（神经生物学专业论文）白细胞介素—2对皮层神经元存活和形态的影响.pdf

浙江大学学位论文 刘双双 白细胞介素2 对皮层神经元存活 和形态的影响 浙江大学医学院神经科学研究所 2 0 0 5 硕士研究生：刘双双 导师：罗建红教授 摘要 背景： 白细胞介素- 2 ( i n t e r l e u k i n - 2 ，i l - 2 ) 是一种单链糖蛋白，能促进t 淋巴细胞 的增殖和分化，所以又称t 细胞生长因子，它是机体细胞免疫作用的核心物质。 近十余年来发现i l - 2 不仅是重要的免疫调节因子，对中枢神经系统也有重要的 调节作用。i l - 2 效应、i l - 2 样活性、i l - 2 样分子、1 1 - 2 结合位点和i l - 2 受体蛋 白相继在中枢神经系统( c n s ) 中被发现。研究表明i l - 2 在脑中主要存在于海 马、下丘脑、小脑、前额皮层、纹状体、膈以及蓝斑等脑区。体内和体外实验证 实了i l - 2 在c n s 内具有如下作用：影响海马神经元的生长和存活，刺激少突胶 质细胞的增殖和成熟，刺激递质和激素的释放，影响生物电活动和行为以及下丘 脑- 垂体轴的神经内分泌作用。也有实验证实i l - 2 具有中枢镇痛作用。 关于i l - 2 对神经元存活和形态的研究目前尚无定论。一些实验室的研究显 示：在海马神经元高密度( 1 1 0 5 c m 2 ) 培养条件下，i l - 2 对海马神经元的存活 具有促进作用；但在低密度( 5 x1 0 3 c m 2 ) 培养条件下，i l - 2 对海马神经元的存 活没有明显影响。在形态上i l - 2 能促进海马神经元的延伸和分支。另有研究显 示：i l - 2 是中枢神经系统中抑制神经元存活的因子，i l - 2 作用三天后海马神经元 的形态发生明显变化，出现胞体膨胀、空泡等损伤现象。一些体内实验也证明i l - 2 浙江大学学位论文 刘双双 对神经元具有神经毒性作用。 所以i l - 2 对神经元存活的影响仍是个有争议的问题，本实验探讨了i l - 2 对 皮层神经元的作用，进一步验证了i l - 2 对皮层神经元存活的影响。另外，i l - 2 对皮层神经元形态的影响尚未见详细报道，研究形态的变化，有助于进一步了解 神经突起和突触的产生机制。 目的： 1 观察i l - 2 对皮层神经元存活的作用。 2 探讨i l - 2 对神经元存活的作用是否具有时间依赖性和浓度依赖性。 3 探讨i l - 2 对发育中皮层神经元形态的影响。 方法： 1 对神经元存活作用的观察：按常规方法原代培养新生大鼠皮层神经元，神经 元培养第1 0 天用于实验，做如下处理：加入不同浓度的1 i - 2 ( 1n g m l ，1 0n g m l ， 1 0 0n g m 1 ) 作用2 4 h 和加入1 0n g m li l - 2 作用不同时间( 1 2 h ，2 4 h ，4 s h ) ，加药 结束前4 小时加入m r r r ，4 小时后加d m s o 溶解结晶，酶标仪检测o d 值。 2 对皮层神经元形态影响的观察：培养神经元4 天后用l i p o f e c t a m i n e2 0 0 0 转染 g f p a c t i n 质粒，1 0n g m li d 2 作用4 8 小时后，荧光显微镜下观察i l - 2 对神经元 形态的作用，数据和图像处理运用e x c e l2 0 0 3 和m e t a m o r p h 软件。 结果： 1 细胞低密度培养时( 密度为1x1 0 4 c m 2 ) ，i l - 2 对皮层神经元的存活没有明显 影响，i l , - 2 作用2 4 小时后，m t r 结果显示：o d 值从0 3 0 _ + 0 0 2 变化到0 3 1 o 0 5 ( p o 0 5 ) ；细胞在高密度培养时( 密度为1 1 0 5 c m 2 ) ，i l - 2 能明显提 高细胞的存活，i d 2 作用后，o d 值从0 4 6 0 0 4 升至0 6 1 o 0 3 ( p o 0 5 ) 。 2 i l - 2 对神经元存活作用具有时间依赖性和浓度依赖性，i i - 2 作用1 2 小时后， 2 浙江大学学位论文刘双双 对神经元的存活作用没有明显的变化；2 4 小时后，有明显的促进存活作用，4 8 小时后，促进作用仍然明显。并且i l - 2 对神经元的作用，在1 0 - 1 0 0n g m l 浓度 范围内，浓度越高，作用越强。 3 i l - 2 对皮层神经元形态影响：细胞在低密度培养条件下，i l - 2 可以对神经元 形态产生影响，i l - 2 能够延伸最长神经突的长度，神经突的长度从1 8 4 4 - - + 1 5 0 ( p ) 延长到2 5 0 3 - + 1 7 2 ( m ) ( p 0 0 5 ) ，但是对于胞体和最长神经突上的 分支数目影响不明显。 结论： 细胞在低密度培养条件下，i l - 2 对皮层神经元的存活没有明显的作用；但是 在高密度培养条件下，h - 2 能够明显提高神经元的存活，在这种培养条件下，神 经元和胶质细胞以及神经元和神经元之间的联系增多，提示i l - 2 可能通过间接 方式影响神经元的存活，即通过刺激神经元或者胶质细胞释放一些营养因子而产 生作用。 形态上，细胞在低密度培养条件下，i l - 2 能够皮层神经元促进最长神经突的 延伸，而对于胞体和最长神经突上的分支数目影响不明显。由于细胞密度低，神 经元和胶质细胞之间以及神经元与神经元之间的联系有限，所以i l - 2 对神经元 形态的影响可能是直接作用的方式。i l - 2 对神经突延伸和分支的不同影响，也可 以说明皮层神经元的延伸和分支是由不同机制控制的。 关键词： 白细胞介素2 ，神经元培养，m t r ，神经元存活，神经突延伸 3 断江大学学位论文 刘双双 t h ee f f e c to fi n t e r l e u k i n 2o ns u r v i v a la n d m o r p h o l o g yi nr a tp r i m a r yc o r t i c a ln e u r o n s m a s t e rd e g r e ec a n d i d a t e ：l i us h u a n g s h u a n g s u p e r v i s o r ：l u oj i a n h o n g d e p a r t m e n to fn e u r o b i o l o g y , s c h o o lo fm e d i c i n e ，z h e j i a n gu n i v e r s i 哆 a b s t r a c t i n t r o d u c t i o n ： i n t e f l e u k l n - 2 ( i l - 2 ) i sn o to n l ya ni m p o r t a n ti m m u n o r e g u l a t o r ym o l e c u l e ，i ti s a l s oa ni m p o r t a n tn e u r o r e g u l a t a r ym o l e c u l ei nt h ec n s d u i n gt h ep a s tt e ny e a r s , i l - 2 - l i k eb i o a c t i v i t y , i l - 2 l i k ei m m u n o r e a c t i v i t y , i l - 2 - 1 i k em r n a , i l - 2b i n d i n g s i t e s , i l - 2r e c e p t o ra n d1 i , - 2r e c e p t o r ( i l - 2 r ) i m m u n o r e a c t i v i t yh a v eb e e nr e p o r t e d t h e ym a i n l yl o c a t eo nn e u r o n sa n dg l i a s i n v e s t i g a t i o n si nv i v oa n di n v i t r oh a v e e l u c i d a t e dt h ef o l l o w i n g ：i l - 2a n di l - 2 rh a v eb e e nd e t e c t e di nt h eb r a i n ；i l - 2 p r o m o t e s s u r v i v a la n dn e u r i t ee x t e n s i o no fc u l t u r e d n e u r o n s ，s t i m u l a t e s o l i g o d e n d r o e y t ep r o l i f e r a t i o na n dm a t u r a t i o n , a f f e c t s t h eh y p o t h a l a m i c p i t u i t a r y f u n c t i o na n dp r o d u c e sb e h a v i o r a la n de l e c t r o c o r t i c o g r a ms p 咖mc h a n g e s i n a d d i t i o n ，i th a sr e p o r t e dt h a t1 1 , - 2h a sa na n a l g e s i ce f f e c ti nt h ec n sa n ds t i m u l a t i n g t h ep r o l i f e r a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o no f t l y m p h o c y t e s c o n c e r n i n ga b o u tt h ee f f e c to fi l - 2o nc n s ，i n v e s t i g a t i o n si ns o m el a b o r a t o r i e s h a v ed e m o n s t r a t e dt h a ti l - 2s h o w e ds u r v i v a l - p r o m o t i n ge f f e c t so nh i p p o c a m p u si n h i g hc e l ld e n s i t yc u l t u r e sb u td i dn o ts h o wa n ye f f f e c to nt h en e u r o n a ls u r v i v a li nl o w c e l l d e n s i t yc u l t u r e f u r t h e r m o r e , ，2p r o m o t e dt h ee x t e n s i o no fp r o c e s s e so f h i p p o c a m p a ln e u r o n si n d e p e n d e n to nd e n s i t y t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a ti l - 2s u p p o r t s 4 渐江大学学位论文 刘双双 n e u r o n a ls u r v i v a li n d k e 虻t l ya n dp r o m o t e se x t e n s i o nb yd i r e c t l ya o i n go l lb r a i n n e u r o n s s ot h ee f f e c t so fi l - 2o i ln e u r o n a ls u r v i v a la n dm o r p h o l o g ya l em e d i a t e db y d i f f e r e n tm e c h a n i s m h o w e v e r , o t h e r sh a v er e p o r t e dt h a t 1 1 - 2m a yf i l n c 蛙0 na sa ni n h i b i t o r yf a c t o r a f t e rt h r e ed a y so fe x p o s u r et oi l - 2 ，n e u r i t er e t r a c t i o n s , c e l l u l a rs w e l l i n g , v a c u o l a t i o n sa n dc e l lr u p t u r ew e r ee v i d e n t s ot h ee f f e c to fi l - 2o nn e u r o n sw a ss t i l l d i s p u t e d f u r t h e r m o r et i t t l ei sk n o w na b o u t t h ep o s s i b l er o l eo fi l - 2o nm o r p h o l o g y i nc o r t i c a ln e 肿o n s i nt h i st h e s i sw ei n v e s t i g a t et h ee f f e c t so fi l - 2o nc o r t i c a l n e u m 略 0 b j e c v e s ： 1 t oi n v e s t i g a t et h ee f f e c to fi l - 2o ns u r v i v a lo fc o r t i c a ln e n g o n s 2 t ot e s tt h ee f f e c to fi l - 2i st i m e - d e p e n d e n to rd e n s i t y - d e p e n d e n t 3 t oc l a i i f yt h ee f f e c to fi l - 2o nm o r p h o l o g yo fc o r t i c a ln e u r o n s m e t h o d s ： 1 t h ee f f e c to fi l - 20 1 1s u r v i v a l ：p r i m a r yc o r t i c a ln e u r o n sw e r ep r e p a r e df r o mb r a i n s o fn e w b o r nr a t s t h en e u r o n sa td i v ( d a y si nv i t r o ) 1 0w e r ee x p o s e dt oi l - 2f o r2 4 h o u r s ，a n dt h es u r v i v a lw a se v a l u a t e db ym t ra s s a y 2 t h ee f f e c to fi l - 2o nm o r p h o l o g y ：t h en e u r o n sa td i v4w e r et r a n s f e c t e dw i t h g f p a c t i ng e n e a n dt h e nt h em o r p h o l o g yw a si n v e s t i g a t e da f t e r4 8h o u r s ，d a t a w e r ea n a l y z e db ye x c e l2 0 0 3a n dm e t a m o r p hs o f t w a r e r e s u l t s ： 1 a d d i t i o no fr e c o m b i n a n th u m a ni l - 2s i g n i f i c a n t l ys u p p o r t e dt h es u r v i v a lo f c o r t i c a ln e u r o n si nh i g hc e l ld e n s i t yc u l t u r e a st h er e s u l to fm t r a s s a y , o dv a l u e c h a n g e sf r o m0 4 6 0 0 4 t o0 6 1 0 0 3 ( p 0 0 5 ) 2 t h ee f f e c to fi l - 2o nc o r t i c a ln e u r o n si st i m e - d e p e n d e n ta n dc o n c e n f f a f i o n d e p e n d e n t w h e ne x p o s e dt oi l - 2f o r1 2h o u r s , t h e r ei sn oa p p a r e n t l ye f f e c t , b u t i ti se f f e c t i v ea f t e r2 4h o u r s , a n dt h eh i g h e ri nc o n c e n u a f i o n , t h es t r o n g e ri n f u n c t i o n 3 t h ee f f e c to fi l - 2o nc o r t i c a ln e u r o n sm o r p h o l o g y ：a d d i t i o no fi l - 2p r o m o t e d e x t e n s i o nf o rp r i m a r yn e u r o n si nl o wc e l ld e n s i t yc u l t u r e s , b u t “d i dn o tf u n c t i o n o np r o t r u s i o no fc e l lb o d ya n db r a n c ho fp r i m a r yn e u r i t e o o n c l u s l o n s ： 1 i l - 2s i g n i f i c a n t l yp r o m o t e dt h es u r v i v a lo fc o r t i c a ln e u r o n si nh i g hc e l ld e n s i t y c u l t u r e ，b u td i dn o ts h o wa n ye f f e c to nt h en e u r o n a ls u r v i v a li nl o wd e n s i t yc u l t u r e h h i g hc e l ld e n s i t yc u l t u r ec o n d i t i o n , n e u r o n - n e u r o na n dn e u r o n - g l i ai sm a x i m i z e d t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a ti l - 2p r o b a b l ys u p p o r t sn e u r o n ss u r v i v a li n d i r e c t l y i ti s p o s s i b l et h a ti l - 2s t i m u l a t e ss e c r e t i o no fs o m en e u r o t r o p h i cf a c t o rf r o mn e u r o no g 百i at os u p p o r ts u r v i v a l 2 a d d i t i o no fi l - 2p r o m o t e dt h ee x t e n s i o no fp r o c e s s e so fc o r t i c a ln e u r o n si nl o w c e l ld e n s i t yc u l t u r e s s i n c en e u r o n a l 百i a sa n dn e u r o n a l - n e u r o n a li n t e r a c t i o nw a s s t r o n g l y r e s t r i c t e di nl o wd e n s i t y c u l t u r e , i l - 2p r o b a b l y a f f e c t sn e u r o n a l m o r p h o l o g yb yd i r e c t l ya c t i n go nt h en e u r o n a lc e l l s t h ed i f f e r e n te f f e c t so fi l - 2 o nb r a n c ha n de x t e n s i o ns u g g e s tt h a tn e u r i t ee x t e n s i o na n db r a n c h i n ga i c i n d e p e n d e n t l yr e g u l a t e db yd i f f e r e n tm e c h a n i s m s 。 k e yw o r d s ： i n t e r l e u k i n 2 ，n e u r o n a lc u l t u r e ，m t ra s s a y , n e u r o n a ls u r v i v a l ，n e u r i t ee x t e n s i o n 6 浙江大学学位论文 翘双双 白细胞介素2 对皮层神经元存活 和形态的影响 浙江大学医学院神经生物学 2 0 0 5 硕士研究生：刘双双 导师：罗建红教授 引言 神经元的发育和存活需要多种营养因子的参与，已经发现许多可溶性的物质 能够影响脑神经元的存活和发育，例如；神经生长因子( n g f ) 咖，脑源性的神 经营养因子( b d n f ) 田嘲等。已有研究证实细胞因子也能对中枢神经系统的发 育和功能产生作用，h a m ae ta l 枷嘲已经证实：i l - 1 广泛存在于各个脑区，能够刺 激生长激素、促肾上腺皮质激素的分泌，促进星型胶质细胞的生长；1 0 6 能够对 隔区胆碱能神经元和中脑儿茶酚胺神经元起营养作用，在免疫系统中起重要作用 的白细胞介素2 ( i l 2 ) 对神经系统的作用也受到越来越受到关注。 i l - 2 是一种维持t 淋巴细胞在体外长期生长的细胞因子旧，它是一条单链糖 蛋白，由1 3 3 个氨基酸组成，分子量为1 5 2 0 k d a ，成熟的i l - 2 是由其前体从n 端 裂解z o 氨基酸而得到，转译后在c y s t 8 和c y s 1 0 5 之间形成二硫键，在t h y 3 处形 成糖苷键，c y s - 5 8 和c y s o l 0 5 之间的二硫键完整性对，2 的生物学活性至关重要。 在免疫系统中，i l - 2 能诱导自身淋巴细胞称为淋巴因子激活的杀伤细胞( u 岖) ， i l - 2 单独或与l a k 合用有显著的免疫调节作用川。正因为1 i - 2 有很强的免疫调节 作用，它被作为一种免疫增强剂在临床上广泛用于肿瘤，自体免疫失调，慢性炎 症疾病，朋d s 和器官移植排斥等的治疗中嘲，但是i l - 2 的临床应用引起了一些中 枢神经系统的副作用，h 埘。例如i l - 2 用于抗肿瘤的免疫治疗过程中经常会带有毒 7 浙江大学学位论文刘双双 性并发症，常伴有中度或严重智力情绪等神经及精神紊乱，提示慢性细胞因子的 升高可能产生神经内分泌和大脑神经递质传递的改变 1 4 1 1 1 5 1 。 i l - 2 不仅在免疫系统中起重要作用，越来越多的研究证明，脑内也存在内源 性的i l - 2 。研究表明i l - 2 能以饱和以及不饱和转运机制穿过血脑屏障进入一些脑 区。i l - 2 效应、，2 样活性、i l - 2 样分子、i l - 2 结合位点和i l - 2 受体蛋白已经相 继在中枢神经系统( c n s ) 被发现 1 e r - 1 2 2 ! 。i l - 2 在正常脑组织中的表达量很低且 分布有限，i l - 2 m r n a 主要分布于大脑皮质，中脑，纹状体，海马，隔区并且主 要由星形胶质细胞分泌p 3 1 q t s l 。 随后i l - 2 在c n s 中的作用也被广泛研究，至今已经证实i l - 2 在c n s 有如下作 用：刺激少突胶质细胞的增殖和成熟l - m l - 1 2 s l ，影响下丘脑垂体的功能i z , i ，产生行 为和电生理的变化1 3 e l - 1 3 z l ，一些实验室的研究也证实了，2 具有中枢镇痛效应1 3 3 1 。 细胞因子对中枢神经系统和免疫系统的作用可能存在这样的机制：细胞因子的多 种作用可能是由不同的结构域或者功能部位与不同的受体或受体亚型相互作用 实现的 3 4 1 。所以i l - 2 不仅是重要的免疫调节因子，也是c n s 中一种神经调节因子 阅。鲫。i l - 2 在临床应用的研究已经比较全面，但关于在神经系统作用的研究却 不够深入和明确。 以往关于i l - 2 对神经元存活和形态的研究出现了不同的结论。一些实验室 网鲫的研究显示：细胞高密度培养后( 1x1 0 5 c m 2 ) ，i i ，2 对海马神经元的存活具 有促进作用；但在低密度培养条件下( 5x1 0 3 c m 2 ) ，i l - 2 对海马神经元的存活没 有明显影响。在形态上1 1 - 2 能促进海马神经元的延伸和分支。另有研究1 4 e 1 1 4 1 1 显 示：i l - 2 是神经系统中抑制生存的因子，i l - 2 作用三天后海马神经元的形态发生 明显变化，出现胞体膨胀、空泡等损伤现象。并且一些体内实验也证明i l 2 对神 经元具有神经毒性作用1 3 s l 。 以往研究证实了l l 2 对海马神经元的存活有作用，但是作用的结果仍不明 确，而关于i l - 2 在皮层神经元形态方面的作用，尚未作过有关报道。为了进一步 8 浙江大学学位论文刘双双 确定i l - 2 的作用，我们运用m 兀方法测试了i l - 2 对皮层神经元存活的影响，以及 是否具有时间和浓度依赖性；我们也运用荧光成像系统和m e t a m o r p h 软件，首次 研究了i i ，2 在皮层神经元形态方面的影响。研究i l - 2 对神经元的存活作用，有助 于进一步探讨i l - 2 在神经细胞培养中的利用价值；研究i l - 2 对神经元形态的影响， 有助于进一步了解神经突起和突触的产生机制。 9 浙江大学学位论文 刘双双 材料与方法 1 材料： 1 1 实验动物： 健康清洁2 4 小时之内的s d 大鼠，由浙江省医学科学院实验动物中心提供 ( 合格证号：2 0 0 1 0 0 1 ) 1 2 培养基和化学试剂： d m e m ，胎牛血清，马血清，谷氨酰胺，抗生素，n 2 ，b 2 7 ，n e u r o b a s a l ， h b s s 均购自g l l x ：o 公司；多聚赖氨酸，胰酶，阿糖胞苷皆购自s i g m a 公司； l i p o f e c t a m i n e2 0 0 0 购自l n v i t r o g e n 公司；3 一( 4 ，5 二甲基噻唑一2 ) - 2 ，5 - 二 苯基四氮唑溴盐( m t t ) 购自上海实生生物技术有限公司。 1 3 溶液配制： ( 1 ) 解剖液： 葡萄糖，蔗糖溶液： 葡萄糖3 0g 蔗糖7 5 9 ，加双蒸水至5 0 0 m l 备用。 h e p e s 缓冲液： h e p e s 8 3 8 9 ，加双蒸水至1 0 0 m l ，用n a o h 或h c i 溶液调p h 值至 7 2 7 3 备用。 d 1 盐液： n a c i 1 6 0 9 k c i 8 9 n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 04 8g k h 2 p 0 4 0 6 9 取上述葡萄糖蔗糖溶液5 0m l ，h e p e s 缓冲液2 8m l ，d 1 盐液5 0m 1 混合加双蒸水至1 0 0 0m l ，调p h 值至7 2 7 3 ，0 2 2 岬滤膜过滤，储存 4 备用。 ( 2 ) 种植液： 浙江大学学位论文 刘双双 d m e m ( 含6m g n l i 的葡萄糖) 8 0 胎牛血清( g i b c o ) 1 0 马血清( g l u c o ) 1 0 谷氨酰胺( 0 2t o o l l )1 抗生素( 青霉素和链霉素) 1 ( 3 ) 饲养液： d m e m9 0 马血清 5 谷氨酰胺 1 抗生素 1 n 21 b 2 7 1 ( 4 ) n e u r o b a s a l 全培养基： n e u r o b a s a l9 6 谷氨酰胺( 0 2m o f l )1 抗生素( 青霉素和链霉素) 1 b 2 72 ( 5 ) 胰蛋白酶：取0 2 5g 溶于解剖液中，用0 2 2p u n 的滤膜过滤除菌。 ( 6 ) 多聚赖氨酸：用三蒸水配成0 1m g m l ，0 2 2l u n 的滤膜过滤除菌。 f 7 ) m i t 的配制：取m t t 溶于预热至3 7 c 的细胞培养液或者p b s 中，配制成 浓度为5m g m 1 的储存液，配制时间若较长需用锡箔纸遮盖避光，溶解后 用0 2 2l u n 的滤膜过滤除菌，4 c 避光保存，两周内有效。 ( 8 ) i l - 2 稀释液的配制：将重组的i l _ 2 浓缩液用n e u r o b a s a l 分别稀释成l n g m l ，1 0n g m 1 ，1 0 0n g m l ，4 储存，两周内有效。 1 4 主要实验仪器设备： a 离心设备：台式离心机( e p e n d o f f ) b 荧光成像平台包括t e 2 0 0 0 荧光倒置显微镜( n i k o n , t o k y o , j a p a n ) ，汞灯 光源( 1 0 0 w ) d u l v i e w t m 分光计( o p t i c a l7 m s i g h t s ，u c s a n t a f c ，n m ) 1 1 浙江大学学位论文刘双双 及s n a p h qc o o l e dc c d ( r o p e rs c i e n i c , t r e n t o n , n j ) 图象分析和成象的 控制由m e t a m o r p h 6 1 ( u n i v e r s a l ，i m a g i n g , w e s th e s t e r , p a ) 完成。 c 细胞培养设备：超净工作台( 苏州净化) ，c 0 2 孵箱( f o r m a ) ，倒置显微 镜( n i k o n ) ，9 6 孔板( o r a n g e ) d 酶标仪( b i o t e k ) 2 方法： 2 1 皮层神经细胞培养： 原代大脑皮层培养按照以前介绍的海马的培养方法操作( j h l u o ， e t a 1 2 0 0 2 ) 嘲，方法简述如下：取新生1 天之内的s d ( s p r a g u ed a w l e y ) 大鼠， 无菌条件下浸泡7 5 的酒精，断头取皮层，在预冷的解剖液中分离取脑膜和血管， 切碎后加入到0 2 5 的胰酶( s i g m a , s tl o u i s ，m o ) 中，3 7 。c 培养箱中消化1 5 分钟，离心后弃上清，加入培养液，反复吹打成单细胞培养液，种植在预先铺好 多赖的9 6 孔板和3 5 m m 的培养肌中，培养液为d u l b e c c o sm o d i f i e de a g l em e d i a ( d m e m ，i n v i t r o g e n ，c a r l s b a d , c a ) ，加入1 0 胎牛血清f i b s ) ，1 0 马血清，2 r a m 谷氨酰胺，1 抗生素，在3 7 c ，5 c 0 2 的培养箱中培养，4 小时后培养液换成 d m e m 含有5 f b s ，2m m 谷氨酰胺，l b 2 7a n d1 n 2 ( i n v i t r o g e n ) 。2 4 小时后，培养液半量换成n e u r o b a s a l + 2 b 2 7 ，1 抗生素，0 2 5 g l u t a m i n e ，在 第5 天加入终浓度为1 0t t m 的阿糖胞苷，作用4 8 小时抑制胶质细胞的过度生长， 其后每周更换两次培养基。 2 2 加药处理： 对存活的观察：在9 6 孔板中培养皮层神经元到第十天，加入i l - 2 ，使终浓 度为1 0n g m l ，2 4 小时后m t t 法观察存活率。另外培养神经细胞，按i l - 2 不同 作用浓度和相同作用浓度不同作用时间进行处理，不同浓度分别1n g m l ，1 0 n g n a ，1 0 0n g m 1 不同作用时间分别是加药作用1 2 h 、2 4 h 、4 8 h 。 对形态的观察：低密度培养皮层神经元( 1 1 0 4 c m 2 ) ，第4 天加入i l - 2 ， 作用4 8 小时后，荧光显微镜下观察神经元的形态。 浙江大学学位论文 刘双双 2 3 细胞存活实验： 细胞存活实验用m 兀弦检测嘲，方法简述如下：神经细胞培养在9 6 孔扳上， 每组有6 个孔，分别分为加药组，和对照组，在实验结束前4 - ? - 小时，细胞在0 5 m g m l 的m t r 中孵育4 小时，然后上清移除，加1 0 0i l l 的d m s o ，m 1 1 代谢物在 光谱长度为4 9 0n m 的酶标仪上测定，以m 兀代谢物值的变化来表示细胞存活的 变化。 2 4 脂质体转染： 体外培养第四天，皮层神经元用u p o f 。c t a m i l 2 0 0 0 衄v i 锄萨n ) 转染，将1 陷 的g f p a c t i nd n a ，和4 $ d l 筝j l i p o f e c t a m i n e2 0 0 0 混合后，加入5 0 0i l l 的o p l r i m e m 中，混合液加到培养的神经细胞里，在3 7 c 培养3 小时，细胞在n e u r o b a s a l 里漂洗 后换成原来的培养液。 2 5 荧光显微镜成像： 经g f p - a c t i n 转染的细胞置荧光显微镜( n i k o n1 1 2 0 0 0 ) 记录槽内观察，选用 n i k o nb a n d p a s s 滤镜观察g f p 绿荧光，并用m e t a m o r p h 图像软件获取和处理图 像。 数据统计： 实验结果均以均数加减标准差( ；s ) 表示，各组之间的比较采用随机区组 设计资料的方差分析，p 0 0 5 为差异有显著意义。两者之间的比较运用t 检验， 所有数据在p r i s m4 软件包上处理。 浙江大学学位论文刘双双 实验结果 1 m 一2 对皮层神经元的影响具有细胞密度依赖性 首先我们检测了在不同细胞密度下，i l - 2 对皮层神经元存活的作用。培养皮 层神经元第1 0 天加入i l - 2 ( 浓度为1 0n g m 1 ) ，作用2 4 小时，作用结束前4 小时加 m t r ，4 d , 时后测o d 值，结果显示：高密度培养条件下( 密度为l x l 0 5 c m 2 ) ， 加n g m l 的，2 明显提高了神经元的存活，o d 值从0 4 6 o 0 4 升至0 6 1 0 0 3 ( p 0 0 5 ) 如图1 b 所示。 图li l - 2 对皮层神经元的营养作用依赖细胞培养密度 f i g 1e f f e c t s o f i l - 2 0 n c o r t i c a l n e u r o n s i s d e p e n d e n t o f c e l l d e n s i t y ( p 0 0 5 ) 2 i l - 2 对神经元的作用具有剂量依赖性 如图2 所示，培养皮层神经元第1 0 天加入不同浓度( 1n g m l ，1 0n g m l ， 1 0 0n g m 1 ) 的i l - 2 ，作用2 4 小时后i l - 2 促进了神经元的存活。在我们所观察 的三种浓度中，最低有效浓度为1n g m l ，浓度越高，存活率越高，并且在三种 浓度下作用均有显著效应。 1 4 浙江大学学位论文刘双双 ， 曩 ， a o 图2 不同浓度的i l - 2 对皮层神经元的营养作用 f i g 2e f f e c t so fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so f i l - 2o nc o r t i c a ln e u r o n s ( p 0 0 5 ) 3 加药不同时间对神经元存活的影响 培养到第十天的皮层神经元，加入1 0 n g m t 的i l - 2 分别作用1 2 h ，2 4 h ，4 8 h ， 如图3 ，通过m t y 实验测得在作用1 2 小时后，i l - 2 对神经元没有产生明显的影 响，当作用2 4 小时后，o d 值从0 4 6 0 0 4 升至0 6 1 0 0 3 ( p o 0 5 ) 产生了 明显的变化，作用4 8 小时后，i l _ 2 的营养作用更加明显。 ： 一 a o 1 2 h2 4 h4 8 h o 吖州 曩1 i b 曲僵r t 图3 不同加药时间对皮层神经元存活的影响 f i g 3e f f e c t so f i l - 2o nc o r t i c a ln e u r o n si nd i f f e r e n tt i m e ( + p 0 0 5 ) 浙江大学学位论文 刘双双 4 ，i l - 2 对低密度培养皮层神经元形态的影响 a c ( 摘自m o k a d d e zs a r d e r ，1 9 9 6 ) b 图4 实验所用的形态学参数a 最长神经突的长度，b 胞体上突起的数目，c 最长神经突上的分支数目 f i g 4m o r p h o l o g i c a lp a r a m e t e r si nt h ep r e s e n ts t u d yap r i m a r yn e u r i t el c - n g t h ，b n u m b e ro f n c u r i t c sp e rs o m a ，cn u m b e ro f b r a n c hp o i n t sp e rp r i m a r yn e u r i t e 图a 1 6 浙江大学学位论文刘双双 图b 图5i l - 2 处理后神经元形态变化的典型图像a 对照组bi l - 2 处理组 f i g 5t y p i c a li m a g e so f m o r p h o l o g yc h a n g e sa f t e ra d m i n i s t r a t i o no f i l - 2 a c o n t r 0 1 ba d m i n i s t r a t i o no f i i ，2 培养到第四天的皮层神经元转染g f p - a c t i n ，转染完成后加l on g m i 的i l - 2 ， 作用4 8 小时，荧光显微镜下观察。图5 a 和图5 b 显示：最长神经突上的分支和 胞体上的突起没有显著性的区别，但是对于最长神经突长度的影响非常明显，加 入几2 作用后，最长神经突的长度明显增加了。 1 7 浙江大学学位论文 刘双双 a 图6i l - 2 对神经元分支的影响a ：胞体上突起的数目。b 最长神经上分支 的数目 f i g 6e f f e c t so fi l - 2o nn e u r i t eb r a n c h e s a ：n u m b e ro fn e u r i t i sp e rb o d y b ：b r a n c hn u m b e r ( x + _ s , n = 3 6 ) 。_=。c-曩基lja|oae，c二oc曩-瞳 浙江大学学位论文 刘双双 c o n 图7i l _ 2 对最长神经突长度的影响 f i g 7e f f e c t so fi l - 2o np r i m a r yn e u r i t el e n g t h ( p 0 0 5 ，；螺，n = 3 6 ) 统计结果显示：i l - 2 对神经元胞体上的突起和最长神经突上的分支影响不 明显，如图6 ，但是作用4 8 小时后，却明显延长了最长神经突的长度，神经 突的长度从1 8 4 4 1 5 o ( 岬) 延长到2 5 0 3 4 - 1 7 2 ( 岫( p 0 0 5 ) ，如图7 。 一量3 qlaci。l|j，。cj_呈jd 浙江大学学位论文刘双双 讨论 我们的研究结果显示：细胞在高密度