细胞凋亡与肿瘤PPT课件.ppt

1,细胞凋亡与肿瘤,2,肿瘤,300-500例/10万,3,2002年10月7日英国人悉尼布雷诺尔、美国人罗伯特霍维茨和英国人约翰苏尔斯顿，因在器官发育的遗传调控和细胞程序性死亡方面的研究获诺贝尔生理医学奖。,SydneyBrennerH.RobertHorvitzJohnE.Sulston,图12002年诺贝尔生理医学奖获得者,线虫为模型Ced-3,ced-4and细胞死亡控制基因ced-9inC.elegans线虫的基因图谱correspondinggenesinhumans,4,细胞凋亡的概念和生物学意义,概念：有基因控制的个别细胞发生的主动有序的死亡过程，具有特征性的形态和生化改变。分生理和病理性凋亡。,生物学意义：选择性地清除多余、无用、有害细胞、衰老细胞,5,表1细胞凋亡与细胞坏死的比较,凋亡坏死,性质生理性或病理性,特异性病理性,非特异性,诱因较弱刺激，非随机发生强烈刺激，随机发生,基因调控有无,形态变化,6,细胞凋亡的形态学改变:,凋亡小体形成(apoptosisbody),细胞皱缩染色质边集核固缩或核碎裂,无炎症反应,7,核固缩或碎裂凋亡小体形成(apoptosisbody),细胞皱缩,细胞凋亡与坏死形态学改变的差别,炎症反应,无炎症反应,细胞肿胀细胞结构全面破坏,胞膜及细胞器相对完整,apoptosis,8,表1细胞凋亡与细胞坏死的比较,凋亡坏死,性质生理性或病理性,特异性病理性,非特异性,诱因较弱刺激，非随机发生强烈刺激，随机发生,凋亡小体有无,基因调控有无,形态变化,生化特点,9,细胞凋亡的生化改变,内源性核酸内切酶(endogenousendonuclease)的激活,DNA片段化,DNA双链在核小体连接区被核酸内切酶切割而断裂成180-200bp或其整倍数的片段。,凋亡蛋白酶caspase的激活,10,核小体,30nm,染色质的基本结构,11,琼脂糖凝胶电泳图,呈特征性的“梯”状条带(ladderpattern),12,细胞凋亡发生的酶学变化,核酸内切酶：在核小体连接区切割DNA形成180-200bp片段，核破碎凋亡蛋白酶Caspases,含半胱氨酸的门冬氨酸特异水解酶(cysteine-containingaspartate-specificprotease,）：消化细胞器蛋白，使细胞皱缩,Caspase家族组成成员共10多个，其中最重要的是caspase-1、caspase-3和caspase-8。,13,细胞凋亡发生的酶学变化,谷氨酰胺转移酶：使粘性蛋白交联，网罗细胞器，形成凋亡小体,14,表1细胞凋亡与细胞坏死的比较,凋亡坏死,性质生理性或病理性,特异性病理性,非特异性,诱因较弱刺激，非随机发生强烈刺激，随机发生,凋亡小体有无,基因调控有无,形态变化,生化特点,15,细胞凋亡的生物学意义,清除受病毒等感染的细胞,确保机体正常发育、生长,清除多余的、失去功能的细胞,维持内环境稳定,清除受损的、突变的及衰老的细胞,发挥防御功能,16,细胞凋亡发生过程中活性氧、钙超载、线粒体损伤的作用,一、活性氧(ActiveOxygen，ReactiveOxygenSpecies，ROS),是活泼的氧自由基和具有氧自由基反应性的其他含氧物质的总称，包括：O-2、.OH、O.2、H2O2。过量ROS引起凋亡：直接损伤DNA；损伤蛋白，灭活酶；影响转录；攻击细胞膜，影响信号传导和线粒体稳定,.,17,二、钙超载,钙超载引起凋亡：钙为第二信使，可活化核酸内切酶，舒展DNA；活化蛋白激酶C，从而使cAMP增加；激活NF-kB。,.,18,三、线粒体损伤,线粒体损伤引起凋亡：通透性升高，析出凋亡启动因子如细胞色素C、凋亡蛋白酶激活因子（Apaf）和凋亡诱导因子（AIF），从而激活Caspase9和Caspase3，AIF还直接激活核酸内切酶；改变细胞氧化还原潜能,.,19,细胞凋亡发生的范围及诱导与抑制因素,范围：多数正常组织，在胚胎发育和机体成长过程中，细胞分裂和凋亡是平衡的,20,一、诱导凋亡的因素,物理因素：紫外线、高温激素：糖皮质激素淋巴细胞细胞因子：TNF、Fas/Apo-1免疫因素：T淋巴细胞杀伤细胞毒药物：多种抗癌药微生物：细菌、病毒,.,21,二、抑制细胞凋亡的因素,细胞因子：Ils、CSF、NGF蛋白激酶C（PKC）激活剂：TPA微量元素锌：抑制钙激活的核酸内切酶激素：睾丸酮、雌激素其他因素：EBV、苯巴比妥,22,细胞凋亡的信号转导,细胞凋亡信号转导的环节各种触发因子与细胞膜受体结合，触发凋亡反应，第一信号系统活化作用；激活信号传导通路，促进凋亡相关基因的表达；某些凋亡相关基因的表达激活内切酶等效应分子，促进细胞凋亡；,23,细胞凋亡信号转导系统的特点,多样性：多种细胞凋亡信号转导系统偶联性：增殖、分化与凋亡同一性：不同凋亡因素可使用同一凋亡信号转导通路多途径：同一凋亡因素可使用多条凋亡信号转导通路,24,细胞凋亡的基因调控,促进细胞凋亡的基因：野生型p53，腺病毒EIA，细胞表面抗原Fas，c-myc，TGF-b1、bax，TNF抑制细胞凋亡的基因：突变型p53，bcl-2、pRb、ras、EBV的BHRF-1,25,一、P53基因,80年代初，癌基因；89年，抑癌基因野生型p53：被DNA损伤激活，阻G1/S进展，轻者修复，重者凋亡，避免DNA突变；激活bad，诱导凋亡突变型p53：抑制c-myc界导的凋亡,26,二、Fas基因,细胞膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)和神经生长因子受体(NGF)家族抑制肿瘤细胞增殖，诱导凋亡Fas需与其配体结合发挥凋亡作用。其天然配体就可能是凋亡信号（包括其抗体）Apo-1:也是细胞膜蛋白，具有Fas相似的作用,27,三、c-myc基因,双重作用抑制因子存在（抑癌、低血清、抑周期因子），c-Myc促进细胞凋亡刺激因子存在，c-Myc促进细胞增殖,抑凋亡;与bcl-2协同,28,四、TGF-1,抑制肝细胞增殖、促进其凋亡,.,29,五、bcl-2基因,抑制细胞凋亡（有选择），延长细胞寿命；成熟和衰老细胞中不表达或低表达Bcl-2和bax基因功能相反，即bcl-2抑制凋亡，而bax促进凋亡（诱导细胞色素C释放、激活Caspase)Bcl-2/bax、bcl-2/xl抑制凋亡；bcl-2/bcl-xs、bax/bad促进凋亡,30,六、pRb,野生型pRb抑制凋亡；pRb高表达抑制p53诱导的凋亡；pRb、P107、P130缺乏诱导凋亡。突变型pRb对凋亡无影响。,.,31,细胞凋亡与肿瘤,在肿瘤中细胞凋亡小于增殖细胞凋亡率约为1%-9.5%，淋巴瘤最高,腺癌次之,肉瘤最低细胞凋亡与肿瘤发生发展及转移都有关在肿瘤细胞中，促进凋亡的基因功能增强，抑制凋亡的基因功能减弱机体免疫反应诱导瘤细胞凋亡的功能不全,一、凋亡与肿瘤发生发展及转移,32,二、细胞凋亡与肿瘤的防治,治疗后发生凋亡是肿瘤化疗疗效的标志之一；增加凋亡指数与增生指数的比值已成为新的治疗目标；同时诱导细胞凋亡已成为筛选抗癌药物的新标准。在激癌和促癌阶段诱导细胞凋亡可使癌变逆转。,化疗、放疗、热疗、免疫治疗都可诱发细胞凋亡。,33,防治举例,放疗：淋巴瘤、腺瘤在照后凋亡增加，故对放疗敏感；肝癌、恶性黑色素瘤在照后凋亡不增加，故对放疗不敏感化疗：抑增殖促凋亡。顺铂、阿霉素、维甲酸等免疫治疗：抗FAS/APO-1抗体使淋巴瘤凋亡增加,.,34,细胞凋亡的检测方法,基于三方面：细胞膜完整性丧失DNA断裂细胞膜内侧磷脂酰丝氨酸(PS)翻转,35,一、形态学观察方法（一）,HE染色、光镜观察：圆、核深染、染色质团块状、胞质浓缩、胞膜“出芽”AO(吖啶橙）染色、荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，膜有“凋亡小体”,36,形态学观察方法（二）,台盼蓝染色：活或凋亡细胞，其膜完整，细胞不着色；死亡细胞，着蓝色透射电镜：细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集、细胞器集中细胞膜起泡和出“芽”凋亡小体和凋亡小体被吞噬细胞吞噬,.,37,二、DNA凝胶电泳,检测原理：凋亡细胞DNA断裂有规律，180200bpDNA片段；坏死细胞DNA断裂无规律结果判断：活细胞，一条区带；凋亡细胞，梯状条带；坏死细胞，血抹片状连续性条带存在问题：不特征；早期凋亡无DNA断裂；灵敏性差，需106细胞,38,三、酶联免疫吸附法（ELISA）核小体测定,原理：DNA断裂有核小体，核小体由组蛋白和DNA片段构成；抗组蛋白抗体方法简单，操作容易敏感性高，可检测5102细胞半定量；全定量不精确,39,四、流式细胞仪定量分析,原理：凋亡细胞膜通透性介于正常细胞和坏死细胞之间特点：检测细胞数量大，较准确可作许多相关分析可确定凋亡细胞所处细胞周期,32,40,1、Hoechs-PI双染色法,正常细胞不着色，荧光很浅凋亡细胞主要摄取Hoechs，强蓝色荧光坏死细胞主要摄取PI（碘化丙啶）红色,33,41,2、DNA片段原位标记法,原理：荧光素、地高辛或生物素标记的DUTP和TdT与凋亡细胞DNA链裂解后3羟基端结合原位缺口转移：用DNA多聚酶将标记物接到DNA断端原位缺口末端标记技术：用TdT将标记的DUTP接到DNA断端,34,42,3、检测细胞膜成分变化的AnnexinV联合PI法,原理：细胞凋亡早期细胞膜内侧磷脂酰丝氨酸(PS)迁移至细胞膜外侧；磷脂结合蛋白V(Annexin)同其有高度结合能力,可作为探针,35,43,V-PI,结果判断：正常细胞V、PI均低染凋亡细胞V高染，PI低染坏死细胞V、PI均高染应用价值凋亡早期；灵敏，假阳性低；简单省时；结果可靠，是目前最为合理的方法,.,44,目前治疗肿瘤新设想诱导凋亡,导入野生型p53抑制肿瘤增生；下调突变型p53、bcl-2的活性与表达，减弱其对细胞凋亡的抑制；抑癌基因引入瘤细胞，降低致瘤性，使肿瘤逆转为正常细胞；引入某些细胞因子，抑制肿瘤恶性表型，使细胞丧失致瘤性