（细胞生物学专业论文）ask1一种新型启动子.pdf

兰州大学硕士研究生学位论文 中文摘要 在研究拟南芥发育过程中，常常需要将所研究的基因在植物中过量表达，从而 观察由此而可能出现的异位表型。此外，在图位克隆鉴定某些未知的基因时，也需 要过量表达这些基因尝试瓦补突变体的表型。然而，在拟南芥遗传学研究中最常用 的花椰菜花叶病毒3 5 s 启动予在花器官中，尤其在雄蕊中往往并不能做到持续而强 烈地表达目的基因，所以有利用3 5 s 启动子无法互补突变体表型，或者观察不到异 位表型的事例的报导。本研究中，我们将彳豚，启动子和3 5 s 启动子与绿色荧光蛋白 g f p 的c d n a 片段连接，构建转化质粒；转化拟南芥植物，筛选转基因植物；与此同 时，我们将这两种启动子驱动表达g f p 的报导系统转到拟南芥原生质体的瞬间表达 体系中，观察彳豚j 和3 5 s 启动子的启动子驱动g f p 在植物体内的，和在原生质体内 的表达情况；，探讨彳脒，启动了和3 5 s 启动子组成型表达的优缺点。我们发现在转基 因拟南芥中，3 5 s 启动子在除了花粉中的其他组织都强烈地表达；而在拟南芥原牛 质体里，彳5 k ，和3 5 s 启动予都能驱动g f p 的表达。本实验进一步证明了3 5 s 启动子 在研究雄性器官和雄配子体发生中的确具有很大的局限性。而枷启动子能在拟南 芥的花粉里表达。因此，4 j 以做为雄性器官和雄配子体发生相关基因的启动子来 进行研究。 关键词3 5 s 启动子，么涮，组成型表达，拟南芥，花药，花粉 兰州大学硕士研究牛学位论文 a b s t r a c t i np l 锄td e v e l 叩m 锄ts t u d y ，i ti so f t n e c e s s a 巧t 0o v 盯- e x p r e s st 鹕e tg e 锄d o b s e em ep o s s i b l er e s u l t e de c t o p i cp h e i l o t y p e s b e s i d e s ，i ti sa l s on e c e s s a 盯t 0 0 v e 卜e x p r c s s c e n a i ng e n ei i l c o m p l e m e n t a d rv e r i f i c a t i o n o n c et l l e g e n eh 弱b e i d e n t i f i e dt l u o u g hp o s t i o n a lm a p p i i l g h o w e v e r t l l em o s tg e n e m l l yu s e dc o n s i t i t u t i v e c a m v3 5 sp r o m o t e ro r 肌f 萄li ns 0 m ei i l c i d e n c e s ，e s p e c i a l l yf o rt l l o s eg e i l e si l lm a l e o 唱a i l g e n e s i s 锄dm a l eg 锄e t o g e n e s i s h e r ew el i i l k e dt l l ep r o m o t e rs e q u e i l c e so fo n e p u t a t i v ec o n s i t i t u t i v e l ye x p r e s s i o ng e i l e 彳础0a n dc 心3 5 st om ec d n ao f 伊咖 f l u o r e s c e n tp r o t e i i l ( g f p ) ，r e s p e c t i v e l y s o m et r a n s g e i l i cp l 鲫陋h a db e 朗s c r e e n e d 锄d i d e n t i f i e da r e r 仃a n s f o n l l i n g 彳，口6 坳西p l a n tw 童彳g 口施c f p 一“聊a tt l l es 锄et h e ，w e 缸锄s f o 咖c dm e 咖g f p o v e r - e x p r e s s i o ns y s t e m si i l t ot l l e 么m 6 f 咖筇括p r o t o p l a s t w b f o u i l di n3 5 s ：g f pn 孤s g e i l i cp l 锄t m ee x p r e s s i o no fg f p v e i lb yc a m v3 5 s p r o m o t e r h a sb e f 0 u l l di i la l m o s ta l lt i s s u e so b s e e d ，o n l yw i t l lt h ee x c 印t i o no fp o l l e l l m e 锄w h i l e 、wd e t c c t e dn os i 伊i f i c 锄td i h 研e i l c eb 帆o e nm ee x p r e s s i o no fg f pd r i v 伽 b y 彳豚，p r o m o t e r 觚d3 5 sp r o m o t e ri np m t o p l a s t o u rw o d 【m r t h e rv e r i f i e d l a t a p p l i c a t i o no fc 枞v3 5 sp m m o t e ri sl i i l l i t e 也e s p e c i a j l yi np l a n tm a l eo 玛e n g e n e s i sa l l d g 锄e t o g 肌e s i ss m d y s o4 豚，c a i ib eu s e d 嬲ap o r 0m i d t e f 证m a l eo 唱a n g e n c s i sa n dm a l e g 锄e t o g e n e s i s k e y w o r d s ： 3 5 sp r o n l o t e r ，彳跚，c o n s t i t u t i v ec x p r c s s i o 巩加曲i d o p s i s ，锄t h p o l l e i l 2 鹄嘲幺雾 硕 ：学位论文 原创性声明 本人郑重声明：本人所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立 进行研究所取得的成果。学位论文中凡引用他人已经发表或未发表的 成果、数据、观点等，均已明确注明出处。除文中已经注明引用的内 容外，不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对 本文的研究成果做出重要贡献的个人和集体，均已在本文中以明确方 式标明。 本声明的法律责任由本人承担。 兰州大学硕士研究生学位论文 关于学位论文使用授权的声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权 归属兰州大学。本人完全了解兰州大学有关保存、使用学位论文的 规定，同意学校保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和 电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权兰州大学可以将本学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用任何复 制手段保存和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或 与该论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为兰州 大学。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：导师签 i i 期：型丛 兰州大学研究生学位论文电子版使用授权书 彳跚一一种新型启动子是本人 在兰州大学攻读博士口硕士口学位的毕业论文，现己通过答辩。本人作为此论文的 著作权人，同意向兰州大学图书馆提交该论文的电子版和印刷本各一份。 根据中华人民共和国著作权法的规定，本人授权兰州大学图书馆对该论文 电子版享有以下权力：( 同意者画 ，) l 、同意提交全文。可以在提交 半年( 公开) 口一年( 秘密) 口 二年( 机密) 口三年( 绝密) 口 期限之后，由图书馆在校园网上提供全文浏览。 2 、本人论文解密之后，同意向“c a l i s 高校学位论文全文数据库提交： 论文标题、提要和论文前1 6 页 口论文全文口 3 、不同意提交电子版论文口。( 选此项者，须由作者本人出具不能公开证明， 导师签字，院系所加盖公章。) 图书馆承诺： l 、不对论文从收集、保存、发布意外的其他活动； 2 、未经著作权人同意，不得从事营利性活动。 院系：生命科学学院 作者( 授权入) 签名： 被授权人：兰州大学图书馆 学号：0 6 2 0 2 0 0 9 0 时间：2 0 0 9 6 。l 关于学位论文向“c a l i s 高校学位论文全文数据库”授权的说明 随着网络和计算机技术的发展，近几年来在国际范围内进行着一种大学范围内的学术资源共 建、共享运动，目的是促进学术团体内学术资源的交流和使用。 “c a l i s 高校学位论文全文数据库”是教育部支持的高等教育文献保障体系( c a l i s ) 的一 个学位论文共建共享项目。目的是为中国高校范围内的读者通过网络利用博硕士学位论文信息提 供途径和保障。参加c a l i s 学位论文库建设的成员单位( 约白所人学) 之间可免费检索浏览获得 授权的论文全文。在获得作者授权方面，c a l i s 高校学位论文全文数据库”采用作者自愿的原则， 作者是否授权完全由自己决定。 作者授权给“c a l i s 学位论文全文数据库”后享有的权益有：1 ) 提高学位论文的使用率，在更 广的范围内被检索浏览，提高论文的影响力；2 ) 授权在“c a l i s 学位论文全文数据库”发布论文 全文的作者，可长期免费检索浏览该库收录的论文全文；3 ) 对检索浏览率高的论文推荐出版社正 式出版。 访问地l l = ：h t t d ：e t d c a li s e d u c n 兰州大学硕士研究牛学位论文 1 j - 刖百 1 植物启动子在基因表达调控中的作用 启动子( p r o m o t e r ) 是一段提供i 州a 聚合酶识别和结合的d n a 序列，它们位于 基因的上游，长度因牛物种类而异，一般不超过2 0 0 b p 。一旦r n a 聚合酶定位并结 合到启动子序列，即可转录( 夏江东等，2 0 0 5 ) 。根据真核基因编码的产物和r n a 聚合酶的种类可把真核生物的启动予分为三类：r r n a 基因启动子( i 型) 、m i a 基 因启动子( i i 型) 和t r n a 基因启动子( i i i 型) 。i 型和i i i 型启动子相对比较简单。编 码蛋白基因的启动子属于i i 型启动子，该型启动了相对复杂。 高等植物基因调控主要是在转录水平上进行的，受多种顺式作用元件和反式作 用因子的作用。植物基因启动子是重要的顺式作用元件，通常位于基因上游，能指 导i a 聚合酶全酶与d n a 模板的正确结合，同时活化r n a 聚合酶，使之具有起始特 异性转录的形式，并决定转录的方向和效率，是植物基因转录调控的中心。 不同的植物启动了使植物基因具有不同的表达特性，按其作用方式大体可分为 三类：即组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子。 1 1 组成型启动子 该类型的启动子也称之为非特异性表达组成型启动子( c o n s t i t u t i v ep r o m o t e r ) 。 由这类启动子控制的结构基因的表达大体恒定在一定水平，不出现组织特异性的表 达差异。其特点是：表达具有持续性；r n a 和蛋白质表达量相对恒定；不表现时空 特异性；也不受外界因素的诱导。 目前在植物分子遗传学研究和植物基因工程中使用最多的组成型启动了( 表 1 1 1 ) 是来源于花椰菜花叶病毒( “聊b 坦，朋纪协谢简称c 心) 的3 5 s 启动子。 由于所得到的转录产物的沉降系数为3 5 s ，故将控制转录的启动子称为c 心3 5 s 启 动子，或简称为3 5 s 启动子。( n a g ye ta l ，1 9 8 5 ；j e n s 锄e ta l ，1 9 8 6 ；l 白ye t a l ，1 9 8 7 ) 。1 9 8 3 年c h u a 等第一次从花椰菜花叶病毒中分离到c 小3 5 s 启动子。当被整合进转基因植 物的基因组后，c a m v 3 5 s 启动子能在大多数植物器官和发育的大多数时期表现出 高启动活性。f u 是，3 5 s 启动子在包括水稻在内的单子叶植物中的启动能力较弱，也 兰州大学硕士研究生学位论文 就是说，3 5 s 启动予对双予州植物而言是个强启动r ，而对单了叶植物而言足个弱 肩动_ ( w i l m i n ka n d d o n s ，1 9 9 3 ) 。而且3 5 s 启动了并不是在转基因植物的所有时段 和所有组织都表达。s u n j l k i l m a r 等以绿色荧光蛋白( g f p ) 基因作为报告基因，用 c a m v 3 5 s 启动子驱动g f p 的表远。在转基因棉托的胚胎发生的早期并没有检测到 g f p 的表达，开花后1 3 天左右才在卜胚轴与了叶交界处的小区域首次看到g f p 的表 达，之后随着胚胎的发育，下胚轴和了叶中的g f p 表达越来越强。可见，在棉花l j ， c a m v 3 5 s 肩动了的调控受胚胎发生的影响，在胚胎发生的不同阶段的多数细胞和组 织中启动了的表达水平不同。p 曲l o 等( p 曲l o d ，吐m ，2 0 0 0 ) 曾经在拟南芥里用3 5 s 肩 动子表达g 雠因，由此观察3 5 s 启动子在各个组织里表达情况。他们发现3 5 s 启动 予并不是在所有组织和植物不i 司的发育阶段都有相蚓的表达蕈( r b o s s i n 2 e r 柚d s m y 血，1 9 9 6 ；s i e b u r 吐l e t 甜，1 9 9 8 ，w i l 姑n s o n 乩出，1 9 9 7 ) 。他们发现在几乎所有花组织 里都有g 吣表达，但是在心皮里表达最明显较低( 1b ) ；而在雄蕊里一直到花发育 的第8 期( 1 一e ) g 吣的表达每部很低。 而且在花药中这种低水平表达持续根长时 日j ，绒毡层甚至一点部没观察到g 的表达( 1 一c ) ，靠花发育的第1 3 期的柱头j 也 没发现g c 西( 1 g ) 。片j g 的抗体上检验g 吣的蚩白量( 1 一h ) 发现与上述结果是一 致的。 兰州大学硕士研究牛学位论文 g圈 一m 雾雾 图l43 5 s 聃动驱动g 吣在花器官和组织的的表达。l 自p a b l o d 等( 2 0 0 0 ) 一蒸嫫舔 兰州大学硕士研究牛学位论文 其中a 为野生型的花，b 为染色后的转g 献湛因的花，c 为转g u 躔因花横切图，d 为转g u 躔因花纵切图，e 为花瓣原基纵切图，f 为转g u 躔因花的胚珠，g 为转g 嬲 基因花雌蕊，h 为非基因花。 此外，来源于t i 质粒中基因的一些启动予也属于常用的组成型启动子( 表 1 1 1 ) 。1 9 0 7 年s m i m 和t o 、孙s 锄d ( s 血t h ，e f & t o e i l s e n d ，c o ，1 9 0 7 ) 发现冠瘿是根瘤农 杆菌引起的。1 9 7 4 年z 猢e n 等人( z a e n e ne ta l ，1 9 7 4 ) 从根瘤农杆菌中分离出t i 质粒。 t i 质粒上携带的基因能编码合成大段的特殊氨基酸一冠瘿碱，可分为章鱼碱型、胭 脂碱型、农杆碱型。此后，c h i l t o n 等人( c h i l t o nm de ta 1 ，1 9 7 7 ) 利用分子杂交技 术证明了植物肿瘤细胞中存在一段外源d n a ，并证明这段d n a 为转移d n a ( n 锄s 矗黼dd n a ) ，简称t - d n a 。在t - d n a 上有冠瘿碱生物合成基因：章鱼肉碱合 成酶( o c t o p i n es ”t l l e t a s e ) 基因( 简称o c s ) 、胭脂碱合成酶( n o p a l i i l es y n t h e t 弱e ) 基因( 简称n o s ) 、农杆碱中的甘露碱合成酶( m a i l 叩i n es ) r i l t h 比啜e ) 基因( 简称m a s ) 等，这些基因也都位于t 一d n a 区。由于这些都是高表达的基因，其肩动子也必然 是组成型的强肩动子。人们陆续从这些基因中分离出了它们各自的启动子，并将它 们成功地应用于植物基因工程中 但是由于组成型启动子会使驱动的目的基因在植物各组织中恒定持续的表达， 过度消耗细胞内的物质和能量，不能从时间和空间上有效地调控目的基因的表达， 因此在应用中存在一定的缺陷( g i t t i n sj e ta l ，2 0 0 0 ) 。如外源基因在整株植物中表达， 产生的大量异源蛋白质或代谢产物在植物体内积累，打破了植物原有的代谢平衡， 不利于产量和品质的提高：有些产物对植物并非必需甚至有毒，因而阻碍了植物的 正常生长，甚至导致死亡。如利用组成型启动了表达病毒衣壳蛋白，就可能会引起 病毒衣壳转移，从而导致植物病毒新株系的产牛( r o b i n s o nd j ，e ta 1 1 9 9 6 ) 。另外， 使用同一种组成型启动子驱动两个以上的外源基因表达可能会引起摹因沉默或共抑 制现象( k u m p a t l as pe ta 1 1 9 9 8 ) 。因此，人们在寻找更为有效的启动予来代替组成 型肩动子，更好地调控植物基因表达。 类别 启动子来源摹因表达特征 t d n a n o sn o s 组成型 6 兰州大学硕士研究牛学位论文 o c s o c s 组成型 n l a s m a s 组成型 d u a lp r o m o t e rm a s l & 2 组成型，双向 病毒c 删1 9 sc 心基因 组成型 c 村订v 3 5 sc a m v 3 5 s r n a 组成型 植物 u b i 1u b i l 组成型，单子 叶 a c t i l l 1a c t i i 卜l 组成型 p h a l 1 菜豆植物凝集 组成型 素 表1 1 1 植物中常用的组成型启动子( 引自苟吉庆，2 0 0 l ，博士论文) 1 2 诱导型启动子 诱导型启动子( i n d u c i b l ep m m o t e r ) 就是在某些特定的物理或化学信号的刺 激下，此种类型的启动子可以以大幅度地提高基因的转录水平，因此，亦称为诱导 型调节序列或诱导型增加子( i n d u c i b l ec i l l l a n c e r ) ( 王莹等，2 0 0 7 ) 。这类启动子有 一些共同特点：启动子的活化受物理或化学信号的诱导；具增加子、沉默予或 类似功能的序列结构；感受特异性诱导的序列都有明显的专性；一部分该类 型的肩动子同是具有组织特异性表达的特点；该类启动子常以诱导信号命名，因 此又可根据此将诱导型启动子分为光诱导型启动子、温度诱导型启动子、创伤诱导 型启动予、病原菌( 共生细菌) 诱导型启动子和化学物质诱导型启动子等。 1 2 2 光诱导型启动子 大量实验证明光对基因的转录过程和转录后加工过程都有调节作用，有许多转 录调控是通过光诱导型启动予来实现的。早在1 9 8 5 年l a i i l p p a 等把小麦的c 拍基因转 入双子叶植物烟草，在烟草中表现出了光调控性和器官特异性( l 锄pg e tm ，1 9 8 5 ) ( 表1 4 7 ) 。1 a 等把们p 基因与g 明1 i 至接开成嵌合载体转化水稻，组织化学检测表 明g 珊只在绿色组织中得到表达，黑暗中生长的植株检测不到表达活性( t 耐aye t a l ，1 9 9 1 ) ，但在光照下可以检测到活性。西红柿叶绿体c “s d d 、历s d d 基因的上游区 7 兰州大学硕士研究牛学位论文 以及一个2 8 5 b p 的启动予区域，转烟草株后也被光照诱导表达。 到目前为止，光诱导型启动子中研究得较为清楚的是两个光合基因：核酮糖二 磷酸羧化酶小亚基( s s 而c ) 基因和光捕获复合物a b 结合蛋白( 1 i g b th a e s t i n g c o m p l e xp r o t e i na bl h c p a b ) 基因启动子。s h e l l 等人( 1 9 8 7 ) 将豌豆厂6 c 蹉因9 7 3 b p 组成的光诱导型启动子和c 口f 基因构成嵌合基因，转化植株表现出叶绿体和光诱导活 性。最近，n o m u r am 等人( n o m u r am ，e ta l ，2 0 0 0 ) 发现，而c s 基因在c 3 和c 4 植物 中的表达的细胞特异性不同，c 3 植物中，6 岱基因主要在叶肉细胞中特异性表达，而 c 4 植物中柏c 瀵因主要在维管束鞘细胞而非叶肉细胞中表达。用来自水稻和玉米的 厂6 岱基因的启动子分别与g 明湛因构建成嵌合基因，并在玉米中表达。结果发现， 两个嵌合基因都能在玉米的光合器官，如叶片中特异地表达，并受光诱导调控，在 非光合器官则不表达。但不同的是，水稻的启动子主要驱动g 聊湛因在叶肉细胞中 表达，而玉米的启动子则主要驱动g 潞在维管束鞘细胞中表达。 对于叶绿素加结合蛋白基因( 国6 ) ，现已明确豌豆的国6 基因的光调节序列不 但具有增加子的性质，同是也具有沉默子( s i l e n c e r ) 的特性。如果用组成型的 启动子与肋f - i i 基因构成嵌合基因，在转基因烟草中，无论是否给予光照都能在叶和 根中稳定地表达；如果用口6 启动子，则在暗条件下砌f - i i 基因以微弱的水平在叶中 表达，而在光照条件下表达水平可提高5 8 倍，但在根中无论光照与否n p t - i i 基因均 不表达。这说明c 口6 基因的2 4 7 b p 调控序列在叶片中不但具有叶绿体依赖性的光诱导 增强子特性，而且具有组织特异性。在小麦c 口6 i 基因上也找到一段d n a 具有增强子 功能，双向激发转录并赋予器官特异性。l 锄p p a 等人( 1 9 8 5 ) 把小麦的白6 基因转入 双子叶植物烟草，在烟草中表现出了光调控和器官特异性。但小麦的，6 c 躔因转入 烟草后未见表达，可见并不是所有的单子叶植物基因都能在双子叶植物中表达。一 种解释是，双了叶植物可以识别单予叶植物的调节信号，但不能对其m r n a 进行有 效的剪接加工。 1 2 3 温度诱导型启动子 当植物暴露在高温下( 通常在3 5 以上) 或称热休克( 1 l 髓ts h o c k ) 时，植物就会在 l 3 小时内增大一些特异蛋白质的合成量，这些热诱导下合成的蛋白质称为热休克 蛋白( h e a ts h o c kp r o t e i n ，h s p ) 。产牛h s p 是植物热休克反应的丰要特征，h s p 的产生 兰州大学硕士研究生学位论文 与植物的耐热性获得有关，可使植物经受高达4 5 的致死温度，因此对植物有保护 作用。截止目前，在动植物中都发现了许多热激基因，从对这些热激基因进行的结 构分析结果看，这些基因的5 馆动子中都有一段保守的热激共有序列或称热激元件 m e a ts h o c ke l e m e n t ，h s e ) 也称之为热休克因子序列。h s e 中含有热诱导基因表达的 调控序列。迄今已分析过的h s p 基因中，大多数都含有类似h s e 序列。 心锄d l 等分析了大豆g m 却1 7 3 2 口热诱导启动子在转基因烟草中的调节作用并 在转基因植物的种子上测得g 啉性，发现该启动予具有一段热诱导因( 艘) 的 同功序列( 胁l d lc ta l ，1 9 9 6 ) 。c o c a 等从向日葵中分离了编码小热激蛋白( s h s p s ) h a l l s p l 8 6 g 2 、h a l l s p l 7 7 g 4 的基因，发现h a l l s p l 8 6 g i n r n a 只有热诱导活性，而 h a t l s p l 7 7 g 4 对高温( 4 2 ) 、脱落酸和水分胁迫都有应答。王雅琴将热休克基因幽口k 启动子的d i n a 片段如口k 亚克隆到报道载体质粒p u c d 6 1 5 携带的费氏弧菌荧光酶基 因姒c 删耻游，转化大肠杆菌，结果表明，转化细菌会由于热激而产生荧光。 与高温一样，低温对植物也是一种胁迫，当寒冷或霜冻来临时，耐低温植物会 在细胞中发生一系列的牛理生化变化，这些变化包括在不同基因表达介导下的蛋白、 脂类和碳水化合物组分的改变及一些新物质的合成。迄今为止，已从小麦、大麦、 拟南芥、洋白菜和首稽等植物中分离或鉴定出十几个冷诱导的基因( d a n y l u ke ta l ， 1 9 9 6 ；pe a = r c ee ta l ，1 9 9 8 ) 。h 面e l a 等人( h 萄e l ac tm ，1 9 9 0 ) 在1 9 9 0 年就从拟南芥中发 现了一个低温诱导表达的基因，命名为尺1 5 以( c o l d r e g u l a t e d ) 。并发现该基因的 启动子能使报告基因在低温下诱导表达。j i 孤g 等人( j i a i l g 锄ds i n g mc ta l ，1 9 9 6 ) 在 冬性洋白菜中也发现了锄f 1 5 ，实验证实该基因的启动子在低温下能驱动g u ：s 于艮告基 因的表达。c h o i 等人( c h o i y he ta l ，2 0 0 1 ) 从拟南芥中发现了第二个被低温诱导表 达的基因，磷酸胆碱胞苷酸转移酶( p h o s p h o c h l i n ec ”i d y l 扣加s f e r 舔e ) 基因。 1 2 4 创伤诱导型启动子 损伤会引发植物的一系列生理牛化变化，一些基因的表达也会发牛变化。已经 鉴定了一些由损伤诱导产牛的i i l 】黼a 和相关蛋白。研究发现植物损伤后会产生一些 小分子物质和多糖成分，它作为损伤信号能诱导一系列防御基因，如编码蛋白酶抑 制剂i i ( p r o t e i n a s ei 1 1 h i b i 白o ri l ，p i ni i ) 的基因表达来处理伤口，从而抵抗昆虫和其它病 原菌对植物的再度攻击。h o w 莉等人( h o w 捌e ta l ，1 9 9 4 ) 利用麟基因上游区和 9 兰州大学硕士研究牛学位论文 g “嗽导基因融合，转化烟草，在得到的转基因植株的叶组织中显示g 潞受近端和 远端创伤诱导。此外，泛素核糖体蛋白融合基因洌3 、马铃薯纠2 基因启动子同 样也受到创伤诱导( j o l l l l ，c ta l ，1 9 9 4 ) 。 1 2 5 病原菌( 共生细菌) 诱导型启动子 高等植物有严密的抗病防御体系，细菌感染可诱导许多基因的表达，形成多种 防卫机制。其中几丁质酶基因受病原茵侵染、真菌激发因子、乙烯、机械创伤和紫 外辐射等胁迫因素诱导表达，是防卫反应的一种。马铃薯尸6 妨和p 6 9 c 基因编码2 个 密切相关的枯草杆菌蛋白质酶，与抗菌反应相关。l u c i a 等把这两个基因的启动子分 别与g 吣和瞄因相连后转入拟南芥，比较它们的基因调控模式，表明雕9 b 和 只5 9 c 情动子受水杨酸诱导以及在假单胞菌的侵染下启始抗性作用( l u c 通e ta l ，2 0 0 0 ) 。 b e l b 枷等将来自烟草的病原菌诱导基因 5 ，2 蝴启动子与删基因相融合，转烟 草发现转基因植株对卵菌病菌原体具有高度抗性( b e l b a 城，e ta l ，2 0 0 1 ) 。 1 3 化学物质诱导启动子 许多化学物质如酸、碱、水杨酸、脱落酸、茉莉花素等，以及各种植物激素都 能影响或诱导植物基因的表达。植物激素调节植物的生长、发育、组织器官的分化 等过程，是植物生命过程中的一类重要物质。自2 0 世纪3 0 年代以来，人们不断对植 物激素进行研究，对植物效应启动子的报道也不断增多。例如，早在五十年代人们 就认识到了植物生长调节因子脱落酸( a b s c i s i ca c i d ，a b a ) 对植物发育进程的影响。进 入八十年代后期，研究发现脱落酸能诱导许多基因的表达。其中以小麦的e m 基因和 水稻的加2 1 基因最为典型。经序列分析证实，在这些能被脱落酸诱导表达的基因的 的启动子中都有一个保守的顺式作用元件序列，试验证明该序列就是脱落酸作用位 点。生长素效应启动子可能含有多个生长素效应元件，这些不同来源的生长素效应 基因中具有一定的保守性。在植物果实成熟过程中，乙烯被大量合成和释放，所产 生的乙烯又反过来启动了许多与成熟有关的基因表达。如：在果实成熟过程中高效 表达的邱基因，其表达受乙烯激活( k n e i s s lme ta j ，1 9 9 6 ) 。 1 4 组织特异性启动子 组织特异性启动予也称之为器官特异性启动子( o r g 锄s p e c i f i cp r o m o t e i ) 。在这些 启动予调控下，基因工程的表达往往只发牛在某些特定的器官或组织部位，并往往 l o 兰州大学硕士研究牛学位论文 表现出发育调节的特性。这种类型的启动了的最大优点是：它所启动的外源基因在 受体植物中特异表达，从而克服了组成型启动子启动的外源基因在受体植物中非特 异性的持续、高效表达造成浪费( 皮灿辉等，2 0 0 3 ) ，而在需要该基因大量表达的特 定组织部位则因表达量过低又达不到预期效果的缺点。因此，组织特异性启动子一 直以来都是植物基因工程中研究的重点和难点。 1 4 1 根组织特异性启动子 根的发生和发育是植物发育过程中的重要问题，研究根中特异表达基因及其启 动子无疑是重要的。 拟南芥根中特异表达的黑芥子酶( m 舯s i i 琊e ) 是由p 砖1 0 基因编码的。b o r i s j u l 【 等( b o r i 匈u l 【c ta l ，1 9 9 9 ) 用根特异性启动子刎髓、g f p 和烟草钙网蛋白质 ( c a l r e t i c u l i n ) 构建融合表达载体，转化烟草，转基因烟草的根细胞能高效产生g f p 。 1 4 2 茎特异性启动子 嘶n d a d e 等利用c d n a f l p 技术从马铃薯中分离了一个与乙醇脱氢酶非常相 似的t d f 5 l l ( t r a n s c r i p td 鲥v e d 魄m e n t ) ，其基因阮醐可能参与植物体内影响赤霉 素水平的复合物的合成( 嘶n d a d ee ta l ，2 0 0 3 ) 。在n c b i 数据库中，比较& 妒刀启动子 与马铃薯的阳幻砌i 和i i 、蛋白酶抑制子、刀d 砌砌2 2 k 和2 3 k 等编码蛋白质基因的 启动子，发现它们包含一些可能与蔗糖应答反应有关的共有序列；该启动子还包含 植物中几个保守的转录因子( 如d o md o 晓，d o f 3 和p b d 的结合位点。构建鼬绷 启动子g 嬲融合表达载体转化烟草，g 嗍织化学染色显示该启动子驱动基因在茎 结节处特异表达，可能参与块茎形成过程。 1 4 3 叶特异性启动子 m a 册c c i n i 等( m a n 盈c c i n ie ta l ，2 0 0 3 ) 从咖啡( c o f j f e aa r a b i c a ) 中克隆了l ，5 二 磷酸核酮糖羧化酶加氧酶( m b i s c o ) 小亚基基因见吕c s l ，该基因在一年牛植物咖啡的 叶中特异表达。i g u c h i 等( 胁i g i l c h ie ta l ，2 0 0 0 ) 在玉米中发现了一个双元启动子 系统( d u a lp r o m o t e rs y s t e m ) 。p p d k ( p y l l j v a t e ，o n h o p h o s p h a t ed i i ( i n a s e ) 是c 4 植物光 合反应中的一个叶绿体酶，该酶基因凡舷具有一个双元启动予系统( g 炉擞启动子和 细胞质只玩启动了) 。这两个启动了的区别在于起始密码了和拼接方式的差异，o 舻撅 肩动予驱动黼录成较长的m r n a ，基因产物定位在叶绿体中；细胞质尸擞启动子 兰州大学硕士研究牛学位论文 在础基因的第一个内含子中，驱动燃录成较短的n 汰n a ，它所编码的蛋白质定 位于细胞质中，又称为细胞质脓肩动予。c 炉擞肩动子是受光诱导的强启动子，驱 动基因在玉米叶肉细胞中特异表达；而细胞质 纭启动子是个弱启动子，且不具有 组织特异性。大多数c 4 植物的光合作用相关基因的表达具有细胞特异性，且主要在 转录水平调节基因活性，因此，可利用这类启动子在c 4 植物叶肉细胞中高效表达外 源基因。 i 4 4 花特异性启动子 植物花特异表达启动子只在植物开花的时期启动基因的表达，而在植物的其它 部位或组织不表达或低量表达其下游的基因，它的分离克隆为花卉的品质改良提供 了重要的顺式调控元件。近年来人们相继分离和鉴定了许多花特异表达基因的肩动 子，如大豆的苯丙氨酸氨裂解酶尼化2 基因的启动予( s a b l o w s l d re ta l ，1 9 9 5 ) ，矮牵牛、 金鱼草与类黄酮合成相关的一些基因删，倒，c 脚，侧2 的启动子( s o l 锄o e ta 1 ，1 9 9 5 ) 。其中对查尔酮合成酶基因家族的c h s 启动子的研究较为深入，它是光依 赖性的并在花器官中特异表达。 1 9 9 5 年，h i r o y u l 【ih 等人从水稻中分离出雌因并对其启动子进行了详细研 究。他们将臁因的5 上游端( 从起始密码子a t g 往上约一千多个碱基) 切下与g 吣 基因构建成嵌合基因表达载体转化水稻和矮牵牛。组织染色法表明，g 嬲基因只在 水稻胚乳和花粉组织中表达，而其它组织中均未见到。这说明嗍因的肩动子是胚 乳和花粉特异性的启动子。只是胚乳中的g 职蒲性比花粉中高约5 0 倍。而同一嵌合 基因表达载体在矮牵牛中的表现却有不同，g 啤因在矮牵牛的花粉中表现了较高 的活性，但令人惊讶的是在胚乳中应该有更高表达活性的g u 法因却没有表现出任 何表达活性。这一结果表明，来自水稻的腿因的启动子只能在矮牵牛的花粉中表 达，而不能在胚乳中表达。对这一现象作者认为，存在于臌因启动了中的驱动基 因在花粉中特异表达的顺式作用元件在单子叶和双予叶植物中可能是共同的，但在 水稻中驱动胚乳特异性表达的顺式作用元件可能在双了叶植物中不起作用。这一研 究结果使研究者对组织特异性基因调控的分予机制、植物在进化过程中组织特异性 的获得、遗传和变异等产乍了极大的兴趣。 花粉发育相关的组织特异性启动子在花粉发育过程中起到重要作用。m a r i a i l i 兰州大学硕士研究生学位论文 等将烟草花药绒毡层特异表达的尉汐与核酸酶基因肋埘船p 、尺刀甜p 融合后转化植 物，核酸酶基因在花药中特异表达( m 撕a n ie ta l ，) ，并破坏绒毡层，获得雄性不育烟草和 油菜，目前已在烟草、玉米、油菜、拟南芥、水稻等植物上应用并获得成功。b a t e 等( b a t en e ta 1 ，1 9 9 8 ) 在西红柿中发现了厶f 5 2 基因，该基因在花粉成熟时首先在花粉 的营养细胞中表达。从拟南芥中分离得到的彳9 基因的启动予也可以驱动该基因在花 药绒毡层特异表达。 1 4 5 种子、果实特异性启动子 油质蛋白( 0 l e o s i i l s ) 首先在芥子中发现，其后在许多油料种子中都被发现，特别 是在白菜( b r a s s i c an a p u s ) 种子中其含量高达种子总蛋白的2 0 ，而在其它组织中都未 检测到( m u 印h yd j c u m m i n s e ta l l 9 8 9 ) 。这说明该蛋白的种予特异性极强。 种子 特异性启动子的另一个典型代表是玉米1 9 k d 醇溶储藏蛋白基因启动子。早先研究者 就发现，玉米( z e am a r sl ) 1 9 l 醇溶储藏蛋白( z e i l l ) 只在种子中存在，这就意味 着编码该蛋白的基因可能是种予特异性表达的。为印证这一假设，m 舭a j m 等人( 1 9 9 3 ) 将从z e i n 基因中切下的肩动了片段融合到g 明湛因上游并转化植物，结果 发现g 明湛因只在种子中特异性地表达，从而直接证实了嬲加基因的启动予是个种 子特异性启动子。后来赵倩等人( 1 9 9 9 ) 用z 咖基因启动子+ g u 溥因转化烟草，结果与 m 如烛e a j m 等人的一致，即g 明识在种子中表达，而在叶、根中都不表达。另 外有人还发现( d i g e o nj fe ta l ，1 9 9 9 ) 来自小麦属的编码嘌呤吲哚酶基因的启动子也 是个种子特异性启动子，他们将该启动子与报告基因融合转化水稻，结果发现报告 基因特异性地在水稻种子中表达。 r o t i n o 等将子房特异性表达肩动予啪与肠口m 基因( i a a 合成酶基因) 融合，并 将其导入茄子和烟草中，单性结实株率达5 0 ，且座果率多数在9 0 以上，该试验说 明，运用转基因技术，在予房中专一性地表达生长素合成酶基因，能诱导单性结实 ( r o t i n oe ta l ，1 9 9 7 ) ( 表1 4 7 ) 。 1 4 6 维管组织特异性启动子 目前发现的能够定位于维铃组织的启动子根据其来源基本可以分为2 种：一是 植物本身特异性表达蛋白的摹因的启动了，如能在韧皮部特异表达的玉米蔗糖合成 兰州大学硕士研究牛学位论文 酶基因跗，启动子，谷氨酰胺合成酶基因g 妈4 启动子，土壤杆菌生根基因r d ，c ， 加曲i d o p s i s 蔗糖合成酶基因加搬，启动子，能在木质部特异表达的p 口，2 摹因( 编码苯 丙氨酸脱氨酶) 启动子，c c 洲删咖啡因一辅酶a 3 一o 甲基转移酶) 基因启动子，4 香豆醛：c o a 连接酶和，( 参与木质部细胞壁的木质素生物合成) 基因启动子( 表 1 4 7 ) ，g 巾，8 基因( 编码甘氨酸富含蛋白) 启动子，p 船崩卿r 朋鲥9 启动子；能在植 物维管组织特异性表达的胁肌1 ( 编码s 一腺苷l 甲硫氨酸合成酶) 基因启动子， 彳c 刀，p l ( 胁b i d o p s i st h a l i 锄a 胞质亲环蛋白) 肩动子。二是能特异性侵染植物维管 组织的病毒基因启动子，如能在韧皮部特异表达的r 绉隋动予，水稻t u n g r o 杆 状病毒尺纺隋动子，鸭砣草黄斑驳病毒( c o y m v ) 启动子，c f d v c ( 椰子叶腐败病 毒) d n a 肩动子等。 1 4 6 1 韧皮部组织特异性启动子 竹节花黄斑驳病毒( c d 历聊础m 弦肋w 舢眈访哪，c o 是一种浸染单子叶植 物竹节花的无胞膜杆状病毒。m 锄e 玎y 等人( 1 9 9 2 ) 对c o m 启动子的分析证实，该 启动子驱动g 明法因特异地在韧皮部、韧皮部相关细胞及根、茎、叶的轴向薄壁组 织和绒毡层表达( 表1 4 7 ) 。后来吴标等人( 1 9 9 9 ) 对该启动子进行了进一步的缺失分 析，发现c b 孙启动子的2 3 0 至2 2 0 区域与c a 仍5 踮动子的a s 1 元件相似，对启动 子的活性有激活作用，而1 5 9 至8 4 之间的序列是韧皮部组织表达所必须的。 韧皮部组织特异性启动子的另一个代表是笋瓜户尸2 基因启动子。1 9 9 2 年， b o 咖i c k 等人从笋瓜c d n a 文库中筛选出一个编码一种韧皮部蛋白o h l o 锄 p r o t e i i l ，p p ) 的基因，命名为尸尸2 基因，其表达的蛋白户! 尸2 是一种独特的结合几丁质的 凝集素，被特异性地在韧皮部组织中表达。1 9 9 9 年，蒋浩等人对尸! 尸2 启动子进行了 序列分析。结果发现，在该启动子的7 4 8 至7 6 0 处有一个典型的富含a t 序列，在1 4 9 和2 7 6 处又各有一个重复。转烟草试验表明，c b y a 启动子可驱动g 明湛因在叶柄、 茎和根的韧皮部组织中特异性地表达，同时在细胞生长、分化活跃的分牛组织中也 有明显地表达。 q 曲锄等人( g r a h 锄m w e ta l ，1 9 7 7 ) 发现来自农杆菌的牛根基因尺d j f c 和来自 玉米的s l 肌n k e l l 蔗糖合成酶( s h r 吼k e i l ；s u c r o s es ”t h a s e 1 ) 基因鼬的启动了都是韧皮 部组织特异性启动子，他们将尺o j c 和鼬的肩动子分别与g 晒基因融合转化马铃薯， 1 4 兰州大学硕士研究生学位论文 结果发现皿d _ ，c 启动子驱动的报告基因在转基因马铃薯的韧皮部组织、维管束鞘细胞 和导管软组织中高水平的表达，而在木质部和非脉管组织中不表达。相比之下，鼢 启动子驱动的报告基因只在转基因马铃薯的韧皮部组织中特异表达。因此可以看出， 勋肩动子具有极强的韧皮部组织特异性。 启动予种类转基因植物表达组织低、不表达达器官 豌豆脂肪氧化酶基因 棉花c 9 基因 烟草n t p 3 0 3 基因 拟南芥a l 冲 玉米胁1 7 玉米a d l l l 3 f 水稻l h c p 西红柿c u 、z ns o d 马铃薯u l a 3 水稻p c n a 菠菜a c p u 农杆菌 烟草 烟草 烟草 烟草 拟南芥 玉米 水稻 烟草 马铃薯 烟草 菠菜 马铃薯 种子、叶、茎根 花粉茎、种子、根 花粉其它 叶、根种子 胚、胚乳其它 花粉、盾片、根其它 叶、茎、花器官根 嫩叶成熟叶、根 根尖、老叶嫩叶 分生组织其它 叶、根、种子其它 维管束鞘细胞和导管软组织木质部 表1 4 7 部分组织特异性启动子。引自李一琨等，植物学通报，1 9 9 8 ，1 5 (