为目的，针对纤维素酶活性不高、酶系缺陷导致的纤维 二糖积累阻遏酶活发挥以及j u a i o 同步糖化发酵体系缺失的问题，开展了以下 三个方面的研究工作： ( 1 ) 以酶制剂生产常用的木霉属菌株9 4 1 4 为目的菌株，利用实验室现有 的1 5 株真菌，进行了协同作用实验，试图发现促进纤维素酶活性发挥的蛋白辅 助因子，提高纤维素的糖化效率。对9 4 1 4 的纤维素酶系具有正协同作用的菌株 的8 葡萄糖苷酶活都比9 4 1 4 高，根据协同系数可初步推测促进作用是由b 葡 萄糖苷酶引起的，验证了纤维素酶的酶系组成与其活性大小的密切关系。 ( 2 ) 通过发酵温度、酵母接种量、底物浓度和酶液浓度的比较实验，对斜 卧青霉j u a 1 0 的同步糖化发酵系统进行了优化并建立了最佳的同步糖化发酵 体系：1 0 木糖渣，2 0i u g 酶浓度，0 2 酵母接种量，3 5 静置培养。这组数 据为燃料乙醇同步糖化发酵工艺的改进提供了重要的参考。 ( 3 ) 在建立了酿酒酵母工业菌株转化系统的基础上，将纤维二糖代谢相关 基因扣囊复膜孢酵母编码的b 葡萄糖苷酶基因b g l l 多拷贝整合到酵母工 业菌株n a n 2 7 的染色体上，并在转化子中筛选得到了具有较高b 葡萄糖苷酶 活( 1 0 2i u m g ) 的重组酵母n a n 一2 2 7 。利用纤维二糖发酵的结果显示，表达 b g l l 基因的重组酵母纤维二：糖的乙醇转化率达到0 5 3 2g g ，接近理论值0 5 3 8 g g 。利用工业发酵中常用的商品化纤维素酶制剂c e l l u c l a s t1 5l 和自己建立的 斜卧青霉发酵系统进行的n a n 2 7 和n a n 一2 2 7 的同步糖化发酵实验结果显示， 重组酵母与宿主菌株相比，纤维二糖代谢能力提高，乙醇终浓度稍有提高，但 与添加b 葡萄糖苷酶的对照组相比，发酵效果尚有差距。在酵母工业菌株中表 达b 6 z j 在一定程度上解除了同步糖化发酵体系中纤维二糖积累对纤维素酶活 发挥的阻遏，可替代或减少乙醇工业生产时额外加入的b 葡萄糖营酶量。 关键词：燃料乙醇：协同作用：同步糖化发酵；6 葡萄糖苷酶 a b s t r a c t i ti se c o n o m i ca n de n v i r o n m e n t a lt op r o d u c te t h a n o lb yc e l l u l o s e ，w h i c hi st h e m o s ta b u n d a n tr e g e n e r a t e dr e s o u r c e si nt h ew o r l d c e l l u l o s i cs a c c h a r i f i c a t i o na n d e t h a n o lf e r m e n t a t i o na r et w oi m p o r t a n tr e s e a r c h p a r t s i nt h eb i o c o n v e r s i o no f c e l l u l o s et oe t h a n o lc u r r e n t l y t h i sr e s e a r c hw a sa b o u tc e l l u l a s ea c t i v i t i e s ，c e l l u l o s e c o m p o s i n ga n ds s f a sf o l l o w sf o re n h a n c i n gh y d r o l y t i ce f f i c i e n c ea n de t h a n o ly e i l d 1 ) i no r d e rt oe n h a n c ec e l t u l a s ea c t i v i t y ，w ec a r r i e do u ts y n e r g e t i ce x p e r i m e n tt o f i n dap r o t e i nw h i c hc a np r o m o t ec e l l u l a s eh y d r o l y z i n g t h er e s e a r c hw a sc a r r i e d u s i n g1 5f u n g u si no u rl a b ，w i t ht r i c h o d e r m as p 9 4 1 4c e l l u l a s ea st h ec o n t r 0 1 t h e f u n g u sw h i c hc a ni n c r e a s et h ec e l l u l a s ea c t i v i t ya l lh a v eh i 曲e rb g l u c o s i d a s e s a c t i v i t yt h a n9 4 1 4 a c c o r d i n gt ot h e i rd s ，t h ep r o m o t ee f f e c ti sp r o b a b l yc a u s e db y 6 - g l u c o s i d a s e 2 ) w eo p t i m i z e ds s fc o n d i t i o no fj u a i ov i ag r a d u a lt e s t so ft e m p e r a t u r e ，y e a s t i n o c u l a t i o n ，s u b s t r a t ea n de n z y m ec o n c e n t r a t i o n t h eb e s tc o n d i t i o ni ss s fw i t h2 0 i u ge n z y m ec o n c e n t r a t i o n 1 5 a c i d - p r e t r e a t e dc o m c o bu s i n g0 2 y e a s ti n o c u l a t i o ni n3 5 * c t h eo p t i m i z a t i o np r o v i d ei m p o r t a n tv a l u ef o rb i o e t h a n o li n d u s t r y p r o g r e s s 3 ) t h e1 3 - g l u c o s i d a s eg e n e - - b g l lo fs a c c h a r o m y c o p s i sf i b u l i g e r aw a si s o l a t e d a n de x p r e s s e di ns a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a en a n 一2 7u s i n gt h es t a n d a r dy e a s tt r a n s f o r m a t i o nm e t h o dw es e tu pi nt h ep a s t t h er e c o m b i n a n ty e a s tw i t ht h ehj i 曲e s t 1 3 - g l u c o s i d a s ea c t i v i t y _ 一1 0 2i u m gw a sn a m e dn a n 一2 2 7 ，a n dw a sa p p r o v e dt o u t i l i z i n gc e l l o b i o s ee f f e c t i v e l yo nc e l l o b i o s ea st h es o l ec a r b o ns o u r c e i t se t h a n o l y i e l da b i l i t yu s i n gc e l l o b i o s ei so 5 3 3g g a p p r o a c ht ot h et h e o r e t i c a lv a l u e t h es s f o fn a n - 2 7a n dn a n 2 2 7u s i n gc e l l u c l a s t1 5la n dj u - a i oa sc e l l u l a s ei n d i c a t e d t h a tr e c o m b i n a n ty e a s tc o u l du t i l i z ec e l l o b i o s em u c hq u i c k l ya n dt h ee t h a n o ly i e l d i n c r e a s e d n e v e r t h e l e s s ，i th a dag a pb e t w e e nt h es s fu s i n gn a n 一2 2 7a n dt h eo n e u s i n gn a n 一2 7a d d e db 一掣u c o s i d a s e t h ee x p r e s s i o no fb g l li ni n d u s t r i a ly e a s t n a n - 2 7d e c r e a s e dt h ep r e v e n c eo fc e l l o b i o s ef o rc e l l u l o s ed e g r a d a t i o ni ns s fa n d w a sa b l et od e c r e a s e ，e v e ni n s t e a do fa d d i n g1 3 - g l u c o s i d a s ei ne t h a n o li n d u s t r y k e y w o r d s ：e t h a n o l ；s y n e r g i s m ；s s f ；1 3 - g l u c o s i d a s e 纤维素酶系协同作用实验及重组酵母的同步糖化发酵 本文缩写词表 d a y e n d o g l u c a n a s e e e l l o b i o h y d m l a s e 8 - g l u c a n a s o s o p t i c a ld e n s i t y s i m u l t a n e o u ss a c c h a r i f i c a t i o na n df e r m e n t a t i o n d e g r e eo fs y n e r g i s m f i l t e r p a p e ra c t i v i t y b e t a - d - g l u c a n a s ea c t i v i t y b - g l u c o s i d a s e sa c t i v i t y x y l a n a s ea c t i v i t y h i g l lp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y m i n u t e h o u r b a s ep a i r k i l o b a s o s m s o d i u md o d e c y ls u l f a t e d i t h i o t hr e i t o l p h e n y l m e t h y l s u l f o n y lf l u o r i d e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n a m p i c i l l i n g e n e t i c i n 天 内切葡聚糖酶 外切葡聚糖酶 b 葡萄糖苷酶 光密度值 同步糖化发酵 协同系数 滤纸酶活 内切葡聚糖酶酶活 8 葡萄糖苷酶酶活 木聚糖酶酶活 高效液相色谱 分钟 小时 碱基对 千碱基对 摩尔每升 十二烷基硫酸钠 二硫苏糖醇 苯甲基磺酰氟 聚合酶链式反应 氨卞青霉素 遗传霉素 。 盼 锄 缸 | i ； 璐 姒 姒 一 著 。 姊曲 m 哪 阿 一 嗽 脚 纤维素酶系协同作用实验及重 r 酵母的同步糖化发酵 独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论文中除特别 加以标注和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究成果，其他同 志的研究成果对本人的启示和所提供的帮助，均已在论文中做了明确的声明并表示谢意。 学位论文作者繇弘移曰 论文使用授权说明 期：枷7 、7 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅。本文授权辽宁 师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。保密的学位论文在解密后使用本授权阻 学位论文作者虢弘孑色指导教师魏彩 日 德国 期：砷，1 27 纤维素酶系协同作用实验及重组酵母的同步塘化发酵 第一章文献综述 1 1 生物转化法生产乙醇的研究进展 世界经济的飞速发展和人口的快速增长，使得石油，天然气等传统的不可 再生能源相对短缺。而各种矿物质资源的过度消耗不断导致生态环境的恶化， 严重威胁人类社会的可持续发展。2 0 世纪的能源危机及当今世界对能源需求的 急剧增长，加快了人们寻找开发燃油替代能源的步伐【1 1 。 1 1 1 燃料乙醇生产工业的发展现状 作为一种良好的汽油增氧剂和高辛烷值调和组分，乙醇己被公认为是最有 发展前景的可再生清洁能源之一】。在2 0 世纪7 0 年代中期以来的四次较大的 “石油危机”的推动下，燃料乙醇生产工业在世界许多国家得以迅速发展。 在众多力图发展燃料乙醇工业的国家中，美国和巴西走到了各国的前列。 巴西是世界上燃料乙醇发展的先驱，它于1 9 7 4 年在世界上第一个推出国家酒精 计划。发展至今，巴西的燃料乙醇产量居世界第一，最高年产达1 6 0 亿立升， 成为世界上唯一不供应纯汽油的国家【4 l 。美国的燃料乙醇项目启动于1 9 7 8 年， 在政府扶持下成为目前世界第二大乙醇生产国，其中8 0 为燃料乙醇1 5 】。自巴 西、美国大力推行燃料乙醇政策以来，加拿大、法国、西班牙、瑞典等国纷纷 效仿，均已形成了较有规模的研究及生产。目前还有许多农业资源国家如英国、 荷兰、德国、奥地利、泰国、南非等国政府也均己制定规划【”，积极发展燃料 乙醇工业。从减少温室气体排放和环境保护角度出发，欧盟国家已建议生物燃 料的使用到2 0 0 5 年要占整个运输燃料消耗的2 ，而到2 0 1 0 年，这一数值要到 达5 7 5 1 7 j 。在国际能源组织( i n t e r n a t i o n a le n e r g ya g e n c y ) 和各国政府的帮助 下，1 4 个国家和欧洲共同体的科学家们联合签订了生物能协议( b i o e n e r g y a g r e e m e n t ) ，共同致力于利用植物纤维资源制取燃料乙醇的研究和开发工作。 中国燃料乙醇的使用始于2 0 世纪3 0 年代，曾因油田的开发终止。随着国内 能源消费量的不断增长，我国于2 0 0 1 年在长春、洛阳、郑州、南洋等地建立了 燃料乙醇生产试点，同时在大中城市中开始逐步推广使用乙醇汽油【剐。中国政 府为了发展燃料乙醇产业，在2 0 0 2 年制定了国家“十五”燃料乙醇发展及车用 乙醇汽油推广使用专项规划。这些有力举措给我国的燃料乙醇开发及工业化 纤维素酶系协同作用实验及重组酵母的同步糖化发酵 生产带来前所未有的发展机遇。 作为石油等不可再生能源的代替燃料，乙醇具有燃烧值高、可再生、产生 温室气体少等优点i 踟。燃料乙醇的应用可大大改善大气环境，节省传统能源， 其工业化生产不但关系到未来的新能源供应，对生态环境的保护和人类社会的 可持续发展也有重大意义。 1 1 2 利用天然纤维素材料生产燃料乙醇 正在迅速崛起，规模日益庞大的乙醇发酵工业主要以淀粉质的粮食作物为 原料，每年耗粮高达数十亿吨，与人畜争粮，且原料成本在生产总成本中比例 很高，一定程度上限制了自身的发展【9 】。与淀粉质原料不同，天然纤维素材料 作为植物体光合作用的产物，是地球上最为丰富的可再生生物质资源。全世界 通过光合作用产生的植物物质每年高达1 万亿吨，其中8 9 未被人类利用。绝 大部分的天然纤维素材料在自然环境中被各种微生物分解转化，最终进入生态 系统的碳循环，造成了巨大的资源浪费i 加】。将天然纤维素材料通过生物转化为 燃料乙醇，不仅能为人类提供数量可观、经济可行的新型能源，而且可在很大 程度上减轻农业废弃物对生态环境造成的污染，具有重要的经济和生态意义。 世界上的两大燃料乙醇生产国巴西和美国都利用纤维素材料作为乙醇 的生产原料，他们以三十多年的实践证明了天然纤维素材料生产燃料乙醇的可 行性【1 , 4 5 , 1 1 】。燃料乙醇生产技术的逐渐成熟和工业化，使纤维素材料生产燃料乙 醇在经济上具有一定的可行性1 1 2 l 。巴西以糖蜜或甘蔗渣为原料生产乙醇，成本 为每公斤0 ，1 9 美元；美国以玉米为原料生产乙醇，成本为每公斤0 3 3 美元f l l 】。廉 价清洁的燃料乙醇已日趋优于传统能源。 我国以农作物秸秆为代表的木质纤维素类生物质资源十分丰富，年产量高 达6 亿多吨，大部分焚烧于田阃地头，即浪费了资源，又造成了环境污染【1 3 】。若 能采用适宜的技术，将这些秸秆类生物质资源加以转化利用，不仅能够节粮代 粮，降低燃料乙醇生产的原料成本，还可以处理废物、消除公害、保护环境， 对我国经济的可持续发展将产生深远的影响。因此，以廉价的纤维素废料作为 燃料乙醇生产的原料，成为我国新型能源领域研究的主要方向之一。 1 1 3 生物乙醇转化技术 利用天然纤维素材料生产燃料乙醇的关键，是把纤维素水解为可发酵性糖， 2 纤维素酶系协同作用实验及重组酵母的同步糖化发酵 即完成纤维素材料的糖化过程。水解纤维素可以采取化学或生物的方法。生物 法即酶水解过程具有反应条件温和，副产物少或无副产物的特点，被认为是最 有希望的工艺【1 4 1 。近二十年来，微生物发酵法即生物转化法生产乙醇作为一种 环保的生产方式，得到了世界各国生物学家的青睐1 1 4 1 。直接生物转化天然纤维 素材科生成乙醇的工艺因其成本低、设备简单而具有良好的发展前景。 生物乙醇的生产包括原料收集和预处理、纤维素的糖化和乙醇发酵、乙醇 蒸馏回收三个主要部分【1 5 】。近二十年来，科学家们在原料预处理、菌种筛选与 选育、纤维素酶制备和酶水解技术、酒精发酵技术上取得了令人瞩目的进展1 1 6 j 。 纤维素酶对天然纤维素材料的水解效率，是由酶活的大小和稳定性决定的。酶 的稳定性可以通过固定化酶的形式来解决。纤维素酶活性的大小主要是由酶的 含量和酶系组成决定的。固定化酶的使用和酶液量的增加都会提高纤维素糖化 的成本，因此优化纤维素酶系组成，是提高酶解效率最经济的方式。 纤维素材料发酵生成乙醇的方法有直接发酵法、间接发酵法、混合菌种发 酵法、同步糖化发酵法、非等温同时糖化发酵法( n s s f ) 、固定化细胞发酵法 等【1 7 1 。其中，同步糖化发酵法因省时、高效、经济等优点，成为生物乙醇转化 的常用方法。 同步糖化发酵在一定程度上可以减少纤维素水解产生的葡萄糖、纤维二糖 对纤维素酶的阻遏作用。但生产纤维素酶制剂常用的真菌菌株的酶系中，b 一葡 萄糖营酶含量很低，造成了发酵过程中纤维二糖的大量积累，进而影响酶解效 率和发酵效果。在乙醇的工业生产中，经常采用添加b 葡萄糖苷酶的方法来提 高水解效率，这就增加了燃料乙醇的生产成本。如何减少同步糖化发酵过程中 积累的纤维二糖成为生物学家新的研究热点【17 4 7 s o l 。 1 2 纤维素酶及其蛋白辅助因子 纤维素酶( c e l l u l a s e ) 又称纤维素酶系，是由多种组分组成的一个复杂酶系， 是水解纤维素及其衍生物的一组酶的总称【1 8 1 。人们在各种原生动物、圆虫类、 软体动物、甲壳类、昆虫、藻类、真菌类、细菌及放线菌中都发现了纤维素酶 【1 8 ，2 0 1 。目前最为典型并得到广泛研究的纤维素酶生产菌株主要集中在丝状真菌， 如木霉属中的瑞氏木霉( zr e e s e i ) 、康氏木霉( zk o n i n g i i ) 、绿色木霉( zv i r i d e ) 以及青霉属中的斜卧青霉( 只d e c u m b e n s ) 、微紫青霉( 只j a n t h i n e l l u m ) 和绳状 3 纤维素酶系协同作用实验及重组酵母的同步糖化发酵 青霉( 只f u n i c u l o s u m ) 等1 1 8 l 。纤维素酶多采用真菌生产，其中酶系较全且活性 高的纤维素酶菌株主要是一些丝状真菌，包括：木霉( t r i c h o d e r m as p ) 、青霉 ( p e n i c i l l i u m 印) 和担子菌( b a s i d i o m y c e t e s ) 。其中木霉属中的瑞氏木霉和绿 色木霉是最为典型并得到广泛研究的纤维素酶生产菌株i 阍 1 2 1 纤维素酶的组成和性质 国内外多根据纤维素酶的底物、作用位点和释放产物将其分为三类【1 8 】： ( 1 ) 内切- b 1 4 葡聚糖酶( 1 , 4 d g h c a n o h y d r o l a s e 或e n d o 1 ，4 b d 一u c a l l a s c ，e c3 2 1 4 ，简称e g ) 的分子量介予2 3 1 4 6k d a 2 _ 间。这类酶作 用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解b 1 ，4 糖菅键，将长链纤维素分子截 短，产生大量带非还原性末端的纤维素小分子，如纤维寡糖、纤维二糖和葡萄 糖。如真菌的异构酶e gi 为5 3k d a ，e gi i i 约为4 9 8k d a ，而纤维粘菌e g 有两 种菌的内切酶分子量只有6 3k d a 。 ( 2 ) 外切b 1 ，4 葡聚糖酶，或称纤维二糖水解酶( 1 ，4 - 8 d 删u c a nc e l l o b i o h y d r o l a s e 或c x o 一1 ，4 b d g l u c a n a s e ，e c3 2 1 9 1 ，简称c b h ) ，分子量介于3 8 1 1 8i d a 之间。这类酶作用于纤维素分子的还原或者非还原末端，水解8 1 ，4 糖 苷键，每次切下一个纤维二糖分子，从而破坏纤维素分子。如木霉的c b h 两种异 构酶，c b h1 分子量约为6 6k o a ，c b hi i 约为5 3k d a 。 ( 3 ) 6 - 1 ，4 葡萄糖苷酶( b 1 ，4 g l u c o s i d a s e ，e c3 2 1 2 1 ，简称g e ) 有胞内 酶和胞外酶之分，分子量介于4 7 7 6k o a ( 胞外酶) 或9 0 1 0 0k d a ( 胞内 酶) 之问。这类酶可水解仞级水解产生的纤维二糖，生成d 一葡萄糖。 除了上述三大组分外，真菌中参与纤维素降解过程的还有一些短肽类化合 物、“氢键酶”、纤维二糖脱氢酶等 1 9 1 。它们通过氧化作用或者破坏氢键来降解 纤维素分子。 1 2 2 纤维素酶的协同作用机制 纤维素酶降解纤维素的过程是从它吸附到纤维素上开始的，这个降解过程 可以是单一酶的作用，如热纤梭菌中存在一种多种组分结合形成的纤维素酶复 合体；也可以是多种酶协同完成的【2 0 】。鉴于纤维素结构的复杂性，在真菌中， 没有任何一种酶能将纤维素彻底水解。不管是在纤维素酶复合体中，还是真菌 体内。纤维素的降解需要多种酶组分的协同作用。真菌通过分泌到胞外的游离 4 纤维素酶系协同作用实验及重组酵母的同步糖化发酵 纤维素酶，以水解酶机制和氧化酶机制降解纤维素；而细菌纤维素酶则是以形 成多酶复合体结构而起作用【1 8 】。 目前，最为广泛接受的纤维索酶解机制是内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和b 葡萄糖苷酶的协同作用机制l 复啦2 矧。这个机制的主要内容是：葡聚糖内切酶随 机水解纤维素分子链外的b 葡聚糖苷键，形成新的链末端；外切葡聚糖苷酶从 纤维素分子链一端开始，连续切下并释放可溶性纤维二糖或葡萄糖；b 葡萄糖 苷酶将中间产物纤维二糖水解成小分子糖，从而解除它们对内切葡聚糖酶 和外切葡聚糖酶的阻遏作用【2 。这三个水解过程同时进行，将纤维素完全降解 成为葡萄糖。整个水解过程如图1 1 所示。 固相 。 液相 、； ，： ( 次级水解)”“_ 一 8 8 o ( 初级水解) f 、 - 图1 1 瑞氏木霉( t r i c h o d e r m a ) 降解纤维素的作用模式酣2 1 】 f i g 1 1m e c h a n i s t i cs c h e m eo fe n z y m a t i cc e l l u l o s eh y d r o l y s i s b yt r i c h o d e r m an o n - c o m p l e x e dc e l l u l a s es y s t e m 1 2 3 纤维素酶蛋白辅助因子的发现及意义 对纤维素酶解机制的迸一步研究表明，纤维素酶结合结构域，短肽类化合 物、“氢键酶”对纤维素酶活性的发挥具有很大的促进作用1 1 9 】。这些辅助纤维 纤维索酶系协同作用实验及重组酵母的同步糖化发酵 素酶进行水解的蛋白质，统称纤维素酶蛋白辅助因子。 结合结构域( c e l l u l o s eb i n d i n gd o m a i n ，c b d ) 是各类纤维素酶组分的一个 重要结构，经常出现在纤维素酶组分的n h 2 末端和c o o h 末端，通过糖基化 的、富含p r o t h r s e r 的衔接片段与催化区域连接【矧。多数鉴定出的c b d 可分 为4 个家族，最具特性的是广泛存在于真菌纤维素酶中的i i 类瞄i 。c b d 可以减 弱微纤维链之间氢链的结合作用力，增加纤维的吸水力，导致纤维溶胀，但没 有催化纤维素酶作用的功能。通常认为，c b d 对纤维素的破坏力表现在破坏纤 维结构，改变其聚集态结构；辅助纤维素酶形成一个完整的拓扑结构；一些c b d 可与纤维素结合，在纤维素酶降解纤维素结晶区时具有重要作用i 捌。 1 9 9 6 年，科学家们先后从分属于1 8 属的约5 0 株真菌中检测到可以氧化性 降解纤维素的短肽类低分子化合物【1 9 】。1 9 9 6 年，j l i u 等1 2 7 1 在拟康氏木霉中和 密粘摺菌的培养滤液中分离到毛细管电泳纯的短肽组分s f g f ( s i n g l ef i b e r g e n e g a t i o nf a c t o r ) 和g t ( g l o e o p h y l l u mt r a b e n m ) ，检测到g t 引发的羟基自由 基h o 和超氧阴离子自由0 2 的产生，并结合此过程中纤维素物理化学性质的 变化，提出了这类短肽化合物形成短纤维的作用机理。1 9 9 7 年，b g o o d e l l 等【篮】 纯化得到了此类物质，证明了这种低分子类化合物可降解植物细胞次生壁中的 木素和纤维素，为纤维素酶降解细胞壁提供有利条件。方婧等1 2 9 】提出短肽类化 合物的作用机理是通过引发f e n t o n 反应，形成羟基自由基，对次生壁纤维进行 非酶催化的氧化性降解。 可降解因子的代表是可以与纤维素酶协同作用的纤维二糖脱氢酶i c e l l o b i o s ed e h y d r o g e n a s e ，c d h ) 。c d h 一般由既能降解纤维素又能分解木质素的微 生物合成，是白腐菌产生的重要的木质素降解酶1 2 9 1 ，其作用机理是氧化纤维二 糖，还原f e “和0 2 生成f c 2 + 及h 2 0 2 ；f c “和h 2 0 2 发生f e n t o n 反应，生成羟基 自由基，攻击底物发生氧化降解。氧化降解因子作用后生成的水溶性产物不是 因为简单的糖苷键水解造成的，而是由于糖环的氧化断裂导致了还原端的生成， 并最终使得糖苷键不稳定而水解i 刈。 1 9 5 0 年，r e e s e 等提出存在破坏结晶纤维素的“氢键酶”，提出它的作用 是破坏结晶纤维素分子链之间的氢键，但至今未能在微生物中获得证实1 1 9 i 。 s e l b y 等经过凝胶过滤判断它的分子量是6 1k d a i l 8 l 。1 9 9 4 年，m c q e e 等【3 0 l 在黄 瓜胚轴中，分离出一种蛋白质“e x p a n s i n ”。“e x p a n s i n ”可使离体的植物细胞壁 6 纤维素酶系协同作用实验及重组酵母的同步糖化发酵 伸长，也可使滤纸强度减弱而无还原糖产生，推测这类酶具有破坏氢键的作用。 2 0 0 2 年，高培基等p 9 】在拟康氏木霉( z p s e u d o k o n i n g i i ) 的滤液中分离到了一个 可以减弱棉纤维氢键区的吸收强度，使棉纤维、几丁质等膨胀而无还原糖产生 的分子量为2 4x1 0 4 的蛋白质，符合“氢键酶”的定义。 2 0 0 2 年，m a r k k u 等f 3 1 】从zr e e s e i 中分离得到s w o l l e n i n 蛋白，并通过实验 证明这种蛋白与纤维素结合后打开其结晶区，使纤维素分子在其上“滑行”，但 对它没有水解作用。这个蛋白的基因序列与植物的e x p a n s i n 具有序列相似性， m a r k k a 推测它在王r e e s e i 生长过程中可修饰其细胞壁，在降解不溶性纤维素物 质时，释放可溶性诱导物诱导纤维素的降解作用。2 0 0 5 年，n o v o z y m e 公司成 功地分离到一种由真菌“z ”分泌的蛋白质，这种蛋白可使纤维素酶的活性提高 一倍。 纤维素酶蛋白辅助因子的发现，为提高纤维素酶活性的探索开辟了一个崭 新的视角。 1 3 同步糖化发酵 1 9 7 7 年，t a k g t 首次报道了同步糖化发酵法。他将里氏木霉产生的纤维素酶 和酿酒酵母放在一个容器里，创造了边糖化边发酵的所谓同步糖化发酵法 ( s i m u l t a n e o u ss a c c h a r i f i c a t i o na n df e r m e n t a t i o n ，s s f ) ，俗称一步法1 3 2 1 。利用 木质纤维同步糖化发酵生产乙醇的过程如图1 2 所示。 慌銎詈麓写，琶开， ii - 百一。g ； i 7 纤维素酶系协同作用实验及重组酵母的同步糖化发酵 在同一容器中，加入纤维素材料、纤维素酶和酵母等乙醇生产菌，使纤维 素塘化产生的葡萄糖、纤维二糖和各种寡糖分子在第一时间被发酵成乙醇。s s f 法中常用的微生物是霉菌和酿酒酵母，主要特点是纤维素的糖化和糖的发酵在 同一装置内同时进行。 1 3 1 同步糖化发酵工艺的特点 由于糖化和发酵可在同一反应器里进行，s s f 节省了设备投资，反应时间可 缩短一半，大幅度减少了纤维素的酶解成本【3 3 l 。与纤维素糖化和乙醇发酵相继 进行的两步法相比，s s f 过程中，水解终产物葡萄糖不断被乙醇生产菌利用， 生成与消失几乎同步，消除了葡萄糖浓度的增加对纤维素酶的反馈抑制作用f 3 4 1 ， 增加了乙醇的发酵产率。乙醇的存在和p h 值降低使发酵过程污染杂菌的可能性 减少。而b 葡萄糖苷酶及时降解反馈抑制纤维素酶活的纤维二糖，减轻了酶解 中间产物对酶活性发挥的抑制，促进了酶促反应的动力学过程。 目前，同步糖化发酵转化纤维质生物材料成为乙醇的研究，距离实际应用 仍有一定差距，造成这一问题的原因有许多方面，主要表现在【3 5 】： ( 1 ) 纤维质原料预处理的能耗太高。目前尚未找到一种既经济又有效的方 法，使纤维质原料组分分离完全且纤维素降解很少。 ( 2 ) 木质素转化利用缺乏行之有效的技术。纤维素类物质中大多含有木质 素、半纤维素。木质素在预处理过程中绝大部分已经被除去。但半纤维素产生 的木糖存留在反应液中，当浓度达到9 时对纤维素酶的抑制作用可达1 0 。消 除木糖抑制的方法是和用能转化与利用木糖的菌株，如假丝酵母、管囊酵母等。 现在研究较多的是能利用葡萄糖与木糖的菌株混合发酵。 ( 3 ) 纤维素酶解与酵母合二为一的耦合技术还不太成熟，最为突出的是两 者的温度不协调。 ( 4 ) 纤维素酶的生产成本高，酶活力低，酶解用量大，生产技术不够成熟。 ( 5 ) 发酵产生的乙醇对纤维素酶的活性可能存在一定的抑制作用。 ( 6 ) 乙醇发酵产物浓度低，造成现有技术产物回收费用高。 同步糖化发酵虽然被认为是纤维素乙醇转化最有效的途径，可以使抑制纤 维素酶的水解产物葡萄糖和纤维二糖的积累降到最低。但常用作工业生产 的纤维素酶生产菌的8 葡萄糖苷酶在酶系中含量相对较低，而发酵体系中水解 纤维素酶系协同作用实验及重组酵母的同步糖化发酵 的中间产物纤维二糖只能通过b 葡萄糖苷酶来降解，因此发酵液中的纤维 二糖不能得到完全的降解。作为纤维素酶的竞争性抑制物1 3 4 州，纤维二糖的利 用或减少就成为提高酶解效率的重要环节。 1 3 2 同步糖化发酵的影响因素 同步糖化发酵的效率通常以乙醇产量来表示。由于发酵中存在多种影响因 素，乙醇浓度受到多方面的影响【3 刀。其中，发酵温度、底物浓度和酶液浓度是 影响较大的因素【3 2 】。 纤维素酶解与酵母糖化同时进行，最为突出的是两者的温度不协调。在s s f 过程中，表现纤维素酶的最佳温度为4 5 5 0 ，而乙醇发酵的最佳温度为2 0 4 0 。折衷两者的最佳温度得到的温度既不最适合发酵、也不最适合水解。美 国可再生能量研究所的i b a l l e s t e r o s 等人选用耐热酵母对提高s s f 过程的转化率 进行了研究，但由于酵母产酒能力较差而无法应用到实际生产中【3 8 ) 9 1 。 在工业生产中，发酵的乙醇达到5 为比较经济的蒸馏浓度，要达到这个浓 度最可简单的办法是提高底物浓度和酶液浓度m l 。理论上，底物浓度和酶液浓 度直接影响底物糖化后的总糖量，进而影响酵母的生长。由于纤维素材料在预 处理过程中，会产生糠醛、羟甲基糠醛等一系列酵母生长的抑制物【4 1 1 ，因而底 物浓度的一味提高会影响工业酵母的生长，继而降低乙醇发酵浓度。而高剂量 纤维素酶的使用会直接增加乙醇的生产成本。适宜的底物浓度和酶液浓度是同 步糖化发酵体系里基础的工艺标准。 1 4 酵母基因工程在乙醇生物转化技术中的应用 利用生物技术的基因工程构建发酵型基因工程菌，将可再生生物质资源转 化生产燃料酒精，是解决人类能源紧缺、走可持续发展道路的有效途径。转化 生产燃料酒精的基因工程菌有酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e ) 基因工程菌、 大肠杆菌( e c o l i ) 细菌基因工程菌 4 2 1 和运动发酵单孢菌( z y m o m o n a sm o b i l i s ) 基因工程菌1 “。 1 4 1 酿酒酵母工业菌株的转化体系 酿酒酵母是真核的模式生物之一。随着分子生物学技术的发展与应用，酿 酒酵母被广泛用于表达各种外源基因1 4 4 , 4 5 1 。作为乙醇生产的最佳菌株，酿酒酵 9 纤维素酶系协同作用实验及重组酵母的同步糖化发酵 母具有安全、厌氧条件生长、良好的酒精耐受性等许多优良的特性。此外，它 对一些生长抑制因子如乙酸、糠醛等的抗性也比其他酵母菌株高1 4 l l 。在对酵母 工业菌株进行改造时，为了实现外源基因的稳定表达，需要利用同源重组将外 源基因整合到酵母工业菌株染色体上。 高效的酵母转化体系的是实现外源基因表达的关键步骤芝l _ 1 4 6 1 。酿酒酵母 转化体系的筛选标记多为营养标记，其转化方法已十分成熟1 4 刀。由于用于大规 模乙醇生产的菌株都为工业菌株，这就需要以能适应粗放环境的工业生产酵母 菌株作为宿主菌。工业酿酒酵母菌一般是二倍体或多倍体，其细胞壁结构、生 理生化特性及遗传背景于实验室菌株相差很大，不宜建立营养缺陷型。因此常 规的酵母转化体系不再适用于工业菌株的基因工程操作。 近年来逐渐发展的不要求受体菌是营养缺陷型的酵母显性标记，如氨基糖 苷类抗生素g 4 1 8 抗性基因、铜离子抗性基因等的使用，使对工业酵母菌株的转 化成为可甜删。不同的工业酵母菌株对g 4 1 8 和铜离子的敏感程度各不相同，转 化方法也因菌株的不同而有差别。因此在对工业酵母菌进行基因操作时，首先 要针对各工业酵母菌不同的特性建立相应的转化体系。 王颖等【4 8 1 以三株工业酵母菌株s k 2 1 、s p s c 2 1 、n a n 2 7 为例，摸索并建立 了相应的转化体系，初步解决了工业酵母菌株转化的问题。酿酒酵母工业菌株 转化体系的建立，为工业菌株的基因改造并应用于工业化生产提供了方法基础。 1 4 2 利用纤维二糖的酵母工程菌的构建 纤维素酶是一种多组分的复合酶，多种酶组分协同作用才能将纤维素大分 子转化为葡萄糖。纤维素酶水解纤维素的中间产物纤维二糖是纤维素酶的 竞争性抑制物，会对纤维素酶的催化作用产生强烈的反馈抑带l j 3 “。已有研究表 明，纤维二糖对8 葡萄糖苷酶水解活性的抑制常数在0 1 1 1 0 m 之间，是非常 有效的抑制剂【3 4 1 。纤维二糖对纤维素酶的抑制作用主要表现竞争性地可逆抑制 外切葡聚糖酶的水解活性。以纤维寡糖做底物的实验表明，这种抑制作用可通 过8 葡萄糖苷酶对纤维二糖的水解有效解除。纤维二糖对纤维性底物的抑制作 用还涉及到它会影响纤维素酶对不溶性纤维素的吸附作用一j 。 乙醇的发酵体系中存在着一些未能被酵母消耗的糖，最常见且含量较高有 纤维二糖、蜜二糖等。由于作为糖化中间产物，纤维二糖对纤维素酶活性的抑 l o 纤维素酶系协同作用实验及重组酵母的同步糖化发酵 制，使其水解成为纤维素水解的限速步骤。而在利用纤维质原料生产乙醇时， 要有效酶解纤维素，需要提高b 葡萄糖苷酶酶活。将b 一葡萄糖苷酶像糖化酶一 样在乙醇生产中直接添加，虽能达到利用纤维二糖的目的，但生产成本也会受b 葡萄糖苷酶价格的影响。有效利用或减少乙醇发酵过程中产生的纤维二糖，具 有一定的实际意义。 若将b 一葡萄糖苷酶基因转化到工业酵母中并高效表达，可扩大酿酒酵母的 底物利用范围【5 0 l ，结合纤维素酶一起应用于乙醇发酵，可进一步提高出酒率， 同时对纤维素原料的高效利用也是一种新的探讨方式。 纤维素酶系协同作用实验及重组酵母的同步糖化发酵 第二章纤维素酶各组分的协同作用实验 2 1 导言 在纤维素的降解过程中，纤维素酶系各组分之间的协同作用是一个普遍存 在的现象【5 1 1 。因此在各种纤维素降解机理的假设中，普遍被接受的是协同理论。 真菌纤维素酶合成后分泌到胞外，它们对纤维素的降解通过内切葡聚糖酶 ( e n d o g l u c a n a s e ，e g ) 、外切葡聚糖酶( c e l l o b i o h y d r o l a s e ，c b h ) 和8 葡萄糖 苷酶( b g l u c a n a s e s ，g e ) 之间的协同作用共同完成。 协同作用是指纤维素酶各组分混合物显示的活性，比它们单独作用时活性 的加和还要高。通常用“协同系数”( d e g r e eo f s y n e r g i s m ，d s ) 来定量表示正 协同的程度，即各组分混合物的活性除以组分单独作用时的活性之和p “。一般 来说，协同作用与底物的结晶度成正比1 5 3 】。除了实验过程中所使用底物的特征， 实验条件也会影响到协同系数的测定1 5 4 1 。 协同作用的作用顺序不是绝对按各酶的功能，也不是简单固定的。c b h 和 e g 都能引起纤维素的分散和脱纤化，从而打乱纤维素的结晶结构使其变形。这 样纤维素酶就可以深入纤维素分子界面之间，增大纤维素孔壁、腔壁和微裂隙 壁的压力；水分子的介入又使纤维素分子之问的氢键被破坏，产生部分可溶性 纤维的微结晶，利于进一步降解【5 5 】。 纤维素酶系各组分之间的协同作用大致可以分为五种类型1 2 0 l ：同种类型酶 组分的协同作用，如内切一内切葡聚糖酶( e n d o g l u c a n a s ea n de n d o g l u c a n a s e ) 、 外切一外切葡聚糖酶( e x o g l u c a n a s ea n de x o g l u c a n a s e ) ；不同类型酶组分之问 的内切一外切协同作用，如内切一外切( e n d o g l u c a n a s ea n dc x o g i n c a n a s e ) 、外 切或者内切葡聚糖酶与b 葡萄糖苷酶( e x o g l n c a n a s eo re n d o g l u c a n a s ea n db - g l u c o s i d a s e ) ；酶组分内部区域之间的协同作用，如催化区域- - c b m ( c e l l u l o s e b i n d i n g m o d e l ) 、两个催化区域分