（细胞生物学专业论文）pnp基因克隆及其表达载体的构建与鉴定.pdf

摘要 摘要 目的：研究p n p 基因的克隆、真核表达载体的构建与鉴定，为肿瘤的 基因治疗与基因工程的应用提供实验和理论依据。 方法：大肠埃希氏杆菌k 1 2p n p 基因的p c r 扩增；重组质粒 p m s c v o p n p 的构建；用氯化钙法制各感受态大肠杆菌( x l l b l u e ) ；转 化感受态菌：用携带目的基因的重组质粒p m s c v - p n p 转化感受态x l l b l u e 大肠杆菌，同时设立阳性对照组和阴性对照组。转移适量转化菌于平皿培养， 筛选氨苄青霉素抗性转化菌落；提取质粒和酶切重组质粒：提取重组质粒 p m s c v - p n p ，限制性内切酶e c o ri 和b g li i 双酶切重组质粒，电泳鉴定； p c r 鉴定、测序鉴定重组质粒p m s c v - p n p 提取质粒和酶切质粒：限 制性内切酶b s p hl 、b g l i i 、a f t1 1 分别酶切p v s v - g ，p g a g p o l ，p m s c v ， 电泳鉴定质粒。 结果：p n p 基因p c r 扩增出特异条带；重组质粒p m s c v - p n p 电 泳结果与预期一致；重组质粒p m s c v - p n p 转化结果：实验组平皿上可见 近百个菌落，阳性对照组有数百个菌落生长，而阴性对照组则未见菌落生长； 阳性克隆质粒p m s c v - p n pp c r 鉴定、酶切鉴定，电泳条带与预期一致； 测序结果正常；克隆质粒p v s v - g ，p g a g p o l ，p m s c v 酶切鉴定与预期 一致。 结论：从大肠埃希氏杆菌k 1 2 中克隆到p n p 基因；构建了表达载 体p m s c v - p n p ；抽提了三种载体质粒p m s c v 、p v s v - g 、p g a g p o l 。 关键词：p n p 克隆；重组质粒；鉴定 i i a b s 仃a c t a b s t r a c t o b j e e t i v e ：t oc o n s t r u c ta n di d e n t i f yt h er e c o m b i n a n tv e c t o rp m s c v - p n p c a r r y i n ge c o l ik 12p n p w h i c hc a ne x p r e s si ne u k a r y o t ec e l l sa n dw h i c hw i l lp r o v i d e t h eb a s i sf o rg e n et h e r a p y m e t h o d s ：p n pw e r ea m p l i f i e df r o me c o l ik 1 2b a c t e r i ab yp o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n ( p c r ) t oc o n s t r u c tt h er e c o m b i n a n tv e c t o rp m s c v - p n pb y m e a n so ft 4 一d n al i g a s e c o m p e t e n tec o l i ( s t r a i nx l l 一b l u e ) w a sp r e p a r e d u s i n gc a l c i u mc h l o r o i d t r a n s f o r m a t i o n o ft h e c o m p e t e n tb a c t e r i a ：w e t r a n s f o r m e dt h ec o m p e t e n tb a c t e r i aw i t ht h ep l a s m i d sp v s v - g , p g a g - p o l ，p m s c v a n dp m s c v - p n pc o n t a i n i n gp n pg e n e t h ea p p r o p r i a t ev o l u m eo ft h et r a n s f o r m e d b a c t e r i aw a st r a n s f e r e da n d s p r e a d e d o n t oa g a rl bm e d i u mt os e l e c tt h e a m p i c i l l i n r e s i s t a n tc o l o n i e s e x t r a c t i o na n dr e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s ea n a l y s i so f t h ep l a s m i d s ：t h ep l a s m i d sp v s v - gp g a g p o l ，p m s c v , p m s c v - p n pw e r e e x t r a c t e df r o mt h et r a n s f o r m e db a c t e r i aw i t hp l a s m i d p u r i f i c a t i o nk i t ，a n dt h e yw e r e c u tw i t hr e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s e sb s p hi 、b g li i 、a f ti i ，e c o ria n db g l 兀， r e s p e c t i v e l y r e s u l t s ：a m p i c i l l i nr e s i s t a n tt r a n f o r m e db a c t e r i ac o l o n i e sg r o w t h ：a f t e r t r a n s f o r m a t i o nw i t hp m s c v ，p m s c v - p n p , p g a g p o la n dp v s v - g , a b o u t10 0 c o l o n i e sw e r eo b s e r v e do nt h ep l a t ec o n t a i n i n ga m p i c i l l i n ，a n dt h ec o l o n i e sw e r en o t f o u n di nt h en e g a t i v ec o n t r o lg r o u p s t h en o r m a ls i z eo ft h ef r a g m e n t sf r o mt h e p l a s m i d sc u tb ye n d o n u c l e a s e s ：t h er e s u l t so fr e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s ea n a l y s i sa n d a g a re l e c t r o p h o r e s i s i n d i c a t e dt h a t s i z eo fp l a s m i d s p m s c v , p m s c v - p n p , p g a g - p o l a n dp v s v - gw a sn o r m a l c o n c l u s i o n ：e c o l ik 1 2p n pc a nb es u c c e s s f u l l yc l o n e d a n di n s e r t e di n t o e x p r e s s i o nv e c t o r t h en e w l yc o n s t r u c t e dv e c t o rm a ys e r v ea st h ep o t e n t i a lt o o lt o c o n d u c tf u r t h e rc o m p r e h e n s i v ee x p e r i m e n t si nf u t u r eo np n pf u n c t i o na n do ng e n e t h e r a p y k e yw o r d s ：p u r i n en u c l e o s i d ep h o s p h o r y l a s e ；c l o n e ；r e c o m b i n a n tv e c t o r ；i d e n t i f y 缩略词表 英文缩写英文全称 p n p b p k b k d o d d m s 0 d n a r n a d n t p e d t a g f p d h m l n s l b r p m 缩略词表 中文名称 p u r i n en u c l e o s i d ep h o s p h o r y l a s e嘌呤核苷磷酸化酶 b a s ep a i r ( s ) k i l o b a s e k i l o d a l t o n 碱基对 千碱基 千道尔顿 o p t i c a ld e n s i t y光密度 d i m e t h y ls u l p h o x i d e 二甲基亚砜 d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d r i b o n u c l e i ca c i d 脱氧核糖核酸 核糖核酸 d e o x y r i b o n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e 脱氧核糖核苷三磷酸 e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n绿色荧光蛋白 d a y ( s ) h o u r ( s ) m i n u t e ( s ) s e c o n d ( s ) l u r i a b e r t a i nb r o t h r e v o l u t i o n ( s ) p e rm i n u t e 1 v 天 小时 分钟 秒 l b 培养基 每分钟转数 缩略词表 p c r r n m s c v v s v - g p b s t e t a e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链反应 r e t r o v i r u sv e c t o r 逆转录病毒载体 m o u s es t e mc e l lv i r u s鼠源干细胞病毒 v e s i c u l a rs t o m a t i t i sv i r e sg口腔炎疱疹病毒g 蛋白 p h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e磷酸盐缓冲液 t r i s e d t ab u f f e rt r i s e d t a 缓冲液 t r i s a c e t a t e e d t ab u f f e r嘶s 乙酸e d t a 缓冲液 v 学位论文独创性声明 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南昌大学或其他教育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名( 手写) ：字日期： 2 。8 年6 月名日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅 和借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名( 手写) ：导师签名( 手写) ： 签字日期：2 。8 年6 月 易日 签字日期：2 。8 年6 学位论文作者毕业后去向： 工作单位：南昌大学抚州医学分院生化教研室电话：1 3 3 0 7 9 4 6 5 6 3 通讯地址：江西省抚州市东临路9 号抚州医学分院邮编：3 4 4 0 0 0 第一章前言 第一章前言 自杀基因( s u i c i d eg e n e ) 是一类前体药物转换酶基因，其编码的特异性酶类 将原先对细胞无毒或毒性极低的前体药物在肿瘤细胞内代谢成毒性产物，从而 达到杀死肿瘤细胞的目的。目前研究过的自杀基因有十余种，最常用的是 h s v - t k g c v t l 】和c d 5 f c t 2 】两种自杀基因系统，对多种肿瘤具有治疗作用，但 有效报道十分有限。与其它自杀基因系统相比，近来发现的大肠杆菌p n p 基因 编码的嘌呤核苷磷酸化酶( p u r i n en u c l e o s i d ep h o s p h o r y l a s e ，p n p 酶) ，可将多种 核苷类物代谢为有毒的嘌呤类物【3 】，这种细胞毒性分子通过抑制肿瘤细胞d n a 、 r n a 和蛋白质的合成，杀死肿瘤细胞。人类细胞内的p n p 为三聚体，特异性强， 只能催化6 一甲基嘌呤核苷的磷酸化反应。然而，细菌的p n p 与人类细胞p n p 的四级结构与底物特异性均不同，这种底物特异性的不同正被用来研究肿瘤细 胞靶向基因治疗。 p n p 酶是核苷磷酸化酶家族的成员之一【3 】。所有家族成员均催化可逆的嘌 呤或嘧啶( 27 脱氧) 核苷的n 一糖苷键的剪切，产生1 个自由的碱基和1 一磷酸( 27 脱氧) 核糖。根据氨基酸序列和物理学属性可将p n p 酶分为2 类【4 j 。第一类主要 在原核生物中发现，这些p n p 酶通常由分子量约为2 6k d 的亚基组成同源六聚 体。一般接受6 氧和6 氨基嘌呤作为底物，如大肠杆菌p n p 基因编码的p n p 酶。第二类由脊椎动物p n p 酶组成，这些p n p 酶通常由分子量约为3 2k d 的 亚基组成同源三聚体。通常以6 氧嘌呤作为底物，如人n p 基因编码的核苷磷 酸化酶。 来源于大肠埃希氏杆菌k 1 2 的p n p 基因( g e n e l d ：9 4 5 6 5 4 ) ，全长7 2 0b p ， 编码合成含2 3 9 个氨基酸残基、分子量为2 5 8 1 9 道尔顿的嘌呤核苷磷酸化酶 ( e c 2 4 2 1 ) ，催化可逆的嘌呤( 2 脱氧) 核糖核苷n 糖苷键的磷酸化剪切， 产生1 磷酸( 27 一脱氧) 核糖和1 个自由的嘌呤碱基【4 5 】。同人的p n p 基因的功能 不尽相同，能将前体药物腺嘌呤类似物氟达拉滨( f l u d a r a b i n e ) 转换成毒性物质， 从而杀伤肿瘤细胞。 p n p f l u d a r a b i n e 自杀基因系统较之h s v t 科g c v 和c d 5 f c 两种自杀基 因系统对肿瘤细胞的杀伤作用有以下优势：o p n p f l u d a r a b i n e 系统能够影响到 第一章前言 细胞的d n a ，r n a 和蛋白质的合成，对增殖分裂期和非增殖分裂期的肿瘤细 胞都有杀伤作用【6 】。良好的旁观者杀伤( b y s t a n d e rk i l l i n g ) 效应。在目前基因转 移效率还较低的情况下，旁观者杀伤效应对使用前体药物自杀基因系统的肿瘤 基因治疗来说是一个基本要求。传统h s v - t i l g c v 自杀基因系统的毒性产物为 磷酸化物，不能透过脂质膜，只能通过细胞连接进入紧邻细胞，其旁观者效应 必须依赖细胞连接，故其旁观者效应弱。而p n p 酶系统的毒性产物为非磷酸化 的嘌呤碱基，由于人细胞膜上有促进嘌呤双向跨膜扩散的碱基载体，因此不需 要细胞接触或缝隙连接，p n p 酶催化所产生的腺嘌呤类似物就可通过细胞膜扩 散，并有效地杀死那些未表达大肠杆菌p n p 酶的邻近肿瘤细胞，旁观者杀伤效 应明显【_ 川。高效率。同h s v - t k 系统比较，p n p 系统只需要较低的病毒复数 就可产生相同的细胞杀伤作用，并且细胞杀伤出现的时间更早。特异性。由 于活性位点结构的不同，大肠杆菌p n p 酶能够激活人p n p 酶不能激活的一些 底物，这样一来前体药物就不会被宿主本身的酶剪切，并且仅仅在肿瘤位置被 剪切。持久性。p n p 酶系统是一种长效的自杀基因系统，p n p 酶将前体药物 m e p d r 转化成的产物6 m p 在体内代谢时的半衰期超过了2 4h 。安全性。 p n p 酶系统常用的前体药物氟达拉滨本身已经作为一种化疗药物应用于临床。 目前国内外基因转移方法最常采用的载体有两类：病毒载体( 逆转录病毒 载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体，单纯疱疹病毒载体) 和质粒载体。采用 上述载体虽然已经取得了一些实验成果，但仍存在着一些缺陷：质粒载体介 导的基因转移，基因转移率较低，且携带靶基因的细胞不能长期表达。腺病 毒介导的基因转移，靶基因不能整合入宿主细胞染色体中，只能短暂表达，并 且容易产生有复制能力的腺病毒。腺相关病毒载体介导的基因转移，其携带 的靶基因不能长于4 5 k b ，同时腺相关病毒包装极为困难，不易大量生产。单 纯疱疹病毒载体介导的基因转移，细胞毒性较大，携带靶基因的细胞较难生长。 传统逆转录病毒介导的基因转移，受靶细胞受体的限制，宿主范围较窄。 r v - p m s c v 逆转录病毒载体系统是一种新型的基因转移载体系统，包括 2 9 3e b n a 包装细胞，病毒穿梭质粒p m s c v 、p v s v 和p g a g p o l 。质粒p m s c v ( p l a s m i dm o u s es t e mc e l lv i r u s ) 来源于鼠源干细胞病毒，在构建过程中保存了 l t r s ( 1 0 n g t e r m i n a lr e p e a t s ) ，整合信号i r e s ( i n t e g r a t e dr i b o s o m ee n t r ys i t e ) 及 病毒包装信号1 l r 的d n a 序列，其编码产物为病毒核酸。质粒p v s v ( p l a s r n i d v e s i c u l a rs t o m a t i t i sv i r u s ) 编码产物为病毒包膜蛋白。质粒p g a g p o l 编码产物 2 第一章前言 为病毒衣壳蛋白及逆转录酶。r v - p m s c v 逆转录病毒载体系统有以下优点： 基因转染率高。逆转录病毒携带的靶基因可随机整合入靶细胞基因组，因此 目的基因可长期稳定的表达。该逆转录病毒由三个病毒质粒进入包装细胞后 由包装细胞组装而成，其中质粒p v s v 编码的口腔炎疱疹病毒( v s v ) g 蛋白 替代了鼠源干细胞病毒( m s c v ) 的包膜糖蛋白。v s v - g 可识别细胞膜上普遍 存在的磷脂分子，可与许多种类细胞的细胞膜融合【8 】。因此宿主范围广泛，可 用于细胞株的基因转染和原代培养的造血干细胞的基因转染。由于 r v p m s c v 逆转录病毒是缺陷型，病毒基因组不含病毒包膜基因和衣壳基因， 因此当携带靶基因的r v - p m s c v 逆转录病毒感染靶细胞时，病毒基因组整合入 靶细胞基因组，可转录靶基因和合成靶蛋白，但不能合成病毒结构蛋白，即不 能合成具感染能力的病毒颗粒，这样解决了安全性问题，且又获得了我们所需 要的靶蛋白。 g f p 基因作为报告基因被克隆入质粒p m s c v ，通过荧光显微 镜和流式细胞仪能便捷的分选出被逆转录病毒感染的阳性细胞，克服了以前非 g f p 的方法费时、费力的弊端。 r v - p m s c v 逆转录病毒存在一定的细胞周期 依赖的整合特性，对静止期的细胞感染能力较差，故本系统较适合于恶性肿瘤 细胞和永生化细胞的基因转染，体内转染时可减少对正常组织细胞的转染。 本研究从大肠埃希氏杆菌k 1 2 中克隆p n p 基因，构建和鉴定重组质粒 p m s c v - p n p ，并抽提和鉴定三种病毒穿梭质粒p m s c v 、p v s v 和p g a g p o l ， 在今后实验中可以用2 9 3 包装细胞产生重组小鼠干细胞逆转录病毒，为p n p 基 因的深入研究和临床应用提供实验和理论依据。 3 第二章p n p 基因的克隆 第二章p n p 基因的克隆 以大肠埃希氏杆菌k 1 2 基因组d n a 作为p n p 基因扩增的来源。提取大肠 埃希氏杆菌k 1 2 总d n a ，应用p c r 方法扩增鼢咿基因。 2 1 材料与方法 2 1 1 菌株 大肠埃希氏杆菌k 1 2 由江西省医学生物高技术重点实验室保存。 2 1 2 主要试剂 2 1 2 1 细菌培养试剂： 酵母提取物、胰化蛋白胨：英国o x o i d 公司 琼脂粉：华美生物技术有限公司。 2 1 2 2 自配试剂 2 1 2 2 1 配制l u r i a b e r t a n i 液体培养基9 j 胰化蛋白胨 1 0 9 n a c l 1 0 9 酵母提取物 5 9 去彦王丞定空王! q q q 世 p h 7 4 ，高压灭菌，4 。c 备用 2 1 2 2 2 配制l b 固体培养基0 1 0 1 l b 液体培养基 5 0 0 m l 速目置捡窆g 4 第二章p n p 基因的克隆 高压，冷却至5 0 6 0 后倒平板，4 c 备用 2 1 2 3 基因扩增试剂： m i n i b e s tb a c t e r i a lg e n o m i cd n ae x t r a c t i o nk i tv e r 2 0 、l ap c r t a qd n a p o l y m e r a s e ：大连宝生物工程有限公司； d n t p 美国p r o m e g a 公司； g e n e r u l e r t md n al a d d e r sm i ) 【：美国f e r m e n t a s 公司。 2 1 3p c r 引物的设计与合成 引物设计使用p r i m e rp r e m i e r5 0 软件，参照g e n b a n k ( 酉：4 917 5 9 9 0 ) 中p n p 基因的序列设计，p n p 基因片段两末端分别引入b g l i i 和e c o ri 限制性内切酶 位点，由大连宝生物工程有限公司合成。 引物序列如下： p n p f ：5 - g g g 鱼丛i a t g g c t a c c c c a c a c a t t 从g g 3 ( 7 3 8b p ) b g li i r ：5 一g g g 鱼丛i i t t a c t c t t l j a t c g c c c a g c a - 3 e c o ri 2 1 4 主要仪器 u1 6 0 0 型c 0 2 恒温培养箱：美国n u a i r e 公司 a b1 0 4 n 型l i b r o r 电子天平：日本s h i m a d z u 公司 s w - c j i f 型超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司 d y y - i i i 型水平式电泳槽，e c p 3 0 0 0 型电泳仪：北京六一仪器厂 u 2 0 0 0 型紫外分光光度计：日本h i t a c h i 公司 p e 9 7 0 0 型基因扩增仪：美国a p p l i e db i o s y s t e m s 公司 d f 3 0 0 s 型照相机：上海海鸥照相机厂 u v - i i 型紫外透射反射分析仪：北京新技术应用研究所 c r 2 1 型高速冷冻离心机：日本h i t a c h i 公司 2 1 5 大肠埃希氏杆菌k 1 2 常规培养 5 第二章p n p 基因的克隆 ( 1 ) 无菌接种环直接从冻存的大肠杆菌储存液中所需的菌种在l b 琼脂板表 面划线，于3 7 培养2 0h 。 ( 2 ) 从过夜培养的l b 琼脂板中挑取一个直径约2i n l t l 单菌落，转到一个含 有5 0 m ll b 的1 l 烧瓶，于3 7 。c 培养2 0h 。 2 1 6 大肠埃希氏杆菌k 1 2 基因组d n a 的提取 ( 参考t a k a r a 公司d v 8 1 0 a 产品使用说明书) e c o l i k l 2 单菌落接种于5 0m ll b 培养基中，3 7 过夜培养。取6 次5m l 菌液，1 2 0 0 0r p m 离心3m i n 。弃上清夜，菌体沉淀物以供提取d n a 。 ( 1 ) 加入1 5 0p l 的s pb u f f e r ( r n a s e a l ) ，振荡混匀。2 0 1 a l 的l y s o z y m e 溶液， 室温静置5m i n 。 ， ( 2 ) 加入3 0p l 的e d t ab u f f e r ，均匀混合，室温静置5m i n 。 ( 3 ) 加入2 0 0l j l 的溶解液a ，4 0 0 a l 的溶解液b ，6 5 0i l l 的溶解液c ，上下 颠倒混匀，1 2 0 0 0r p m 离心1m i n 。 ( 4 ) 水相移入f i l t e rc u p 中，1 2 0 0 0r p m 离心1m i n 。加入4 5 0l a l 的d bb u f f e r ， 混合均匀。将上混合液移入s p i nc o l u m n 中，3 6 0 0r p m 离心1m i n ，弃滤液。， ( 5 ) 加5 0 0l a l 的r i n s ea ，3 6 0 0r p m 离心1 m i n ，弃滤液。加7 0 0l j l 的r i n s eb ， 3 6 0 0r p m 离心1m i n ，弃滤液。再加7 0 0p l 的r i n s eb ，然后1 2 0 0 0r p m 离心1m i n 。 ( 6 ) 在s p i nc o l u m n 膜中央处加入6 0p 1 的预热至6 5 的e l u t i o nb u f f e r ，室 温静置1m i n 。1 2 0 0 0r p m 离心1m i n 洗脱d n a 。将所提取的d n a 于2 0 保存。 2 1 7p n p 基因片段p c r 扩增 以大肠埃希氏杆菌k 1 2 基因组d n a 为模板，上、下游引物各1l a l ( 见2 1 3 ) ， 扩增p n p 基因。 2 1 7 1p c r 反应体系( 5 0 p 1 ) ： ( 参考t a k a r a 公司d r r 0 0 2 a 产品使用说明书) 1 0 x l at a qb u f f e ri i ( m 9 2 + p l u s ) d n t pm i x t u r e ( 2 5 m me a c h ) 6 5 1 a l 4 t a l 第二章p n p 基囚的克隆 u p s t r e a mp m e r ( 2 0 u m ) d o w n s t r e a m p n m e r ( 2 0 7 a m l t a k a r a l a t a q ( 5 u pj ) d n a t e m p l a t e n u c l e a s e f r e ew a t e rt oaf i n a lv o l u m eo f 2 1 7 2p c r 反应参数 1 p l 1 o5 u 1 l u l 5 0 l a ( 参考t a k a r a 公司d r r 0 0 2 a 产品使用说明书) 9 6 c2 m i n 热启动： 9 4 5 0 s ，5 8 3 0 s ，7 2 l m i n ，循环3 0 次： 7 2 。c5 m i n 最终延伸，4 c 保存，扩增产物15 琼脂糖凝胶电泳 2 2 结果 2 2 1 大肠埃希氏杆菌k 1 2 总d n a 抽提结果 大肠埃希氏杆菌k 2 基冈组d n a15 琼脂糖凝胶电泳可见一条淡红色 条带结果显示提取到总d n a 可以进行p c r 实验( 见图1 ) 。 肠杆菌基因组总d n a r f i 9 1t h e t o t a ld n a o f c o i l k l 2 图1 大肠埃希氏杆菌k 1 2 总d n a 第一章p n p 萆冈的克隆 2 2 2p n p 基因扩增结果 p c r 产物15 琼脂糖凝胶电泳，p n p 基因长约7 3 8b p ，扩增出的特异条带 与预期大小致f 见图2 ) 。 f i g2a n a l y s i so f p c rp r o d u c t sf r o mec o l ik 1 2o n a15 a g a r o s eg e l 罔2 大肠杆菌p n p 基因扩增 2 3 讨论 来源于大肠埃希氏杆菌k 1 2 的尸 【p 基 习( g e n e l d ：9 4 5 6 5 4 ) ，全长7 2 0b 口， 编码合成禽2 3 9 个氨基酸残基，分子量为2 5 8 1 9 道尔顿的嘌呤核昔磷酸化酶 ( e c2 42 】) ，催化可逆的嘌呤f 2 一脱氧) 核糖核苛n 一糖苷键的磷酸化剪切，产 生l 一磷酸( 2 一脱氧】核禧和一个自山的嘌呤碱基 4 ”。 在人类与之相列应的基因为p 基因( g e n e l d ：4 8 6 0 ) ，位于染色体1 4 q 1 31 ， 仝k = 7 6 3 5b p ，成熟r n r n a 全陆1 4 1 8b p ，翻译区为1 1 0 - 9 7 9b p ( 长8 7 0b p ) ，编 码台成含2 8 9 个氧基酸残基、分子量为3 2 0 1 7 道尔顿的核苷磷酸化酶 f e c242 l p 忆 由于活性位点结构的不同，大肠杆茼p n p 酶能够激活人核苷磷酸化酶不能 激活的一些底物，如作为自口体药物的腺苷类似物m e p d r 。这样一束前体药物 就不会是宿主本身产生的酶的底物，并且仅仅在肿瘤位置被剪切，从而减轻前 体药物对宿主正常细胞的毒性。 p n p 酶自杀基因系统还有阻f 优势：p n p f l u d a r a b i n e 系统能够影响到细 第二章p n p 基冈的克隆 胞的d n a ，r n a 和蛋白质的合成，对增殖分裂期和非增殖分裂期的肿瘤细胞 都有杀伤作用【6 j 。良好的旁观者杀伤( b y s t a n d e rk i l l i n g ) 效应。传统 h s v - t k g c v 自杀基因系统的毒性产物为磷酸化物，不能透过脂质膜，只能通 过细胞连接进入紧邻细胞，其旁观者效应必须依赖细胞连接，故其旁观者效应 弱。而p n p 酶系统的毒性产物为非磷酸化的嘌呤碱基，由于人细胞膜上有促进 嘌呤双向跨膜扩散的碱基载体，因此不需要细胞接触或缝隙连接，p n p 酶催化 所产生的腺嘌呤类似物就可通过细胞膜扩散，并有效地杀死那些未表达大肠杆 菌p n p 酶的邻近肿瘤细胞，旁观者杀伤效应明显【7 j 。高效率。持久性。p n p 酶系统是一种长效的自杀基因系统，p n p 酶将前体药物m e p d r 转化成的产物 6 一m p 在体内代谢时的半衰期超过了2 4h 。安全性。p n p 酶系统常用的前体药 物氟达拉滨本身已经作为一种化疗药物应用于临床。因为p n p 自杀基因系统的 上述优势，因此p n p 基因成为近年来研究的热点之一。 用p c r 法从细菌中体外扩增目的基因，是现今基因克隆常用的一种分子生 物学技术。实验首先提取出大肠埃希氏杆菌k 1 2 基因组总d n a ，然后以总d n a 为模板，选用设计的特异性p n p 基因上下游引物进行扩增。p n p 基因通过引物 接头设计，引入e c o ri 、b g li i 限制性内切酶位点，扩增产物全长7 3 8b p 。 9 第三章重组逆转录病毒载体质粒p m s c v - p n p 构建及其鉴定 第三章重组逆转录病毒载体质粒p m s c v - p n p 的构建 及其鉴定 载体质粒p m s c v ( p l a s m i do f m u r i n es t e mc e l lv i r u s ) 的多克隆位点含e c o r i 、b g li i 限制性内切酶位点。p c r 扩增产物p n p 基因通过引物接头设计，引入 e c o ri 、b g li i 限制性内切酶位点。分别将质粒p m s c v 和p n p 基因e c o ri 、 b 西i i 双酶切，凝胶回收，t 4d n a 连接酶连接回收产物，将连接子转化入感受 态细菌，氨苄青霉素选择性平板筛选阳性克隆，p c r 、酶切鉴定，测序( 见图3 ) 。 o r i5 l t rp n pg f p3 l t ra n i p 。 包装信号目的基因标记基因抗生素基因 f i g 3 s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f r e c o m b i n a t i o nr e t r o v i r a lv e c t o r p m s c v - p n p l t r ：l o n gt e r m i n a lr e p e a t 1 ，? v i r a lp a c k a g i n gs i g n a l o r i ：r e p l i c o n 图3 重组逆转录病毒载体p m s c v - p n p 结构示意图 3 1 材料与方法 3 1 1 质粒与菌株 逆转录病毒载体质粒p m s c v 和克隆菌株x l l - b l u e 大肠杆菌由江西省医学 生物高技术重点实验室保存。 3 1 2 试剂 e c o ri 、b g li i 限制性内切酶、t 4d n a l i g a s e 美国n e we n g l a n db i o l a b s 公司； 质粒小量抽提试剂盒、凝胶回收纯化试剂盒：美国p r o m e g a 公司； 氨苄青霉素：国产； 其它试剂( 见第二章2 1 2 ) 。 1 0 第三章重组逆转录病毒载体质粒p m s c v - p n p 构建及其鉴定 3 1 3 自配试剂 3 1 3 1 配制选择性固体培养基9 i l b 液体培养基1 0 0 m l 琼脂粉 1 5 9 氢芏壹重塞壁在速( ! q q 婴g 趔】! q q 卫! 高压，冷却至5 0 6 0 加入氨苄青霉素贮存液，混匀，倒平板，4 c 备用 3 1 3 2 配制s o c 液体培养基1 1 2 i 保存 l b 液体培养基4 8 m 1 1 m o l l m g c l 2 0 5 m l l m o l l m g s 0 4 o 5 m l ! 堡q 丛l 苞萤糖! 趔 混匀，0 2 2 p m 滤膜过滤，分装于1 5 m l 的微量离心管，每管1m l ，2 0 。c 3 1 4 新鲜感受态细菌制备o ”l ( 1 ) 从一8 0 。c 冰箱取出菌株x l l b l u e ，无菌接种环挑取少量冰渣在l b 固体培 养基上画线接种，于3 7 培养2 0h 。 ( 2 ) 从3 7 。c 培养2 0h 的l b 琼脂板上挑取单一菌落，接种到3m ll b 液体培 养基中，于3 7 过夜培养。 ( 3 ) 转到一个含有1 0 0m ll b 液体的1 l 烧瓶，3 7 。c ，2 2 0r p m ，震荡培养5h 后出现云雾状现象，o d 6 0 0 = 0 3 5 时停止培养。 ( 4 ) 将细菌转移到两个无菌、一次性使用的、用冰预冷的5 0m l 聚丙烯管中， 在冰上放置1 0m i n ，使培养物冷却至o 。 ( 5 ) 于4 * c 用s o r v a l lg s 3 转头以4 5 0 0r p m 离心1 0 m i n ，回收细菌。 ( 6 ) 弃上清液，将管倒置l m i n ，以使最后的残留培养液尽量流尽。 ( 7 ) ! j l 入预冷的o 1 m o l lc a c l 2 重悬细菌，每管2 0m l ，然后2 管合为1 管。 。 ( 8 ) 于4 用s o r v a l lg s 3 转头以4 5 0 0 r p m 离心1 0m i n 。 第三章重组逆转录病毒载体质粒p m s c v - p n p 构建及其鉴定 ( 9 ) 弃上清液，将管倒置1m i n 以使最后的残留培养液流尽。 ( 1 0 ) ) ) f l5m l 预冷的o 1m o l lc a c l 2 重悬细菌沉淀。 3 1 5 感受态细菌的冻存0 1 4 l ( 1 ) 每2 m l 重悬细菌液加1 4 叩ld m s o ，轻轻旋转混匀之，将悬液置冰上 1 5 m i n 。 ( 2 ) 每份细菌悬液再加1 4 叩ld m s o ，轻轻旋转混匀之，将悬液置冰上1 5 m i n 。 ( 3 ) j g 一速将悬液分装到冷却的无菌微量离心管中，封紧管口，储存于8 0 。c 备 用。 3 1 6 重组质粒p m s c v - p n p 的构建 将载体质粒p m s c v 及p c r 体外扩增的p n p 基因分别用e e o ri 、b g li i 双 酶切，1 5 t a e 琼脂糖凝胶电泳，回收纯化。酶切后的载体质粒p m s c v 与p n p 基因按摩尔数1 ：5 混合，t 4 d n a 连接酶连接。 3 1 6 1 酶切体系 ( 参考b i o l a b s 公司r 0 1 4 4 v 、r 0 1 0 1 v 产品使用说明书) d n a 1 5 2 l a g 1o n e b u f f e rf o re c o ri 5 l a l b g lii(25u ) 2 5 1 a l e e o ri(20 u ) l l a l 丕菌亟苤丕至堇q 丛1 3 7 ，水浴3 h 3 1 6 2 双酶切后的载体质粒p m s c v 与目的基因p n p 回收纯化 ( 参考p r o m e g a 公司n o 3 0 8 产品使用说明书) ( 1 ) 电子天平预热半小时后，称量一只1 5 m l 空微量离心管重量。紫外灯下 切取琼脂糖凝胶中的载体质粒p m s c v 或目的基因p n p 条带，分别将胶加入 1 5 m l 微量离心管，电子天平称重，减去空微量离心管重量，即为加入凝胶的重 1 2 第三章重组逆转录病毒载体质粒p m s c v - p n p 构建及其鉴定 量。 ( 2 ) 按1 0 m g 凝胶：1 0 p lm e m b r a n eb i n d i n gs o l u t i o n 的比例加入一定量的 m e m b r a n eb i n d i n gs o l u t i o n ，盖好盖子，摇匀，6 0 。c 水浴，l o m i n ，离心5s e c 。 ( 3 ) 将m i n i c o l u m n 插入收集管，将融化后的混合物移至m i n i c o l u m n ，室温 孵育lm i n ，1 4 0 0 0r p m 离心l m i n 。 ( 4 ) 清空收集管，加入7 0 0 p 1m e m b r a n e w 瓠hs o l u t i o n ( 已加9 5 乙醇) ，室温， 1 40 0 0r p m 离心1m i n 。 ( 5 ) 清空收集管，加入5 0 叩lm e m b r a n ew a s hs o l u t i o n ，室温，1 4 0 0 0r p m 离 心5m i n 。 ( 6 ) 小心将m i n i c o l u m n 离心管移至另一洁净1 5 m l 的微量离心管中，室温静 置1 分钟，以挥发掉残余的乙醇。 ( 7 ) j j i 4 叩1n u c l e a s e f r e ew a t e r 入m i m c o l u m n ，室温孵育1 耐n ，3 4 c ，1 4 0 0 0 r p m 离心l m i n 。 ( 8 ) 各取5 p l 回收产物，1 5 t a e 琼脂糖凝胶电泳检测，其余保存于2 0 。c 。 3 1 6 3 连接体系( 4 0 p 1 ) ( 参考b i o l a b s 公司m 0 2 0 2 v 产品使用说明书) 1 0 x t 4d n a 连接缓冲液 4 l l l 4 0 p e g8 0 0 0 4 p l t 4d n a l i g a s e( 2 0 0 0u ) 2 p l 卫丛墨y 皇丛呈基固酶切回噍主物( 麈筮数! ；) 兰业1 1 6 ，1 2 h ； 6 5 ，l o m i n 灭活酶；取5 p l 连接产物电泳检测，其余保存 于2 0 备用 3 1 7 重组质粒p m s c v - p n p 的转化1 5 1 3 1 7 1 转化的对照设置 在每一个实验中，设立阳性对照，以估计转化效率；设立阴性对照，以消 除可能的污染及查明可能的失败原因。 阴性对照：将未转化质粒感受态细菌接种于含氨苄青霉素的l b 琼脂培养 1 3 第三章重组逆转录病