（细胞生物学专业论文）人工诱发烟草类根瘤的生理生化研究.pdf

摘要 人工诱发烟草类根瘤的生理生化研究 摘要 我们以只在共生体系中才有固氮活性的突变型豇豆根瘤菌5 1 2 ( r 1 e g u m i n o s a r m ) 和全国推广种植的烟草k 3 2 6 组建共生固氮体系，使用化学 合成的植物激素2 ，4 d 人工诱导烟草根系，使其结瘤。我们对烟草k 3 2 6 无菌 苗叶片经组织培养产生的再生苗进行了以下4 种处理( c k ：使用不含2 ，4 一d 和根瘤菌的常规j e n s e n 无氮培养液处理：d ：使用只含有0 3 m 鲫2 ，4 一d 的j e n s e n 无氮培养液处理；r ：使用只含有5 1 0 8 个l 根瘤菌的j e n s e n 无氮培养液处理： d + r ：使用同时含有0 3m 矾2 ，4 - d 和5 1 个几根瘤菌的j e n s e n 无氮培养 液处理) 。 在实验中，我们测定了以上四种处理对不同发育周期烟草不同组织来源的 超氧化物歧化酶( s o d ) 的活性。丙二醛( m d a ) ，可溶性蛋白和叶绿素含量 以及根尖细胞染色体的影响。研究结果表明，使用2 ，4 d 处理后，在处理前 期( 第一至第三周) 抑制了烟草茎和叶细胞中m d a 的积累，诱导其可溶性蛋 白含量和s o d 活性的升高；在处理后期( 第四至第五周) ，2 ，4 d 则加速了烟 草茎和叶细胞中m d a 的积累、可溶性蛋白和s o d 活性的下降，并且加快了烟 草叶片中叶绿素的降解，但是却抑制烟草根细胞m d a 的积累：仅用根瘤菌处 理，在第一至第三周促进烟草根茎叶细胞中m d a 积累，诱导烟草s o d 活性和 可溶性蛋白含量的升高，随着时间的延长，根细胞中的m d a 含量下降并且低 于对照，而且此时根瘤菌促进烟草根茎叶细胞中可溶性蛋白含量和s o d 活性的 下降；并且在处理第一周促进烟草叶片叶绿素的合成，随着处理时间的延长， 却加速烟草叶片时绿素的降解：在我们用2 ，4 d 和根瘤菌共同处理的烟草幼 苗中，其不同发育时期根茎叶的m d a 含量的变化与仅使用2 ，4 d 或根瘤菌处 理的不尽相同。在处理第一和第二周，共同处理加速了烟草各组织中m d a 的 积累，并且促进各组织中s o d 活性的升高，然而此时却抑制烟草叶片叶绿素的 摘要 合成，随着处理时间的延长，共同处理的烟草各组织中m d a 虽然仍然呈上升 趋势但含量低于对照，此时各组织中s o d 活性都要高于对照，但是却加速烟草 叶绿素的降解。我们的实验还发现在不同处理后，首先受害的是烟草根细胞， 其次是茎最后是叶。我们的实验结果还表明各处理组在第二周时均促进了烟草 根尖细胞的分裂，其中又以用根瘤菌和2 。4 一d 共同处理对烟草根尖有丝分裂 指数促进最为明显，随着时间的延长，在第三至第五周，各处理均明显抑制烟 草根尖细胞有丝分裂指数，并且导致不同程度的染色体畸变。因此，在我们实 验条件下，用植物激素2 ，4 一d 人工诱导根瘤菌侵染烟草形成类根瘤在其生长 初期对烟草生长具有抑制作用，随着时间的延长，则能延缓烟草幼苗的衰老。 关键词：烟草；类根瘤；2 。4 - d ，根瘤菌；超氧化物歧化酶( s o d ) ；影响 t h es t u d i e so f p h y s i o l o g y a n d b i o c h e m i s t r yo n a r t i f i c i a li n d u c e dt o b a c c op a r a n o d u l e a b s t r a c t w es e tu pt h es y m b i o t i cn i t r o g e n f i x a t i o ns y s t e mw i t hm u t a n to f f a s t - g r o w i n g s t r a i ni n 兄印v 辔n 仉t h a t j u s th a v en i t r o g e n f i x a t i o na c t i v i t yi nt h es y m b i o t i cs y s t e m a n dt h et o b a c c ok 3 2 6t h a tb ee x t e n d e d p l a n t a tt h ew h o l e c o u n t r y ，a n du s e d t h e p l a n t h o r m o n e2 , 4 一da n i 丘c i a li n d u c e dt o b a c c op a r a n o d u l e w ec a r r i e do nf o l l o w i n g4 k i n d so ft r e a t m e n tt ot h er e g e n e r a t e dt o b a c c ok 3 2 6 p l a n f l e t s ，w h i c hw e r ep r o d u c e d f r o mt h e1 e a v e so ft h es t e r i l es e e d l i n go ft o b a c c o ( c k ：n a t i v ej e n s e n n o n n i t r o g e n m e d i u m ；d ：j e n s e nw i t ho 3 r a g l 2 ，4 一da l o n e ；r ：j e n s e nw i t h5xl o s lr h i z o b i u m a l o n e ；d + r ：j e n s e nw i t h0 3 m a l l 2 ，4 da n d5 1 0 札r h z o b i u m ) no u re x p e r i m e n t ， e f f e c t so nt h ea c t i v i t yo fs u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) a n dt h ec o n t e n t so fm d a 、 2 摘要 s o l u b l ep r o t e i nc h l o r o p h y l la n dc h o r o m o s o m ei nt o b a c c o s1 e a f 、s t e ma n dr o o ta t d i f f e r e n tt r e a t m e n t sa n df o rd i f f e r e n tt i m ew e r es t u d i e d ， t h er e s u l ts h o wt h a t2 ，4 一di n h i b i t e da c c u m u l a t i o no fm d a i nt h et o b a c c o ，s t e m a n dl e a fc e l l ，i n d u c e dr i s eo fc o n t e n to fs o l u b l ep r o t e i na n d a c t i v i t yo fs o d ( t h ef i r s t w e e kg ot ot h et h i r d w e e k ) ；i nl a s tp e r i o d ，2 , 4 一da c c e l e r a t e dt h ed e c r e a s eo ft h e c o n t e n to fm d aa n ds o l u b l ep r o t e i na n da c t i v i t yo fs o dt h a to f e a c ho r g a n i z a t i o n o ft o b a c c o ；c o n t e n to fm d aw i t hr h i z o b i u ma l o n et r e a t m e n ti sa l w a y sh i g h e rt h a n t h a to fc ka tt h ed i f f e r e n tg r o w t hi nt o b a c c or o o t ，s t e ma n dl e a fc e i l s ，a n dr h i z o b i u m c o u l di n d u c ea c t i v i t yo fs o da n dc o n t e n to fs o l u b l ep r o t e i nt og ou pi nt h ef i r s ta n d t h es e c o n dw e e k w i t ht h ee x t e n s i o no ft i m e ，t h ec o n t e n to fm d ad e s c e n da n dl o v q e r t h a nt h a to fc ki nt h er o o tc e l l ，a n dr h i z o b i u mc o u i dp r o m o t ed e s c r e a s eo fs o l u b l e p r o t e i nc o n t e n ta n ds o da c t i v i t yo ft o b a c c or o o t ，s t e ma n dl e a fc e l l s ，a n dc o u l ds t i l l i n h i b i tt h et o b a c c oc h l o r o p h y l ls y n t h e s i sa tt h ep r o p h a s eo ft r e a t m e n t ( t h ef i r s tw e e k g ot o t h es e c o n dw e e k ) ，b u tt h er h i z o b i u ma l s oc o u l dd e c e l e r a t et h e c h l o r o p h y l l d e s t r o y e dw i t ht h e e x t e n s i o no ft i m e ；a st h et o b a c c od i s s i m i l a r i t y d e v e l o p s ，t h e v a r i e t yo f t h ec o n t e n to fm d aw e r et r e a t e dw i h2 4 - da n dr h i z o b i u md i d n ta c h i e v e t ot h eu t m o s ta sw i t ht h eu s eo fo n l ye i t h e r2 , 4 一do rr h i z o b i u mt r e a t e d ，a tt h e p r o p h a s et r e a t m e n t ，t h ec o m m o np r o c e s s i n ga c c e l e r a t e de a c ho r g a n i z a t i o no ft o b a c c o i nt h em d a a c c u m u l a t i o n ，a n ds t i m u l a t e ds o l u b l ep r o t e i nc o n t e n ta n ds o d a c t i v i t y o fe a c h o r g a n i z a t i o n t o g ou p h o w e v e r , a t t h i st i m ei ti n h i b i t e dt h et o b a c c o c h l o r o p h y l s y n t h e s i sw i ht h ee x t e n s i o no ft h et i m e be a c ho r g a n z a t i o no f t o b a c c o o ft h ec o r n n o np r o c e s s i n g ，a l t h o u g ht h ec o n t e n to fm d as t i l lp r e s e n t e dt h eu p t r e n d b u tl o w e rt h a nt h a to fc ka tt h i st i m e a c t i v i t yo fs o dw a sa l lh i g h e rt h a nt h a to f c ki ne a c ho r g a n i z a t i o n a f t e rd i f f e r e n tt r e a t m e n t w es t i l ld i s c o v e r e dt h a ti tw a st h e t o b a c c or o o tc e l lt h a tw a sv i c t i m i z e da tt h ee a r l i e s t t h es t e me e l lw a ss e c o n dt oi ta n d t h el e a fc e l tw a sv i c t i m i z e da tt h e1 a t e s t t h er e s u l t ss t i l ls b o wt l 】a tm i t o t i ci n d e xo f t o b a c c or o o te e l lw a s p r o m o t e di n c r e a s ew i t hu s eo f d i f f e r e n tt r e a t m e n ta tt h es e c o n d w e e k t h em i t o t i ci n d e xo ft o b a c c or o o te e l lw a s p r o m o t e dm o s to b v i o u s l yw i t hu s e o f2 ，4 一da n dr h i z o b i n mt r e a t m e n ta m o n gt h e m a l o n gw i t ht h ee x t e n s i o no ft i m e ， 3 摘要 m i t o t i ci n d e xo ft o b a c c or o o te e l lw a si n h i b i t e do b v i o u s l yi nd i f f e r e n tt r e a t m e n t a n d c a u s e dt h ec h r o m o s o m em u t a t i o no fd i f f e r e n td e g r e e t h e r e f o r e ，a c c o r d i n gt oo u r e x p e r i m e n t ，w h e nu s i n gp l a n th o r m o n e2 , 4 - da r t i f i c i a li n d u c e dt o b a c c op a r a n o d u l e h a d c e r t a i n l ys t i m u l a t i v ef u n c t i o na tt h ee a r l yp e r i o d ，t h e ni ti sh a r m f u l t og r o w t ho f t h et o b a c c ow i t ht h ee x t e n s i o no ft i m e k e yw o r d s ：t o b a c c o ；p a r a - n u d u l e ；2 , 4 一d ：r h i z o b i u m ；s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ；e f f e c t 4 文献综述 1 文献综述 1 1 超氧化物歧化酶的研究 1 1 1 超氧化物歧化酶的种类、分布 超氧化物歧化酶( s o d ) 是在生物学中普遍存在的一种含金属的酶类，作 为植物抗氧化系统的第一道防线，清除细胞中多余的超氧根阴离子。在高等植 物中，s o d 根据活性位点所含金属离子的不同可以分为c u z n s o d 、m n s o d 、 f e s o d 三种同功酶【“。但最近k i m 等发现在链霉菌天蓝菌( s t r e p t o m y c e s c o e l i c o l o rm u l l e r ) 中还存在有两种新的s o d ：n i s o d 和f e z n s o d 3 1 。 c u z n s o d 对氰化物和h 2 0 2 均敏感；m n s o d 对氰化物和h 2 0 2 均不敏感； f e s o d 对氰化物不敏感但对h 2 0 2 敏感。并以此作为最初的分类生化依据【4 】。 每一种同功酶在不同植物中或同一种植物不同组织中数量变化很大，而且相对 丰富度也不一样，如叶绿体s o d 在绿色叶子中含量丰富，在萌发的幼苗和黄化 材料中胞质和线粒体s o d 较多【5 j 。 对s o d 基因家族的深入研究是在玉米中进行的，已得到的序列分析表明， 广泛存在于真核生物中的c u z n s o d 与m n s o d 和f e s o d 不同源，已证明真 菌和动物都有c u z n s o d 、m n s o d ，而少数植物和细菌除了含有c u z n s o d 、 m n 。s o d 外还含有f e s o d 。植物s o d 同功酶亚细胞定位不同，典型的是 c u z n s o d 在质体和胞质，其中有几种胞质c u z n s o d 同功酶，但是在叶绿体 中只有一种，胞质c u z n s o d 的同功酶分布在不同的亚细胞区域，在核、液泡、 过氧化物酶体、质体中已有发现1 6 “i 。s o d 同功酶在系统发育上的分布和亚细胞 定位为真核生物的叶绿体及线粒体起源于原核生物内共生的假说提供了有力的 证据。几乎在所有的植物中，叶绿体含有的c u z n s o d 都是作为最主要的s o d 同功酶。有的植物如烟草叶绿体中存在f e s o d 。在含有f e s o d 的植物中， f e s o d 只存在于叶绿体基质中，叶绿体中过多表达f e s o d 的烟草转化体获得 文献综述 了对光氧化胁迫的抗性，在蓝细菌中f e s o d 位于胞质中，缺失f e s o d 的硅藻 ( s y n e c h o c o c c u s ) 突变体对光氧化胁迫敏感，并且与缺失叶绿体c u z n s o d 的 烟草一样，它的p si 复合物失活【9 】，这些结果表明f e s o d 也连接在类囊体膜 上，在活性氧扩散到基质或细胞质之前，进行原位清除j 1 0 】，m n s o d 一般存在 线粒体基质中【1 l j ，在过氧化酶体和胞外也有s o d 存在 1 2 1 。但在生物学上不易 得出一个高度普遍性的原则，仍就此问题进行研究。例如，k a r p i n s k a 蝤j 等发现 一种高等电点的胞质c u z n s o d ，其位置在筛胞和胚乳细胞中不同，并且也存 在于细胞外，高的氧胁迫促进胞外s o d ( e c s o d ) 向核内转运，以保护基因 组d n a 5 6 1 。 1 1 2s o d 的分子结构与理化性质 1 1 2 1 c u z n s o d 的结构与理化性质 到目前为止，已经完成全部氨基酸序列分祈工作的c u z n s o d 不下3 0 种， 不同来源的c u z n s o d 在氨基酸序列上显示出明显的进化保守性和高度的序列 同一性。在1 5 0 多个氨基酸组成中，有1 9 个氨基酸是完全不变的，另外有1 9 个也近乎不变。c u z n s o d 结构的同一性还进一步表现在：( 1 ) 与金属辅基相 连和参与肽链内部二硫键形成部位附近的氨基酸残基相同；( 2 ) 富含甘氨酸残 基；( 3 ) 氨基酸序列中都有一个超可变区，共有2 3 2 5 个残基，从x 射线晶体 结构分析表明，这个超可变区位于分子的主要结构表面部分，可能与酶的免疫 学性质有关。与此相对应，在c 末端有一序列同一性更高的区域，在此区域有 一精氨酸( a r 9 1 4 1 ) 对酶活力起关键作用。m n s o d 与c u z n s o d 的氨基酸组成 差异较大。如甘氨酸含量降低，酪氨酸与色氨酸含量高。魏俊发1 1 9 垮人对几种 不同来源m n s o d 氨基酸序列测验表明：不同来源的m n s o d 具有不同的氨基 酸组成和顺序。 b a n n i s t e r 等通过旋光色散( o r d ) 、圆二色性( c d ) 和红外( i f ) 光谱的 分析研究，表明c u z n s o d 的两个相同亚基之间是通过非共价的疏水相互作用 而缔合，共有1 2 1 4 个疏水的氨基酸残基的侧链提供了范德瓦力。肽链内部由 文献综述 半胱氨酸( c ) 5 5 和1 4 4 的s h 基之间构成的二硫键，对于亚基的缔合起重要作 用。整个结构特征是由八股反平行的1 3 一折叠围成的圆桶状结构，称之为1 3 一桶( 1 3 b a r r e l ) 、其一侧上有两个无代表性结构的环( 1 0 0 p ) 在牛红细胞c u z n s o d 亚基 中，c u 分别与四个组氨酸残基( h “，4 6 ，6 1 ，1 1 8 ) 配位，而z n 则与三个h ( h 6 1 ，6 9 ，7 s ) 和一个天冬氨酸f d 8 1 ) 配位，c u 、z n 之间相距约0 6 r i m c u z n s o d 的结构已经比较清楚，与m n 和f e s o d 不同，不同植物间叶绿 体c u z n s o d 的氨基酸组成有8 0 9 1 的同源性，线粒体和胞质中的 c u z n s o d 只有6 0 6 8 的同源性【1 7 ”j ，而不同植物的线粒体m n s o d 的蛋 白氨基酸组成有7 4 8 8 的同源性。c u z n s o d 在一级结构上与m n 和f e s o d 明显不同，在构象上必然表现出差异c u z n s o d 含a 螺旋成分很少，主要是1 3 折叠，与此相反，m n 和f e s o d 含有较多的q 螺旋( 3 2 ) ，b 折叠较少构象研究 还表明，m n 和f e s o d 中不可能存在像c u z 1 1 s o d 中的那种八股反平行的0 折 叠也不存在长的松散环，整个结构比较紧凑 l 1 2 2 m n s o d , f e s o d 的结构与理化性质 f e s o d 和m n s o d 两种酶蛋白具有结构上相似性。m n s o d 在真核生物 中为四聚体，在原核生物中多为二聚体大多数f e s o d 为二聚体，这两种s o d 的 许多性质都很相似每个亚基的分子质量一般为2 3 k d ，大于c u z n s o d 亚基得分 子量，每个亚基含o 5 1 0 个m n 或f e 原子。f e s o d 的结构特征是不含c y s ，含 有较多的t r p 和t y r 。因此紫外吸收光谱类似一般蛋白质，在2 8 0 n m 附近有最 大吸收峰，m n s o d 的可见光吸收光谱在4 7 5 n m 附近有最大吸收，f e s o d 在 3 5 0 n m 处有最大吸收，这都反映了所含金属离子的光学性质。 m n s o d 晶体和f e s o d 晶体的电子密度图分辨率分别为0 1 8 n m 和 0 2 1 n m ，在活性中心以及金属配体附近的结构上，二者很相近。每个亚基包含 两个结构域，一个结构域由三个d 螺旋组成，另一个结构域由三个a 瑚；旋和一 个b 折叠组成。金属结合位点就在这两个结构域之间。围绕活性中心的是几个 保守的芳香氨基酸，其中有三个t r p 、三个t y r 和两个p l a e ，都在距金属离子l n m 的范围内。f e s o d 中的第9 0 位氨基酸残基是 r y r ，m n s o d 则是p h e ，两者都 围绕活性中心，作用相似。 7 文献综述 1 1 2 3s o d 的活性中心 在0 3 n m 分辨率的基础上，1 9 8 0 年获得的牛红细胞s o d 的0 2 n m 分辨率 电子密度图，可以比较详细地看清活性中心附近的排列。结合底物0 2 一的是 一个椭球型的“口袋”，长1 5 n m ，宽0 9 r i m ，深0 6 n m ，口袋外缘一边是由苏 氨酸( t h r 3 1 5 ) 、甘氨酸( g l y l 3 6 ) 、丙氨酸( a l a l 3 8 ) 和甘氨酸( g l y l 3 9 ) 组 成。另一条边由甘氨酸( g 1 y 5 9 ) 、脯氨酸( p r 0 6 0 ) 、组氨酸( h i s 6 1 ) ，以及苯 丙氨酸( p h e 6 2 ) 和天冬酰胺( a s p 6 3 ) 组成。赖氨酸( l y s l 3 4 ) 和精氨酸( a r g l 4 1 ) 的侧链构成口袋的两侧。口袋底部排列着c u 、z 、天冬氨酸( a s p 8 1 ) ，以及 h i s l l 8 、h i s 4 4 、h i s 7 8 和h i s 6 9 。r o t i l i o 等应用顺磁共振、核磁共振以及化学修 饰等手段，获得了不少关于s o d 活性中心分子，原子，以及电子信息的信息。 通过光敏氧化和次级自由基对s o d 的失活测验，表明与c u 配位的n 原子来自 组氨酸的咪唑环，用组氨酸特异性的化学修饰剂乙氧基甲酸酐进行修饰实验说 明，至少有三个组氨酸与c u 配位，同样证实z n 也有三个组氨酸配位，c u 和 z n 之间通过共同连接一个组氨酸( h i s 6 1 ) 而形成所谓“眯唑桥”结构。在“眯 唑桥”结构中，咪唑环几乎与c u ，z n 金属离子在一个平面上，仅向c u 侧倾斜 了约0 0 3 n m ，所有的五个非配位的咪唑氮和非配位的d 8 1 羧基中的氧都是氢键 相连，而h 6 1 的眯唑基的毗咯氢以被除去，允许同时和c u 、z n 相配位。活性 中心“袋”的分子表面积约6 6 r i m ，它是由主键和不变的侧链原子组成，参与“袋” 组成的氨基酸具有相应的不变性，这说明活性袋的形状对酶的功能起着关键的 作用。在“袋”的底部最狭窄的部位有两个深洼，即形成了特殊键合位置：“c u 位”和“水位”，这是活性中心中最关键的部位。归纳出c u z n s o d 活性中心结 构有这样两个特点：1 ) z n 2 + 周围环境拥挤，z n 2 + 并不裸露在溶剂中，不直接与 0 2 作用。z 1 1 “的作用还在于固定“活性袋”的主链和侧链，对于维持s o d 的构 象是必不可少的。2 ) c u 2 + 是五配位，三肽h i s 4 4 v a l 4 5 h i s 4 6 的两个咪唑基 占据了c u 配位平面的反应，正是由于c u 处于这样的歧变配位空间环境下，使 得c u 2 + 的氧化电势达0 4 2 v ，远高于含水溶液中c u 2 + 的氧化电势，所以说c u 2 + 对催化0 2 的作用机理有其特殊性。经研究结果表明【2 1 l 在催化过程中与c u 2 + 相 距6 a 的a r g l 4 1 具有重要作用。如果该酶残基被修饰，大部分正电荷消失，不 利0 2 的进入，酶活性降低9 9 。也有研究表明c u “与z n 2 + 对活性中心的作用 文献综述 亦不同，c 1 1 2 + 是必需的，任何金属取代c u 2 + 都可能使酶失活，而z n 2 + 被c 0 2 + ， h g + ，c d 2 + 取代而不影响酶活性1 2 1 1 。 m n s o d 活性中心，每个m n 2 + 都是具有五配位的三角双锥结构，其中一个 轴向配体为水分子，来自蛋白质辅基的4 个配位基位h i s 2 8 ，h i s 8 3 ，a s p l 6 6 和 h i s l 7 0 。后三个配位基位于赤道平面，h i s 2 8 的咪唑基则占据着另一个轴向位置。 活性部位处在一个主要由疏水残基构成的疏水壳子里，两个亚基链共同开成一 个通道，该通道终止于金属离子附近的t r y 3 6 和h i s 3 2 残基，是底物或其他内 界配体接近m , a 2 + 的经由之路。i - i i s 3 3 、t r p 3 7 、 - i i s 8 3 和t r y 3 6 形成一个疏水口袋， 该口袋构成底物结合部位。其它来源的m n s o d 活性部位的m n 2 十离子的配位情 况基本相似卅 m n s o d 晶体f 矧的电子密度图分辨率为0 】8 n m ，显示活性中心及金属一配 体簇附近的结构。每个亚基包括两个结构域。一个结构域由三个a 螺旋和b 一 折叠组成。金属结合位点就在这两个结构域之间。围绕活性中心的是几个保守 的芳香族氨基酸，其中有三个酪氨酸，其中有三个酪氨酸，三个色氪酸和两个 苯丙氨酸，都在距金属离子l n m 的范围内。 f e s o d 由2 个亚基组成，每个亚基各含1 个铁，相对分子量3 8 0 0 0 左右。 f e s o d 晶体f 2 4 1 的电子密度图分辨率为0 2 1 r m a 。f e s o d 和m n s o d 尽管在一 级结构和空间结构显示了很大的相似性，但毕竟还有区别。b a r r y 等1 2 5 1 对f e s o d 的活性中心结构作了详尽的描述，认为催化金属拥有一个扭曲的三角双金字塔 结构，也可描述为扭曲的四面体，f e 与蛋白配体的结合是不对称的，其中三个 配基在一个平面上，它们是h i s 7 4 ，a s p l 5 6 和i - i i s l 6 0 ，而第4 个配基h i s 2 6 为 金字塔顶。f c 位于离平面0 5 a o 处，趋向于h i s 2 6 但远离开放的金属结合位置。 在一级结构上，也有几个位置的氨基酸对m n s o d 、f e s o d 分别是专一的，由 此可区别两者【2 6 1 f e ，s o d 中8 3 位和1 6 0 位氨基酸在空间结构上相距很近，为了适应这个结 构，其8 2 、8 3 位分别是a l a 和g l n ，则在1 6 0 位是体积较小的赳a 。t r y 8 5 是对 f e s o d 专一的氨基酸，正是因为此，i r e s o d 才对h 2 0 2 敏感。 9 文献综述 1 1 3s o d 的催化机理 三类s o d 的催化机理基本相同，但其中c u z n s o d 比m n s o d 和f e s o d 更稳定，并容易制各，各种来源的c u z n s o d 构造容易搞清楚而且有c l l 2 + 和z n 2 + 以及“咪唑桥”特殊结构，有利于采用理化方法探究其作用，因此，常以 c u z n s o d 作为对象研究s o d 的催化反应机理。 s o d 与一般酶催化反应相比，在于其底物是一种寿命极短的自由基0 2 一， 这给s o d 的反应动力学研究带来了很大困难，对s o d 中金属离子的氧化与还 原研究是探讨活性中心结构的重要方面。目前，不少事实确证c u z n s o d 催化 作用过程中c u 2 + 的还原与氧化，但其机理毖无一致结论，主要有以下两种不同 的假说：( 1 ) 有学者认为i 7 1 2 个0 2 - 的电荷相同，故很难接近，但通过c u “的 配位，可加速0 2 一的歧化。 桅理l ： b k s o d c 。+ 也- - s o d - c u 一侥 o ： o ! 一 s 0 0 一c u + 仉+ 2 8 - - s 一c o 十h 热 帆理i i ： e - c u 一吼一e - c u - 0 , 。 e - c u - 0 , 。+ 0 ；1 + 2 旷- - e - c u 。h ：q + 嗥 目前讨论研究最多的为i 反应机理，还未见到过对h 反应机理的研究报道。张 静怡、司徒仲意i 砧】从氧化还原电位及电极电位阐述了s o d 中c u 2 一与c i 】+ 相对 稳定，可以互相变换，它们是良好的电子传递体，可以自发发生。 ( 2 ) 另一些些学者【2 9 】认为s o d 催化0 2 - 不能仅用简单的配位理论来解释，而 认为c u 2 + 与z n 2 + 相连的眯唑桥起重要作用。 1 0 一! p t m 滞嘲一a 占蔓, r z p l m c 璩碡罄) c u 一 i l m il z - l m i l + c + o l i入 l mi m i m l 1 一z 一一k c - ”，l 1 0 。 i 。al l _ 啪， l m b n 一7 。这示意图表明咪唑桥”并非刚性的固定结构，而是一种柔韧灵活的连接方式， 在0 2 - 与h + 的作用下可以暂时断开，但又在另一o z 一作用下，可以恢复“眯 唑桥”原来结构。正由于“咪唑桥”这一性质，c u z n s o d 才发挥对0 2 一的歧 化作用。 在c u z n s o d 的催化反应中，两个亚基虽独立催化0 2 一歧化，但它们的相 互作用是不可忽视的。在辐射所致c u z n s o d 失活过程中，一个亚基的失活可 诱导另一个亚基的失活，从而导致2 个亚基都失活。m n - s o d 和f e - s o d 的催 化作用研究进展不及c u z n s o d 。虽然许多方面尚不知道，但两类酶的共同都 涉及活性部位内金属离子的交替还原或再氧化，其通式为： e m ( n ) + 0 # 1 ，- 。( n i ) ( b e 一2 ( l 一1 ) 一0 。”e m ( n ) * l - i tm 反应生成的过氧化氢在过氧化氢酶作用下，转化为机体无害的物质 2 “? 钒! ! ! 竺 2 愀o + 0 ： m r f b 兰：兰：!- 2 鲥：魄t 窿 这有效的防止了活性氧( 包括0 2 、o h 、h 2 0 、0 2 ) 对生物体的毒害。 1 1 4s o d 在植物逆境和衰老生理中的作用 植物由于其生长过程中的相对固定不变的位置，在自然界中更易受到强光、 干旱、高温、低温、辐射等各种外界因子的胁迫，已知这些逆境条件都能通过 文献综述 r o s 的提高而对植物细胞带来伤害，又因为农作物抗逆境是生产上倍受关注的 问题，因而植物的s o d 研究亦受到重视。 1 1 4 1 植物衰老与s o d 的关系 自由基衰老学说是人体与动物衰老机理众多学说之一。该学说认为衰老过 程即是活性氧代谢失调积累的过程。植物衰老的研究亦获得与此相似的结果。 在植物衰老期间s o d 、c a t 活性下降，氧吸收量增加，有利于形成更多的0 2 一、 h 2 0 2 、h o 和1 0 2 等活性氧。豆类植物叶片中0 2 - - 含量随衰老进程而增加【3 0 】。 衰老早期s o d 能有效地清除0 2 ，衰老后期s o d 则不能有效的清除0 2 一，因 而很容易引发氧化性破坏作用。 不同生育期叶片s o d 活性具有明显差异。例如：白杨上部叶片s o d 活性 分别比中、下部叶约高1 到1 0 倍0 2 一。2 日龄菜豆叶片s o d 活性比9 日龄地 高9 倍。水稻叶片自灌溉浆期到成熟期s o d 、c a t 活性显著下降，过氧化物含 量则迅速上升 3 1 】。4 0 展开地食荚菜豆叶片s o d 活性为全展叶地2 3 倍。燕麦 吲叶片切段在暗中保温4 天后其s o d 和c a t 活性分别下降1 4 和5 0 。许多 研究表明，在叶片s o d 、c a t 活性随衰老而下降，0 2 一等活性氧随衰老而增加 地同时伴有丙二醛( m n a ) 和脱落酸( a b a ) 含量的上升，即膜脂过氧化的加 强。此规律很普遍，已在水稻1 3 1 】、燕麦【3 2 】等植物叶片的衰老研究中被证实。伍 泽堂【3 4 】等研究发现，水稻叶片衰老过程中，k t 含量下降，a b a 、m d a 积累， 以致s o d 活性下降。认为这可能是k t 含量的下降，导致对s o d 激活以及对 a b a 抑制s o d 活性的抗拮作用减弱，同时a b a 和m d a 的积累增强了对s o d 活性的抑制作用。很多研究表明，植物衰老期间膜脂过氧化加强的原因在于活 性氧含量的上升，故利用自由基清除剂如v t e 、乙醇等能够有效地抑制衰老叶 片s o d 、c a t 活性的下降和m d a 的增加，而应用细胞激动素、赤霉素、6 - b a 、 2 ，4 d 也能保持高水平的s o d 和。叮活性，减少m d a 的积累量，抑制膜脂 过氧化作用，进而延缓衰老1 3 4 3 8 j 。众所周知，去掉植株主茎顶端能延缓衰老， 机理之一在于该措施能大大提高或恢复衰老叶片的s o d 、c a t 活性，降低其 m d a 含量。这些结果表明，植物叶片的衰老过程就是s o d 、c a t 活性下降， 0 2 - 活性氧积累，膜脂过氧化作用不断加强的过程。 文献综述 关于衰老中活性氧代谢的变化在种子【3 9 】和果实m4 1 】中亦有报道。一般随种 子衰老的发展，其s o d 、c a t 活性不断下降。 1 1 4 2 植物s o d 与低温胁迫的关系 低温能增加植物体内0 2 一等活性氧含量，降低s o d 活性，加强膜脂过氧 化作用【42 1 。在1 0 1 2 c 的低温下，青萍细胞内保护酶的调节功能发生了紊乱。 其s o d 的活性同最适温度的相比开始降低，处理对间延长，降低越明显。处理 1 5 天时，大约降低了4 0 1 4 3 1 。吴建慧i “瞎在对玉米的研究中发现，在不同低温 处理的s o d 活性变化存在差异。2 c 低温处理的幼苗，其s o d 活性在胁迫的初期 下降速率较慢，从第三天迅速下降，比对照下降2 4 和4 4 。而8 低温处理的幼 苗，其s o d 活性在胁迫的初期先升高后下降，且下降速率较慢，到第5 天比对照下 降2 6 和4 6 。2 低温胁迫下的s 0 d 活性明显小于8 c 低温胁迫下的s o d 活 性，两者差异达极显著水平。低温下植物s o d 活性下降率与植物品种本身抗寒性 有关，如抗寒性强的黄瓜品种子叶的s o d 活性分别比抗寒性差的品种少下降 3 0 4 、3 3 0 、5 2 7 4 5 。还发现低温下植的s o d 活性大小与膜脂过氧化强弱 之间呈高度负相关。从水稻叶片i 4 6 】不同细胞器的s o d 活性及其网功酶谱对低温 反应的敏感性研究可知，叶绿体s o d 对低温反应最敏感，线粒体s o d 次之， 细胞质s o d 较迟钝。 低温与光照同时作用对植物s o d 影响更显著，例如越冬期间遮阴的红松苗 针叶s o d 活性比全光照的约高三分之二【4 7 】；水稻叶片在黑暗中低温处理，其 s o d 活性约降低1 0 ，而光下低温处理的则下降2 0 - 3 0 1 1 7 1 ：此与有无光诱 导的膜脂过氧化有关。而s c h o a e r 和k r a u s e l 郇j 亦发现，菠菜在1 c ，2 6 0 3 0 0 p t o o l - 1 3 3 2 s - 1 光强下锻炼可降低叶子对低温光胁迫的敏感性，其抗冻性的发展 与叶绿体s o d 、抗坏血酸过氧化物酶的活性等的提高有关，认为冷驯化的植物 中增加了对0 2 。和h 2 0 2 清除系统的能力，加之色素组分的变化，从而增强了光 合器官在低温光胁迫下对抗活性氧毒害的保护作用。 t a k a h a m 【4 9 1 等研究发现经低温黑暗处理的菠菜叶片中，叶绿体在光照下能 诱导不饱和脂肪酸的过氧化和过氧化产物m d a 的形成，m d a 是一种能强烈地 与细胞内各中成分发生反应的物质，因而引起对酶和膜的严重损伤，膜电阻和 文献综述 流动性显著降低，最终导致膜的结构和生理完整性的破坏，同时光合电子传递 活力丧失而且人为地加入s o d 到菠菜的照光叶绿体碎片中，在有苄基紫精 ( b e n z y lv i o l e g e n ，光系统i 的电子受体) 存在下，可抑制m d a 的形成。在番 茄叶片的低温黑暗处理中也获得相似的结果。另外，用强离子缓冲液t r i s 等( 可 去掉类囊体膜上的m n 2 + ，从而终止光合电子传递) 洗涤菠菜叶绿体也得同样的 效果。因此，可以认为，低温黑暗下，膜脂过氧化加强得原因是光合电子传递 活力得丧失。 据报道，当易受到冷害得植物在0 和黑暗下贮藏后照光时，中断得光合电 子传递被恢复，叶绿体中光诱导得膜脂过氧化加强，在照光2 小时后其m d a 产生速率均是鲜叶得2 倍左右，其中照光叶绿体h i l l 反应活力与鲜叶相近，约 是不照光的2 5 倍，即使加入羟胺恢复了在低温黑暗处理下曾经中断的光合电子 也不能阻止其m d a 含量的上升。这些结果证实，低温下叶绿体中光合电子传 递活力是否丧失与膜脂过氧化作用无关。已知，t r i s 和h e p e s 缓冲液除了能阻 断光和电子传递链外，还可结合于类囊体膜和基粒上的c u z n s o d 失活。研究 发现，不论叶绿体是否经t r i s 和h e p e s 洗涤过，如加入k c n n - - 者的m d a 产 生速率要高，显然此时