（生理学专业论文）缺氧对小鼠背根神经节神经元上超极化激活的电流ih的影响.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研 究成果据我所知，除文中已标明引用的内容外，本论文不包含任何其他人或集体已 经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均己在文中以明 确方式标明本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：高琳琳 日期：2 0 0 6 年4 月1 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本 人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密曰。 ( 请在以上方框内打“4 ”) 学位论文作者签名：高琳琳指导教师签名：唐明 日期：2 0 0 6 年4 月1 日日期：2 0 0 6 年4 月1 日 华中辩技大学羁滂医学院2 0 0 6 属硕士学位论盘 缺氧对小鼠背根神经节神经元上超极化激活的电流五的影响 摘要 本实验采用全细胞膜片钳技术研究急性分离的小鼠背根神经节r g ) 神经元上 矗电流的生理特性以及缺氧对k 电流的影响。在电压钳模式下，五电流可被细胞外 灌流的i m m l 的c s c l 完全而可逆性的阻断。在我们所观察的1 5 5 个d r g 神经元 中五电流的平均表达率为7 5 5 而且细胞体积越大，五电流的表达率越高。其中， 五电流在小细胞上的表达率为5 3 o 产19 ) 中等大小的细胞为7 9 8 归鲫，大细 胞为9 4 2 陋弓2 ) 五电流的幅度也与细胞的大小呈正比，随着细胞体积的增大而 增加。但是，其电流密度与细胞的大小没有相关性。对j h 电流的电压依赖性和时间 依赖性激活的研究发现，该电流在超极化时激活且其电流密度随超极化程度的增加 而增大，其激活的速度也随着膜电位超极化程度的增加而加快。激活时间常数f 与神 经元的大小负相关，也就是说大细胞上的五电流的激活速率要比小细胞上的快。在 电流钳模式下，我们发现在表达有厶的d r g 神经元上可观察到“去极化下陷” ( d e p o l a r i z i n gs a g ) 现象，这说明五电流的激活可通过使细胞膜去极化而使细胞的 兴奋性升高。，h 的翻转电位( v 龠) 和最大电导密度( g h 。曲。m ) 分别是3 1 0 a ：4 8m v 和o 2 士0 0 2n s p f 恤- 5 3 ) 。半激活电位( v n s ) 和其激活曲线的斜率x 分别为 一9 9 钍1 1 m y 和一1 0 2 _ 4 - o ，3 m v ( i l _ 5 0 ) a 晶电流的最大电导密度g h * k 。唧与细胞的大小 呈负相关，其他参数( v o j ，v 备，1 c ) 均与细胞大小不相关。根据缺氧对细胞静患膜 电位的不同影响，我们将小鼠d r g 神经元分为缺氧敏感型和缺氧不敏感型。在缺氧 条件下，v n 5 和v 。向超级化方向平移约3 0m v ，而g h m a x - a e m i # 和1 c 不受缺氧的影响。 本研究的结果显示在不同大小的小鼠d r g 神经元上，矗电流的激活动力学和电压依 赖性特征是不同的。对于缺氧敏感型神经元，缺氧通过将i h 的激活电压向超级化的 方向平移从而抑制k 电流。 关键词：背根神经节，膜片钳，缺氧，五电流 i 2 0 0 6 硅硬士学位论定 a b s t r a c t t h ep 哪t i = o fb p e r p o l a r i z a t i o n a 以v a t e dc u r r c u t ( i nm o l l s d o m a lr o o t 殍m g l i o l n ( d r g ) l l e u l o l l $ a n dt h ee f f e c to f h y p o x i ao nt h ec u r r e n th a v eb e e ns t u d i e du s i n g w h o l e m e uc o n f i g u r a t i o no ft h ep a t c hd a m pt e c h n i q u e u n d e rv o l t a g e - c l a m pm o d e , k ， b l o c k e db yl m me x t r a c e l l u a rc s c l 嘲p r e s e n ti n7 5 5 o fm o t m ed r gl a t = i l l r o n s 1 1 始 d i s t r i b u t i o nr a t ei n c r e a s e da st h el l e u a d t l sb e c o m el a r g e r , 5 3 ，7 9 8 a n d9 4 2 i ns m a l l ， m e d i u ma n dl a r g en e u r o n s ，r e s p e c t i v e l y b o t hi hd 目咖a n dt h er a t eo fka c t i v a t i o n i n a x m s e di ni e s p o r k q ot om o mh y i m z l l a r i z e dp o t e m i a l t h ea c t i v a t i o no fka m l ti n l a i g 吲n e u r o bw a sf a s t e rt h a ni ns m a l l e rn e u r o n , t h e r ew a sas i g a i f i c a mc o r l a t i o n b e t w e = lt h et i m ec o n s t a n to f i ha c t i v a t i o na n dn 嗣o n ss i z e h o w e v e r , l h d e n s i t yd i dn o t s h o wa n yc o r r e l a t i o nw i t hn 朗o n ss i z e u n d e rc u r r a n t - c l a m pm o d e , d e p o l a r i z i n gs a g w a so b s e r v e di na l ln e l n o l x sw i t hi h i 眦t h er c v e r m lp o t e n t i a l ( u 曲a n dt h em a x i m a l c o l l d u c t m l c md * a s i l yo fk ( o i u l i 曲w e 坤- 3 1 o 珥3m va n do 1 7 圭- 0 0 2n s p f ，w i t ha h a l f - a c f i v a t e dp o t e m j a l ( v 如= - 9 9 4 士1 1m y ) a n das l o p ef a c t o r ( k = 1 0 2 - 0 3m y ) t h e r ew a sac o r r e l a t i o nb e t w e e l ll l e u l o n ss i z e 扣dg h 删州啊衄o n l y a c x m r d i n gt ot h e e f f e c to fh y p o x i ao nm 蛾m e m b r a n ep o t e n t i a l , t h e r ew e r eh y p o x i a - s e m i t i v ea n d h y p o x i a - i n s e n s i t i v ei l e u l o r l s i nt h eh y p o x i a - s e m i t i v en e u r o n s , l hw a sf i | l l ya b o l i s h e db y h y p o x i a , a l t h o u g ht h er c s l i n gm e m b r a n ep o t e n 血1w a sh y p e r p o l a r i z e d v m 5a n dv mw e r e s h i t c 毡da b o u t3 0m yt o w a r d st oh y p e r p o l a r i z a t i o n , w h e r e a sg h m 缸。d e 岵时a n dkw e r en o t a f f e c t e db yh y p o x i w es u g g e s tt h a tt h ek i n e t i c sa n dv o l t a g ed e p e n d e n tc h a r a c t e r i s t i c so f i h a r ev a r i e di nm o l l d r gl l e u r o r s 谢t hd i f f e r e n ts i z e h y p o x i ai n h i b i t si i li nt h e h y p o x l a - s e n s i t i v en e i i l sb ys h i f t i n gi t sa c t i v a t i o np o t e n t i a lt oam o r eh y p e r p o l a r i z e d l e v e l k e yw o r d s ：d o r s a lr o o tg a n g l i o n , p a t c hc l a m p ，五o u r r o n t 2 ， 2 0 0 6 盛硬士学位论文 引言 超极化激活的阳离子电流( h y p e r p o l a r i z a t i o n - a c t i v a l e d c a t i o n c u r r e n t , h ) ，也叫作 有趣的电流( f m m y c u r r e n t , i f ) 或奇怪的电流( q u e e r c u r r e n t , 岛) 。这些都是因为该电 流有着其独一无二的特性：超极化激活，对n a * 和k + 非选择性通透，引起内向电流、 受胞内c a m p 水平的调节。五由超极化激活的环核苷门控( h y p e r p o k 眦洳啦虹v a 自e d c y c l i cn u c l e o t i d e - g a t e d , h c n ) 基因编码，目前发现有h c h i - 4 共4 种亚型，这4 种异 构型的核心跨膜区域、环核苷结合区( c y c l i cn u c l e o f i d e - b i n d i n gd o m a i n , c n b d ) 高度 保守，有8 0 一9 0 的序列一致。但在c 末端和n 末端的胞质区域却差异很大。每 个h c n 亚单位由6 个跨膜片段( s 1 - s 6 ) 组成，其中s 4 片段带正电荷，司电压感受 器的作用【。 最早在心脏发现的五电流，曾经因为其在超极化水平产生内向电流使细胞膜去 极化而被称作起博电流【1 1 后来发现矗电流也广泛存在于神经系统【2 l 。作为起博电流， 矗广泛的参与心脏和脑的自发性节律性活动【l ，3 j 。近年来，五在神经系统的表达和 作用越来越成为研究的热点五也表达于脊髓背根神经节细胞 4 - 8 1 ，通过限制膜的超 极化和促进去极化参与兴奋性刺激所引起的放电频率的增加1 7 】。 缺氧是缺血导致神经系统损伤的最常见的重要因素之一，触发这一过程的最主 要的机制之一是缺氧可以改变细胞膜上各离子通道的特性。例如，已经证实短时闻 的缺氧可以快速引起膜电位的改变，而这对于改变神经元的兴奋性起着关键性的作 用。缺氧可以使神经元的膜电位发生不同的变化，有的发生超级化变化，有的发生 去极化变化。如，缺氧可以使海马c a l 区的锥体细胞的膜电位向超级化方向变化 9 - 1 2 1 。 而其他一些研究发现缺氧主要使细胞膜的静息膜电位向去极化的方向变化【1 3 ，1 4 1 。而 同在d r g 神经元，缺氧对膜电位的影响也是不同的【1 5 ，1 6 1 。缺氧所致的膜电位的改变 紧接着可以激活或者抑制一些电压门控离子通道，从而介导缺氧时的神经痛过程。 如大多数神经元膜电位的去极化可以激活电压依赖性的钙通道，从而引起胞内钙超 载【l 9 1 ，进而引起兴奋性递质特别是谷氨酸的释放增加。不管是胞内钙超载还是谷 氨酸过度释放均可对神经元产生神经毒性效应【1 9 - 2 7 。除了钙通道，人们还对由膜电 3 2 0 0 6 屠硬士学位论文 位去极化激活的其他离子通道，如钾离子和钠离子通道在缺氧时的情况进行了广泛 的研究随2 9 1 。尽管缺氧引起膜的超级化也是一个很常见的现象，但是对于这方面的 研究却是相对缺乏的。因而，在本实验中，我们利用小鼠的d r g 神经元，探求缺氧 对人们熟知的超级化激活的电流k 的影响。已经证实，缺氧可引起背根神经节细胞 的自发放电，这与神经根病时的异常感觉和疼痛密切相关刚。除此之外，人们还证 实在神经性疼痛d l 】和神经损伤所致的痛觉过敏0 2 1 时，d r g 神经元上的k 电流发生上 调。在本实验中，我们认为，i h 作为一个疼痛相关电流，可能参与缺氧引起的神经病 理性损害过程，本研究以小鼠作为实验模型，系统的研究了小鼠的脊髓背根神经节 细胞上表达的k 电流的特征以及缺氧对五电流的影响。 材料和方法 1 细胞的分离制备 6 - - 1 2 周的成年雄鼠，用戊巴比妥钠( 4 0 m g k g , i p ) 深度麻醉，取胸腰段脊髓 背根神经节，置于氧饱和的生理盐溶液中洗净、剪碎。该生理盐溶液的成分如下( 单 位：r a m l ) ：1 5 0n a c i , 5k c klm g c h ，2 5c a c l 2 , 1 0h e p e s ，1 0d - g l u c o s e 。用n a o h 调节p h 到7 4 。将d r g 细胞转移到含有胶原酶i a ( 1 5 0 u n i t s m l ；c 懿b c o ) 和胰蛋白酶m ( 0 4 m g m l ；s i g m a , s t l o u i s ，m 0 ) 的d m e m 溶液中消化3 0 分钟。在消化的过程中， 轻柔的吹打使细胞分散，通过离心( 1 0 0 0 转分钟，5 分钟) 3 次终止消化分离出 的d r g 细胞保存在4 。c 的d m e m 溶液中，于6 小时内进行膜片钳实验。 2 电生理记录 在膜片钳实验之前，将d r g 细胞转移到载玻片上静置贴壁，载玻片与灌流槽固 定后，置于倒置显微镜( z e i s s ) 操作台上，向灌流槽持续灌流成分如下的细胞外液 ( 单位，r a m ) ：1 5 0 r q a c l , 5 k c i ，2 5 c a c h ，1 m g c h ，1 0 h e p e s ，1 0 9 l u c o s e ，34 - a p , l b a c l 2 ，用n a o h 调节p h 到7 4 ，电极用硼硅酸玻璃电极( 中国南京六合仪器设备厂) 由拉制仪( d a v i dk c p f i n s t r u m e n t s ，t u j u n g a , c a ) 经两步拉制而成。记录矗的电极内 液成分如下( 单位，r a m ) - 1 5 0k - a s p a r m t e ，5n a 2 - a t p , 0 4n a 2 - g t p , 5e g t a , 1 8 3 4 2 0 0 6 弱颀士学位论文 c a c l 2 ，1 0h e p e s 。用k o h 调节p h 至7 2 。充灌内液后的电极阻抗为2 3m q 。 室温下用全细胞膜片钳技术记录五电流。所用膜片钳放大器为a x o p a t c h2 0 0 a 、 数膜转换器是d i g i d a l a1 2 0 0 ( a x o ni n s t r u m e n t s , u n i o nc i t y ，c a , u s a ) ，实验数据用 p c t a m p6 0 4 ( a x o ni n s t r u m e n t s ) 软件包记录。电极电容和膜电容分别在封接后和破膜 后由放大器补偿，在实验中串联阻抗为5 6 6 士- 0 2 3m q ( n = 1 5 5 ) ，为了减小由串联阻抗 所致的电压误差，将其补偿5 0 * 0 - - 8 0 ，且将串联阻抗大于8m n 的细胞弃之不用。 采样频率为1 0k h z ，2k h z 滤波，漏电流用c i a m p f i t9 0 软件( a x o ni n s m 蛐e n t s ) 消 除 标准常氧灌流液由空气平衡3 0 分钟后使用。缺氧液实验前由纯n 2 饱和至少3 0 分钟得到，并测定前后溶液的p h 和温度均不发生变化。用氧分压测定仪0 t s s - 5 1 0 0 , 中国上海测定常氧液和缺氧液的氧分压分别为1 4 5 - - 1 5 0 和1 5 - - 2 5 m m h g 氯化铯和缺氧液由快速灌流交换系统( 5 m l m i n ) 给予，为了避免铯离子和缺氧对 其他神经元的影响，每皿细胞中仅对第一个用铯离子或缺氧处理的细胞进行实验， 其他细胞弃之不用。 3 数据分析 。 一嚣 数据经p c l a m p9 0 ( a x o n 咖e n t s ) 和s i g m a p l o t2 0 0 1 ( s p s si n c c h a g o , u s a 1 统计处理，结果用均数标准误表示，数据采用t 检验和方差分析进行统计学分析， p 小于0 0 5 认为有统计学意义。文中的电流电压曲线取自实验中的原始数据( 所用 软件为c l a m p f i t 9 0 ) ，其他统计图用s i g m a p l o t 7 0 绘制。 结果 3 1 小鼠背根神经节神经元上表达的超级化激活电流i h 的特性 3 1 1 铯雅j i h 的阻断作用 在所有被测试的细胞( i f 3 ) 中，细胞外给予铯离子( 1 m m ) 能完全阻断五， 冲洗 3 0 分钟后，能够完全恢复( 图l 所示) 。这与之前多个实验室所得到的结果一致p 孤。 |口，til”j， 2 0 0 6 撼礓圭学位论文 c ：弋：弋 主匹 图1 c s + 对五电流的可逆性阻断效应。图l ，用正常外液所记录的对照五电流。图1 b ，细 胞外灌流c s c i ( 1 m m ) 完全阻断五电流。国1 c 冲洗3 0 分钟后五电流恢复图i d 灌 流c s + 前后的五电流密度与测试电压的对应关系。：p 0 0 5 ，“：p o 0 1 3 1 2d r g 神经元上五电流的分布特征 用全细胞膜片钳技术记录五电流，先将电压钳制在一6 5 m v ，后以一7 _ 5 m v 到一 1 3 5 m v 、跃阶一l 加的一系列的超极化电压激活五电流。为了避免超级化刺激对细 胞的损伤，所给予的测试电压在向超极化的方向变化时以2 0 0 m s 为步长逐步缩短( 图 2 a 所示) 。h 电流幅度为测试电压开始时的峰值到测试电压末的稳定激活电流之间 的差值。对所观测的1 5 5 个d r g 神经元的研究发现，五电流的平均表达率为7 5 5 。 本实验沿用p e a r c e 等人的方法刚，根据膜电容的大小，将细胞分成3 组，小细胞组 ( = 7 0p f ) 。本实验中，磊电流在 不同大小的细胞其上的分布情况不同。其中厶电流的表达率在小细胞、中等大小细 胞、大细胞上分别为5 3 ( n - - 1 9 ) ，7 9 8 ( n - 8 4 ) 和9 4 2 ：5 2 ) 。在小细胞上的表达 率明显低于大细胞和平均表达水平( 7 5 5 ) ( p o 0 1 ，二项检验) 。在中等大小细胞 上的表达率与平均表达率没有显著性差异( p ：o 2 2 ，二项检验) 。 虽然在大细胞上的矗表达率显著性高于小细胞，但其电流密度( 五电流幅度膜电 容) 在所有的测试电压范围内( 一7 5 m v 到一1 3 5 m y ) 均与细胞的大小没有任何相关 6 - 一 2 0 0 6 羁礤士学位论文 性( 表1 ) 。比如，当测试电压为一1 3 5 m v 时，电流密度和膜电容之间的p e a r s o n i 关 系数r 为0 0 0 6 ，这与r = o ( 完全不相关) 问没有统计学差异( n = 7 8 ，p = o 9 6 , a n o v a ) 表l 不同测试电压下的电流密度与膜电容闻的相关分析 不同测试电压下的电流密度与膜电容闻的相关系数及p 值 3 1 3 五电流的电压和时间依赖型激活特性 如图2 a 所示，五由超极化电压激活，电流幅度随着电压超极化水平的增加而增 加。如，电压从一9 5 m v 变化到一1 3 5 m y 时，电流幅度从- 2 9 圭o 4p a p f 到一1 4 8 士1 5 p a p f ( n = s 9 ，p - 叱，这里龟和皤分别 是快和慢时间常数。不管是单指数还是双指数方程拟合，结果均显示五的激活速度 随着超极化程度的增加而增加。当测试电压从- 9 5 m v 到一1 3 5 m y 变化时，百的平均值( 由 可被单指数方程成功拟合的3 1 个细胞计算得来) 从4 8 8 5 士4 1 1m s 下降到1 5 7 1 ：i ：1 4 2 m s ( n = 3 1 ，p o o l ，配对t 检验) ( 图2 c ) 。神经元的膜电容和t 的相关性分析得出大细 胞上的五电流激活速度比小细胞的快。如表2 所示，在不同的测试电压水平，荫均 7 2 0 0 6 疆硬士学位论文 与神经元的大小呈负相关q o o i ) 。例如，在一1 3 5 m v 时，t 值与膜电容之间的 s p e a r m a n 相关系数p = 一o 6 3 ，此结果与p = o ( 完全不相关) 有着显著性的差异 ( n - - = 2 7 ，p 0 o o l ，a n o v a ) 。另外，图2 d 的散点图所示测试电压为一1 1 5 m v 时的懂与 膜电容之间的关系，也显示了百与细胞大小之间的负相关性。 表2 不同测试电压下的矗电流时间常数t 与膜电容间相关分析 不同测试电压下的矗电流时间常数百与膜电容问的相关系数及p 值 s 2 0 0 6 属谩士学位论文 l _ w a l - o 覃昌固菌菌 c d 图2 五的电压和时问依赖性激活特性。图2 a 一例在d r g 神经元上记录的五电流，其电流幄 度随超极化程度的增加而增大。n l 电流幅度的计算为取测试电压开始和结束时的峰电流差测试 电压模式如图所示。图2 b ，五电流密度与测试电压的对应关系图2 c 平均时间常数t ( 单指数 拟合) 与测试电压的对应关系。图2 d 测试电压为一1 1 5 m v 时的时间常数t 与神经元的膜电容负相 关( 雎哳，s p e a m m 相关系数p = 岫6 3 ，p 妯0 1 ) 它们之间的关系- - f g j 如下的方程表示：怡匆舫纂 电容+ 4 8 5 0 3 1 4 五的翻转电位和最大电导密度 在测定翻转电位( v 劫和最大电导密度( g l l 一一d 。哪) 时，先给予一个一1 3 5 m y 、持 续2 秒的测试电压最大激活五，然后从一7 5 舶_ v 到1 2 5 m v 每次阶跃一1 0 m y 将其分别 去极，测试在此过程中的尾电流( 图3 a 所示) 。测试尾电流峰值的时间如图3 a 箭头所示。将每一个测试电压下的尾电流，进行漏电流的削减处理后，用以下的线 性回归方程拟合：五词。g h 。d 。“v m - v 。) ，其中五同是尾电流的峰值，v 。是测试 电压，g l l 。“。h 是最大电导密度，v 。是矗电流的翻转电位。拟合产生的平均 g b m “- d m s t t y , 和v 。的值分别是o 1 7 0 0 2n s p f 和- 3 1 o “8m y ( n = 5 3 x 图3 b ) 。 回归分析显示g k 。如。h 与神经元的膜电容呈负相关。其p c a r s o r t 相关系数r = - o 3 4 ( n = 5 3 ，p = 0 0 1 2 ，a _ n o v a ) 。但是v 。与神经元的膜电容没有相关性，其p c 蠲湖l 9 华中科技大学礴济医学院2 0 0 6 疆硪士学钽论文 相关系数r = - 0 1 8 ，这与r - - 0 水平没有显著性差异( n = 5 3 ，p - - - o 2 1 9 ，a n o v a ) 。 b 图3 五电流的电导和翻转电位图3 a 在一例典型的d r g 神经元上，五被一1 3 5 m v 持续2 秒的电压预激活，接着阶跃性改变测试电压从- 1 2 5 到- 7 5m v 。测其尾电流( 箭头所示) - 图3 b 减 去漏电流后的尾电流与测试电压之间的对应关系。其斜率为0 2 - - 印0 2n s p f 翻转电位是- 3 1 0 ：1 ：4 8 m v 3 1 5d r g 神经元上五电流的激活曲线 将细胞钳制在- 6 5 m y ，给予从_ 5 5 m y 到1 3 5 m y 跃阶为1 0 m y 的刺激后将电压钳制 在1 3 5 m y ，通过测定在一1 3 5 m y 时候的尾电流得到矗的激活曲线( 如图4 1 所示，插 入部分为所用电压模式) 每个神经元的激活曲线均由以下b o l t z m m m 方程进行拟 合：( 五舢1 k l 。) ，( i j 。，衄咖h ) 鼍1 + e ( 。“。v 0 5 埽1 ，其中v 。是所给予的预测试电压，v o5 是五半激活时候的膜电压，k 是稳态激活曲线的斜率，五蝴是预激活后的尾电流的 峰值，五吐。和l m 。分别是预测试电压为5 5 m y 和一1 3 5 m y 时候的尾电流( 如 图4 a 箭头所示) 。半激活电压v o j 和稳态激活曲线的斜率k 分别是9 9 4 1 1m v 和一1 0 2 - + 0 3i i v ( n - - 5 0 ) ( 如图4 b 所示) 。其中半激活电压v o5 与膜电容的p e a r s o n 相 关系数r = 0 0 3 ，这个值与r - - 0 没有显著性差异( n = 5 0 ，p = o 8 5 ，a n o v a ) ；稳态激活 曲线的斜率k 与膜电容的p e a 瑁相关系数r = 0 1 5 也与r = 0 水平没有显著性差异 ( n = 5 0 ，p = o 3 0 ，a n o v a ) 。由此可见，本实验中这两个参数均与细胞的膜电容没有相 关性。 1 0 2 0 0 6 器硬士学位论文 a | | 险阻 图4 五电流的稳态激活曲线图4 a ，以如图所示的测试电压模式激活五电流，以尾电流伍曲 和最小尾电流编岫。测试电压为- 5 5 v 时的尾电流) ( 箭头所示) 的差值作为五的激活指标 图4 b 示在5 0 个神经元上用单b o l t z m a n n 方程拟合获得的稳态激活曲线。纵坐标代表标准化电 流气6 _ m 1 湫k 。- 曲由) 指的是测试电压为1 3 5m v 时的尾电流( 箭头所示) 拟台 得到的半激活电压v o j 和斜率k 分别为- 9 9 壮1 1m v 和- 1 0 2 = 1 ：0 3m y 3 1 6 在- - h 表达的细胞上可观察到“去极化下陷” 为了研究五电流对膜电位和神经元兴奋性的影响，在电流钳模式下，给予五电流 表达细胞一系列的外向电流灌注( o 到- 2 0 0 p a , 5 0 0m s ，跃阶- 5 0p a , 如图5 所示) 。这 种方式可以使细胞膜发生阶梯型的超极化变化。当给予足够的外向电流注入时，膜 电位先是发生超极化，接着产生缓慢的“去极化下陷”( d e p o l a r i z i n gs a g ) ( 如图5 箭头所示) ，这种“去极化下陷”可使膜电位的超极化程度降低。在外向电流灌注 结束后，神经元能自发产生一系列的动作电位( 如图5 所示) ，这种现象仅仅发生在能 产生。去极化下陷”膜电位水平上。“去极化下陷”的出现提示超极化激活内向电 流的参与，因为细胞外灌流c s c i ( 1 m m ) 能完全阻断这种“去极化下陷”以及随后出 现的膜的自动去极化( 数据未显示) ，这就提示五电流是出现这种“去极化下陷” 的基础，矗电流的激活可使细胞的兴奋性增加。 华中辩技大学蘑济医学皖2 0 0 6 器硬士掌经论文 善舢 董4 1 0 喜1 三 l 棚 o 曲 毛圣奏量耋i 一 撕蚺 0 j0 1 1 弧l l l 图5 耐膜电位和神经元兴奋性的影响在电流钳模式下，给予表达五电流的细胞一系列的 负电流灌注( 从o 蔓j - 2 0 0p 持续5 0 0m s , 跃阶- 5 0p a ) 这种方式可以使细胞膜发生阶梯型的超 极化变化当给予足够的负电流注入时，超极化激活的内向电流产生，使细胞膜发生缓慢的。去 极化下陷”( d e p o l a r i z i n gs a g ) ( 箭头所示) 在负电流灌注结束后，神经元能自发产生一系列的 动作电位( 箭头所示) 3 2 缺氧对i h 的影响 3 2 。l 缺氧对膜电位的影响 关于缺氧对膜电位的影响，不同的实验室得出的结论不尽相同。有人观察到缺 氧可使膜电位向去极化方向变化 9 - 埘，然而，另一些实验发现缺氧使得膜电位向超极 化方向变化【1 3 洲。为进一步探求这一问题的答案，我们在急性分离的小鼠背根神经 节神经元上观察了缺氧对该种细胞膜电位的影响。当给与短时间的缺氧( 小于3 分 钟) 时，在被观察的1 5 个细胞中，有9 个发生膜电位的超极化变化，从7 8 1 + - 2 8 m y 到1 0 3 1 + - 4 8 m y ( p 0 0 1 ，配对t 检验) 。而其他的6 个神经元在缺氧前后膜电位没有明 显的变化。缺氧前后分别为7 4 8 + - 2 8 m y 和7 4 5 + - 3 2 m y ( p - - o 7 3 ，配对t 检验) 因 此根据细胞对缺氧的不同反应，我们将d r g 神经元分为两类：缺氧敏感型和缺氧不 敏感型。 2 0 0 6 屠硬士学位论文 由于有报道称，在海马的中间神经元，k 参与细胞膜静息膜电位的形成口习，在 缺氧敏感型d r g 神经元上，观察到的超级化变化可能与缺氧对i h 的抑制有关，为了验 证这种假设，我们进一步测定了在给予c s c l o m m ) 前后的静息膜电位。结果发现，在 d r ( 稀经元，静息膜电位不受c s c l 的影响。 因为缺氧敏感的神经元的膜电位在短暂缺氧后发生平移从- 7 8 1 4 - 2 8m v 到 - 1 0 3 1 “8m v ，变化后的膜电位非常接近k 的半激活电位。我们推测，缺氧可能激活 k 电流，从而参与缺氧时的病理性疼痛发生。因此，对于缺氧敏感的d r g 神经元，我 们进一步研究了缺氧对其i h 的影响。 3 2 2 缺氧抑制i h 电流 与之前的预想相反，在所观察的所有缺氧敏感型d r g 神经元，不到3 分钟的短暂 缺氧可以完全阻断k 电流，更奇怪的是，在同样的缺氧条件下，已经被抑制的i h 电流 又可以被一串更为超级化的刺激( 从1 1 5m v 到1 7 5m y ) 重新激活，丽以上效应均 可在以常氧灌流液灌流5 分钟后恢复( 如图6 所示) a l w月1 w 。一 目_ 叫“ ! l 沁 ! l 一 图6 缺氧抑制k 电流。图6 a ，灌流常氧外液时，记录的对照k 电流。图6 b ，缺氧时，利 用在常氧情况下的钳制电压模式，k 电流被完全抑制。图6 c ，当使钳制电压向超级化方向平 移时，k 电流重新被激活。图6 d ， 常氧及其缺氧条件下的i h 电流密度和各自所用的测试电压 的关系。表示p o 0 5 差ib姜 华中辩技大学弱济医学院2 0 0 6 羁碗士学垃论文 3 2 3 缺氧使翻转电位向超级化的方向变化，但不改变k 电流的最大电导 为计算l h 的翻转电位和最大电导，先用- 1 3 5 m v 的预刺激使l h 完全激活，然后测定 电压从5m v 到- 1 2 5m v 的尾电流，以线形回归方程：k i 艄时刊3 i i ，。酗鲫m - v 。) 拟 合。因为缺氧使得i h 在此电压时完全抑制，为测定在缺氧状态下的翻转电位和最大电 导，我们将预刺激改为1 7 5m v ，测试电压从 1 1 5m v 到1 6 5m v 。结果发现，缺氧时翻转电位从_ 3 3 84 - 4 9m v 变化为斟8d ：4 9 m s ( p o 0 5 ) 2 0 0 6 强硬士学位论文 讨论 本实验中，k 电流可被超级化激活和氯化铯可逆性阻断，在观察的1 5 5 个d r g 神经元，其矗电流的平均表达率是7 5 5 。这与其它实验室在新生大鼠d r g 胞体上 的研究结果相符( 五电流的表达率为8 0 ) 【3 3 】。不同大小的d r g 神经元上的k 分 布特征与别的报道相一致d q ，即在大细胞上有着更高的表达率。除此之外，我们所 得的激活动力学相关数据也同别的实验室的描述相一致。如k 电流的平均翻转电位 和最大电导分别为3 1 0 ：t ：4 8i e t v 和0 1 7 土 0 0 2n s p f ，这与之前的在小鼠d r g 神经元 上所得的数据- 2 7 o 蛹2m v 和0 2 4 ：主- 0 1 lm y 非常接近 3 7 1 。 在之前的研究中发现，k 电流曲线有时可用单指数【3 8 3 9 最佳拟合，有时需要用 双指数方程阻4 0 最佳拟合。在本研究中，我们发现大约7 0 ( 4 4 个被观察的细胞中 的3 1 个1 的神经元可以由单指数方程最佳拟合，而其余的3 0 ( 4 4 个细胞中的其他 1 3 个河用双指数方程最佳拟合。这就表示表达在不同d r g 神经元上的k 有着不同 的特征。这种不同的细胞需要用不同的指数方程拟合的现象可能是因为五通道存在 有不同亚型，而不同亚型的激活动力学特点不同。现在已经克隆了编码哺乳动物的 矗通道的4 种基因家族( h c n l - h c n 4 ) 【4 1 1 。表达于h e k 2 9 3 细胞株上的4 种矗通道 皿型h c n i f i c n 4 被证实有不同的激活动力学特征，其中h c i , , 1 1 的澈潜时间常数量 小，h c n 2 h c n 4 依次增大，也就是说，f i c n l 的激活速度最快，其他依次递减【4 2 】。 本实验中不同的细胞有着不同的拟合特性提示，在d r g 上存在h c n 通道的不同的 异构体。这于有关大鼠的d r g 神经元上同时表达有h c n 1 、h c n 2 、h c n 3 三种k 通道的报道相一致【4 3 ，4 哪。 为了阐明是否不同大小的d r g 细胞上的五有不同的特征，我们作了描述五的不 同参数和膜电容之间的相关分析。结果发现：矗的时间常数f 和最大电导密度 g h 。陆硫，均与神经元的膜电容负相关，而电流密度、半激活电位v o 5 、翻转电位 v 。和激活曲线的斜率k 均与膜电容没有直接的相关性。这表明，不同大小的小鼠 d r g 神经元上的矗电流具有不同的特性。表达在大细胞上的电流有更快的激活速度， 这与t l l 等人的结果一致，他们证实h c n 1 主要表达在大细胞和中等大小的细胞上， 该亚型具有最快的激活速度1 3 6 1 由于在不同大小的细胞上矗电流密度没有显著性差 2 0 0 6 疆碗士学位论文 异，而最大电导又与细胞大小负相关，这个结果提示，大d r g 细胞上的厶通道的开 放概率较小细胞上的高。关于这一点，需要使用单通道膜片钳的方法进一步证实。 与我们的结果不同的是，t u 等人发现表达在大细胞上的厶电流的v o j 和电流密度都 比小细胞和中等细胞上的要高 3 6 1 。我们推测，产生这样的差异可能有以下一些原因： 1 ) 实验中所使用的动物不同，他们用的是大白鼠，而我们的是小白鼠：2 ) 所取的 d r g 的节段不同，他们的实验中仅仅采用腰4 和腰5 节段的d i m ，我们的实验中取 的是所有胸段和腰段的d r g 。 近年来，越来越多的研究报道了k 电流参与静息膜电位的调控( 3 5 ，舒】和神经系统 的自律性活动 4 6 1 。除此之外，也有报道证实h 的激活参与d r g 神经元在神经病理性 损伤时过度兴奋的发生，从而与在此时产生的神经性疼痛阱l 和慢性压迫所致的痛觉 过敏 3 2 1 的发生相关在本研究中观察到的“去极化下陷”也表示，在超级化状态下 激活的k 电流可以使膜电位发生去极化变化，从而可以增加神经元的兴奋性 缺氧或者缺血是神经系统最常见的损伤因素之一。在缺氧时，神经元过度兴奋 是被人们广为接受的最重要的损伤机制之一。由于缺氧时，神经元的兴奋性增加， 从而导致钙离子内流增加，神经元释放的兴奋性递质也增加，如谷氨酸。进而，通 过兴奋性中毒机制，引起神经元的低氧性损害n 9 - 2 7 i 虽然h 的激活可增加神经元的兴 奋性，本实验中，我们发现，在缺氧条件下，6 0 ( 1 5 个被观察的神经元中的9 个) 的神经元的膜电位发生超级化变化，而i h 电流并不参与这一过程。因此，我们推测， 对于这些缺氧敏感型的细胞，k 可能参与缺氧时的低氧性损害效应。 奇怪的是，这些缺氧敏感型细胞在缺氧时虽然发生了膜电位的超级化变化，更加 接近i h 电流的激活电压，可是结果观察到的却是缺氧时i h 电流的完全抑制。进一步 的研究显示缺氧改变k 的电压依赖性特性。翻转电位v 。和半激活电压v 0 5 均向着 超级化的方向平移。i h 的最大电导和稳态激活曲线的斜率硼自并没有变化。因此，虽 然缺氧时，膜电位向超级化方向变化了，但是此时k 电流的激活电压也向更加超级 化的水平平移了。 综上所述，我们的研究结果表明，在不同大小的d r g 细胞上的五电流的表达率 不同。细胞越大，表达率越高。不同神经元上所表达的k 电流的特性也不相同。缺 氧通过将k 电流的激活电压向更加超级化的方向平移从而抑制k 电流。 1 7 2 0 0 6 商硬士学位论文 参考文献 d i f 燃, d ，p a c e m a k e rm e c l u m i s m s 胁c a r d i a ct i s s u e a b n ur e vp h y s i o l ， 1 9 9 3 5 5 ：p t4 5 5 - 7 2 p a i , h c ，q u e e r c u r r e m a n d p a c e m a k e r ：t h e h y p e r p o l a r i z a a o n - a c t i v a t e d c a t i o n c u r r e n t n ，钾柏叼腿a n n ur e v p h y s i o l ，1 9 9 6 5 8 ：p 2 9 9 - 3 2 7 l u t h i , 丸a n d d 丸m c c o r m i c k , h - c u r r e n t ：p r o p e r t i e s o f a n e u r o n a l a n d n e t w o r k p a c e m a k e r n e u r o n , 1 9 9 8 2 l ( 1 ) ：p 9 - 1 2 m a y e r , m l a n dg l w e s t b r o o k , av o l t a g e - c l a m pa n a l y s i so f i n w a r d ( a n o m a l o u s ) r e c t i f i c a t i o n 拥m o u s es p i n a l s e n s o r y g a n g l i o nn e v i r o n e s jl 珞y s i o l , 1 9 8 3 3 4 0 ：p 1 9 - 4 5 s 镊o g 鹦s ，e ta 1 ，v a r i a t i o ni n1 h , i i ga n d i l e a kb e t w e e na c u t e l yi 博o l a t e d a d u l tr a td o r s a lr o o tg a n g l i o n 万e 埘叼嘴o f d i f f e r e n ts i z e jn c u r o p h y s i o l1 9 9 4 7 l ( 1 ) ：p 2 7 1 - 9 v i l l i e m , v a n de m m c l a c h l a n , e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l p r o p e r t i e s 删饧明删新 i n t a c