（化学工程专业论文）芳香胺和萘及其衍生物的毛细管电泳分离.pdf

摘要 摘要 大多数芳香胺和萘及部分萘衍生物都是重要的化工原料。以这些化合物为原 料的化学工业废水都含有其污染物。它们的分离分析在生产合成和环境治理中都 十分重要。本研究为之提供了毛细管电泳分离分析这些化合物的新方法。毛细管 电泳是8 0 年代以来发展起来的新方法。由于毛细管毫泳技术具有微量、快速、灵 敏、高效、准确、简便等特点，被广泛应用于无机物、有机物和生物大分子的检 测。 本文综述了毛细管电泳的起源、检测技术与分离模式的发展、毛细管电泳技 术的特点、应用和发展。 研究了四种化工废水含有的四种混合物( 共含十二种芳香胺和七种萘及萘的 衍生物) 在毛细管区带电泳( c z e ) 、低电渗流毛细管区带电泳( e o f 一0 ，c z e ) 、 胶束电动毛细管色谱( i t i e c c ) 三种毛细管电泳模式中的行为特征。讨论了p h 值、 电解质浓度、十二烷基硫酸钠( s d s ) 浓度对芳香胺和萘及其衍生物的迁移时间和 分离效果的影响，建立起废水中芳香胺和萘及其衍生物的毛细管电泳分离分析方 法。并从理论上探讨p h 值与芳香胺质子化程度及酸性萘衍生物的电离度的关系。 根据这四种混合物组成上的特点差异分别称之为芳香胺( i ) ，芳香胺( i i ) ，苯胺 及其衍生物，萘及其衍生物。对“芳香胺( i ) ”、“芳香胺( i 7 ) ”、“苯胺及其衍 生物”三种混合物的分析研究均发现，在c z e 分离中，当p h 1 0 58 7 峰痞量捌璃子 细肝 蛋白，j 吩子 至蛋白大炯蟑 分离对象0 2 5 8 0o 1 0 0 2 5 典型分离时间( h )高自动化手工 自动 自动 操作形式很低 高高 高 操作费用好半定量 好好 老| 生定量效果 低高 高高 墨塑塑 r 第一章绪论 注：反向高效液相色谱；体积排斥色谱：“分子量”约1 0 ”：分子量不大于1 0 5 分子量约为1 0 7 。 ( 5 ) 吸附引起电渗变化，进而影响分离重现性等，目前尚难以定量控制电渗。 下面通过与双向电泳( 2 一d e ) 和高效液相色谱( h p l c ) 等的比较，可对毛 细管电泳获得更细致的了解( 见表i 2 ) 。 从表1 2 可见，c e 的分离效率、分析速度、消耗、应用范围、定性定量功能 等都远远超过2 - d e ，但峰容量和制各水平则差得多。和h p l c 相比，c e 的应用 面广得多，效率、峰容量高得多，操作费用和环境污染则低得多，但制备能力也 差得多 1 6 1 。 1 3 文献综述 1 3 1 毛细管电泳的起源 毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 又叫高效毛细管电泳( h i 鐾h p e r f o l n 1 a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，h p c e ) 或毛细管电分离法( c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i ss e p a r a t i o nm e t h o d ，c e s m ) 是一类以毛细管为分离通道、以高压直 流电场为驱动力的新型液相分离分析技术【l 鲥。 最早利用窄孔径管作电泳分离的报告，可追溯到1 9 4 2 年m a r t i n 的工作，他用 称为置换电泳( 类似于置换色谱，后来称为等速电泳) 的方法分离了四种有机酸f 1 5 。 1 9 6 7 年，瑞典科学家h j e r t e n t m 最早提出用窄孔径管在高电场下进行自由溶液电 泳，并用内壁有甲基纤维素涂层的( 内径3 r a m ) 的螺旋形石英玻璃管分离，用u v ( u l t r a v i o l e t ) 检测，成功地证实了他的设想。此仪器可用于无机和有机离子、多肽、 蛋白质、核酸、病毒和细菌的分离，并能高精度测定淌度，亦可用于等电聚焦和 等速电泳，但操作麻烦 1 6 1 。1 9 7 0 年，e v e r a e r t s 等 1 列报道在毛细管等速电泳系统上 得到毛细管区带电泳( c a p i l l a r y z o n ee l e c t r o p h o r e s i s ，c z e ) 的结果，但效率差。1 9 7 4 年v i r t a n e n d s 认为必需使用细毛细管方能提高分离效率，此观点为m i k k e r s 等于 1 9 7 9 年所证实。m i k k e r s 等 1 5 1 一方面从理论上研究了影响c z e 效率的电场聚焦现 象，一方面在实验上用2 0 0pm 内径的聚四氟乙烯管为分离通道，获得了小于1 0 um 板高的空前高效率，这是毛细管区带电泳( c z e ) 发展史中的第一个重大突 破。1 9 8 1 年，j o r g e n s o n 和l u k a c s 使用7 5 | lm 内径的熔融石英毛细管做c z e ，利 用电迁移进样和荧光检测，在3 0 k v 电压下产生了4 1 0 5 n m 的效率，成为毛细管 电泳发展史上的一个里程碑 1 6 j 。1 9 8 3 年后，h j e r t e n 【l 副先后提出了毛细管凝胶电泳 和毛细管等电聚焦法，它们不仅可以大幅度提高效率，而且可以实现自动化操作， 便于定性、定量。1 9 8 4 年t e r a b e 用含十二烷基硫酸钠胶束( s d s ) 的缓冲溶液进 行毛细管电泳分离中性组分，获得成功，从而建立起胶束电动毛细管色谱( m i c e l l a r 9 华南理工大学工程硕士学位论文 e l e c t r o k i n e t i cc a p i l l a r yc h r o m a t o g r a p h y , m e c c ) 。1 9 8 6 年，l a u e r 报道其在蛋白质 c z e 中获得了1 0 6 n m 的极高效率。这些激动人心的研究结果，激发了关于毛细管 电泳的研究热潮，分折仪器厂商也同时卷入。随着商品仪器在1 9 8 8 年的迅速推出， 毛细管电泳( c e ) 开始突飞猛进地发展 1 5 , 1 6 。所以许多学者认为高效毛细管电泳 出现于8 0 年代【i l ”，19 1 。自8 0 年代起，毛细管电泳得到全面的多方面的发展。下 面从几方面迸行分述。 1 3 2 毛细管电泳检测技术的发展 1 9 8 7 年，s m i t h 等i ” 通过电喷射接口，将质谱( m a s ss p e c t r o m e t r y , m s ) 与c e 联用，记录到区带的m s 图，获得非常可贵的有关样品分子结构的信息。进一步 采用基体辅助激光解吸电离质谱法，可以得到分子量高达1 9 0 0 0 0 d a ( 质量单位， 道尔顿) 的生物大分子的准确分子量及其结构信息。1 9 8 7 年，w a l l i n g f o r d 和 e w i n g 【”2 0 】将电化学方法引进c e 检测，并用超微电极进行了单细胞的现场毛细管 电泳分离和检测。到目前为止，毛细管电泳仪中使用的检测方法有：紫外一可见 光吸收检测、荧光检测、激光诱导荧光检测( 1 a s e r i n d u c e df l u o r e s c e n c e ，l i f ) 、激 光诱导荧光间接检测、电导检测、电位检测、安培检测、质谱法、间接紫外吸收 检测、折射指数检测、磷光检测等 1 5 , 1 6 , 1 8 , 1 9 , 2 1 , 2 2 , 2 3 。其中，紫外一可见光吸收是毛 细管电泳中应用最广泛的一种检测方法。2 0 0 2 年，莫金垣等人又研制成功毛细管 电泳多道电化学检测工作站，首次建立三通道电化学检测系统，在同一工作电极 下对同一复杂的分析体系同时进行氧化、还原和电导测定旺“。 1 3 3 毛细管电泳分离模式的发展 毛细管电泳分离模式也得到蓬勃发展。1 9 8 4 年，t e r a b e 等【l6 】在c e 电解质溶 液中加入表面活性剂型胶束作假固定相，实现中性分子的分离，这种模式称为胶 束电动毛细管色谱( m e c c ) 。经过t e r a b e 及其他人的多年研究，又相继发展了环 糊精毛细管电动色谱、离子交换毛细管电动色谱、微乳胶毛细管电动色谱等“。 目前，新胶速体系研究异常活跃，m e c c 已成为应用非常广泛的电泳模式之一。 1 9 8 3 年，h j e r t e n 首先将填充聚丙烯酰胺凝胶的毛细管用于毛细管电泳分离，发展 了毛细管凝胶电泳( c a p i l l a r yg e le l e c t r o p h o r e s i s ，c g e ) 。由于c g e 具有极高的分 辩能力，很快受到人们的青睐。c o h e n 等 1 5 】最先用c g e 分离了蛋白质碎片。c g e 分离和l i f 检测相结合，成为d n a 快速序列分析的优选方案。人们寄希望它在人 类基因组的庞大计划中发挥巨大作用。1 9 8 5 年，h j e r t e n 又将等电聚焦( i s o e l e c t r i c f o c u s i n g i e f ) 电泳方法引进c e 分离，使毛细管等电聚焦( c a p i l l a r yi s o e l e c t r i e f o c u s i n g ，c i e f ) 技术在蛋白质分离中成为一个强有力的微柱分离分析工具，达到 i o 第一章绪论 能分辨等电点仅相差o 0 1 p h 的高分辨率水平。目前，毛细管等速电泳( c a p i l l a r y i s o t a c h o p h o r e s i s ，c i t p ) 在分析和微制各中的应用，特别是与c z e 耦合，作为c z e 的一种预浓缩方法得到普遍重视【1 5 。除上面提到的一些模式外，近二十年来，还 发展了许多毛细管电泳新模式。如：亲和毛细管电泳( a c e ) 、毛细管阵列电泳 ( c a e ) 【。8 、电压梯度毛细管电泳5 1 、低电渗流毛细管电泳 2 5 1 、无( 或低) 电渗 流毛细管电泳【1 7 、微乳液毛细管电动色谱 26 1 、非水毛细管电泳2 7 , 2 s 、芯片式毛细 管电泳【1 6 , 18 , 2 9 】、超高速平板通道毛细管电泳等【2 9 1 。 1 3 4 毛细管电泳基础理论研究的发展 毛细管电泳( c e ) 基础理论研究也不断深入。c e 涉及许多基本理论问题，如 区带增宽和塔板高度计算、分离度优化、溶质与柱壁间的互相作用，热效应，电 渗流等，深入地研究这些问题将有助于c e 技术的进一步提高与应用的迅速推广。 1 9 8 5 年，t e r a b e 等 1 5 , 3 0 用甲醇作为不溶组分、苏丹i i i 作为全溶组分，考察了 电流、电压、表面活性剂浓度、温度等一系列实验条件对保留参数，容量因子和 分配系数对溶质保留行为的影响，并得出分离度、有效塔扳数、峰容量、保留时 间等分离指数的表达式。 区带增宽的理论模型及板高计算，一直是人们关注的基本理论问题。1 9 9 0 年， f o l e y ”】提出优化c e 分离度的理论。1 9 9 2 年，s c h w e r 等【”】基于e i n s t e i n n e m s t 方程，讨论了扩散系数和离子淌度之间的关系，得到板高和塔板数表达式。1 9 9 3 年，林炳承等【3 1 对c z e 中各种影响区带增宽的因素进行了定量分析，得到计算 c z e 区带宽度的数学表达式。用计算机对多肽的c z e 分析进行了全过程模拟， a n d r e e v 等 1 5 1 提出一个数学模型，讨论了电渗流对c e 分离效率的影响。k h a l e d i 等 ” 讨论了酸性和碱性化合物在胶束电动毛细管色谱( m e c c ) 中的迁移行为。 l u c k e y 等提出优化c g e 分离d n a 的分离度模型。k e n n d l e r 等讨论了c g e 的分离 效率和峰增宽。c i f u e n t e s 等发展了一个简化模型，定量地评价蛋白质与管壁之间 的相互作用。通过各种理论模型的研究及与实验结果的比较，加深了对c e 分离机 理的认识，因而有助于在实际中采取相应对策，提高c e 分离效果。1 9 9 3 年， c a s t a g n o l a 等【1 5 , 3 2 1 利用加权变步长单纯形算法优化胶束电动色谱( m e c c ) 分析2 0 种已内酰苯硫脲氨基酸的实验条件，综合考虑p h 值、有机溶剂的百分比、十二烷 基硫酸钠( s d s ) 浓度对分离度的影响，用1 0 - - 1 5 步实现了1 8 种氨基酸的有效分 离。1 9 9 8 年w a n g ”，3 2 悃加权变步长单纯形方法优化毛细管区带电泳( c z e ) 分析 1 3 种氨基酸和m e c c 法分析4 种麻醉剂的实验条件。1 9 9 5 年，p r e t s w e l l 则用加权 变步长单纯形方法优化c e 分离金属阳离子的条件【2 4 1 。1 9 9 5 年，h a v e l h 2 用人工神 经网络的b p 算法建立了c e 的分离模型。1 9 9 8 年何金兰等【3 3 】人用正交实验设计 与人工神经网络结合优化了七种食物色素与防腐剂的c e 分离条件。1 9 9 6 年， 华南理工大学工程硕士学位论文 h a v e l 口2 等在理论推导的基础上，发展了用c e 计算金属离子的硫酸络合常数的方 法，并优化测定了自来水和矿石中的碱金属和碱土金属【3 2 】。1 9 9 7 年，邹汉法等【3 4 通过对前人文献中胶束毛细管电泳保留指数的分析，建立了阴、阳离子表面活性 剂胶束毛细管电泳下溶质保留值与溶剂化结构参数的定量关系。 表1 3 一些商品c e 仪器的性能指标 1 5 公司 a p p l i e d b e c k m a nb i o - r a dc o l o r ad i o n e xg r o mw a t e r s b i o s y s t e m s i n s t r u m e n t sl a b o r a t o r i e s s s t e c h n i kh p l cc h r 。_ ! 塑! 丝i ! 些! 竺竖! 血 型号 2 7 0 a - l f fp a c 您1 0 0b i o f o c u smi s c o3 1 4 0c e s s y s t e mq u a n t a4 0 0 0 3 0 0 01 。o 高压 电压范围( k v ) 极性切换 恒流操作 电压睇升 电流记录 电压记录 毛细管 最小长度( c 而 管盒系统 迸样方式 压力真空 电动 待温 温度控制 恒温器 温度范围( ) 控温介质 温度记录 检测器 多波长检测 波长范围 带宽6 瑚) 单色器 光纤 自动进样器 样品位置数 不同缓冲演数 托盘瞳温 防止：样品蒸发 样品体积( n 1 ) 组甜l 蝶 | 孰陆 重复畦( 1 0 次进 样) 高度： 面积： o _ 3 0 y n y y n 5 0 8 y y 4 2 0 0 y 嗍0 y y y y n 2 2 n 1 删 0 _ 3 0 y y y y y 3 1 3 l y y 5 _ 删 y o 6o 4 _ 珈8 l2 _ 一1 30 6 _ _ o 7 1 4 天天精度 l8 _ 3 1o 5 _ 1 3 高度： l _ 9 _ - 2 72 1 _ 2 7 o 0 0 y y y y y 4 0 4 n y 7 5 硼 n 0 _ 3 0 y y y n n n l 旷 8 0 0 6 光栅 y 4 0 n y 5 _ 堋 n n7 二_ 1 30 7 - 一 1 o 一1 2l3 lo _ 一 1 3 _ 1 61 2 1 8 2 4 0 _ 3 0 y y n n n o - 3 0 y n n y n 2 0 4 n y 2 5 _ 删 y 0 3 _ - o 7 0 7 _ 0 8 1 8 _ 2 5 1 5 - 1 9 亘婴!一 注：y ，n 分别表示“有”和“没有”。 1 2 。 ，。 。一执， 。一 一光。 矧 。 。 。一一。 。 黼。 帅n y y n n 一一n嚣z；，厶警￥；。矗学 挈；，晶蓁z 删。 ，。 ，一戡。 咖紫肾 组 磅咄母弩 第一章绪论 1 3 5 毛细管电泳仪器的发展 自1 9 8 9 年出现商品毛细管电泳仪以来，十多年间，世界范围已推出近二十种 型号的毛细管电泳仪。有的厂家还多次改型，提供了不少自动化和性能指标都较 完善的仪器，为进一步开展c e 的方法研究和推广应用起到促进作用。表1 - 3 列出 目前一些商品仪器的主要性能f 1 5 , 1 6 。 1 3 6 毛细管电泳的应用 毛细管电泳的高效、快速、灵敏以及样品消耗少等优点，使其具有极大的发 展潜力，它的应用领域也正在不断扩展深入。高效毛细管电泳在化学、生物化学、 生命科学、药物学、临床医学、法医学、刑侦学、环境科学、农学、燃料及食品 科学等领域都有着十分广泛的应用 15 , 2 5 , 2 7 。从小无机离子到生物大分子，从荷电 粒子到中性分子均能用h p c e 技术进行分离分析。尤其对珍贵样品，取样极少， 基体复杂的生物大分子，h p c e 技术更展示出特有的分离能力与极大的应用前景。 1 9 9 0 年，f f o r e t 等【l5 】人用羟基异丁酸作络合剂，肌酸酐作u v _ 一吸收离子， 间接吸收检测，5 r a i n 内完成1 4 种镧系元素的c z e 分离检测。1 9 9 1 年po j a n d i k 等人用毛细管电泳在5 m i n 内分离了从碱金属到镧系元素的2 4 种金属离子。1 9 9 2 年，w r j o n e s 等人用于c e 缓冲溶液中添加电渗流( e o f ) 改性剂使e o f 反 向并在阳极端检测，3 r a i n 内完成了3 6 种阴离子( 包括有机酸根) 的分离分析【”j 。 r o c o l e l 9 9 2 年用m e c c 分离激光诱导荧光检测，3 0 r a i n 内四种常见的黄曲霉 素g l ，g 2 ，b l 和b 2 获得基线分离。毛细管电泳也常用于氨基酸分离分析，其检 测方法有：光吸收衍生检测、荧光衍生检测、间接荧光分析、间接紫外检测等。 1 9 9 0 年m v n o v o t n y 等报道，成功地用m e c c 分离了血管紧张肽。c e m s 己用于各种分子量范围的肽的分析，分子量测定精度可达o 0 1 。1 9 9 2 年k t s u j i 等报导，用c e m s 分离捡测五种血管舒缓激肽和脑啡肽。将蛋白水解酶固定到 毛细管内壁上，使毛细管成为一个微型异相蛋白质消化反应器，然后将消化毛细 管与c e 分离毛细管用一个小聚四氟乙烯池连接。蛋白质经消化毛细管消化后，用 电迁移法将消化液转移到分离毛细管中进行c e 分离。1 9 9 3 年l n a m a n k w a 等【” 用此法分析胰蛋白酶消化1 3 一酪蛋白所得的肽序列。用h p c e 分离肽或蛋白 质在方法上有许多共同之处，因为两者结构上仅仅是氨基酸数目多少的差异；所 以适于肽分析的方法一般也适于蛋白质分析。但是，蛋白质的管壁吸附严重，如 何抑制和消除管壁对蛋白质( 特别是碱性蛋白质) 的吸附，往往是蛋白质c e 分离 成败的关引1 6 】。1 9 9 2 年，m g i l g e s 等【1 5 比较了用不同涂渍方法得到的不同涂层 毛细管c e 分离4 种碱性蛋白质。1 9 9 0 年t w e h r 等报导用毛细管等电聚焦方法 华南理工大学工程硕士学位论文 ( c l e f ) 分离八种蛋白质。1 9 9 1 年k t s u j i 等【j 副报导用毛细管凝胶电泳( c g e ) 法分离和测定六种蛋白质分子量【j 。从1 9 8 8 年始，c e 被用于d n a 分析，现已被 应用于d n a 研究的众多方面，比如测序、p c r ( p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n ) 产物 鉴定、基因突变研究、d n a 损伤分析、临床诊断等【”l 。毛细管电泳用于手性化合 物的分离分析，是最简单高效的手性分析新方法【l 。 毛细管电泳手性分离有两种基本策略，一是构建手性分离环境，二是手性消 除。手性环境可以通过三种方法来构建，即使用手性添加剂、使用手性填充毛细 管或使用手性涂层毛细管。g a s s m a n 等在1 9 8 6 年曾用组氨酸一铜金属络合物实现 氨基酸对映异构体的分离，随后g o z e l 等用天冬酰苯丙氨酸甲酯一铜来分离氨基 酸对映体。1 9 8 9 年，f a n a l i ( ”j 最早报道用环糊精( c d ) 为添加剂分离生物碱。后 来证明，环糊精及其衍生物可用于分离多种不同类型的对映异构体，如丹酰化氨 基酸、肾上腺素及其他手性药物等。天然大环化合物可具有多个手性中心，可能 具备广谱手性选择能力。1 9 9 4 年，d a n i e l 等【l6 报道使用具有九个手性中心的利福 霉素，使十八个醇胺对映体获得较好的分离。1 9 9 9 年，陆豪杰等【35 用毛细管电泳 分离测定尿液中扑尔敏对映体。2 0 0 0 年，李关宾等口6 用胶束电动毛细管色谱法分 离酮康唑手性异构体。2 0 0 0 年，陆豪杰等【37 】用毛细电泳分离萘普生和萘普生甲酯 手性异构体。 利用毛细管电泳也可分离分析糖类化合物。1 9 9 9 年，党福全【2 2 j 用毛细管电泳 一激光诱导荧光检测分离分析了麻胡多糖水解产物。1 9 9 9 年，叶建农等用毛细管 电泳测定饮料中糖类物质【“】。 十多年来，毛细管电泳又成为对活细胞进行生化研究的重要工具，许多研究 者都努力将此法用于单细胞分析。e w i n g ，j o r g e n s o n 和s w e e d l e r 2 0 研究组开创性地 将毛细管电泳用于非哺乳动物神经细胞分析。e w i n g 2 0 1 研究组首先证明了毛细管电 泳在研究哺乳动物细胞方面的巨大潜力。进样和检测是毛细管电泳在单细胞分析 中的核心问题。目前己研究的进样方法可分为活体进样、单细胞溶解进样、单个 全细胞进样等。在单细胞分析中采用的检测方法有紫外可见检测、荧光检测、电 化学检测和免疫分析法等，其中电化学检测器和荧光检测器应用较多l 2 。 c e 用于药物成分分析，具有快速、准确，试样处理简单，试剂用量少等优点。 a l e t r i a 等 ”1 选用7 个医药公司生产的双氯醇胺( c l e n b u t e r 0 1 ) ，在几个实验室内分别 用c e 进行手性分离，结果表明，c e 是一种快速可靠的药物分析工具。c e 技术具 有良好的时间分辨，能为治疗机理与用药水平提供可靠信息。例如，用m e c c 测 定服药2 4 h 后，血液与尿液中的乙酰氨基酸及其代谢产物的含量；用c z e 和m e c c 分析尿液中阿斯匹林；用m e c c 分析肿瘤细胞中的核苷酸等。体内代谢紊乱引起 的疾病，在体液或细胞中常常出现某种代谢产物分布异常，积累增多或严重不足。 这类疾病通过临床化验能作出诊断。但要求化验方法具有多组分同时检测能力。 1 4 第一章绪论 ! = = ! ! = = = = = = e l e e = = 目目_ e | e = = = = j l _ e _ j 目e _ c e 具有这种快速，同时多组分测定的特点，已经用于氨基酸失调，核酸失调等内 分泌失调疾病的诊断f ” 。 毛细管电泳技术近年来在环境分析应用上也表现出强劲的发展势头，越来越 多地用于环境中实际样品的分离和分析工作。环境样品来源主要是水源、土壤和 大气三个方面。水源是人类生存最重要的环境资源。对水质的分析是c e 最广泛的 应用领域之一。c e 的工作环境是水介质，这一点很接近生物体、植物体和自然界 的背景。这一特点将会为以水为背景的各种分析( 包括环境分析) 带来极大方便， 减少一些样品处理的繁琐过程，大大缩短分离周期，在未来的快速分离和连续监 测方面有很好的发展前景。c e 几乎可以分离除挥发性或难溶物之外的各种分子。 如此广泛的适用性，对分析科学研究人员具有很大的吸引力。随着愈来愈多的具 有开拓性的工作的不断推进，c e 很有希望在将来的环境分析应用中取得更大的进 展【18 1 。 目前，毛细管电泳技术又应用于司法鉴定工作中，张建华等 3 8 建立了胶束电 动毛细管色谱法( m e c c ) 对纸上微量蓝色园珠笔油墨进行分析鉴别的方法。 1 3 7 展望 对于已发展了近二十年的毛细管电泳技术来说，在新世纪中，仍然面l 临极大 的机遇和挑战。毛细管电泳仪器的发展需要进一步成熟和完善，在重现性、速度 和检测灵敏度等方面还期待着重大突破。微全分析( u t a s ) 的提出，使得集成 毛细管电泳技术( i c e c ) 延伸了毛细管电泳的潜力和可行性。随着人类基因计划 的重大进展，基因组学的出现和发展以及大规模测序的需求，毛细管阵列电泳 ( c a e ) 一跃成为承担这些任务的最佳选择之一。另外，利用离子液体非水介质 的毛细管电泳的研究也正在渐渐崛起【l 引。 1 4 主要研究内容 1 4 1 低电渗流c z e 和m e c c 分离芳香胺混合物( 1 ) ( 1 ) 低渗流c z e 分离芳香胺混合物( i ) 的研究内容： 建立低电渗流毛细管区带电泳分离体系。 1 5 华南理工大学工程硕士学位论文 试验研究不同p - 值( p h p k a 。，) 对芳香胺的迁移时间和分离效果的影 响；从理论上探讨p h 值的大小与芳香胺质子化程度的关系，从而得到最佳的口h 条件。 试验研究电解质浓度对芳香胺混合物( 【) 的迁移时间和分离效果的影响， 从而得到最佳的电解质浓度条件。 讨论优化后的低电渗流毛细管区带电泳条件下芳香胺出峰次序的规律。 ( 2 ) 胶束电动毛细管色谱分离芳香胺混合物( i ) 的研究内容： 试验研究p h 值远大于p k a 的胶束电动毛细管色谱条件下，口h 值对芳香胺 混合物( i ) 的迁移时间和分离效果的影响。 试验研究电解质( n a 2 h p 0 4 ) 浓度、添加剂( s d s 和0 - - c d ) 浓度对芳香 胺混合物( i ) 的迁移时间和分离效果的影响。 讨论优化后的胶束电动毛细管色谱条件下芳香胺的出峰顺序规律。 ( 3 ) 比较低电渗流c z e 和m e c c 分离芳香胺( i ) 的重现性和分离效果。 ( 4 ) 选用重现性、分离效果较好的方法进行实际样品分析。 ( 5 ) 通过实验测出用上述选用的优化的毛细管电泳分离体系定量测定芳香胺 ( i ) 的线性范围、检测限、分离效率、回收率 5 , 1 4 , 1 9 , 3 9 4 1 4 扪。 1 4 2 m e c c 分离芳香胺混合物( i1 ) 由于分离芳香胺混合物( i ) 的毛细管电泳条件不一定能分离芳香胺混合物 ( i i ) ，故有必要试验研究分离芳香胺混合物( i i ) 的毛细管电泳条件。下面主要 试验研究m e c c 分离芳香胺混合物( i f ) 的毛细管电泳条件。 ( 1 ) 胶束电动毛细管色谱分离芳香胺混合物( i i ) 的主要研究内容： 试验研究p h 值，电解质浓度、s d s 浓度对芳香胺迁移时间和分离效果的 影响，从而得出分离芳香胺( i i ) 的最佳的胶束电动毛细管色谱条件。 讨论优化的m e c c 分离条件下的峰序特征。 f 2 ) 进行实际样品分析。 ( 3 1 实验测出样品分析中的各种评价指标( 线性范围、检测限、回收率等) 【5 ，1 4 ，1 9 ，3 9 4 2 4 5 。注：硭a 是芳香胺的共轭酸的电离平衡常数，如c 6 h 5 n h 2 的共轭酸是c 6 h 5 n h 3 + ， 【c 6 h 5 n h 2 】 h + c 6 h 5 n h 3 + 寻苎h + + c 6 h 5 n h 2 ，i f a - p 硭a _ l 趔b ；2 2 ( 2 时 【c 6 比n h 3 + 】 p l g a + p k b = 1 4 。 1 6 第一章绪论 1 4 3 苯胺及其衍生物的毛细管电泳分离 1 4 3 毛细管区带电泳分离苯胺类混合物的主要研究内容 ( 1 ) 试验研究不同p h 值对各种苯胺及其衍生物的迁移时间和分离效果的影 响，从而得出最佳的p h 条件。 ( 2 ) 试验研究毛细管电泳缓冲溶液中电解质浓度对苯胺及其衍生物迁移时间 和分离效果的影响，而得出最佳的缓冲溶液组成。 ( 3 ) 讨论c z e 分离的峰序特征。 1 4 3 2 胶束电动毛细管色谱分离苯胺类混合物的主要研究内容 ( 1 ) 试验研究m e c c 分离苯胺及其衍生物的优化毛细管电泳条件。 ( 2 ) 比较c z e 分离和m e c c 分离的分离效果和重现性。 ( 3 ) 选用分离效果和重现性均较好的方法对实际水样进行分析。 ( 4 ) 实验测出定量分析的线性范围、检测限、回收率。 1 4 4 萘及其衍生物的毛细管电泳分离 ( 1 ) 主要研究内容： 试验研究p h 值、电解质浓度、s d s 浓度对萘及其衍生物迁移时间和分离 效果的影响，而得出分离萘及其衍生物混合物的最佳毛细管电泳条件。 讨论优化的毛细管电泳条件下的峰序特征。 ( 2 ) 实验测出定量分析的几种评价指标【4 2 ，4 5 o 1 7 华南理工大学工程硕士学位论文 2 1 仪器 第二章实验部分 毛细管电泳仪：1 2 2 9 型毛细管电泳仪及2 1 4 n m 3 1 紫外吸收检测器( 北京新技 术应用研究所) 毛细管：未涂层弹性熔融石英毛细管，管总长5 6 5 c m ( 有效长4 1 5 c m ) ，内 径5 0 um ( 河北永年光纤厂) 记录仪：x y 记录仪( 四川仪表厂) p h 计：p h d z 一1 笔型酸度计( 上海) 2 2 试剂 十二烷基硫酸钠( s d s ) ：广州化玻仪器公司进口分装。 0 环糊精( b c d ) ：上海化学试剂公司进口分装。 其它试剂：均为分析纯。 实验用水均为石英亚沸水。 2 。3分析操作和柱温及分离电压 阳极端手动迸样，进样高度1 0 c m ，进样时间1 0 秒，分离电压：2 6 k v 溶液 进入毛细管之前均用0 2 2 um 微孔滤膜过滤：两次迸样之间用缓冲溶液冲洗毛细 管约l m i n ；分离进行5 - - 6 次后，更换两边缓冲溶液。电泳温度：2 6 c 。 2 4 毛细管电泳仪器简介 2 4 1毛细管电泳仪的基本结构 毛细管电泳系统的基本结构包括进样、填灌清洗、电流回路、毛细管温 第二章实验部分 度控制、检测记录数据处理等部分，如图2 1 所示，可以简化为包含了一段 电解质溶液导体的导电回路( 图2 2 ) 【16 1 。 图2 1毛细管电泳系统的基本结构 1 6 】 1 一高压电极槽与进样机构；2 一填灌清洗机构；3 一毛细管 4 一检测器；5 一铂丝电极；6 一低压电极槽；7 一恒温机构 8 一记录数据处理 图2 - - 2 毛细管电泳系统的电流回路【1 6 1 一金属导体；2 一毛细管中的溶液导体 图2 1 所示的毛细管电泳系统适于阳极端进样，阴极端检测。有的毛细管电 泳系统为反向电泳系统，适于阴极端迸样，阳极端检测。 2 4 2 进样系统 2 4 2 1 基本构成“5 毛细管分离通道十分细小，所需的样品区带不过数纳升，所以象色谱中的那 些进样方法就不太适用了，它们存在较大的死体积，会使分离效率严重下降。有 一种简单的办法可以实现无死体积进样，这就是让毛细管直接与样品接触，然后 由重力、电场力或其他动力来驱动样品流入管中。进样量可以通过控制驱动力的 大小或时间长短来控制。显然，对应的进样系统必须包含动力控制、计时控制、 1 9 华南理工大学工程硕士学位论文 电极槽或毛细管移位控制等机构。 2 4 2 2 进样方法 至少有三种方法可以让样品直接进入毛细管，即电动法、压力法和扩散法。 ( 1 ) 当把毛细管的迸样端插入样品溶液并加上电场e 时，组分就会因电迁移 和电渗作用而进入管内【1 6 1 。 ( 2 ) 压力进样 压力进样也叫流动迸样，它要求毛细管的填充介质具有流动性，比如溶液等。 当将毛细管的两端置于不同的压力环境中时，管中溶液即能流动，将进样带入。 本文采用的进样方法为“手动高差进样”，属压力进样方法的一种。所谓手动 高差进样即是用手取出毛细管的进样端迅速插入样品溶液中，并立即抬高( 本文 的实验抬高1 0 c m ) ，由虹吸作用将样品溶液吸入，同时记录吸入时间( 也称进样 时间) ，本文实验的进样时间为l o 秒。 ( 3 ) 扩散进样 利用浓度差扩散原理同样可将样品分子引入毛细管。当将毛细管插入一样品 溶液时，样品分子因管口界面存在浓差而扩散进掣1 6 】， 2 4 3 毛细管清洗和缓冲液填灌机构 装填缓冲液是c e 分离的基本要求，对毛细管进行清洗则是保持自由溶液c e 高效和重现分离的条件之一。采用正压或负压容易实现毛细管的填灌或冲洗，所 需的机构和压力进样一样，包括位置控制、压力控制和计时控制等部分【l 。 注射器是许多实验室都容易得到的加压和抽空方法，将( 1 0 - 5 0 m 1 ) 注射针筒 固定于槽形结构中，同时利用弹簧来推动或抽拉活塞，就能使之产生所需的压力 1 6 】。本文的实验就是使用注射器进行缓冲溶液的填灌和毛细管清洗。 2 4 4 电源及其回路 毛细管电泳的电流回路系统，包括高压电源、电极、电极槽、导线和电解质 第二章实验部分 缓冲溶液等。 ( 1 ) 电源c e 一般采用0 一- + 3 0 k v 连续可调的直流高压电源。理想的电源应具 备：能输出单极直流高压( 一端接地) ；电压、电流、功率输出模式任意可选； 能控制电压、电流或电功率的梯度；电压输出精度应高于1 。 ( 2 ) 电极与电极槽c e 的电极通常由直径o 5 一l m m 的铂丝制成，在许多情况 下，可以用注射针头代替铂丝。电极槽通常是带螺口的小玻璃瓶或塑料瓶( 1 5 m l 不等) ，要便于密封。 ( 3 ) 导线接地端使用普通导线便可，但高压端需使用专门的高压导线，中间 不要有接头( 或仅有密封接头) ，否则容易出现放电现象并产生臭氧。 ( 4 ) 缓冲液缓冲液内含电解质，充填于电极槽和毛细管中，通过电极、导线 与电源连通，是分离室中的导体。 2 4 5 毛细管 毛细管是c e 分离的心脏。理想的毛细管必需是电绝缘、紫外可见光透明和 富有弹性的。目前可以使用的有塑料管、玻璃管、石英管等，其中弹性熔融石英 毛细管已有大量商品出售，因而被普遍使用。由熔融石英拉制得到的毛细管很脆， 易折断，但外涂聚酰亚胺后即变得富有弹性，这就是商品毛细管 】”。本文的实验 使用的是弹性熔融石英毛细管。 聚酰亚胺涂层不透明，所以检测窗口部位的外涂层必需剥离除去，剥离长度 通常控制在2 - 3 m m 之间。涂层剥离方法有硫酸腐蚀法、灼烧法、刀片刮除等。 2 4 6 检测及数据记录与处理系统 2 4 6 1 检测 c e 有许多潜在的检测方法，比如光吸收法、电化学方法、电导法以及化学发 光、磷光、荧光、质谱技术等，其中紫外吸收已经非常成熟，是绝大多数商品仪 器的主要检测手段。有少数商品仪器( 如d i o n e x 公司的c e ) 采用荧光检测方法。 2 l 华南理工大学工程硕士学位论文 荧光技术可以提高检测的灵敏度但属非普适性方法。如将普通荧光激发光源代之 以激光，就成了激光诱导荧光( l i f ) ，能达到单分子检测水平。b e c k m a n 和b i o r a d 公司己先后推出商品l i f 检测器。质谱作为检测手段已渐趋成熟，但尚无c e 专用 的检测器，均以联用方式实现柱后检测。a g i l e n t 的h p3 d 和b e c k m a n 的p a c e 等机型都可以和质谱联用。电导法适用于无机离子等的检测，但检测系统的制作 加工和重现性都还有待改进。化学发光也是一种极灵敏的检测方法，不过发光的 试剂系统不稳定，检测需要混合过程，使用不