（分析化学专业论文）基于树状分子的dna电化学生物传感器研究.pdf

论文题目： 学科专业： 学位申请人： 指导老师： 基于树状分子的d n a 电化学生物传感器研究 分析化学 高欢 祝宁宁副教授 中文摘要 脱氧核糖核酸( d n a ) 是重要的生命物质，其结构和功能的研究对遗传和变异 有着重要意义，对d n a 的检测分析是临床诊断的重要依据。常见的分析方法有 色谱法、显微光度法、吸光光度法、荧光光度法、光散射技术、电化学分析法和 传感器技术。其中d n a 传感器又根据换能方法的不同分为电化学传感器、光化 学传感器、压电传感器、光导纤维传感器等。d n a 的电化学分析和电化学传感 器的研究是近年来研究的热点，与荧光标记、发光标记等常见标记技术相比，具 有选择性好、灵敏度高、测试费用低、易于微型化等优点，同时又不破坏测试体 系，不受生物样品中混浊、溶血等情况干扰，所以能够在临床基因疾病检验、环 境检测、法学鉴定等领域得到广泛的应用，逐渐成为分子生物学研究中直接进行 d n a 序列检测的方法之一。 树枝状大分子是上世纪中期开发的一类具有三维结构的合成高分子，其结构 特点是高度支化，与传统线型聚合物相比，具有良好的溶解性和较低的黏度。其 内部具有空腔，外部含有大量的功能基团，具有络合与分散各种金属微粒的潜在 能力。作为一种新型分子，在表面活性剂、纳米复合材料等方面已展现出较好的 应用前景。随着支化代数的增加，树枝状大分子的分子结构逐渐接近球形。与传 统的表面活性剂相比，虽然分子结构不同，但是树枝状大分子的官能团也含有亲 油基和亲水基，因此具有和传统表面活性剂相近的性质。同时，树枝状大分子的 结构比传统高分子更明确，由于具有非结晶性、低黏度和较好的水溶性，并且末 端可导入大量的反应性或功能性官能团，因此在生物医药，材料改性、工业催化 及石油工业呈现出较好的应用性能。在纳米复合材料方面，树状大分子可以作为 聚合模板，表面经修饰的p a m a m 树状大分子还可以用来制备c u - - - p a m a m 、 a g _ p a m a m 、a u - - p a m a m 及c d s - - - p a m a m 等树状金属纳米复合材料。树枝 状大分子的特殊结构，即内部具有空腔，外部含有大量的功能摹团，使其被广泛 应用于d n a 电化学传感器的制备。 本论文的工作致力于基于树状分子的d n a 电化学生物传感器研究。主要包 括以下三个方面：( 1 ) p a m a m - n h 2 ( g 4 ) 、a g p a m a m n h 2 ( g 4 ) 的光谱 学研究；( 2 ) 羧基化多壁碳纳米管和p a m a m - n h 2 ( g 2 ) 增强的d n a 电化学生 物传感器；( 3 ) 基于d t 4 5 c u 2 + 标记d n a 探针的d n a 电化学传感器研究。本论 文的新意在于将a g p a m a m - n h 2 复合纳米粒子、羧基化多壁碳纳米管、p a m a m 树状大分子和d t 4 5 c u 2 + 树枝状络合物应用至i j d n a 电化学传感器中，并采用紫外 可见光谱、荧光光谱、红外光谱、原子力显微镜、差热热重分析、x 射线光电 子能谱以及循环伏安、交流阻抗、差分脉冲伏安等电化学分析方法进行全方位表 征。实验证明，制备的新型d n a 电化学传感器灵敏度高、检测限低、稳定性和 重现性好，且传感器能够再生。本论文主要内容分为以下几个部分： 一、p a m a m n h 2 ( g 4 ) 、a g p a m a m n h 2 ( g 4 ) 的光谱学研究 本文包括两部分内容：( 一) 通过原子力显微镜( a f m ) 成像，比较 p a m a m n h 2 ( g 4 ) 和p a m a m - n h 2 ( g 2 ) 结构形态的差异。研究四代以氨基为 端基的聚酰胺胺树枝状化合物p a m a m - n h 2 ( g 4 ) 在不同条件下的荧光发射，讨 论p h 、陈化时间、浓度和生物分子d s d n a 对其荧光强度的影响；( 二) 以 p a m a m - n h 2 ( g 4 ) 为模版，制备a g p a m a m - n h 2 ( g 4 ) 树形纳米分子，讨论 不同摩尔比( p a m a m n h 2 ( g 4 ) ：a 矿) i 拘a g + p a m a m - n h 2 ( g 4 ) 溶液的滴定 曲线图，从而定性地研究了不同摩尔比和p h 值对a 矿与p a m a m - n h 2 ( g 4 ) 络合 的影响，并用紫外可见光谱，荧光光谱等测试手段对所制得的银树形纳米分子 进行表征。a g p a m a m - n h 2 ( g 4 ) 树形纳米分子在d n a 传感器中具有极其广阔 的应用前景。 二、羧基化多壁碳纳米管和p a m a m n h 2 ( g 2 ) 增强的d n a 电化学生物传感器 本文介绍了一种新型的高灵敏度的d n a 电化学传感器，即将羧基化的多壁 碳纳米管和聚酰胺胺树枝状化合物应用到d n a 电化学传感器中。我们在玻碳电 极( g c ) 表面依次修饰羧基化的多壁碳纳米管( m w n t - c o o ) 和二代以氨基 为端基的聚酰胺胺树枝状化合物( p a m a m - n h 2 ( g 2 ) ) ，得到 p a m a m m w n t c o o - g c 电极。该修饰电极共价键合d n a 探针序列，在不同浓 l i 度的互补序列溶液中经过杂交反应后，检测电极表面的阻抗变化，得到r c t _ 浓 度曲线。采用c v 、e i s 、i r 、x p s 和t a g 对层层修饰进行表征，同时讨论 m w n t - c o o 。浓度及杂交时间的选择。该种传感器灵敏度高，线性范围宽，线性 范围在5 0 x 1 0 以o m 到5 0 x 1 0 。1 4 m 之间，最低检测限为1 0 3 4 x 1 0 1 4 m 。实验证明， 传感器稳定性佳、重现性好，同时具备良好的再生能力。另外，以柔红霉素为指 示剂，检测d n a 电化学探针对目标d n a 的识别能力，柔红霉素响应信号明显。 三、基于d t 4 5 c u 2 + 标记d n a 探针的d n a 电化学传感器研究 利用d t 4 5 能与c u 2 + 络合的特性，将大量c u 2 + 嵌入d t 4 5 内部，首次将其标记 d n a ，制备d t 4 5 c u 2 + 标记的d n a 电化学探针。本论文使用紫外吸收光谱表征 d t 4 5 与c u 2 + 络合的情况，研究了p h 值对d t 4 5 与c u 2 + 络合的影响和相关机理， 并证明了d t 4 5 c u 2 + 标记的d n a 电化学探针的成功制备。文章中还讨论和优化了 包括修饰电极的制备、阳极溶出伏安法( a s v ) 检测c u 2 + 的各种参数选择在内的 各种实验条件，最终选择碳纳米管修饰电极、0 4 v 作为最佳富集电位、3 0 0 s 作 为还原富集时间。由于采用了灵敏度很高的阳极溶出伏安法并使用碳纳米管修饰 电极进行测定，使传感器对特定序列d n a 片段检测的灵敏度得到了极大的提高， 检测下限达到1 o x l 0 。1 2 m ，稳定性和重现性良好。 关键词：d n a 电化学传感器；d n a 电化学探针；多壁碳纳米管；树枝状大分子 i i i a b s t r a c t d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ( d n a ) i so n e o fi m p o r t a n tm a t e r i a l st ot h el i f e s t u d i e so f i t ss t r u c t u r ea n df u n c t i o nc o n t r i b u t et ot h er e s e a r c ho fg e n e t i cv a r i a t i 0 i l a n dt h e d e t e c t i o na n da n a l y s i so fd n ai sa l li m p o r t a n tb a s i sf o rc l i n i c a ld i a g n o s i s c o m m o n a n a l y t i c a lm e t h o d si n c l u d ec h r o m a t o g r a p h y ，m i c r o - s p e c t r o p h o t o m e t r y ，a b s o r p t i o n s p e c t r o p h o t o m e t r y ，f l u o r e s c e n c es p e c t r o p h o t o m e t r y ，l i g h ts c a t t e r i n gt e c h n i q u e s ， e l e c t r o c h e m i c a la n a l y s i sa n ds e n s o rt e c h n o l o g y d n as e n s o r s ，a c c o r d i n gt oh o wt h e t r a n s d u c e rw o r k sc a nb ed i v i d e di n t od i f f e r e n tm e t h o d s ，s u c hf i t se l e c t r o c h e m i c a l s e n s o r s ，p h o t o c h e m i c a ls e n s o r s ，p i e z o e l e c t r i cs e n s o r s ，o p t i c a lf i b e rs e n s o r s e l e c t r o c h e m i c a ld n aa n a l y s i sa n de l e c t r o c h e m i c a ls e n s o rr e s e a r c ha r et h eh o t s p o t si n r e c e n ty e a r s c o m p a r e dw i t hc o m m o nm a r k e r ss u c ha st h ef l u o r e s c e n t ，l u m i n e s c e n t m a r k e r s ，i t sa d v a n t a g ei sg o o ds e l e c t i v i t y ，h i g hs e n s i t i v i t y ，t e s t i n gl o w - c o s t ，e a s y m i n i a t u r i z a t i o n ，e t c ，w i t h o u td e s t r o y i n gt h et e s ts y s t e mo rd i s t u r b e db yt h et u r b i d i t y a n dh e m o l y t i ci n t e r f e r e n c ef r o mb i o l o g i c a ls a m p l e s i tc a nb ew i d e l ya p p l i e dt o c l i n i c a lg e n e t i cd i s e a s e s ，e n v i r o n m e n t a ld e t e c t i o n ，a n di d e n t i f i c a t i o ni nt h ef i e l do f l a w d n ae l e c t r o c h e m i c a ls e n s o r sh a v eg r a d u a l l yb e c o m ed i r e c td n a s e q u e n c e d e t e c t i o nm e t h o d si nm o l e c u l a rb i o l o g yr e s e a r c h d e n d r i m e r sd e v e l o p e di n t h em i d d l eo fl a s tc e n t u r ya r eak i n do fs y n t h e t i c p o l y m e r so ft h r e e - d i m e n s i o n a ls t r u c t u r e t h e i rs t r u c t u r a lc h a r a c t e r i s t i c sa r eh i g h l y b r a n c h e d a sc o m p a r e d 谢t ht r a d i t i o n a ll i n e a rp o l y m e r s ，d e n d r i m e r sh a v eg o o d s o l u b i l i t ya n dl o wv i s c o s i t y w i t h t h e i ri n t e r n a lc a v i t ya n de x t e m a lt oc o n t a i nal a r g e n u m b e ro ff u n c t i o n a lg r o u p s ，d e n d r i m e r sc a nd i s p e r s eo rc o m p l e xw i t hv a r i o u sm e t a l p a r t i c l e s a san e wt y p eo fm o l e c u l e si nt h es u r f a c t a n t s ，n a n o - c o m p o s i t em a t e r i a l s h a v es h o w ng o o da p p l i c a t i o np r o s p e c t s w i t ha i li n c r e a s eo ft h e i rg e n e r a t i o n , t h e m o l e c u l a rs t r u c t u r eo fd e n d r i m e r si sg r a d u a l l yc l o s et os p h e r i c a l w i t l lt h et r a d i t i o n a l s u r f a c t a n t si nc o m p a r i s o n , a l t h o u g ht h e i rm o l e c u l a rs t r u c t u r ei sd i f f e r e n t ，t h e f u n c t i o n a lg r o u p so ft h ed e n d r i m e r sa l s oc o n t a i np r o - o i l - b a s e da n dw a t e r - b a s e d ，a n d t h e r e f o r es i m i l a rt ot r a d i t i o n a ls u r f a c t a n t s n a t u r e a tt h es a m et i m e ，t h es t r u c t u r eo f d e n d r i m e r sa r em u c hc l e a r e rt h a nt h et r a d i t i o n a lp o l y m e r s ，b e c a u s eo fn o n - c r y s t a l l i n e ， l o wv i s c o s i t ya n dg o o dw a t e r - s o l u b l e ，a n dt h ee n dt oi m p o r tal a r g en u m b e ro f r e a c t i v eo rf u n c t i o n a lg r o u p s ，s od e n d r i m e r ss h o wb e t t e ra p p l i c a t i o np e r f o r m a n c ei n b i o m e d i c i n e ，m o d i f i c a t i o no fm a t e r i a l s ，i n d u s t r i a lc a t a l y s i sa n dt h eo i li n d u s t r y t h e i v d e n d r i m e rc a l lb eu s e da sat e m p l a t ep o l y m e r i z a t i o ni nn a n o c o m p o s i t e s a f t e r s u r f a c e m o d i f i e d ，p a m a md e n d r i m e rc a na l s ob eu s e dt op r e p a r ec u - p a m a m ， a g - p a m a m ，a u - p a m a ma n dc d s - p a m a md e n d r i m e rm e t a ln a n o c o m p o s i t e s ，e t c b e c a u s eo ft h es p e c i a ls t n l c 眦o fd e n d r i m e r s ，t h a ti s ，w i t ht h ei n t e r n a lc a v i t y ， e x t e r n a lt oc o n t a i nal a r g en u m b e ro ff u n c t i o n a lg r o u p s ，t h e ya r ew i d e l yu s e di nt h e p r e p a r a t i o no fd n a e l e c t r o c h e m i c a ls e n s o r i nt h i sp a p e r ，t h ew o r ki sc o m m i t t e dt od e v e l o p i n gd n ae l e c t r o c h e m i c a l b i o s e n s o rb a s e do nd e n d r i m e r s t h i sp a p e rm a i n l yi n c l u d e st h ef o l l o w i n gt h r e e a s p e c t s ：( 1 ) t h es p e c t r a la n a l y s i so fp a m a m - n h 2 ( g 4 ) ，a g p a m a m n h 2 ( g 4 ) ；( 2 ) c a r b o x y l a t e dm u l t i w a l lc a r b o nn a n o t u b e sa n dp a m a m - n h 2 ( g 2 ) - m o d i f i e dd n a e l e c t r o c h e m i c a ls e n s o r s ；( 3 ) s t u d yo fd n ae l e c t r o c h e m i c a ls e n s o rb a s e do n d t 4 5 c u 2 + m a r k e dd n a p r o b e i nt h i sp a p e r ，t h en o v e l t yl i e si nt h a tw ea p p l i e dt h e c o m p o s i t en a n o p a r t i c l e sa g p a m a m - n h 2 ，c a r b o x y l a t e d m u l t i - w a l lc a r b o n n a n o t u b e s ，p a m a md e n d r i m e ra n dd t 4 5 c u 2 + d e n d r i t i cc o m p l e x e st od n a e l e c t r o c h e m i c a ls e n s o r ，a n dg o tc o m p r e h e n s i v ec h a r a c t e r i z a t i o nb yu l t r a v i o l e t - v i s i b l es p e c t r o s c o p y ，f l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y ，i n f r a r e ds p e c t r o s c o p y ，a t o m i cf o r c e m i c r o s c o p y ，d i f f e r e n t i a lt h e r m a l t h e r m a lg r a v i m e t r i ca n a l y s i s ，x - r a yp h o t o e l e c t r o n s p e c t r o s c o p ya n ds o m ee l e c t r o c h e m i c a la n a l y s i sm e t h o d ss u c ha sc y c l i cv o l t a m m e t r y ， a ci m p e d a n c e ，d i f f e r e n t i a lp u l s ev o l t a m m e t r y ，e t c d a t as h o wt h a tt h i sn e wt y p eo f d n ae l e c t r o c h e m i c a ls e n s o rh a sh i 曲s e n s i t i v i t ya n dl o wd e t e c t i o nl i n e ，g o o ds t a b i l i t y ， g o o dr e p r o d u c i b i l i t ya n dr e p r o d u c i b i l i t y t h em a i n c o n t e n t so ft h i sp a p e ra r ed i v i d e d i n t ot h ef o l l o w i n gs e c t i o n s ： it h e s p e c t r a la n a l y s i so fp a m a m - n h 2 ( g 4 ) ，a g p a m a m - n h 2 ( g 4 ) t h i sa r t i c l ei n c l u d e st w op a r t s ：( 1 ) t h r o u g ht h ea t o m i cf o r c em i c r o s c o p e ( a f m ) i m a g i n g ，w ec o m p a r ep a m a m - n h 2 ( g 4 ) w i t hp a m a m - n h 2 ( g 2 ) d i s c o v e r i n g m o r p h o l o g y d i f f e r e n c e s a s t r o n g f l u o r e s c e n c ee m i s s i o no fn h 2 - t e r m i n a t e d f o u r t h - g e n e r a t i o np o l y ( a m i d o a m i n e ) d e n d r i m e r sh a sb e e ns t u d i e dt h r o u g hc h a n g i n g p h ，a g i n gt i m e ，c o n c e n t r a t i o no ft h es o l u t i o no fp a m a m - n h 2 ( g 4 ) o ra d d i n g b i o l o g i c a lm o l e c u l a r sd s d n a t ot h i ss o l u t i o n ；( 2 ) w et a k ep a m a ma st e m p l a t e st o c r e a t ea g p a m a m - n h 2 ( 0 4 ) d e n d r i m e rn a n o c o m p o s i t e s ( d n c ) w ed i s c u s st i t r a t i o n c u r v eo ft h es o l u t i o no fa g + p a m a m - n h 2 ( g 4 ) t h er e s u l t ss h o w e dt h a td i f f e r e n t m o l er a t i oo fa g + t op a m a ma n dp hs t r o n g l yi n f l u e n c ec o m p l e x a t i o nb e t w e e na g + v a n dp a m a m t h es i l v e r - d n c sw e r ec h a r a c t e r i z e d b ym e a n so fu v v i s i b l e a b s o r p t i o na n df l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y a g p a m a m - n h 2 ( g 4 ) d e n d r i m e rn a n o m o l e c u l a r si nd n as e n s o r sh a v ea l le x t r e m e l yw i d ea p p l i c a t i o np r o s p e c t i i c a r b o x y l a t e dm u l t i - w a l lc a r b o nn a n o t u b e sa n dp a m a m n h 2 ( g 2 ) - m o d i f i e dd n ae l e c t r o c h e m i c a ls e n s o r s i nt h i sp a p e r , w ei n t r o d u c ean e wt y p eo fh i g h s e n s i t i v i t yd n ae l e c t r o c h e m i c a l s e n s o r , t h a ti s ，w ea p p l i e dc a r b o x y l a t e dm u l t i - w a l lc a r b o nn a n o t u b e sa n dp a m a m d e n d r i m e rt od n ae l e c t r o c h e m i c a l s e n s o r l a y e r - b y - l a y e rf i l m sa s s e m b l e db y a l t e r n a t ea d s o r p t i o no fc a r b o x y l a t e dm u l t i - w a l lc a r b o nn a n o t u b e s ( m w n t - c o o 。) a n d n h 2 一t e r m i n a t e ds e c o n d g e n e r a t i o np o l y ( a m i d o a m i n e ) d e n d r i m e r s ( p a m a m - n h 2 ( g 2 ) ) o n t oag l a s s yc a r b o ne l e c t r o d ew e r er e p o r t e d a f t e rc o v a l e n t l ya d s o r b e d 丽t l lp 0 4 p r o b es e q u e n c e p a m a m m ，l q t - c o o g ce l e c t r o d ew a si m m e r s e di nt h es o l u t i o n s o fc o m p l e m e n t a r ys e q u e n c e so fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s ，a n dt h e nw ec a ng e t r c t - c o n c e n t r a t i o nc u r v e b ye i s l a y e r b y l a y e rf i l m sw e r ec h a r a c t e r i z e db yc ve i s ， i 凡x p sa n dt a ga tt h es a m et i m e ，t h ec o n c e n t r a t i o no fm w n t - c o o a n dt h e t i m i n go ft h eh y b r i d i z a t i o nw e r ed i s c u s s e d t h i ss e n s o rh a sd e m o n s t r a t e dh i g h s e n s i t i v i t ya n dw i d el i n e a rr a n g e l i n e a rr a n g ei sb e t w e e n5 0 x1 0 。1 0m t o5 0 x1 0 1 4m ， a n dt h em i n i m u md e t e c t i o nl i m i ti s1 0 3 4 x1 0 1 4m e x p e r i m e n t ss h o wt h a tt h i ss e n s o r h a sg o o ds t a b i l i t y ，g o o dr e p r o d u c i b i l i t y ，a n da tt h es a m et i m e ，i th a sg o o dr e g e n e r a t i o n c a p a c i t y i na d d i t i o n ，w eu s ed a u n o m y c i na si n d i c a t o rt ot e s tt h er e c o g n i t i o no fd n a e l e c u o c h e m i c a lp r o b eo nt h et a r g e td n a a sar e s u l t ，r e s p o n s es i g n a li ss i g n i f i c a n t a n ds a t i s f a c t o r y s t u d y o fd n ae l e c t r o c h e m i c a ls e n s o rb a s e do nd t 4 5 c u 2 m a r k e dd n a p r o b e w i t ht h ec o m p l e x a t i o nb e t w e e nd t 4 5a n dc u 2 + ，i ti st h ef i r s tt i m et h a tw e e m b e dl a r g ea m o u n t so fc u 2 + i n t ot h ei n s i d eo fd t 4 5 ，a n dt h e nt h ec o m p l e xi s m a r k e dt os s d n a t h u s ，w eg e td t 4 5 c u + l a b e l e de l e c t r o c h e m i c a ld n a p r o b e i n t h i sp a p e r ，t h ec o m p l e x a t i o nb e t w e e nd t 4 5a n dc u 十i sc h a r a c t e r e db yu v a b s o r p t i o ns p e c t r o s c o p y a tt h es a m et i m e ，w es t u d yt h ei m p a c to ft h ep h v a l u ea n d m e c h a n i s mo ft h ec o m p l e x a t i o nb e t w e e nd t 4 5a n dc u 2 十，a n dp r o v et h es u c c e s s f u l p r e p a r a t i o no fd t 4 5 c u 2 + l a b e l e dd n a e l e c t r o c h e m i c a lp r o b e w ea l s od i s c u s sa n d o p t i m i z eav a r i e t yo fe x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s ，i n c l u d i n gt h ep r e p a r a t i o no f m o d i f i e d e l e c t r o d ea n dc h o o s i n gt h ev a r i o u sp a r a m e t e r so nt h ep r o c e s so fa n o d i cs t r i p p i n g v o l t a m m e t r y ( a s v ) d e t e c t i o no f c u 2 + a sar e s u l t ，w ec h o o s et ou s ec a r b o nn a n o t u b e s m o d i f i e de l e c t r o d e ，- 0 4 va st h eo p t i m a le n r i c h m e n tp o t e n t i a l ，a n d3 0 0 sa s p r e c o n c e n t r a t i o nt i m e a sar e s u l to fu s i n gt h eh i g l l l y s e n s i t i v ea n o d i cs t r i p p i n g v o l t a m m e t r ya n d c a r b o nn a n o m b em o d i f i e de l e c t r o d e ，t h es e n s i t i v i t yo fs e n s o r so nt h e s p e c i f i cs e q u e n c eo fd n af r a g m e n td e t e c t i o n h a sb e e ng r e a t l yi m p r o v e d t h e d e t e c t i o nl i m i tr e a c h s1 0 xl0 q 2 m t h i ss e n s o rs h o w sg o o ds t a b i l i t ya n d r e p r o d u c i b i l i t y k e yw o r d s ：d n ae l e c t r o c h e m i c a ls e n s o r ；d n ae l e c t r o c h e m i c a lp r o b e ；m u l t i 。w a l l c a r b o nn a n o t u b e s ；d e n d r i m e r s v i l 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究 成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声明并表 示了谢意。 作者签名：产司次日期： 论文使用授权声明 沙卜吗 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者签名：瓣泛导师签名摘日期：7 冲妒2 7 5 上海! i l j 范大学硕士学位论文第一章绪论 第一章绪论 1 1d n a 电化学传感器 d n a 是一类重要的生命物质，是大多数生物体遗传信息的载体，对d n a 的 研究是生命科学研究领域中极为重要的内容。随着人类基因组计划的顺利实施， 基于d n a 探针的基因传感器、基因：墨片的研究正成为基因组研究的一个热点。 d n a 电化学传感器是用电化学手段选择性检测d n a 的生物传感器，由已知的 d n a 片断和电活性指示剂构成。利用电活性分子( 杂交指示剂) 来指示杂交前后信 号变化，选择性地识别靶序列。电化学d n a 传感器与通常的标记( 放射性同位素 标记、荧光标记等) 探针技术相比，不仅选择性好、灵敏度高、响应快、操作简 便及价格低廉，而且有无可比拟的分离纯化基因的功能。故可望用于临床快速检 测基因疾病，探讨各种因素引起的d n a 损伤程度和可能的突变机理以及以d n a 为作用靶的药物研究【l 】。 1 1 1d n a 电化学传感器原理 d n a 电化学传感器是由一个支持d n a 片断( o p d n a 探针) 的电极( 包括金电 极、玻碳电极、热解石墨电极和碳糊电极等) 和电活性杂交指示剂构成。d n a 探 针一般是由2 0 4 0 个碱基组成的核苷酸片段，包括天然的核苷酸片断和人工合成 的寡聚核苷酸片断。将s s d n a 修饰到电极表面，构成d n a 修饰电极，由于电极 上的探针d n a 与溶液中的互补链( o p 靶序列) 杂交的高度序列选择性，使得d n a 修饰电极具有极强的分子识别能力。d n a 探针分子与靶序列杂交，在电极表面 形成d s d n a ，从而导致杂交前后电极表面d n a 结构的改变，这种杂交前后的差 异可用杂交指示剂来识别，从而达到检测的目的。d n a 电化学传感器具有快速、 灵敏和价廉等优点，是目前d n a 传感器中最成熟的一种。 1 1 2d n a 在电极表面的固定化方法及其特点 d n a 修饰电极是d n a 电化学传感器的一个重要部分。将d n a 修饰到电极上 的方法，文献报道主要集中在以下几种方法，即吸附、共价键合、自组装、亲和 素一生物素反应系统固定法和组合法等。 一、吸附法 上海师范大学硕士学位论文第一章绪论 随着研究的发展，现在的吸附法可通过物理吸附、化学吸附和恒电位吸附来 实现。吸附法还可通过静电吸附和l b 膜技术来实现。利用带正电荷的聚吡咯、 阳离子聚合物壳聚糖和聚赖氨酸将单链d n a 固定在电极上，大大提高了d n a 的 固定效率【2 卅。吸附法的优点是方法简单，操作条件温和；不足之处是d n a 与固 体表面结合力弱，在表面上进行任意取向的不规则分布，故使制得的修饰电极容 易发生d n a 解脱，灵敏度低，选择性差。该法得到的s s d n a 修饰电极不利于分 子杂交。 二、自组装( s e l f - - a s s e m b l y ，s a ) 法 自组装法就是基于分子的自组作用，在固体表面自然形成高度有序的单分子 层的方法。在核酸技术中，一般是利用一端带巯基的d n a 片段，在金电极表面 上形成自组装单分子膜来固定核酸【5 - 1 2 1 。自组装膜法得到的s s d n a c m e 表面高度 有序，稳定性好，在适当的固定密度下，对互补d n a 有很好的杂交效率；但它 对巯基修饰的d n a 纯度要求较高，分离提纯操作繁琐，这是由于大的亲水性核 酸基团也较难产生一个紧密堆积表面，并且有一定非特异性吸附结合。 三、共价键合法 共价键合法是通过形成共价键( 如：酰胺键、酯键、醚键等) 使d n a 固定到支 持电极表面。首先活化预处理支持电极表面，引入所需活性基团( 如：- n h 2 ， c o o h ，o h 等) ，或衍生核苷酸，使其带上合适的功能团，随后用双官能团试 剂或偶联活化剂联结支持电极与衍生d n a 1 3 。5 1 。共价键合法制备d n a 修饰电极， 能得到稳定的修饰层，易进行分子杂交，但由于电极表面反应活性位点少，表面 合成又是异相反应，故固定的d n a 量少，响应信号小。 四、亲和素一生物素反应系统固定法 生物素( b i o t i n ) 是生物体内分布