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基于细胞膜片技术构建组织工程管状骨 中文摘要 骨组织的再造和骨缺损的修复一直是临床治疗中的难题之一，组织工程技术 为解决这一难题提供了新的思路和方法。骨组织工程是目前组织工程中研究的重 点内容，研究对象包括种子细胞、支架材料及与骨生长有关的生长因子三方面内 容。 目的：本实验以临床应用为出发点，研究如何在体外构建具备一定形态、体 积和机械强度的组织工程骨移植体，目的在于：探索具有更高的细胞利用效率 和获取更多种子细胞数目的培养方法；在细胞膜片技术的基础上，研究如何在 体外构建具备三维立体结构的管状骨移植体：研究如何利用生物反应器在体外 重建出具有骨特性的组织工程管状骨；观察将体外构建的骨移植体植入裸鼠体 内后继续分化成熟的能力和分化稳定性的保持。 方法和结果：实验中，首先采用原代细胞连续培养方法将兔骨髓基质细胞培 养成具有一定机械强度和可操作性的细胞膜片，并对其结构进行了检测。在此基 础上，利用细胞膜片和玻璃管外支撑体在体外通过生物反应器构建出管状骨移植 体，得到的标本虽然具有一定的机械强度，但是和天然骨组织还有一定的差距。 进一步我们将体外构建的管状骨移植体植入裸鼠皮下，通过1 2 个月的体内实验， 得到了外部形态和内部结构都与天然骨组织相似的组织工程人工骨。与此同时我 们还探究了在细胞膜片的构建时添加珊瑚颗粒，然后用相同的策略构建管状骨移 植体，最终发现珊瑚颗粒的存在与否对组织工程骨的构建和成熟具有很大影响。 结论：研究结果表明，连续培养的复合珊瑚颗粒的细胞膜片+ 外支撑的构建策 略在生物反应器条件下能够诱导形成具备特定形态的仿生组织工程骨，而且移植 体在体内会继续发育成熟而接近天然骨组织。该策略为体外构建管状骨移植体提 供了一个简单实用的方法。我们相信通过不断的探索和研究，该方法将很有可能 最终应用于临床治疗工作当中。 关键词：骨，组织工程，骨髓基质细胞，细胞膜片 t h ec o n s t r u c t i o no ft i s s u ee n g l n e e r l n gt u d l 工0 r r nd 0 n e 一-， g r a f tw i t hc e l ls h e e tt e c h n i q u e a b s t r a c t t i s s u er e c o n s t r u c t i o na n dr e p a r a t i o nr e m a i n so n eo ft h em o s tc h a l l e n g i n gt a s k si n t h ec l i n i c a ls u r g e r y t i s s u ee n g i n e e r i n gp r o v i d e san o v e la p p r o a c ht os o l v et h i s p r o b l e m b o n et i s s u ee n g i n e e r i n gi so n eo ft h ef o c a lp o i n t si nt i s s u ee n g i n e e r i n g ，w h i c h i n v o l v e ss e e dc e l l s ，s c a f f o l d sa n dg r o w t hf a c t o r s o b j e c t i v e ：t or e g e n e r a t et i s s u ee n g i n e e r e db o n eg r a f tw i t hf a v o r a b l ec o n t o u r ， a d e q u a t ev o l u m ea n de n o u g hs t r e n g t hf o rc l i n i c a la p p l i c a t i o n i nd e t a i l s ：1 t oe x p l o r e h o wt og e tm o r es e e dc e i l si nc e l lc u l t u r ea n dh i g he f f i c i e n c yi nc e l lu s a g ei nt i s s u e f a b r i c a t i o n 2 t or e g e n e r a t et h r e e d i m e n s i o n a lb o n eg r a f ti nv i t r ow i t hc e l ls h e e ta n d w i t h o u tt h et r a d i t i o n a l l yu s e ds c a f f o l d s 3 t oe s t a b l i s hs t r t e g yo fr e g e n e r a t i n gt i s s u e e n g i n e e r e db o n eb yb i o r e a c t o ri nv i t r o 4 t oo b s e r v et h ed i f f e r e n t i a t i o na b i l i t ya n d s t a b i l i t yo ft h et i s s u ee n g i n e e r e db o n eg r a f ti n v i v o m e t h o d sa n dr e s u l t s ：r a b b i tb o n em a r r o ws t r o m a lc e l l s ( b m s c s ) w e r ec u l t u r e d c o n t i n u o u s l yt of o r mac e l ls h e e tw i t hp r o p e rm e c h a n i c a ls t r e n g t ha n dc o n v e n i e n th a n d l i n g p r o p e r t y t h ec h a r a c t e r i s t i c so ft h ec e l ls h e e tw e r es t u d i e d t u b i f o r mb o n e 铲世w a sf a b r i c a t e d b yr o l l i n gt h ec e l ls h e e t sa r o u n dag l a s st u b ea n dc u l t u r e di nb i o r e a c t o ri nv i t r o t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h es a m p l eh a dc e r t a i nm e c h a n i c a ls t r e n g t h f u r t h e rm o r e ，w ei m p l a n t e dt h e t u b i f o r mb o n eg r a f ts u b c u t a n e o u s l yi n t on u d em o u s ef o r1 - 2m o n t h sa n df i n a l l yw eg o ta t i s s u ee n g i n e e r e db o n eg r a f tw h i c hr e s e m b l e dt ot h en a t u r a lb o n eb o t hi nt h ea p p e a r a n c ea n d t h es t r u c t u r e a tt h es a m et i m e ，w ef o u n do u tt h ec o n s t r u c t i o na n dm a t u r i t yo ft h et i s s u e e n g i n e e r i n gb o n ec a nb ei n f l u e n c e db ya d d i n gc o r a lg r a n u l e si n t ot h ec e l ls h e e t c o n c l u s i o n s ：t h e s er e s u l t sp r o v i d ed i r e c te v i d e n c et h a tt h es p e c i a lc o n t o u r - b i o n i c t i s s u ee n g i n e e r e db o n ec a nb er e c o n s t r u c t e dw i t ht h es t r a t e g yo fc e l ls h e e tw i t hc o r a l g r a n u l e sp l u se x t e r n a ls u p p o r t i n g s c a f f o l di nb i o r e a c t o r t h eb o n eg r a f tb e c a m e m a t u r a t i o na n ds i m i l a rt on a t u r a lb o n ea f t e ri m p l a n t e di n t ot h ea n i m a lb o d y c e l ls h e e t s t r a t e g yt o g e t h e r w i t hs i l i c o n et u b ea se x t e r n a l s u p p o r tp r o v i d e san o v e la p p r o a c ht o c o n s t r u c tt u b i f o r mb o n eg r a f t w eb e l i e v et h a tt h i sn o v e ls t r a t e g yh a sg r e a tp o t e n t i a li n f u t u ec l i n i c a la p p l i c a t i o n k e yw o r d s ：b o n e ，t i s s u ee n g i n e e r i n g ，b o n em a r r o ws t r o m a lc e l l s ( b m s c s ) ，c e l ls h e e t 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。学校 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许 论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所等机构将本学位论 文收录到中国学位论文全文数据库或其它相关数据库。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：至! l 鱼兰叁指导教师签名： 、工 夥年。月今7 日矽年j 月，日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西 北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的 同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 意。 学位论文作者签名： 刘专吱 7 钳肘) 日 西北人学顾：j ：学位论文 第一章前言 组织缺损或功能障碍是危害人类健康的重要原因，目前还没有有效的治疗手 段。组织工程( t i s s u ee n g i n e e r i n g ) 是通过制备具有特定功能的支架，并在需要时， 将具有生物活性的因子和或生活细胞复合于支架上，使整体具备适于受体组织部 位特定要求的具有生命特征的艺术和科学【1 1 。组织工程技术自建立到现在的2 0 多 年中，获得了突飞猛进的发展，被认为是未来进行组织、器官缺损修复和再造最 有效的方法之一。 组织工程技术的基本要素包括活细胞、促进细胞和组织再生的生物活性因子，以及 各种用以维持人工组织特定形态的支架材料。自从1 9 8 7 年提出“组织工程 这一概念 以来，种子细胞和支架材料一直是该领域研究的中心和重点，学者们已通过组织工程方 法再造出了具有生物活性的人造皮肤、血管、软骨、骨、角膜、气管和神经等组织，其 中人造皮肤是第一种组织工程产品，已应用于临床治疗。为了使组织工程技术获得更广 泛的应用，应进一步对细胞生物学、细胞培养技术、生物材料学、材料加工技术、生物 力学环境影响、组织构建方法等进行深入研究，使组织工程技术更加科学、完善，最终 应用于临床以解决组织缺损修复这一医学难题。 一组织工程人工骨研究现状 骨骼作为人体的支架，担负着支持、承重、造血等功能。临床治疗当中由于创伤、 肿瘤、感染所造成的骨组织缺损很普遍，为解决这些问题，最常见的治疗方案是自体骨 移植。自体骨具备骨诱导性、骨传导性及骨生成性，是修复骨缺损的金标准【2 j ，但自体 骨移植需要开辟第二术区，增加了手术时间、出血量及创伤，而且取骨量有限，并不是 最理想的植骨术；采用同种异体骨移植，不同学者报道的临床效果差异很大，植骨成功 率为6 6 一9 4 ，感染率为o 9 一1 2 4 【3 】；应用异种骨移植只有2 0 左右可以达到预 期的骨愈合，同时有传播人畜共患疾病的危险；采用人工材料作为填充物治疗骨缺损则 存在因为材料组织相容性、降解性难以控制等问题而引起的并发症。组织工程骨由于可 以大大减少对患者的创伤及手术并发症，某些动物实验结果表明具有较好的效果，是目 前骨缺损修复研究领域的热点。 1 9 9 5 年c r a n e 4 1 系统提出了骨组织工程的概念、研究方法、研究现状及发展前景， 引起了广大学者的广泛关注。骨组织工程是指将分离获得的骨形成细胞，经体外培养扩 第一章前言 增后接种于天然或人工合成的、具有良好生物相容性、可被人体逐步降解吸收的细胞支 架( s c a f f o l d ) 上，这种生物材料支架可为细胞提供生长的三维空间，有利于细胞进行营 养物质交换、气体交换，使细胞在预制形态的三维支架中生长，然后将这种细胞材料 的复合体植入骨缺损部位，在生物材料逐步降解的同时，接种的细胞不断增殖、分泌骨 基质，从而达到修复骨组织缺损的目的。近年来，骨组织工程已取得了很大进展，构建 组织工程人工骨的希望正逐步成为现实。 二组织工程人工骨研究内容 组织工程骨的研究内容包括了支架材料、种子细胞和生长因子这三个要素以及它们 之间相互作用的复杂关系，众多学者从不同角度对组织工程骨进行了大量的实验研究【5 6 1 o 1 种子细胞 骨的生成是由成骨细胞向周围分泌胶原纤维，然后将自身包埋于其中，形成类骨质， 最后由钙盐沉积后形成骨组织而完成的【7 1 。理想的骨组织工程种子细胞应具备下列特点： 取材容易，同时对有机体的损伤较小：体外培养时具有较强的传代增殖能力，在 较短时间内能够得到大量可以定向分化的成骨细胞；植入机体后能适应局部的微环 境并保持成骨活性。目前用于骨组织工程种子细胞的来源包括：骨膜、骨髓、骨以及胚 胎干细胞等。 骨膜：骨膜中含有骨原细胞、成纤维细胞、成骨细胞和破骨细胞。骨原细胞保持着 定向的分化潜能，可被激活、增殖、分化为成骨细胞。取骨膜进行培养可分离得到成骨 细胞。g r o g e r 等【8 1 将实验猪的骨膜细胞在体外扩增后复合在纤维蛋白胶中，对下颌骨缺 损模型进行修复，体内移植9 0 7 1 8 0 天后发现缺损被完全修复，而空白对照的缺损未获 得修复。p e n g 等【9 】在2 0 0 0 年1 2 月到2 0 0 1 年6 月期间采用从骨膜中分离得到的成骨细 胞复合生物材料对1 0 例患者的骨缺损进行了修复手术，并进行了7 年的术后随访，结 果发现除1 例因为骨松动在术后一年后手术取出移植体外，其他9 例通过x 线片检查证 实在术后3 。4 5 个月获得骨性愈合。骨膜来源细胞的优点是具有很强的增殖和分化成骨 能力，缺点是骨膜需要手术取材。 骨：胚胎与新生动物的骨组织经培养可以得到成纤维样细胞，在适当条件下可进一 步诱导分化为成骨细胞。r i c c i o 等1 1 0 】将从人胚胎颅盖骨中获得的成纤维样细胞在体外培 养，发现细胞具有很强的增殖能力，且能与生物材料复合，继续生长分化，形成新骨。 两北大学硕一 ：学位论文 骨来源的优点是易定向分化为成骨细胞，缺点是也需要手术取材，造成额外的创伤。 骨髓：骨髓中的基质细胞( b o n em a r r o ws t r o m a lc e l l s ，b m s c s ) 具有多向分化的潜 能，可分化为成骨细胞、成纤维细胞和软骨细胞等。在诱导因子的作用下，可定向分化 为成骨细胞，并具有良好的体外增殖能力，是目前骨组织工程中最理想的种子细胞【1 1 ，1 2 】。 m a n i a t o p o u l o s 掣1 3 峙艮道鼠b m s c s 体外培养时在地塞米松、b 甘油磷酸钠和维生素c 等 存在的条件下能形成钙化的骨样组织，表明体外培养的b m s c s 具有成骨能力。b m s c s 的突出优点是来源广泛、取材简单、增殖能力强、有很强的分化成骨潜能，并且同种异 体b m s c s 移植不发生或只发生轻微的免疫排斥反应，更增加了其临床应用的范围。 胚胎干细胞：是从早期胚胎细胞分离得来的、高度未分化的、能在体外长期培养的 细胞。胚胎干细胞技术的建立，为人们在体外研究胚胎及器官发育带来希望。通过对胚 胎干细胞的定向分化诱导，可以使其向成骨细胞分化，但是由于来源困难，目前尚处于 研究阶段。 2 支架材料 骨组织工程研究的另一个重点内容是作为细胞移植与引导新骨生长的支架材料，以 作为细胞外基质( e x t r a c e l l u l a rm a t r i x ，e c m ) 的替代物。支架材料影响细胞的接种效率、 黏附、增殖、分化以及对组织缺损的修复。骨组织工程发展至今已有很多种天然或人工 的材料被研究并用作支架。 用作支架的材料应该满足以下几个要求：具有良好的生物相容性，在体外培养 时对细胞无毒性，植入体内后不会引起机体炎症和排斥反应；具有三维立体结构， 必须是多孔结构，即具有很大的比表面积，这样既有利于细胞的爬入、黏附，又有利于 细胞进行营养成分和代谢产物的交换，同时可以最大程度的容纳更多的细胞；具有 良好的表面活性，能促进细胞的黏附并为细胞的增殖提供良好的微环境：具有生物可 降解性，支架在细胞形成组织的过程中应逐渐被降解，同时不影响新生组织的结构和功 能，而且降解产物对细胞和组织无毒害作用；具有可塑性，可被加工成所需要的形状， 同时应具有一定的机械强度，以便在植入体内后的一段时间内仍可保持其结构，使新形 成的组织具有预期的外形。 目前，用于骨组织工程的材料可分为天然材料和人工合成材料两大类。其中天然材 料包括胶原、珊瑚、藻酸盐、壳聚糖、氨基葡聚糖、脱钙骨基质等；人工合成材料有聚 乙交酯( p o l y g l y c o l i ca c i d ，p g a ) ，聚丙交酯( p o l y l a c t i ca c i d ，p l a ) 、p g a 和p l 气 的共聚物p l g a 、生物活性玻璃陶瓷、羟基磷灰石( h y d r o x y a p a t i t e ，h a ) 、磷酸三钙等。 第一章前言 这些材料都具有良好的组织生物相容性。以下着重介绍几种骨组织工程当中常用的支架 材料。 2 1 壳聚糖 又名几丁质，甲壳素，是一种天然氨基多糖高分子物质，是由n 乙酰氮基葡萄糖 通过糖苷键相连接聚合而成。近年来，壳聚糖及其衍生物作为生物材料获得了广泛的重 视。研究结果表明，壳聚糖对成骨细胞具有良好的组织相容性，可促进成骨细胞的增殖 及a l p 活性，成骨细胞可以在几丁质膜表面较好地贴附和伸展。 s e o l 掣1 5 1 通过冻干将壳聚糖制作成海绵状支架，然后在其中接种不同浓度的来源于 鼠颅盖骨的成骨细胞进行培养，并在1 ，2 8 ，5 6 天分别取样，发现细胞可以在材料中良 好的贴附和增殖，并且所有标本中均有不同程度的钙沉积和新骨形成。 同时，还有很多学者将壳聚糖和其他材料复合制作成合成材料然后用于骨组织工程 研究当中。k a t t i 等【1 6 】将壳聚糖、蒙脱石和羟基磷灰石通过水合反应制作成复合材料， 然后接种细胞，发现细胞可以良好的黏附在材料上，生长速率较在单纯的壳聚糖中快很 多，而且复合材料的机械强度、生物相容性、降解能力都非常优秀。o l i v e i r a 等【1 7 】通过 冻干技术将壳聚糖和羟基磷灰石复合在一起制成双层材料，然后接种山羊的b m s c s ， 通过体外诱导培养1 4 天，发现细胞可以在材料中良好的贴附生长并向成骨细胞分化。 j i a n g 等【1 8 l 把壳聚糖和聚乳酸羟基乙酸( p o l yl a c t i ca c i d g l y c o l i ca c i d ，p l a g a ) 制成复合 材料，然后接种成骨细胞m c 3 t 3 e 1 ，发现细胞可以材料中良好的黏附和增殖，生长状 态比在单纯的聚乳酸糖脂中好，同时壳聚糖的存在增加了细胞的碱性磷酸酶活性，并且 对骨桥蛋白和骨涎蛋白的基因表达均起正调控作用。 2 2 藻酸盐水凝胶( c a l c i u ma l g i n a t eh y d r o g e l ，c a h ) 海藻酸是一种从海藻中提取的带有二价阴离子的多糖，可以与带有二价阳离子的 c a 7 + 通过交联聚合作用形成具有三维网状结构的海藻酸钙水凝胶，具有良好的生物相容 性、亲水性和塑形能力，容易制成不同的形状并长时间保持【1 9 1 。 为了研究骨髓基质干细胞是否可以在c h a 内增殖分化，w a n g 等人【2 0 】将大鼠的 b m s c s 接种在c a h 内，观察其增殖分化能力，结果证明c h a 可以作为三维的可降解 材料用于骨组织工程研究。h w a n g 等1 2 1 】研究发现将未分化的胚胎干细胞包裹在c h a 内， 采用成骨诱导液经体外微重力旋转培养后可以生成三维立体的矿化结构，其形态特征、 机械强度都与骨组织极为相似。s m i t h 等【2 2 】采用包裹氯化钙的光感脂质体与海藻酸钠复 合的方法体外三维培养骨来源细胞，为复杂组织的再造创造了条件。 4 西北大学硕：i ：学位论文 2 3p g a 、p l a 及p l g a 聚酯类化合物如聚乙交酯( p o l y g l y c o l i ca c i d ，p g a ) ，聚丙交酯( p o l y l a c t i ca c i d ， p l a ) 及其共聚物p l g a 是最早应用于组织工程的人工合成支架材料，相关研究也取得 了巨大成功，这几类高分子材料在体内外均可发生水解，降解产物为水和二氧化碳，在 体内时可以通过机体代谢排出体外。 早期学者一般只采用单纯的聚合材料作为支撑体。k i m 等【2 3 】通过使用p g a 复合成 骨细胞的移植体成功的修复了裸鼠颅骨缺损，而在单纯植入p g a 的对照组中缺损却未 获得修复；p u e l a c h e r 等【2 4 】则用p g a 复合骨膜来源的成骨细胞经过1 2 周的时间成功修 复裸鼠股骨处l c m 缺损。 近来的研究趋向于将不同的材料通过化学和物理的方法结合在一起制作成复合材 料，各种研究表明复合材料在生物相容性、机械强度等方面都优于单体材料。n g i a m 等 【2 5 】将p l g a 和纳米羟基磷灰石以及胶原制成混合材料，然后在材料上接种细胞，观察细 胞在材料上黏附和增殖情况，同时与细胞在单一材料上的生长情况进行比较，发现细胞 在复合材料上的生长状态较好，表现出高的碱性磷酸酶活性。w u 等【2 6 】用胶原和壳聚糖 包裹p l g a 制成复合材料，并观察成骨细胞在该材料上附着、增殖和分化的情况，结果 表明胶原的存在促进了细胞的黏附和增殖，却影响细胞的分化，而壳聚糖虽然促进细胞 的分化，但是同时又阻碍细胞的黏附和增殖。j o s e 掣2 7 l 通过静电纺丝的方法将纳米羟基 磷灰石和p l g a 制成复合材料，然后通过各种检测方法比较了不同浓度的羟基磷灰石复 合p l g a 以后对整个复合材料的影响，结果发现合适浓度的羟基磷灰石可以增加材料的 储存模数、降解速率以及机械强度等物理化学性质。c h a r l e s 等【2 8 】通过融合技术和相分 离技术将p l a 和磷酸钙复合在一起，然后在该材料上接种成骨细胞，并通过体外培养 来研究不同材料和不同培养方式对成骨的影响，结果表明融合技术得到的复合材料更有 利于细胞的黏附和分化成骨，同时动态培养方式比静态培养方式更有利于细胞成骨。 2 4 羟基磷灰石( h y d r o x y a p a t i t e ，h a ) ： h a 分子式为c a l o ( p 0 4 ) 6 ( 0 h ) 2 ，广泛存在于人体组织中，是骨骼和牙齿的主要 组成成分，有良好的组织相容性，但是不能够被降解。 y o s h i k a w a 等【2 9 】将体外培养扩增的b m s c s 接种在h a 支架材料上，体外培养 两周后，扫描电镜观察发现在h a 支架表面形成了钙沉积并布满了胶原纤维，碱性 磷酸酶检测结果表明材料内已经生成了成骨细胞，继而他们将h a 与b m s c s 复合 后植入动物体内，一周后检测发现种植体具有较高的成骨活性，且这种活性可以 5 第一章前言 维持长达一年。m o r i s h i t a 等【3 0 】将患者的b m s c s 体外扩增后接种在h a 上，通过体 外诱导培养发现b m s c s 分化为成骨细胞并伴随有骨基质的形成，当患者的骨瘤被 切除后，将这种h a b m s c s 复合体填充在手术形成的缺损内，3 个月后通过x 线 片和c t 断层扫描检测证明了患者的骨缺损得到了完全的修复，为h a 与b m s c s 复合构建自体骨组织移植物的临床应用提供了理论依据。o l i v e i r a 等人【3 1 】通过新的 交联方法制成具有近7 0 孔隙率、孔径达5 0 6 0 0 9 m 的h a 支架材料，然后通过红外衍 射、扫描电镜、x 线片以及接种鼠b m s c s 来研究其作为骨组织工程支架材料的可行性， 结果表明，此种h a 具有良好的三维结构、机械强度、生物相容性以及细胞可黏附性等 优良特性，是作为骨组织工程支架不可多得的材料。 2 5 珊瑚( n c ) n c 是由海洋动物珊瑚虫分泌的石灰质外壳堆积形成的，其化学成分主要为碳 酸钙。n c 具有与骨组织相似的微孔结构，同时具有良好的生物相容性和生物可降 解性，且易被切割打磨加工成型，以n c 作为骨组织工程支架材料己经进行了大量 的研究。最常用的n c 为滨珊瑚，它具有相通的三维孔隙结构，孔径约为1 5 0 2 0 0 p m 。陈富林等【3 2 l 将天然的n c 颗粒填充在长为1 2 r a m ，直径为8 m m 的钛网模型中 制成钛网和n c 复合的支架材料，然后将密度为4 x 1 0 7 的软骨细胞接种在该支架材 料上，体外培养两天后植入裸鼠皮下，两个月后取材结果发现移植体外观近似骨 组织，并且体积大小和形状均未发生改变。免疫组化结果显示移植体内有骨组织 形成，且大部分n c 颗粒已被降解吸收。c u i 等【3 3 1 将狗的自体脂肪干细胞经体外成 骨诱导后接种在n c 支架上用于颅骨缺损修复，2 4 周后，检测发现修复率高达9 0 ， 且新生组织为骨组织，而单纯植入n c 的对照组的缺损却未获得修复。袁捷等【3 4 】 通过b m s c s 复合n c 对狗的右侧下颌骨3 c m 的缺损进行了修复实验，结果显示在 1 2 周时，有新骨形成且缺损被修复而空白对照组的缺损仍然存在，通过力学测试 发现，新生骨与正常下颌骨具有相似的机械强度。 n c 的降解速度较快是由吞噬细胞的吞噬作用完成的，在不同部位及不同种属 的动物体内降解速度均有很大差异。研究发现n c 只具有骨引导活性，而无骨诱导 活性，为了提高其骨缺损的修复效果，l o u i s i a 等【3 5 】将n c 与自体新鲜骨髓复合后 修复兔尺骨2 c m 长的缺损，术后2 个月，单纯植入n c 的对照组骨缺损未获得愈 合，而复合自体新鲜骨髓的植入组缺损获得完全修复，同时发现在复合自体新鲜 骨髓后，n c 的降解吸收也会加快。v i a t e a u 等【3 6 j 以长骨缺损的羊为动物模型，分别 西北人学颀l ：学位论文 用自体b m s c s 复合n c 支架、自体长骨、单纯n c 支架对缺损进行了修复实验，6 个 月后对实验动物进行了相关检测，发现在用b m s c s n c 复合体和自体长骨进行修复的 实验组中，缺损都得到了修复，而单纯使用n c 支架的空白对照组的缺损仍然存在，并 且通过x 线片等检测发现，用b m s c s n c 复合体和自体长骨进行修复的结果无明显差 异。 3 培养方式 早在1 9 7 7 年，就有人预言有可能在新型的生物相容性材料上接种细胞形成能 成骨的移植体。成骨细胞与载体材料在体外的复合培养，是骨组织工程构建的起 始和关键。为了促进成骨细胞与载体的良好结合，理想的发挥成骨细胞的功能， 人们发明了三维细胞培养的方法。三维细胞培养是指将细胞接种在具有三维结构 的载体材料上在体外共同培养，使细胞在载体的三维立体空间结构中攀附、迁移、 生长，构成三维的细胞载体复合物。b o t c h w e y 等【3 7 】比较了成骨细胞在二维和三维 培养体系中的生长情况，发现三维培养体系中的成骨细胞增殖和分化能力明显优 于二维培养体系中的成骨细胞。s i k a v i t s a s 等【3 8 】通过比较动态和静态的三维培养方 式，发现动态培养方式较静态培养方式更有利于鼠b m s c s 在可降解材料上增殖、 分化和细胞间质矿化。 3 1 静态三维细胞培养 静态三维细胞培养是指将一定浓度的种子细胞接种到载体材料上后在不受外 力影响下进行静置培养的方法。i s h a u g 等【3 9 】发现，静态培养2 4 h ，绝大部分细胞都 黏附在载体的表面和底部，仅有少部分细胞固定在了载体内部。h o l y 等【4 0 】也报道， 细胞被接种到三维载体中进行静态培养，迁移到载体内部的最大细胞数量仅占最 初细胞接种数量的2 5 ，其余7 5 的细胞均黏附在载体的底部和表面。这是因为 静态培养时细胞仅受到重力的影响，且细胞自身的运动能力极其微弱，所以细胞 大都聚集在材料的底部和表面，仅有一小部分由于多孔材料的虹吸作用而进入到 载体内部。i s l l a u g r i l e y 等【4 1 】研究发现，将b m s c s 接种在三维立体材料上进行复 合培养时，仅在材料外表层形成钙化组织，而载体的内部几乎没有骨样组织生成。 所以，载体中吸附的细胞数量直接影响复合体的成骨能力。虽然载体材料本身适 合细胞的黏附生长，但是静态培养的方式却不利于细胞向载体内部迁移，同时因 为在静置情况下培养液难以扩散渗透到载体的内部，导致氧气、营养物质和代谢 产物的交换受到限制，从而影响细胞在载体内部的生长。如果通过增大载体材料 7 第一章前占 的孔径来促进培养液的渗透又会影响材料的机械强度，同时还会造成细胞的流失。 因此，需要改善培养方法或改进细胞接种手段来解决材料内部细胞量不足和细胞 分布不均的问题。 3 2 动态三维细胞培养 动态三维细胞培养就是把种子细胞接种到载体材料上后在外乔力学刺激的作 用环境下进行的一种培养方式。g l o w a c k i 等1 4 2 】用培养液灌注的方法培养b m s c s ， 结果发现能够增加细胞在载体中的生存能力和活性。k a s p a r 等【4 3 ，4 4 】发现外力刺激 能够促进细胞的增殖并刺激细胞d n a 的合成。g r a n e t 等【4 5 】在生物反应器中的微载1 体上培养成骨细胞，发现细胞载体复合物可以生成类似骨组织的结构，这表明动 态三维培养有利于细胞的增殖和分化。使用生物反应器对细胞载体复合物进行培 养是一种优化的培养方式，复合物在反应器中可以通过转动减少细胞聚集现象， 同时培养液的相对流动性和材料的三维孔隙空间，有利于氧气的扩散和营养物质 的交换，从而保持细胞的活性和特性。b o t c h w e y 等【4 6 l 在生物反应器中培养成骨细 胞，并与静态培养方法进行比较，结果发现前者可以保持成骨细胞表型，并且可 增加细胞碱性磷酸酶的活性和基质的矿化。s i k a v i t s a s 等【卅将b m s c s 复合在多孔材 料中，然后比较了不同培养方式对细胞活性的影响，结果发现动态旋转培养的结果要明 显的优于静态培养，在1 4 天的时候动态培养的细胞碱性磷酸酶活性和骨钙素分泌量分 别是静态培养的2 4 和3 5 倍。 骨组织工程中细胞载体材料复合培养是一个非常复杂而又受多因素影响的过 程，不但需要材料具有适合细胞生长的良好结构形态，而且还要有适宜的力学特 性，动态三维细胞培养不仅为细胞生长提供良好的生物微环境，而且还能够提供 适宜的机械应力刺激，以促进细胞发挥其正常功能，较静态三维细胞培养方式更 适合体外组织工程骨的构建。 三b m s c s 诱导成骨在骨组织工程中的应用 随着骨组织工程研究的不断深入，种子细胞的选择范围也在不断扩大。其中， b m s c s 因其分离培养方法简单，扩增迅速，而成为一种重要的骨组织工程种子细胞 来源，b m s c s 是一种具有多分化潜能的细胞，在特定条件下可以诱导分化成骨，且具 有极强的自我复制能力。 早在1 8 6 7 年，德国病理学家c o h n h e i m 在研究伤口愈合时，首次提出骨髓中 两北人学颀i ：学位论文 存在b m s c s l 4 引。1 9 7 6 年，f r i e d e n s t e i n 4 9 l 等在做骨髓培养时发现在塑料培养皿底 部黏附有少量的单核细胞，这些细胞在一定条件下可分化成为成骨细胞、软骨细 胞、脂肪细胞等，而且经过多次细胞传代培养后，仍能保持其多向分化潜能。 b m s c s 可通过多种诱导方式向成骨细胞分化。 1 化学药物诱导 通过化学药物诱导b m s c s 成骨是目前常用的诱导方法。地塞米松可以促进 b m s c s 向成骨细胞分化，并可提高其碱性磷酸酶活性，调节b m s c s 分泌生长因 子i g f s ，此外还能促进细胞外基质胶原合成。b 甘油磷酸钠为b m s c s 新陈代谢提 供磷酸离子，促进钙盐沉积和矿化结节的产生。维生素c 促进细胞合成i 型胶原 以形成丰富的细胞外基质，并可调节a t p 、碱性磷酸酶活性和非胶原基质蛋白的 合成。在培养液中加入1 0m m o l l3 - 甘油磷酸钠和5 0m g m l 维生素c 以及1 0 一 7 m o l l 地塞米松【5 0 】后b m s c s 发生分化并出现了成骨细胞所具有的特异指标：i 型 胶原的表达、碱性磷酸酶活性的提高、矿化结节的产生等。 2 细胞因子和生长因子作用 骨形成蛋白( b m p ) 是迄今为止已知诱导能力最强的骨形成因子，是u r i s t 等 于1 9 6 5 年发现的，其作用细胞是骨髓中的b m s c s ，它可以诱导b m s c s 向成骨细 胞分化，促进新骨生成【5 1 1 。除了可以诱导b m s c s 分化为成骨细胞以外，b m p 还 可以促进矿化结节的形成，抑制b m s c s 分化为脂肪细胞1 5 2 ，5 3 1 。t g f b 是一种多肽， 主要通过促进b m s c s 的有丝分裂、增加钙盐的沉积、促进细胞合成i 型胶原、抑 制细胞合成i i 型胶原来提高b m s c s 的成骨效应，在分化成骨和骨的改建过程中发 挥着重要的作用。b f g f 可以促进b m s c s 增殖【54 1 ，且在骨移植后可促进局部毛细 血管生长，从而促进骨组织修复。 四细胞膜片技术 细胞膜片技术是指在体外将细胞连续培养，而使细胞复层生长形成一种只由 细胞和细胞外基质组成的膜片，形成的细胞膜片具有一定的机械强度可以用细胞 刮刀方便的从培养皿底部分离下来，并且可以直接用镊子进行操作，同时由于细 胞外基质的存在使得细胞之间紧密联系不会因为培养液的流动而流失，所以在复 合其他材料的时候可以极大的增加细胞的利用效率。 细胞膜片技术已经广泛应用于组织工程研究当中。a k a h a n e 等【5 5 i 将b m s c s 在 9 第一章前旁 体外扩大培养并形成细胞膜片，然后将其植入大鼠皮下，6 周后，通过检测发现在 移植区有矿化结构和骨细胞出现，证明有新的骨组织生成。k u b o 等【5 6 】将培养得到 的心肌细胞膜片包裹在纤维素管上，经脉冲加压后构建出与天然心肌导管功能和 结构相似的组织工程心肌导管。z h o u 等【5 7 】采用细胞膜片与材料复合技术成功构建 出与天然骨组织结构功能相似的组织工程人工骨，他们首先将猪b m s c s 在体外通 过连续培养形成具有多层细胞的膜片，然后将其包裹在已经接种细胞的复合支架 材料上来构建骨移植体，体外诱导8 周后，移植体表面出现了矿化点并且有骨相 关蛋白的表达，之后又进行了两组实验，一组将体外诱导培养8 周的复合体植入 裸鼠皮下，另一组则在复合体构建好后直接植入裸鼠皮下，两组实验结果均显示 有4 0 以上的移植体成骨并有血管化的松质骨形成。f l o r e s 等【5 8 j 将体外培养的牙 周膜细胞膜片植入裸鼠牙周缺损处，观察缺损修复情况，实验分为对照组与实验 组两组进行，对照组的细胞膜片采用基础培养液进行培养，实验组则采用成骨诱 导培养液进行培养，结果显示两组牙周缺损处均有胶原纤维形成，实验组的免疫 组化结果显示在牙周缺损处有牙骨质形成，并且缺损得到修复，而对照组却无此 现象发生，缺损未得到修复。 五实验设计和研究目的 组织工程已经成为现如今研究的热点问题，其中部分研究成果已经应用到临 床医学当中，为广大患者带来了前所未有的福音。组织工程骨的研究更是具有光 明前景，研究围绕种子细胞，支架材料和培养方法等方面展开，并且获得了很有 意义的成果。 本实验采用b m s c s 作为种子细胞，n c 颗粒作为辅助材料，玻璃管硅胶管作 为外支撑通过体外动态三维培养和体内移植实验对组织工程骨的构建进行了深入 的研究，设计并完成了三方面的实验。 1 b m s c s 的体外分离培养和细胞膜片的体外构建 传统的组织工程构建方法是在扩增细胞之后，将细胞接种于材料上，然后进 行培养或者体内移植实验，其最大的缺点在于细胞以单细胞悬液接种材料时，部 分细胞会随着培养液流失而不能黏附到材料上，浪费了大量获取困难的种子细胞。 而细胞膜片技术则通过连续培养使得细胞复层生长并分泌大量基质，丰富的细胞 外基质可以将细胞之间紧密的联系在一起而形成“一张”由细胞和外基质组成的 1 0 两北人学硕l - 学位论文 具有良好操作性的细胞膜片，然后用适当材料加以辅助就可以构建特定形态的人 工组织。 本实验目的在于如何通过体外连续培养获得可用于骨组织工程的b m s c s 细胞 膜片，并在细胞膜片形成过程中添加n c 颗粒，制备嵌合有n c 颗粒的细胞膜片， 并通过检测对细胞膜片进行分析。重点在于为后续实验提供良好的实验基础。 2 通过b m s c s 膜片体外构建管状骨移植体 根据实验一的结果，我们可以在短时间内获得b m s c s 的细胞膜片。将单纯的 b m s c s 细胞膜片和复合n c 颗粒的细胞膜片分别卷在管状支撑物。外构建管状复合 体，通过一个月的体外动态三维诱导培养后获得管状骨移植体并对其进行相关检 测。 一 3 管状骨移植体体内移植实验 将实验二构建的管状复合物经体外短暂培养后植入裸鼠背部皮下，研究其在 体内的转归情况。经过1 个月和2 个月的体内实验收获标本并对其进行相关检测 以研究膜片在体内环境下相互融合、移植体成骨以及n c 颗粒代谢等情况。 第一二帝实验内容 第二章实验内容 实验一b m s c s 的体外分离培养和细胞膜片的体外构建 种子细胞的获取是骨组织工程的难点之一，成骨细胞来源较少，体外扩增培 养相对困难，并且在培养过程中有可能出现“去分化”现象，在本实验中，我们 以b m s c s 作为骨组织工程的种子细胞，通过原代细胞连续培养的方法直接构建细 胞膜片，并且在不同培养阶段采用不同培养液，以期望可以在短时间内构建出细 胞数量多、基质丰富、机械强度高的可以用作移植体构建的细胞膜片，为后续实 验奠定基础。 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 实验动物 健康中国本兔( 2 - 3 周龄) ，体重约5 0 0 9 ，雌雄不限，由西安雁翔兔业有限公 司提供。 1 1 2 实验试剂和仪器 f 1 2 d m e m 培养基( g i b c o ) ，d m e m 培养基( g i b c o ) ，胎牛血清( f b s ，中美 合资兰州民海生物工程有限公司) ，维生素c ( s i g m a ) ，h e p e s ( w o l s e n ) ，1 - 甘油磷酸 钠( f l u k a ) ，地塞米松( s i g m a ) ，c 0 2 细胞培养箱( b i n d e r ) ，倒置显微镜( n i k o n ) ， 超净工作台( 海尔) 。 1 2 实验方法 1 2 1n c 颗粒的制作 将块状的滨珊瑚( 海南三亚) 压碎，制成直径小于0 3 r n m 的细小颗粒，形状 不定，装入1 0 m l 离心管，1 2 1 高温高压消毒备用。 1 2 2 培养液的配置 本实验在细胞培养过程的不同阶段选用了不同的培养液，以得到最好的实验 结果。培养液i ：f 1 2 d m e m 培养基，添