（生物化学与分子生物学专业论文）甲状腺激素受体β新同功体trβ△的初步研究.pdf

学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研 究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的 地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究 成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名；盘! 主塑 日期? 。p f 年月1 日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意 学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。 作者签名：妞导师签名：燃日期：如口 年5 月- 日 天津医科大学硕士论文 躺翘赫 t h y r o i dh o r m o n e ( t 3 ) a c t i v a t e sn u c l e a rr e c e p t o rt r a n s c r i p t i o nf a c t o r s ， e n c o d e db yt h et r a ( n r l a l ) a n dt r b ( n r i a 2 ) g e n e s ，t or e g u l a t et a r g e tg e n e e x p r e s s i o ni nt h ep o s i t i v eo rn e g a t i v em a n l i e r t h y r o i dh o r m o n ep l a y sc r i t i c a l r o l e si nd i f f e r e n t i a t i o n ，g r o w t h ，a n dm e t a b o l i s m s e v e r a lt ri s o f o r m se x i s t ，t r g e n ee n c o d e s f i v ei s o f o r m s ，a n dt rbg e n ee n c o d e sf o u ri s o f o r m s o n l yf o u ro f t h e ma r ec o n f i r m e da sf u n c t i o n a lr e c e p t o r s ，t h e ya r e a1 、b1 、b2a n d0 3 , b i o r o l e so fo t h e r sa r cs t i l lu n c l e a r t h e s en i n ei s o f o r m sh a v ea r i s e nb yd i f f e r e m s p l i c i n go rt r a n s c r i p t i o nf r o ms e p a r a t e dp r o m o t e r s t h i si sp a r tw o r ko f n a t i o n a ln a t u r es c i e n c ef o u n d a t i o n i nt h i se x p e r i m e n t ， r n a sw a se x t r a c t e df r o mr a t sl i v e ra n di ts e r v e da st h et e m p l a t ef o rp r o d u c i n g t h ef i r s ts t r a n do f t h ec d n a s t h e na m p l i f i e dt h et r01 诵t l lt h ec d n a s t r0i g e n ew a si n s e r t e di n t oc l o n i n gv e c t o rp g e m te a s y t h e nh a dt h ec l o n e dt rb1 g e n es e q u e n c e d t h e nc o m p a r e di tw i mt h es e q u e n c ew h i c hh a sb e e np u b l i s h e do n t h en e t t h er e s u l ts h e wt h a tt h en e w l yc l o n e ds e q u e n c eh a sa na d d i t i o n a l s e q u e n c eo f10 8 b p ，b l a s t e dt h ea d d i t i o n a ls e q u e n c eo nn c b i ，t h es e q u e n c em e t w i t ht h ep a r to f t h e6 2 2 4 b p3 - 4i n t r o no f t h et h y r o i dh o r m o n er e c e p t o r t h e c h a n g et a k ep l a c eb e f o r et h ec h a n g i n gp o i n t ，t h es e q u e n c el o c a t e di nw h a t p r e v i o u s l yc o n s i d e r e da sh i g h l yc o n s e r v e ds e q u e n c ei nv e r t e b r a t e s f r o mo u r r e s u l t ，an o v e lt r 口i s o f o r mw a sf o u n di no u re x p e r i m e n tw h i c hi sl o n g e rt h a nt r pi t h es e q u e n c eh a sb e e np u b l i s h e d0 1 2g e n e b a n ko f n c b i t h e r e g i s t e r n u m b e ri s 乜q 1 2 l l 5 ，i ti sn a m e dt rb i ti sc o n s i d e r e dt h a tt h e r ei sa c h a n g i n gp o i n ti nt rbm l l n a t h ei n v a r i a n ts p l i c es i t eb e t w e e nt h ed i v e r g e mn t e r m i n ia n dt h ef i r s to f t h ec o m m o ne x o n si sk n o w na st h ec h a n g i n g p o i n t 国家自然科学基金资助课题( 3 0 2 7 1 1 5 4 ) 3 天津医科大学硕士论文 u p s t r e a mo f t h ec h a n g i n gp o i n tt h es p l i c i n gm a n r e r i sh i 曲l yv a r i a b l e ，b u t d o w n s t r e a mo f t h ec h a n g i n gp o i n tt h es p l i c i n gn l a n n e ri sh i 曲l yc o n s e r v e di n v e r t e b r a t e s n l cd i f f e r e n c eb e t w e e nt rbia n dt r0 i st h a tt h el a t e rh a sa n a d d i t i o n a lf r a g m e n to f1 0 8 b pa p p e a r e db e t w e e ne x o n 3a n de x o n 4 w et h i n kt h i s 10 8 b pd n af r a g m e n ti sm a y b ean e w l yf o u n de x o nb e h i n dt h ec h a n g i n gp o i n t a n di tb r e a kt h ec o n s e r v e ds p l i c i n gm a n n e r t h er e s u l ti sac h a l l e n g et ot h e p r e v i o u st h e o r yo f t h ec h a n g i n gp o i n t ，w h e t h e rt h i sc h a n g i n gp o i me x i s t ss h o u l d b e d o u b t e d t h et rb g e n es e g m e n tw a si n s e r t e di n t of u s i o ne x p r e s s i n gv e c t o r p q e - 3 0 x a f u r t h e r m o r e ，r e c o m b i n a n t v e c t o r p q e - 3 0 x a t r1 3 w a s t r a n s f o r m e di n t oe c o l im 1 5 【p r e p 4 t h et a r g e tp r o t e i n sc o n t a i n i n g6 h i s a f f i n i t yt a g f a c i l i t a t e sb i n d i n gt on i - n t ar e s i ni nm e t a lc h e l a t i n ga m n 时 c h r o m a t o g r a p h y a f t e rt h ep r o t e i n sb i n d i n gn o n s p e c i f i c a l l y t or e s i nw e r e r e m o v e db yw a s h i n gs o l u t i o n sw i t l lg r a d i e n ti n c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o no f i m i d a z o l e t h et a r g e tp r o t e i n sw e r ee l u t e df r o mr e s i nw i t ha p p a r e n th i g h e rc o n c e n t r a t i o no f i m i d a z o l ea n dc o n c e n t r a t e db yc e n t r i f u g eu l t r a f i l t r a f i o n s t o r et h ep r o t e i na t - - 8 0 f o rt l l ef u r t h e rr e s e a r c h k e yw o r d s ：t h y i r o i dh o r m o n er e c e p t o r s i s o f o r m s c h a n g i n gp o i n t f u s i o n e x p r e s s i o n 国家自然科学基金资助课题( 3 0 2 7 1 1 5 4 ) 4 天津医科大学硕士论文 纛誊j 麟 甲状腺激素( t h y r o i d h o m o n e ，t h ) 是机体内分泌激素之一，对于维持机 体正常的分化发育和代谢平衡具有十分重要的作用。甲状腺激素主要有三碘 甲状腺原氨酸( 3 ，5 ，3 。廿i i o d o l - t h y m n i n e ，t 3 ) 和四碘甲状腺原氨酸或甲状腺 素( 3 ，5 ，3 ，5 t t c t r a i o d o l i t h y r o n i n e ，t 4 ) 吲两种，t 3 与细胞核中的甲状腺激素受 体( t r ) 结合，通过甲状腺激素应答元件( t h ”o i dh o r n l o n er e s p o n s e ，t r e ) 作用于转录过程，实现其多种靶基因的正性负性调节。t 3 有着多种作用， 为许多哺乳动物的神经系统，内耳，肌肉，心脏及其骨骼的发育、两栖动物 的变形提供重要的信号。t 3 是出生后生长的一个关键调节剂，对于软骨成骨 的形成至关重要，是成人期基础代谢率的主要调节荆。一般认为t 4 则主要通 过在外周组织脱碘成t 3 发挥作用【3 4 1 ，但这一概念尚需进一步研究以证实其是 否如此绝对。 t r 的m r n a s 同样表达广泛，但是在不同的组织却有着表达亚型的集中 性，t rb2 主要限制在垂体前叶和下丘脑，主要是干预下丘脑一垂体甲状腺轴 的反馈调节，然而很难找出t r 其他亚型的专一功能，其他亚型没有这么局限 的表达模式。t r d 和t r b 都与t 3 有着很高的亲和力并且识别相同的t r e 的 d n a 结合位点。但一些研究表明a 型受体和b 型受体会优先选择激活特定的 靶基因。 尽管t h 在细胞内多个位点发挥作用，它们主要的作用还是对于靶基因的 转录调节。以前的研究显示t h 在基因组水平的调节作用是由核的t r 所介导 的，t r 与染色体紧密结合并且与t h 高亲和力及特异性的相结合【5 6 1 。t h 进 入细胞并进入细胞核( 见图1 1 ) 随后与t r 结合，t r 在此之前已经和靶基 因启动子区域的t r e 相结合。既与配体结合又与t r e 相结合的t r 复合物的形 国家自然科学基金资助课题( 3 0 2 7 1 1 5 4 ) 天津医科大学硕士论文 成是对靶基因以及随后的蛋白合成的正向或者负向调节的关键性的第一步。 由于t r 既有与配体、d n a 相结合的能力又有转录调节的能力，所以t r 可以 被认为是配体调节的转录因子。 狂 1 4 图1 1 核内甲状腺激素作用的通常模式。t r 甲状腺激素受体，r x r ，维 甲酸x 受体 t r 与糖皮质激素、雌激素以及孕激素等激索受体同属于核受体超家族的 成员。1 9 7 2 年o p p e n h e i m e r 等运用标记的t 3 在大鼠肝、肾组织细胞核中首次证 实t r 存在。1 9 8 6 年美、法有两家实验室同时证实编码t r 是病毒癌基因产物 v e r b a ( 来自于鸟类成红细胞增多症病毒) 的细胞同源物c e r b a 7 1 。目前研究 表明，t r 本身存在2 种主要的亚型：t ra 和t r b 。人t rd 和t r b 由2 个不同 的基因编码，分别位于1 7 q 1 1 2 和3 p 2 4 3 。t r n 和t r b 基因由于启动子不同造 成的转录不同以及在转录后加工过程中的剪接不同而产生若干同工体 ( i s o f o r m s ) ，主要的包括t rd1 、t r a2 、t r a3 、t r aq1 、t r a2 、 t r b1 、t r b2 、t r b3 、t r b3 等i ”。其中t rq 基因编码a1 、a2 、q3 、 n1 、n2 五种t 3 受体亚型，他们的作用主要为调节机体的生长发育，维 国家自然科学基金资助课题( 3 0 2 7 1 1 5 4 ) 天津医科大学硕士论文 t r 3 l d n a b i n d i n gs p e c i f i c i | y “- “ n u c l e 矗rl o e 鑫l i 篇砸o n 1 张- 8 6 似b i n d i n g 2 譬- 掌1 h e i e r o d i m e r i z 鼎t i o n2 8 譬皓3 譬毒1 图1 2t r s 功能分区示意图 a b 区组成转录激活域，其内参与转录激活作用的区域称为a f l 区“们。 d b d 的序列非常保守，其内有9 个保守的富含胱氨酸的区域( c y s l c y s 9 ) ， 其中c y s l c y s 4 、c y s 5 一c y s 8 各与一个z n 2 + 形成配位键，组成锌指结构【1 8 】。( 见 图l - 3 ) 每个锌指结构的完整性是至关重要的，因为如果锌指结构中的氨基 酸缺失或者替被替换，那么t r 的d n a 结合活性以及转录活性就会丧失【1 9 之2 】。 与雌激素受体( e r s ) ，维甲酸( 视黄酸) 受体( r a r s ) ，视黄醇x 受体( r x r s ) ， 以及维生素d 受体( v d r s ) 相似的是，在第一个锌指内有一个所谓的”pb o x ，” 由第三个和第四个半胱氨酸之间和稍远的氨基酸组成 2 3 - 2 5 1 决定与t r 相互作 用的d n a 序列的特异性。这个关键的区域对于序列特异性识别核内激素受体 超家族的不同成员的t r e 以及接触核苷酸和t r e 大沟内的磷酸基团非常重要 2 6 , 2 7 】。d 盒位于第二锌指内，决定反应元件两半位( h a l fs i t e ) 的间隔并参 与受体二聚体的形成。在第二锌指的羧基侧有羧基端延伸区( c t e ) ，约由 2 5 个氨基酸残基组成，其内有a 盒和t 盒。c t e 具有重要的功能，它既参与 受体与d n a 的相互作用，也参与受体与其他蛋白质的相互作用 2 8 。3 0 】。 绞链区其内含有核定位序列，它可使t r 在合成后不久就转运到细胞核 内。由于绞链区的存在，受体得以弯曲、旋转以改变构像 3 1 。l b d 是t r 分子 国家自然科学基金资助课题( 3 0 2 7 1 1 5 4 ) 天津医科大学硕士论文 或类视黄醇和甲状腺激素受体的静息介体( s i l e n c i n gm e d i a t o rf o rr e t i n o i ca n d t h y r o i dh o r m o n er e c e p t o r , s m r t ) ，组成抑制复合物，通过恢复组蛋白去乙酰 化酶( h i s t o n ed e a c e t y l a s e ，h d a c ) 活性，修饰染色质结构，抑制靶基因的基 础转录 3 7 4 0 1 。当t 3 存在时，受体与激素的结合使抑制复合物被释放，而t r 与辅助激活剂，诸如类固醇受体辅助激活剂一1 ( s t e r o i dr e c e p t o r c o a e t i v a t o r - 1 ， s r c 一1 ) 、p 3 0 0 c b p ( c y c l i ca m pr e s p o n s ee l e m e n tb i n d i n gp r o t e i nb i n d i n g p r o t e i n ) 和p c a f ( p 3 0 0 c b p a s s o c i a t e df a c t o r ) 重新组成激活复合物，恢复 局部组蛋白乙酰转移酶( h i s t o n ea c e t y l t r a n s f e r a s e ，h a t ) 活性，染色质构象改 变，激活靶基因转录【4 1 删。 在临床上，t r0 基因座位与t h 抵抗( r e s i s t a n c et ot h y r o i dh o r m o n e ，r t h ) 有着紧密联系。r t h 是一个综合征，表现为各种组织对t h 敏感性降低，循 环中t 3 和t 4 水平升高，但促甲状腺激素( t s h ) 水平却并不降低，甚至出 现升高。r t h 于1 9 6 7 年由r e f e t o f f 首先报道，至今全世界已报道了1 4 0 个家 系约3 5 0 例患者。本病发病率约为1 ( 1 00 0 0 3 00 0 0 ) 人。根据垂体及周围 组织对甲状腺激素反应性，临床上将r t h 分为全身型( g r t h ) 、垂体型 ( p r t h ) 和周围型( p n 汀h ) 3 种，以g r t h 为多见，占已报道病例的8 0 以上【4 5 1 。该病临床表现多样化，轻者可仅有t s h 分泌异常，甲状腺肿大，重 者可出现身体发育不良，智力低下，以至于神经精神损害症状。在部分组织 对甲状腺素反应低下的同时，也可有部分组织表现为机能亢进，如心功能亢 进，表现心跳、脉搏加快等。到目前为止，在r t h 病人超过1 0 0 个家系中发 现6 0 多种不同的t r b 基因突变。其中主要是单个碱基置换突变，也有缺失、 移码和无义突变，这些突变多发生在由外显予9 和1 0 编码的2 个区域： 3 1 0 3 5 3 和4 2 9 4 6 1 ，被称为“热点( h o ts p o t s ) ”，后来发现在l b d 的最氨基 端靠近铰链区还有第三个热点：2 3 4 2 8 2 【4 6 ，枷。另外，目前一些新型的t h 类 国家自然科学基金资助课题( 3 0 2 7 1 1 5 4 ) 天津医科大学硕士论文 似物( g c 一1 和c g s2 3 4 2 5 ) 已经被设计出来，可以1 0 5 0 倍的高亲和力与 t r b1 结合，选择性激动t r l 31 ，用于治疗高胆固醇血症，而几乎没有心脏 ( 主要含有t rd ) 副作用h 8 ，4 9 】。 研究表明增加细胞内磷酸化状态可以增强t 3 介导的靶基因的转录激活 5 0 - 5 2 1 。有研究表明磷酸化的t 旺1 与多种t r e s 结合能力的研究中发现磷酸化 选择性地增强甲状腺激素受体的同二聚化，而不是t r r x r 的异二聚化 s 3 】也 有研究表明磷酸化能同时增强甲状腺激素受体复合物的d n a 结合能力。有趣 的是，蛋白激酶a 的磷酸化降低v - e r b a 及鸡t r m - 1 单体结合甲状腺激素应答 元件的能力。这些研究表明磷酸化可能是另外一种机制，除了与t 3 结合外， 还能调节甲状腺激素受体复合体结合与甲状腺激素应答元件的结合。另外t 3 本身能够调节甲状腺激素受体的磷酸化状态 5 4 1 。 近年来由于对t r b1 的研究，人们已经对其有了一定的了解。然而，t r bl 的作用机制以及和临床疾病的关系人们还不是很清楚。进一步了解t r b l b d 的晶体结构，对于设计新型降脂药物也有重要意义。 在进行国家自然科学基金项目( 3 0 2 7 1 1 5 4 ) 的研究中，需要对大鼠t r b l 受体进行克隆，在此过程中，意外的发现了加长型的新的t r 同功体，此意 外发现的加长型的新的t r 同功体m r n a 在n c b i 的g e n eb a n k 注册时，获 准登记号为乜q 1 2 11 鳋，命名此新同功体为t rb x 。此发现具有非常重要的 科学意义：其一，目前发现的所有的九种t r 亚型中，没有任何一种是加长 型的，只有截短型的( an1 、a 2 和ab3 ) ，我们发现的这个新亚型b 是迄今发现的唯一一种加长型的t r 亚型。其二，目前公认的t r b 基因中 有一个变化点，其5 端的部分在转录中的剪切方式是高度可变的，因此产生 了1 31 、1 32 、1 33 、b3 四种t 3 受体亚型，而其3 端的部分在转录中在脊 椎动物体内又是高度保守的，而本实验中发现的新的改变恰好发生在变化点 国家自然科学基金资助课题( 3 0 2 7 1 1 5 4 ) 天津医科大学硕士论文 之后的外显子3 和4 之间，因此对原有变化点是否存在提出了新的质疑。 我们将在此发现的基础上继续进行深入的研究，首先，验证这种剪切方 式是否存在于其他物种或组织中；其次克隆这两种亚型并得到受体蛋白，考 察其与t 3 的亲和力，及其与t 3 结合后对转录的影响。 国家自然科学基金资助课题( 3 0 2 7 1 1 5 4 ) 天津医科大学硕十论立 蘩攀寨 一菌种、细胞和载体 大肠杆菌e j m l 0 9 菌株为本室保存，大肠杆菌e “m 1 5 p r e p 4 菌株购自q l a g e n 公司ip g e m - te a s y 载体购自p m m e g a 公司，p q e 3 0 x a 购自q i a g e n 公司。 图2 1 p g e m - te y 克隆载体 图2 2p q e 0 0 x a 表达载体 国家自然科学摹余贽助课题( 3 0 2 7 l l5 4 ) *_ 舢神玎玎料瓣盯啪m阱川 天津医科大学硕士论文 n i - n t a 亲和层析蛋白纯化试齐盒购自i n v i 仃0 9 e n 公司。d a b 显色试剂盒购 自北京中杉金桥生物技术有限公司。 七试验仪器 g e n e a m pp c rs y s t e m9 6 0 0 扩增仪和d n a 1 1 1 e r n l a lc y c l e r4 8 0 扩增仪为 美国p e r 虹ne l h l e rc c t i l s 公司产品；d h 2 0 0 0 凝胶图象采集分析系统， s o r ：v a l le v o l u t i o 咀r c 高速冷冻离心机为美国k e n d r o 公司产品；s o l l i c a t o r t m 超声细胞粉碎仪为美国h e a ts y s t e m s u l 曲s o n i c s ，i n c 公司产品；垂直板电 泳仪为h o e f e r 公司产品；高压电源、亚室温恒温水浴、紫外透射仪及蛋白电 泳仪为瑞典l k b 公司产品。u v l 2 5 0 i p c 型紫外分光光度计为日本岛津产品。 3 7 x a z 型倒置生物显微镜为上海光学仪器厂产品。m 2 3 0 0 型二氧化碳培养箱 为美国s h e l d o n 公司制造。m u l t i s k a n m s 酶标仪购自芬兰l a b s y s t e m s 公 司。聚苯乙烯活动9 6 孔板、6 孔细胞培养板、2 4 孔细胞培养板为o r a n g e 公 司产品。a 商c o nu l 仃a 一4 ( 1 0 k d ) 离心超滤管为m i i i i p o r e 公司产品。 国家自然科学基金资助课题( 3 0 2 7 1 1 5 4 ) 天津医科大学硕士论文 4 。c ，1 60 0 0 g 离心1 5 m i n ，弃上清，加入l m l7 0 乙醇，1 20 0 0 g 离心5 m i n 。 弃上清，3 7 放置3 0 m i n 干燥沉淀，溶解沉淀于2 0 一3 0u 1t e 中，加 入0 5u lr n a s e ( 1 0ug m 1 ) ，3 7 保温1 5 m i n 以消化r n a 。一2 0 保存备 用。 ( 2 ) 酶切鉴定 在0 5 m l 离心管中加入1 0 b u f f e r1u l ，上述提取的质粒8 虬限制性 内切酶屁。ri ( 8 - 2 0 u m ) 0 5 u l ，混匀，3 7 。c 放置2 小时。以1 5 琼脂糖 电泳鉴定酶切片段。重组质粒命名为p g e m - t t r6 。 ( 3 ) 对酶切鉴定有阳性结果的重组子进行d n a 序列分析 d n a 序列分析由上海博亚生物技术公司完成。 5 重复以上实验 以前面同一大鼠的肝脏所提取的r n a 为模板，以前面所使用的引物，通 过r t - - p c r 再次扩增t r b1 ，d n a 序列分析由上海博亚生物技术公司完成。 国家自然科学基金资助课题( 3 0 2 7 1 1 5 4 ) 天津医科大学硕士论文 四重叠延伸法修改错配碱基 1 修改策略( 见图3 1 ) 图3 1 重叠延伸法修改错配碱基 在引物s 3 序列中用正确的碱基( ) 取代错配碱基( 鱼) 。 国家自然科学基金资助课题( 3 0 2 7 1 15 4 ) 天津医科大学硕士论文 ( 3 ) p c r 反应条件： 9 5 c 预变性5 m i n ；9 4 。c 变性4 0 s e c ，5 3 c 退火4 0 s e c ，7 2 。c 延伸l m i n ，3 5 个 循环；最后7 2 延伸5 m i n 。 ( 4 ) 琼脂糖凝胶电泳鉴定p c r 扩增产物 取5ulp c r 扩增产物进行1 5 琼脂糖凝胶电泳， 以核酸分子量标志 物d l 20 0 0 为参照，估算扩增产物分子量大小。 ( 5 ) p c r 扩增产物s 1 s 2 的纯化 使用d n a 快速纯化回收试剂盒，方法同前。 2 - 2 用引物s 3 、s 4 扩增目的片段$ 3 s 4 ： ( 1 ) 碱法小量提取o g e m t t r0 质粒：方法同前。 ( 2 ) p c r 扩增体系组成( 见表3 4 ) 表3 4p c r 反应体系单位：i i i 1 0 p c r 缓冲液2 5 d m p ( 各2 5 m m o l l )2 m g c l 2 1 5 上游引物s 3 ( 5 u m o l l )1 0 下游引物s 4 ( 5 u m o l l )1 0 p f u d n a 聚合酶( 1u u l ) 1 0 d d h 2 01 5 0 合计2 5 0 ( 3 ) p c r 反应条件： 9 5 c 预变性5 m i n ：9 4 c 变性4 0 s e c ，5 3 退火4 0 s e c ，7 2 c t 垂伸l m i n ，3 5 个 国家自然科学基金资助课题( 3 0 2 7 1 1 5 4 ) 2 4 天津医科大学硕士论文 循环；最后7 2 延伸5 m i l q 。 ( 4 ) 琼脂糖凝胶电泳鉴定p c r 扩增产物 取5p1p c r 扩增产物进行1 5 琼脂糖凝胶电泳， 以核酸分子量标志 物d l 20 0 0 为参照，估算扩增产物分予量大小。 ( 5 ) p c r 扩增产物$ 3 s 4 的纯化 使用d n a 快速纯化回收试剂盒，方法同前。 2 2 用引物s 3 、s 4 扩增目的片段$ 3 s 4 ： ( 1 ) 碱法小量提取p g e m - t t rb 质粒：方法同前。 ( 2 ) p c r 扩增体系组成( 见表3 5 ) 表3 5p c r 反应体系单位：l l i 反应体系组成加样体积 纯化回收的p c r 产物s 1 s 2 、 2 0 $ 3 s 4 各l u l 1 0 p c r 缓冲液 2 5 d n t p ( 各2 5 m m o l 几)2 m g c l 2 l - 5 上游引物s l ( 5u t o o l l ) l0 下游引物s 4 ( 5p m o l 几) 1 0 s u p e r l t a q d n a 聚合酶( 1 u 0 5 ul ) d d h 2 0 1 3 5 合计2 5 。0 ( 3 ) p c r 反应条件： 9 5 。c 预变性5 m i n ；9 4 c 变性4 0 s e c ，5 6 。c 退火4 0 s e c ，7 2 。c 延伸l m i n 3 0 s e c ，3 5 个循环：最后7 2 延伸1 0 m i n 。 ( 4 ) 琼脂糖凝胶电泳鉴定p c r 扩增产物 取5 t t1p c r 扩增产物进行1 0 琼脂糖凝胶电泳， 以核酸分子量标志 物d l 20 0 0 为参照，估算扩增产物分子量大小。 国家自然科学基金资助课题( 3 0 2 7 1 1 5 4 ) 天津医科大学硕士论文 ( 5 ) p c r 扩增产物s i s 4 的纯化 使用d n a 快速纯化回收试剂盒，方法同前。 4 p g e m - t t rba ( 修改正确) 重组质粒构建 ( i ) 目的基因与质粒载体的连接 p c r 扩增产物的回收处理 所用d n a 快速纯化回收试剂盒购自北京鼎国生物科技公司。按试剂盒使用 说明进行操作。 连接 以紫外灯下的荧光强度和d n a 片段大小粗略估算p c r 回收产物及 p g e m te a s y 载体的摩尔浓度，按摩尔比1 0 ：1 进行1 0u 1 体系连接反应( 见 表3 6 ) 。 表3 6连接体系单位u 1 反应体系组成加样体积 p c r 回收产物 p g e m t 载体 2 l i g a s eb u f f e r t 4d n al i g a s e d d h 2 0 合计 1 6 水浴连接2 h 。 ( 2 ) 宿主菌的转化 i 0 0u1j m l 0 9 感受态宿主菌融化后迅速加入连接产物，轻微混匀后冰浴 1 5 m i n ，4 24 c 热休克9 0 s e c ，冰浴5 m i n ，取5 01 1l 菌液铺于含5 0ug m l 氨苄 青霉素、4 “li p t g ( 2 0 0 m m o l l ) 、4 0u1x g a f f 5 溴一4 - 氯3 吲哚- b d - 半乳糖 菅2 0 m g m l 溶于二甲基甲酰胺中) 的l b 琼脂板上，3 74 c 倒置培养过夜。 5 重组质粒的鉴定 ( 1 ) 碱法小量提取p g e m - t t r b ( 修改正确) 质粒。5 5 6 国家自然科学基金资助课题( 3 0 暂1 1 5 4 ) 2 6 5 5 0 0 m王m 钏枷侄m 天津医科大学硕士论文 方法同前 ( 2 ) 酶切鉴定 在0 5 m l 离心管中加入1 0 b u f f e rlu l ，上述提取的质粒8 乩限制性 内切酶屁积i ( 8 2 0 u u 1 ) 0 5 u l ，混匀，3 7 。c 放置2 小时。以1 5 琼脂糖 电泳鉴定酶切片段。重组质粒命名为p g e m t t rb ( 3 ) 对酶切鉴定有阳性结果的重组子进行d n a 序列分析 d n a 序列分析由上海博亚生物技术公司完成。 四t r b1 和t r p 蛋白质结构预测与比较 利用w w w e x p a s y c h p r o s i t e 上面提供的软件查询t r1 31 和t rb 蛋 白质的所含结构域以及一些功能亚区，比较多出3 6 个氨基酸的t rb 蛋白 在功能上可能发生的改变。 五p q e - 3 0 x a t r l 3a 重组质粒的构建 2 克隆策略 按图3 2 所示，进行表达重组子的构建。 2 目的e d n a 片段的扩增 ( 1 ) 碱法小量提取p g e m t t rb 质粒：方法同前。 ( 2 ) p c r 扩增体系组成( 见表3 7 ) 以重组p g e m te a s y t rb 质粒为模板，p c r 扩增t rb 片段 国家自然科学基金资助课题( 3 0 2 7 1 1 5 4 ) 天津医科大学硕士论文 多克隆位点 p q e - 3 0 x a t r b 国家自然科学基金资助课题( 3 0 2 7 1 1 5 4 ) 天津医科大学硕士论文 正c o jm 1 5 p r e p 4 感受态宿主菌。待点c o jm 1 5 p r e p 4 融化后迅速分别 加入重组质粒，轻微混匀后冰浴1 5 m i n ，4 2 热休克9 0 s e c ，冰浴5 i n ，转 化产物接种于l m l 无抗生素l b 液体培养基，3 7 振摇1 h r ，取5 0ul 菌液铺 于含1 0 0 ug m l 氨苄青霉素、2 5 ug m l 卡那霉素的l b 琼脂板上，共两块， 3 7 倒置培养过夜。将l b 琼脂板的单菌落接种于含1 0 0ug m l 氨苄青霉素、 2 5ug m 1 卡那霉素的l b 液体培养基中，保存菌种。 2 i p t g 诱导表达t r ( 1 ) 分别挑取含重组p q e 一3 0 x a t r 且质粒的点c 以jm 1 5 p r e p 4 单一 菌落接种于含1 0 0 i lg m l 氨苄青霉素、2 5 ug m 1 的l b 液体培养基中，3 7 震荡培养过夜。同时以p q e 一3 0 x a 质粒转化菌及空宿主菌为对照。 ( 2 ) 次日按1 ：1 0 0 比例分别接种于3 m l 新鲜l b 液体培养液中，3 7 振 摇约6 小时至0 d 。为o 6 0 8 ，向各培养管中加入i p t g ( 终浓度为1 帅o l l ) ， 3 7 诱导6 小时。 3 表达产物的处理 ( 1 ) 将各管菌液分两次转入1 5 m le p p e n d o r f 管中，7 0 0 0 g 离心5 m i n 。 ( 2 ) 菌体沉淀以1 m l 冷p b s 溶液( 1 4 0 砌0 1 几n a c l ，2 7 m m o l 几 k c l ，l o 硼o l ln 叫p 仉，1 8 咖o l lk h ：p 0 4 ，p h 7 4 ) 洗涤一次。 ( 3 ) 7 0 0 0 g ，离心5 m i n ，弃上清，以6 0 0ul 冷p b s 溶液( p h 7 4 ) 悬浮 沉淀，反复冻融三次。 ( 4 ) 冰浴下超声破碎菌体，输出能量为4 0 w ，每次3 s e c ，间隔3 s e c ，2 0 次左右，使菌液达到明显澄清状态。 ( 5 ) 4 ，1 5o o o g 离心1 5 i n ，分别收集碎菌上清和沉淀，沉淀用l o o ulp b s 混悬， t r b1 碎菌上清和沉淀行s d s p a g e 4 s d s p a g e 鉴定重组子p q e - 3 0 x a t rb 诱导表达产物5 6 】 国家自然科学基金资助课题( 3 0 2 7 1 1 5 4 ) 天津医科大学硕士论文 ( 1 ) 制备浓缩胶和分离胶( 见表3 9 ) 表3 9 配制t = 1 5 、c = 3 3 的分离胶和t = 5 、c = 3 3 的浓缩胶 3 0 丙烯酰胺溶液( a c r ：b is = 2 9 ：1 ) ( 2 ) 制胶 按照仪器使用说明安装好垂直板s d s 聚丙烯酰胺凝胶制胶装置，迅速在 两层玻璃板间灌入分离胶，并在胶面上用少量水饱和的正丁醇覆盖；待分离 胶聚合完全后，用滤纸吸去凝胶表面的水饱和的正丁醇，再灌入浓缩胶，插入 干净的梳齿，待浓缩胶聚合完全后，安装好电泳槽，将1 s d s p a g e 缓冲液 ( 2 5 m m o l 几t r i s c 1p h 8 o ，2 5 0 哪o l 几甘氨酸，0 1 s d s ) 倒入电泳槽，拔出 梳齿，用电泳缓冲液、井洗加样孔。 ( 3 ) 上样 以1 0 pl 中分子量蛋白标志物作为参照，分别取细菌裂解物上清和沉淀 样品1 0u1 与等体积上样缓冲液混合( 4 s d s ，2 0 甘油，1 0 b 巯基乙醇，1 2 5 哪o l lt r i s h c lp h 6 8 ，o 1 溴酚蓝) ，沸水浴3 m i n ，短暂离心后以微量进 样器依次上样。 ( 4 ) 电泳 电泳条件为：恒压方式，8 v c m 。待样品进入分离胶后，升高电压至 1 5 v c m 。当示踪剂到达分离胶底部时结束电泳。 ( 5 ) 固定、染色及脱色 国家自然科学基金资助课题( 3 0 2 7 1 1 5 4 ) 丕竖墨型盔堂堡主丝苎； 5 抗原抗体反应 以p b s 清洗p v d f 膜3 次后将其置入一杂交袋中，加入1 ：2 0 0 倍稀释的 兔多克隆抗体t r a4 m l ，将杂交袋热封，3 7 。c 放置2 小时。剪开杂交袋，以 p b s 清洗p v d f 膜3 次，加入1 ：2 0 0 0 倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 i g g 抗体4 m l ，3 t c 放置2 小时。 6 加底物显色 取出p v d f 膜，以p b s 清洗3 次后将其浸入d a b 显色工作液( 按试剂盒操作说明， 将贮存液稀释成工作液) 中，轻轻摇动，待显色良好时立刻用水洗膜中l e 反应，将p v d f 膜置于p b s 中保存。 八融合蛋白的纯化陆6 3 使用i n v i t r o g e n 公司p r o b a n d “p u r i f i c a t i o ns y s t e m 试剂盒进行，金 属螯合亲和层析所有步骤均在层析柜中4 下进行操作，采用非变性条件下 的纯化操作，按试剂盒使用说明操作如下： 1 重组p q e - 3 0 x a t r 8 质粒转化菌的大量培养及诱导表达 分别挑取重组质粒p c e 一3 0 x a t rb 转化的c o l im 1 5 p r e p 4 单一菌 落至3 m l 含1 0 0 ug m l 氨苄青霉素、2 5 ug m 1 卡那霉素的l b 液体培养基中， 3 7 。c 震荡培养1 6 小时后转移至2 0 0m 1 3 7 。c 预温的含i 0 0ug m l 氨苄青霉素、 2 5ug m l 卡那霉素的l b 液体培养基中，3 7 。c 继续震荡培养至0 d “，达到 0 6 - 0 8 。重组质粒p q e - 3 0 x a p t h r p l 1 4 1 转化的叵c o l im 1 5 p r e p 4 中加入 i p t 6 至终浓度为0 5 m m o l l ，3 7 震荡培养6 小时。重组质粒p q e 一3 0 x a t r b 转化的c o l im 1 5 p r e p 4 中加入i p t g 至终浓度为l m m o l l ，3 7 。