（分析化学专业论文）发光细菌法检测量子点的毒性.pdf

摘要 发光细菌法检测量子点的毒性 分析化学专业硕士研究生王凌凌 指导教师郑鹄志 中文摘要 由于具有摩尔吸光系数高，荧光量子产率高，发射波长可调谐，耐光漂白等 显著优点，量子点在科研、医疗、生产和生活中得到广泛应用，人们接触到的机 会也逐渐增加。同时量子点的生物安全性和环境安全性研究也逐渐引起了人们的 重视。与宏观材料相比，量子点的尺寸小，表面能量高，反应活性大，其毒性的 评价研究也不能依照常规材料的方法。本文基于发光细菌发光抑制法系统检测了 六种量子点的毒性，并初步探讨了新型荧光碳点的毒性。主要的研究工作归纳如 下： 1 量子点的合成。分别以巯基乙酸( m a a 一) 、l - 半胱氨酸( c y s ) 、二巯基 辛酸( d 卸l a ) 和牛血清白蛋白( b s a ) 为稳定剂，水相合成了荧光性能良好的 c d s eq d s ，并用相似的方法合成了d h l a c d t eq d s 。油相中合成了银铟锌型 ( z a i s ) 量子点，然后用二巯基辛酸( d h l a ) 做了水溶性修饰，得到具有生物 兼容性的水溶性d h l a z a i sq d s 。 2 量子点的毒性检测。以发光细菌发光抑制法检测了各种量子点的毒性，得 到了量子点的半数有效浓度( e ) ，并得到了量子点的浓度、组成成分和表面修 饰基团影响其毒性大小的结论。 3 毒性机理的探讨。通过紫外照射实验、维生素c 对毒性的影响实验和超 薄切片结合透射电子显微镜技术，探讨量子点毒性机理。 4 荧光碳点的合成与检测。普通回流方法合成荧光碳点，并用聚乙二醇 ( p e g l 5 0 0 ) 进行表面钝化，得到未钝化c d o t s 和p e g c d o t s 两种荧光碳点。然 后用发光细菌发光抑制法对未钝化c d o t s 和p e g c d o t s 的毒性做了初步探讨。 实验证实碳点存在一定的毒性，并且p e g 钝化后碳点毒性降低。 关键词：发光细菌，量子点，碳点，毒性 a b s t r a c t d e t e r m i n a t i o no ft h et o x i c i t yo fq u a n t u m d o t sw i t hl u m i n o u sb a c e r i a p o s t g r a d u a t em a jo r i n g i na n a l y t i c a lc h e m i s t r y ：w a n g l i n g - l i n g s u p e r v i s o r ：a s s o c i a t ep r o f z h e n g h u z h i a b s t r a c t w i t ht h eb r i g h tf l u o r e s c e n c e ，n a r r o we m i s s i o n ，b r o a da b s o r p t i o nc o e f f i c i e n t s ，a n d h i g hp h o t o s t a b i l i t y , q u a n t u m d o t s ( q d s ) h a v er e c e i v e ds i g n i f i c a n ta t t e n t i o n a sp o t e n t i a l a l t e r n a t i v e st oo r g a n i cd y e sd u r i n gt h el a s td e c a d e s h o w e v e r , w i t ht h ee x t e n s i v e a p p l i c a t i o no fq u a n t u md o t si nt h eb i o l o g i c a lf i e l d s ，i tw a sm o r ea c c e s s i b l ef o rp e o p l e t oc o n t a c tt h e m s or e s e a r c hc o n c e r n i n gt h ep o t e n t i a lt o x i c i t yo fq d sh a da l s og a i n e da g r e a ta m o u n to fi n t e r e s t i tw a sc r i t i c a l l yi m p o a a n tt os e l e c tq d s w i t hl o wt o x i c i t yi n o r d e rt or e a l i z ea p p l i c a t i o n si nc e l l u l a ra sw e l la si nv i v ol a b e l i n g i nt h i sp a p e r ，an o v e l m e t h o ds o c a l l e db i o l u m i n e s c e n c ei n h i b i t i o n a s s a y w i t hl u m i n o u sb a c t e r i a ( p h o t o b a c t e r i u mp h o s p h o r e u m ) w a si n t r o d u c e dt oe v a l u a t et h et o x i c i t yo fq u a n t u m d o t s t h em a i nr e s e a r c hw o r k sa r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 w i mt h em e r c a p t o a c e t i ca c i d ( m a a 一) ，l - c y s t e i n e ( c y s 一) ，d i h y d r o l i p o i ca c i d ( d h l a 一) a n db o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a 一) a st h es t a b i l i z e r s ，w ep r e p a r e dc d s ei n a q u e o u sp h a s e a n dd h l a c d t ew a ss y n t h e s i z e du n d e r t h es a m es y n t h e s i sc o n d i t i o n s ( i e r e a c t i o nt e m p e r a t u r e ，p h ，p r e c u r s o rc o n c e n t r a t i o na n dr a t i o o fc d 2 + s eo r t e l i g a n d ) t h e nt h ef r e s hp r o d u c t sw e r ed i a l y z e dj u s tb e f o r et h ee x p e r i m e n t sa g a i n s t u l t r a p u r ew a t e rt or e m o v et h ee x c e s si o n s w h i l ez a i sq d sw e r es y n t h e s i z e di n o r g a n i cs o l u t i o n ，f o l l o w i n g w a t e r - s o l u b i l i z e dw i t hd h l ab yal i g a n de x c h a n g e p r o c e d u r e 2 u s i n gt h el u m i n o u sb a c t e r i aa sam i c r o b i a ls e n s i n ge l e m e n t ，w ec a r r i e do u ta s y s t e m a t i cs t u d yo nt h et o x i c i t yo fas e r i e so fq d sw ep r e p a r e d m e d i a ne f f e c t i v e c o n c e n t r a t i o n ( e ) ，t h ec o n c e n t r a t i o no fac o m p o u n dt h a ti n h i b i t s 5 0 o ft h e b a c t e r i a lb i o l u m i n e s c e n c e ，w a sc h o s e na st h ei n d i c a t i o nt oe s t i m a t et h et o x i c i t yo fq d s t h e s er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tb o t hc o m p o s i t i o na n ds u r f a c em o d i f i c a t i o nw e r e r e s p o n s i b l ef o rt h et o x i c i t yo fq d s h t 西南大学硕+ 学位论文 3 t h r o u g hu vi r r a d i a t i o ne x p e r i m e n t s ，t h ei n f l u e n c eo fv i t a m i nco nt h e t o x i c i t ya n dt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y , t h em e c h a n i s mo ft o x i c i t yo fq u a n t u m d o t sw a si n v e s t i g a t e d 4 b a r ec a r b o nd o t s ( c d o t s ) w e r ep r e p a r e do fb yo x i d a t i o no fc a r b o ns o o tw i t h n i t r i ca c i dr e f l u x i n g a f t e rs u r f a c ep a s s i v a t i o nw i t hp o l y e t h y l e n eg l y c o l ( p e g i s 0 0 n ) ，w e g o tt h ep e g c d o t s t h et o x i c i t yo ft h et w oc - d o t sw a ss t u d i e db a s e do nt h e b i o l u m i n e s c e n c ei n h i b i t i o na s s a yw i t hl u m i n o u sb a c t e r i a o u rr e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a t t h ec d o t sw e r et o x i ca n dt h es u r f a c ep a s s i v a t i o nw i t hp e gr e d u c e dt h et o x i c i t y e f f e c t i v e l y k e yw o r d s ：l u m i n o u sb a c t e r i a ，q u a n t u md o t s ，c a r b o nd o t s ，t o x i c i t y i v 符号说明 符号说明 缩写 名称 q d s c d o t s m a a d h l a c y s b s a n a c v c e c s o p e g t o p o t o p m t t s d c r o s t e m 量子点 碳点 巯基乙酸 二巯基辛酸 半胱氨酸 牛血清白蛋白 乙酰半胱氨酸 维生素c 半数有效浓度 聚乙二醇 三辛基氧膦 三辛基膦 3 一( 4 ，5 二甲基噻唑一2 ) 2 ，5 一二苯基四 氮唑溴盐 二乙基二硫代氨基甲酸钠 活性氧自由基 透射电子显微镜 v 独创性声明 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了 特别标注。不存在抄袭、伪造等学术不良行为所获的相关内容。对本 研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁在文中作了明确 说明并表示衷心感谢。 学位论文作者：守逸吹签字日期：乃幻年多月牛日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：峻莨导师签名：名量 譬字号期：。弓口f d 年厂月争日签字日期： p 年 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话：( 邮编：一 日 ) “ 乞胡 川易 第一章文献综述及前言 第一章文章综述及前言 1 1 前言 纳米科技产生于上世纪8 0 年代，指的是人们在纳米尺寸的范围内认识和改造 自然，在原子和分子水平上研究纳米结构的基本功能和规律，创造新的结构和功 能性材料的科学，它的产生为多种学科的交叉和融合提供了有效的平台l 。美国 未来学家德雷克斯勒认为：“纳米技术不是尺寸技术的延伸，而是一场认知革命”。 纳米科技开辟了人类认识世界的新层次，使人们改造自然的能力直接延伸到分子、 原子水平，因此纳米技术一诞生就引起了各国科学界的极大关注，被公认为是2 1 世纪最具有前途的科研领域。短短二十余年，纳米科技已经取得了许多令人鼓舞 的成就，并以惊人的发展速度广泛渗透于物理、化学、生物、医学以及材料等许 多学科领域，成为- - f - j 新兴的交叉学科7 j2 1 。其中纳米材料是纳米科技最为活跃、 研究内涵十分丰富的分支学科之一，它支撑了纳米科技的飞速发展，并迅速成为 新材料科学的前沿阵地。量子点( q u a n t u md o t ，q d ) u 3 ，又可称为半导体纳米 微晶体，是一种由一v i 族或i i i v 族元素组成的纳米颗粒，其三个维度的尺寸 都在1 0 0n l n 以内，内部电子在各方向上的运动都会受到局限，这种量子局限效 应会导致类似原子的不连续电子能级结构，因此量子点又被称为“人造原子。与 宏观的材料相比，量子点具有一些基于自身量子效应的独特性质。 1 1 1 量子点的物理效应 量子点的内部电子受到空间限制，只能在有限的区间运动，这种尺寸限域现 象引起了量子点的尺寸效应，表面效应，量子隧道效应和量子介电限域效应等物 理效应。 1 1 1 1 量子尺寸效应 量子尺寸效应指的是随着量子点尺, - j 的逐渐减小，量子点的载流子被限制在 一个小尺寸的势阱中，使其能带变为分立能级，有效能级加大，吸收光谱向短波 方向移动的现象【14 1 。 1 1 1 2 表面效应 表面效应是指量子点表面的原子数与总原子数之比随粒径的变小而急剧增大 后所引起的性质变化，即随着粒径的减小，量子点裸露在表面的原子数迅速增加， 导致其表面积、表面能都迅速增大，进而表现出很高的化学活性，很容易与其它 原子结合【1 5 1 。 西南大学硕士学位蹬文 l l l3 量子隧道效应 微观粒子具彳j 贯穿势垒的能力称为隧道效应【】。当材荆的尺寸进入纳米级， 电子的运动空问和其自由程具宵相当的数量级，电子能级处于分立状态，载流子 的运输过程呈现明显的波动性，从一个量子阱穿越量子势垒进入另个量子阱就 会出现量子隧道教戍。 i l l4 介电限域效应 介电限域足指纳米微粒分散在异质介质中由于界丽引起的体系介电增强的现 象。量子点表面结台介质中某种介电常数较小的材料后，引起光学| 生赝较大的变 化，产生介屯限域效应。 1 12量子点的荧光性质 作为种新型的荧光纳米材料，量子点具有许多优良的光学性质，丰要表现 为： 1 12 1 量子点激发光谱宽而连续 凡是小于量子点阜：子限域峰的任意波民，都可以激发量子点产生荧光，并日 小同颜色的量子点叫存同一波长处激发实现一元激发多元发射，从而降低了对 激发光源的的要求，人大简化了检测过科。 一 、 i i ：- 1 i | |_ 、d0 扑、刊忆 2 l 、：、，、 ： 。 1 三三：；到l 生o 一 图i1同一紫外照射下不同发射波长的量子点叫1 f i g u r ei 1 d i s t i n g u i s h a b l ee m i s s i o nc o l o r so f q d se x c i t e d w i t han e a ru v l a m p 第一章文献综述及前占 1 1 2 2 量子点发射光谱窄而对称 量子点的半高峰宽通常只有4 0n i n 甚至更小，且在长波方向没有明显的拖尾 现象，这样可以在发射峰不出现或出现少量重叠时，同时使用不同发射峰的量子 点，从而使量子点作为多彩编码应用于生物荧光标记中成为可能【1 8 - 2 1 1 。 1 1 2 3 荧光强度高 量子点具有非常高的激发重叠区，能够吸收大量的激发光。另外量子点的量 子产率是有机荧光素的1 0 1 0 0 倍，能有效的把吸收的光能发射出去，因此，量子 点具有很强的荧光。随着量子点合成和表面钝化技术的不断提高，其荧光性能必 将小断得到改善，有报道称量子点量子产率可达到8 0 一9 0 【2 2 之4 】，这使得量子点 在单分子研究中有很大的潜力。 1 1 2 4 发射波长可“调谐” 量子点的荧光发射波长随量子点的组成及尺寸而改变，其发射光谱覆盖了从 远紫外到近红外的波长区域，从而弥补了普通荧光分子在近红外光谱区品种少的 不足 2 5 - 2 6 】。 1 1 2 5 光稳定性强 量子点荧光寿命长，且耐光漂白，可以经受多次激发，因此为研究生物大分 子之间的长期作用及在体内的定位示踪提供了可能2 7 - 2 8 。 1 2 量子点的制备 量子点的合成条件直接影响其组成尺寸、形状和表面性质的均一性，进而影 响光学性能，因此良好的制备及处理方法对其在不同领域的进一步应用都非常重 要。目前为止，文献中已报道许多种量子点合成方法，且一直在不断改进中。这 里我们简单介绍两种最主要的合成方法：金属有机合成和水相加热合成。 1 2 1 金属有机合成法 金属有机合成法是基于有机物与无机金属化合物或有机金属化合物之间的反 应。此方法通常是在无水无氧的条件下，将反应前体注入到高沸点的表面活性剂 中，通过反应温度控制微粒的成核与生长过程。 1 9 9 3 年，b a w e n d i 等采用t o p o ( 三辛基氧膦) 作为有机配位溶剂，用二 甲基镉和t o p s e ( 三辛基硒膦) 做前体，通过调节温度成功合成了c d s e 量子点， 第一次展示了金属有机合成法的巨大潜质。但是此方法中所用盼试剂存在价格昂 贵，有剧毒，在常温下不稳定，甚至在高温下还会发生爆炸并放出大量的有毒气 体等问题，因此对实验条件要求十分严格，并且q d s 尺寸得不到有效的控制。 3 西南大学硕十学1 1 c 7 ：沦文 2 0 0 2 年，p e n g 3 0 j 等人用c d o 代替二甲基镉，他们将c d o 、t o p o 和用作配体的 己基磷酸或十四烷基磷酸混合加热至3 0 0 o c ，然后加入硫、硒或碲的溶液，再将 温度降到2 5 0o c ，直至纳米粒子生长到需要的尺寸，合成了c d s 、c d s e 和c d t e 等粒径十分均匀的纳米粒子。这些改进使量子点的制备变得相对安全和简单。 图1 2 ：有机相合成t o p o c d s e 的示意图f 2 卅 f i g u r e1 2s c h e m a t i cp r e s e n t a t i o no ft h es y n t h e t i cr o u t eo ft o p o - c d s e 采用金属有机化学法制备纳米粒子具有结晶性好、发光效率高、尺寸均一、 粒度可调等优点。但也存在许多问题：其水溶性差而不能直接用于生物体系中； 实验条件苛刻，不易控制；所用药品成本高，且有的药品毒性较大，室温下不稳 定等。 1 2 2 水相加热合成法 水相加热合成法是一种在适当稳定剂存在下以无机试剂在水溶液中直接合成 量子点的方法。现在合成较多的是c d s e 和c d t e 量子点，合成方法已趋于成熟。 水溶性c d e ( e ：s ，s e ，t e ) 量子点合成大致分为以下几个过程 3 1 - 3 4 1 ：第一步 是n a h e 前体的合成。这一过程要在氮气保护下进行加热回流，直至溶液澄清： 第二步是在c d c l 2 的水溶液中加入稳定剂如巯基乙酸，然后用n a o h 溶液或者浓 氨水调节p h 值至碱性，通氮除氧备用；第三步，将第一步所得溶液加入到第二 步所得溶液中，在搅拌的条件下，水浴加热回流得水溶性量子点。为保证在前体 转移过程中刁、= 被氧化，d e n g 等 3 5 1 对上述步骤进行了改进，合成n a h e 前体后， 加入稀硫酸，产生了h 2 e ，然后由氮气流带入到含c d c l 2 和稳定剂的烧瓶中反应， 这样有效的避免了n a h e 的氧化损失。 4 第一章文献综述及前言 n 2 c = = 图1 3 ：水相合成c d s e 量子点示意刚3 5 】 f i g u r e1 3s c h e m a t i cp r e s e n t a t i o no ft h es y n t h e t i cr o u t eo fw a t e r - s o l u b l ec d s e 与在有机相中合成量子点相比，水相中合成量子点的方法具有操作简单、成 本低、实验条件易于控制、安全可靠、重复性高等优点，并且可以直接应用于生 物体系。其缺点是合成的量子点尺寸分布不均匀，量子产率较低。 1 3 量子点在生物医学中的应用 1 9 9 8 年n i e t 3 6 1 和a l i v i s a t o s 3 7 1 研究组同时报道水溶性修饰的量子点可以与生 物分子偶联应用于细胞荧光成像研究，从而将量子点引入到生物医学领域。此后， 量子点在生物体系中的应用引起了各界科研工作者的关注，随之在生物化学、细 胞生物学、生物医学等研究领域显示了巨大的潜力。 1 3 1量子点应用于生物大分子的标记 量子点一般通过偶联的方式和生物大分子如：核酸、d n a 、各种蛋白等结合 的。结合主要有两种方式：一种是共价结合法，即量子点表面修饰基团所带的羧 基、氨基或环氧基等官能团与生物分子中的氨基或羧基结合来实现偶联。这种方 法较复杂，但是结合牢固，故应用最为广泛。另一种是根据静电作用，通过所带 电荷的不同将量子点和生物大分子结合起来，此方法适合一些简单的研究。 5 两南大学硕士学位论文 0 s c h 2 c o o h 图1 4 ：表面修饰巯基乙酸的c d s e z n s 与蛋白通过羧基和氨基的共价作用结合【3 7 1 f i g u r e1 4az n s - c a p p e dc d s eq d si sc o v a l e n t l yc o u p l e dt oap r o t e i nb ym e r c a p t o a c e t i ca c i d m i t c h e l l 3 8 1 等用末端带有巯基的d n a 分子部分取代量子点表面的巯基丙酸， 结合量子点的d n a 分子作为探针可特异性检测到样品中的互补序列。b a k a l o v a 【3 9 】 等将量子点应用于蛋白质印迹中通过免疫分析检测痕量蛋白。m i r k i n 掣柏j 用疏基 丙酸修饰c d s e z n sq d s 后，分别将两段不互补的d n a 固定到q d s 上，得到两 种d n a 功能化的q d s ，然后再分别与这两段d n a 互补的d n a 片断混合，即可 进行杂交组装。 1 3 2 量子点应用于细胞成像 n i e 3 6 1 研究表明功能化的量子点能通过内吞作用进入细胞，且能实行细胞实 时检测。此后用量子点的细胞成像功能在量子点毒性检测和实时踪探测领域表现 了相当大的潜力。d u b e r t r e t 等【4 1 1 将q d s 胶囊注入非洲蟾蜍胚胎中观察其胚胎发 育过程，发现胶囊q d s 在生物体内很稳定，基本不影响细胞生长和发育。d a h a n 【2 0 】 等人用量子点示踪单个甘氨酸受体蛋白，分析这种蛋白在神经细胞活动的动态过 程，得到了其在细胞中的运动轨迹。 1 3 3 量子点在荧光能量转移中的应用 荧光共振能量转移是一种光物理过程，在一定尺寸范围内，供体的发射能量 激发受体，使其发生能量转移。这项技术已经应用于检测细胞内的生物蛋白或分 子之间的相互作用【4 2 - 4 3 1 。量子点由于具有宽且连续的吸收光谱以及波长可调的发 射光谱，它在作为能量供体时，可以选择有最佳的激发波长以及最适宜的发射波 长的量子点来得到最大的波谱重叠，从而在构建d n a 传感器、蛋白质及小分子 传感器中得到应用。w a n g l 4 4 j 等应用量子点的共振能量转移原理，以红、绿量子点 分别标记牛血清白蛋白( b s a ) 和抗牛血清白蛋白( i g g ) ，结果当二者形成免疫 复合物时，b s a 上的红色量子点荧光增强，i g g 上的绿色量子点荧光相应减弱。 6 第一章文献综述及前青 此外，量子点还被广泛应用于活体成像m 却j 、生物传感器m - 4 9 1 、光谱编码技 术【5 眄1 1 、药物检测及治疗 5 2 - 5 5 1 等多方面研究。 量子点作为一种新型的荧光探针，具有传统有机染料不可比拟的优点，使其 代替有机荧光染料在很多领域取得了突破性的进展。但是量子点在生物体系中的 应用也存在着很多问题，例如：量子点光不稳定，存在着光闪烁现象影响单分子 检测。有文献报道在持续照射情况下，量子点的荧光增强，从而影响检测结果。 量子点的毒性也是影响其应用的重要制约因素。量子点含有的重金属元素对肺和 肾脏都具有毒性，且其表面活化能高，易吸附，易反应，所以量子点的广泛应用 对人类环境可能产生的污染问题已日渐引起研究者的高度关注。 1 4 量子点的毒性研究方法 随着q d s 应用的深入研究和广泛普及，q d s 的生物安全性即对健康和环境的 潜在负面影响也逐渐引起科研工作者的重视，已有多种方法用于研究量子点毒性。 1 4 1 动物实验法 体内研究一般指动物实验法。动物研究法主要通过动物存活率、生化指标检 验、组织病理学检验等方法研究量子点的毒性。根据染毒方式的不同，又可分为 吸入染毒法、静脉注射染毒法和喂食法。l a r s o n t 5 6 3 等分别将2 0n m 和1g m c d s e z n sq d s 注入小鼠内，结果发现这两个实验组和对照组的小鼠在成长中没什 么显著区别。a k e r m a n 5 7 1 将分别用氨基酸和p e g 修饰的c d s eq d s 静脉注射入小 鼠后，发现它们主要聚集在肝脏和肾脏中，并且p e g 可以降低q d s 的非特异性 吸附。 动物实验法可以从整体上检验量子点的综合毒性，是目前最为接近实际情况 的研究方法，但也存在着花费大，实验周期长等问题。 1 4 2 细胞实验法 与动物实验法相比，细胞实验法以其显著的优点受到人们的关注。首先，它 操作较简单，易控制，重现性好。其次， 易接受。然而细胞对外界环境的敏感性， 它的花费较低。另外在道德上人们更容 使得严格控制实验条件并选择合适的分 析方法显得尤为重要。基于细胞实验的分析方法很多。最为简单的是直接用显微 镜可视化观察细胞，根据细胞或细胞核形态的变化判断其损害程度。随着毒性的 增加，细胞膜会产生膜泡，并且染色体出现浓缩现象，从而得到直观的结果。 细胞活性研究更为普遍的方法是比色法，根据所用染料的不同，它可进一步 判断某一细胞器如细胞膜和线粒体的活性。台盼蓝和中性红实验就是根据细胞膜 7 两南大学硕士学位论文 的通透性来判断细胞膜的完整性。而细胞实验法中最常用的m t t 活性分析法， 则是通过判断线粒体的活性来考察量子点的细胞毒性。m t t 是一种淡蓝色的试 剂，与活细胞线粒体中的脱氢酶反应产生一种深蓝色的物质甲簪，通过测定其在 4 9 2 n m 处的吸收可定量检测活细胞的数量。 量子点可能还具有遗传毒性，一般是通过检测d n a 损伤来判断的。彗星电 泳法是常用的方法。将单个细胞悬浮于琼脂糖凝胶中，短时间的电泳后用荧光染 料染色。凋亡细胞中形成的d n a 碎片在电场中速度较快，使细胞核呈现出一种 彗星式的形状，而正常的d n a 则保持球状，从而可以快速简便的检验出细胞是 否凋亡。 细胞实验法也存在着一些不足，如：培养条件复杂，实验周期长，而且不同 类型的细胞对相同的量子点可作出不同的反应等。 1 4 3 微生物检测法 微生物检测纳米材料毒性的方法鲜有报道。2 0 0 6 年，b r a y n e r t 5 8 】用大肠杆菌 研究z n o 纳米材料的毒性，通过菌落计数判断毒性的大小。z h e n g 5 9 1 等将发光细 菌法引入纳米材料毒性检测领域，用一简单快速灵敏的方法成功的检测了荧光纳 米金和碳纳米管的毒性，验证了发光细菌法检测纳米材料毒性的可行性。这里我 们重点介绍发光细菌法检测量子点毒性的方法。 发光细菌是一类能产生生物发光的细菌，主要来自于海洋。正常生理活性下， 发光细菌能发出肉眼可见的蓝绿色可见光。任何影响它新陈代谢的环境条件变化 和有毒物质均能引起其发光度的变化，其减弱程度与毒性大小或毒物物质浓度成 一定比例关系，这是它能定量检测物质毒性的基础。1 9 7 8 年，美国的b a c k i n a n 公司研制成一种生物发光光度计( 或称生物毒性测定仪) ，注册商标为“m i c r o t o x ”， 所使用的菌株是发光细菌杆菌，其灵敏度可与鱼类9 6h 急性毒性试验相媲美唧】。 此后发光细菌毒性检测技术开始用于各种生物毒性方面的检测，因其具有快速， 简便，经济等不可比拟的优点，迅速得到全世界范围内的认可，现已被多个国家 列为水质急性毒性检测的标准方法。 纳米材料的飞速发展，使其毒性检测成为巨大的挑战，我们迫切希望更简单、 快速、灵敏的方法来系统的研究量子点的毒性。发光细菌检测法就具备了这种条 件，它操作简单，检测快速、反应灵敏、经济等优点，并且具有成熟的商品化仪 器，能快速灵敏的检测出毒性物质的急性毒性，有望在纳米材料的毒性研究中大 放异彩。本论文我们用发光细菌法成功检测了6 种量子点的毒性，研究了量子点 毒性的影响因素，所得毒性结果与文献一致，成功建立了快速、可靠检测量子点 毒性的新方法【6 。 8 第一章文献综述及前言 1 5 量子点毒性效应的影响因素 随着量子点毒性研究的深入发展，毒性效应的影响因素和机理探讨已初步形 成理论。各种研究表明，影响量子点的因素很多，包括：外界环境、量子点的理 化性质( 如成分、粒径大小、形状、表面修饰基团、表面电荷、稳定性等) ，量子 点的浓度，培育时间，所用染毒的受体种类等。因此评价量子点的毒性时，应该 综合分析量子点的内在性质，及其与外界环境的相互作用等诸多因素【6 2 1 。 1 5 1 粒径对量子点毒性的影响 量子点的物理化学性质是影响其毒性的关键因素。由于量子尺寸效应，q d s 具有特殊的理化性质，并且它可通过粒径大小来调谐荧光发射波长，这一优点对 q d s 在生物体内作为荧光探针起到了重要作用。然而近年来研究发现，量子点粒 径的大小与毒性有关，它可影响q d s 在细胞中的分布，进而影响细胞活性。 s h i o h a r a 等 6 3 1 利用三种粒径不同的m u a c d s e z n s ( q d s 5 2 0 、q d s 5 7 0 、q d s 6 4 0 ) 探讨了粒径对细胞活性的影响。三种q d s 分别对非洲绿猴肾细胞( v e r o ) 、人宫 颈癌传代细胞( h e l a ) 和人原代肝细胞( h c ) 作用后，用m t t 法测细胞活性发 现，即使在低浓度( o 1m g m l ) 下，q d s 也会影响细胞活性，并且呈现剂量一 效应关系，浓度增加，毒性增大。粒径最大的q d s 6 4 0 对细胞活性影响最小，而 q d s 5 2 0 、q d s 5 7 0 的对细胞活性影响趋势相同，粒径的不同造成了其毒性效应的 不同。由于粒子在细胞内的运动与粒径大小密切相关【1 1 1 ，这可能解释小粒径的颗 粒更容易引起细胞变化原因。l o v r i c 等畔j 进一步证实了这一结论。他们分别检测 了巯基丙酸修饰的红色c d t eq d s ( 直径为5 2 o 1n m ) 和半胱胺修饰的绿色c d t e q d s ( 直径为2 2 0 1n m ) 在p c i 2 和n 9 细胞中的分布和毒性作用。结果表明： 在1 0m gm l d 时，两种q d s 都会影响线粒体活性，随浓度的增加，小粒径的绿色 q d s 作用更为明显。进一步研究显示，红色的q d s 主要分布在细胞质中，而绿色 的q d s 则主要分布在细胞核中。由此得出结论：小粒径的q d s 能进入细胞核， 可引起d n a 损害，从而造成细胞凋亡。 1 5 2 修饰基团对毒性的影响 表面修饰基团对q d s 毒性的影响也是毒理学研究的热点。h o s h i n o 等【6 5 】研究 了5 种不同表面修饰的c d s e z n s 对w t k l 细胞遗传毒性的影响。他们在c d s e z n s 表面分别包被上了巯基十一酸( m u a ) 、半胱氨盐、硫代甘油及它们不同比例的 混合物，得到五种水溶性的q d s ：q d - c o o h 、q d - o h 、q d n h 2 、q d o h c o o h 及q d n h 2 o h 。研究结果表明q d c o o h 的毒性最大，而q d o h 的毒性最小。 从而得出了表面修饰基团而非核的成分决定了q d s 的毒性效应。g u o 等惭】用三种 9 西南大学硕士学位论文 表面活性剂f l u r o n i c6 8 ( f 6 8 ) 、溴代十六烷基三甲胺( c t a b ) 和十二烷基磺酸 钠( s d s ) 修饰c d s e q d s ，分别得到中性、带正电和带负电的q d s ，通过比较这 三种量子点对h e p g 2 细胞活性的影响发现：c t a b - - q d s 毒性远远大于f - 6 8 q d s 和s d s q d s 的毒性，从而证实了h o s h i n o 的结论：修饰基团影响q d s 的细胞毒 性，并月这种作用与其表面电荷密切相关。因此为降低量子点的毒性，选择合适 的修饰基团尤为重要。有研究报道表明两性分子或一些大分子如p e g 等可有效钝 化表面，降低q d s 毒性。 除此之外，外界条件也是影响q d s 毒性的重要因素。例如有的q d s 只有在 光照和氧化的条件下才有毒性【6 7 1 ，因此不论是在合成、储备还是应用过程中控制 q d s 的无氧环境是非常重要的。另外量子点的浓度、暴露时间也在很大程度上影 响着q d s 的毒性，浓度越大，暴露时间越长，毒性越大。 1 5 3量子点毒性机理探讨 毒性机理的研究是毒性考察中的重要部分，人们从不同的角度探讨了这一问 题，得到初步的理论成果。d e r f u s 等【6 8 】首先提出了表面氧化引起c d “泄漏的机理。 t o p o c d s e 在空气中氧化3 0 m i n 后用m a a 进行表面修饰，然后与细胞作用，结 果细胞活性显著降低，由此推测是由q d s 表面氧化所致。为验证这一猜测，他们 进一步做了紫外照射实验。将q d s 在紫外灯下照射不同的时间，以加速q d s 表 面氧化，然后和细胞进行孵育，结果发现随照射时间的增长细胞活性明显降低， 并且体系c d 2 + 自由溶解态浓度增加，由此证实了q d s 表面氧化导致c d 2 + 泄漏引 起细胞毒性的机理。s u 等【6 9 】研究了三种c d t e ：裸露c d t e 、c d t e c d s 和 c d t e c d s z n s 的细胞毒性，发现裸露的c d t e 毒性最大，随着壳层的增多，q d s 抗氧化能力增加，可有效防止c d 2 + 泄漏，从而逐渐降低其细胞毒性，进一步验证 了c d 2 + 泄漏引起细胞毒性的机理。l o v r i c 等m 】在相同条件下将三种物质乙酰半胱 氨酸( n a c ) 、t r o l o x 和牛血清白蛋白( b s a ) 加入细胞培养基中，再加入c d t e 作用，结果只有n a c 、b s a 降低了c d t e 量子点对细胞活性的毒性效应，同为抗 氧化物质t r o l o x 却没有此作用，表明了c d 2 + 释放不是量子点产生毒性的唯一机理。 1 0 c d s e q d s + 包 o x i d a t i o n t o p o o r 3 6 5 n m u v r e m o v a jo fs u r f a c ea t o m s + c d + s e 0 2 图1 5c d s e 表面氧化产生c d 2 + f 6 s 1 f i g u r e1 5s u r f a c eo x i d a t i o nl e a d st or e l e a s eo fc a d m i u mi o n s 钳 c 第一辛文献综述及前青 活性氧自由基( r o s ) 的产生，是研究发现的另一种量子点的细胞毒性机理。 l o v r i c 等【7 0 j 将裸核c d t e 和m c f - 7 细胞作用后，在共焦显微镜下用二水和溴乙非 啶( d 耶) 验证了r o s 的产生。随着细胞环境中r o s 的不断增多，线粒体膜发 生脂质过氧化，使得磷脂双分子层降解，线粒体膜电位发生变化，最终导致细胞 色素c 的释放，促进细胞凋亡。t a n g 等【7 1 1 在q d s 产生r o s 的基础上，根据细 胞质内的c a 2 + 在r o s 损害细胞的过程中起重要的作用的原理，提出了c a 2 + 增加 引起细胞毒性的原理。c h o 等【7 2 j 进一步研究了q d s 的毒性机理。他们将同一浓度 ( 1 0 9 9 m l - 1 ) 下的不同量子点作用于m c f - 7 细胞，并以c d c l 2 溶液作为阳性对 照，比较了细胞中c d 2 + 浓度与细胞增殖毒性之间的关系。结果发现：当暴露于 c d c l 2 时，细胞内c d 2 + 浓度和细胞活性之间存在显著的负相关，而暴露于量子点 时，这种剂量一效应关系并不明显。这说明细胞毒性的产生并不是c d 2 + 单独作用 的结果。进一步结合暴露过程中细胞溶酶体和线粒体形态学的改变，研究人员认 为量子点毒性是游离c d 2 + 和氧化过程产生的r o s 共同作用的结果。 综上所述，量子点的毒性机理探讨主要集中存c d 2 + 泄露、r o s 的产生及r o s 自由基介导的氧化应激等三个方面。为减弱这些机制的影响，一般在量子点表面 增加壳层，以提高量子点的稳定性。 量子点的广泛应用前景必将推动对其毒性的深入研究。尽管量子点毒理学的 研究已经取得一定的成果，但其毒性机理、代谢动力学等方面的研究还很4 完善。 我们需要建立合适的测试方法和模型，深入研究其潜在的毒性效应及机制，完善 q d s 的生物兼容性，使其更好的应用于生物体内。 1 6 本文的出发点及主要研究内容 量子点具有摩尔吸光系数高，荧光量子产率高，发射波长可调协，耐光漂白 等优点，在科研、医疗、生产和生活中得到广泛应用，人们接触到的机会也越来 越多。同时由于具有尺寸小，表面能量大，反应活性大等特点，量子点的生物安 全性和环境安全性研究也逐渐引起了重视。现有的研究方法主要为动物实验法和 细胞实验法，虽然取得了一定的成果，但存在操作繁琐，耗时较长，花费较大等 问题。量子点的飞速发展，对其毒性检测带来了极大的挑战，客观上需要建立更 快速、灵敏、简便的方法来系统的研究量子点的生物毒性。基于此，本论文将发 光细菌法引入量子点毒性检测领域，与现有的量子点毒性检测方法比较，它具有 操作简单，快速、灵敏高，花费较低等显著优点，能在1 5m i n 内定量检测出量子 点的毒性，在纳米材料的毒性研究领域具有很大的潜力。基于以上的研究意义， 本论文在以下方面展开了工作： 1 量子点的制备。以相似的方法水相中合成了二巯基辛酸修饰的c d t eq d s 西南大学硕十学位论文 和多种修饰基团修饰的c d s eq d s ，得到d h l a c d t eq d s 、m a a c d s e 、 d h l a c d s e 、c y s c d s e 和b s a c d s eq d s 。有机相中合成了银铟锌型( z a i s ) 量子点，并用二巯基辛酸做了水溶性修饰，得到生物兼容性的d h l a z a i sq d s 。 2 以发光细菌发光抑制法检测了各种量子点的毒性，得到了量子点的半数有 效浓度( e c s o ) ；详细探讨了量子点组成成分、表面修饰基团对量子点毒性的影响。 3 通过紫外照射实验、