（应用化学专业论文）表面等离子体激元共振用于药物蛋白相互作用和DNA放大检测.pdf

硕士毕业论文 摘要 摘要 本文回顾了表面等离子激元共振( s p r ) 传感器的发展历史并简 单介绍了s p r 在大量生物体系中的应用。由于s p r 传感器不需要标 记就可以直接测量生物分子间的相互作用，使其成为研究生物分子 作用表征和定量的重要手段。与其他技术如酶、放射标记等相比较， s p r 技术以其快速、高灵敏度的特性被广泛的应用到生物分子机制 的研究中去，包括蛋白相互作用，抗原航体作用，配体受体相互作 用等。本论文使用s p r 与流动注射( f i ) 联用装置，研究了药物与 蛋白的相互作用和新的d n a 序列放大检测两个不同体系。 通过层层自组装方法，将1 1 - 巯基十一酸( m u a ) 固定在金膜 表面上，再利用n h s e d c 对羧基的活化将牛血清白蛋白( b s a ) 固定到m u a 上，形成单分子层的b s a 膜，未反应的m u a 分子的 活性基团再用氨基乙醇( a e ) 进行封闭，使形成的s p r 芯片表面 只裸露b s a 的活性基团。流动注射药物双氯酚酸钠( d f s ) ，当d f s 分子与b s a 相互作用时，产生s p r 信号变化。研究表明不同浓度 d f s 浓度为5 0 3 0 0v m o l l 时，s p r 的信号变化与浓度呈现良好的 线性关系。说明在一定条件下，b s a 与d f s 有相互作用，对了解药 物的特性有一定的理论意义。另外实验设计的b s a 芯片，可以用来 研究其它药物与b s a 的相互作用，这一模板在研究药物蛋白作用 中具有通用性。 实验通过形成“三明治”结构多层单分子膜，在检测探针寡核苷 酸末端标记有生物素( b i o t i n ) ，再通过抗生素一过氧化物酶共聚体 ( s a 冲) 将酶修饰到d n a 芯片表面，当4 一氯萘酚( c n ) 和双 氧水混合液与过氧化物酶相遇时，形成相应的沉淀，覆盖在自组装 分子层上。实验采用f i s p r 方法测定，由于沉淀的生成使s p r 信 号急剧变化，放大，得到很低的检测限。该实验可重复且选择性高， 得到的检测限为1 0f m o l l 。 关键词表面等离子激元共振，牛血清白蛋白，双氯酚酸钠，酶一沉淀， 放大 硕士毕业论文 a b s t r a c t a b s t r a c t i nt l l i sp a d e rw er e v i e w e dt h ed e v e l o p m e n to fs p rb i o s e n s o nw e a l s or e v i e w e dt h em a i na p p l i c a t i o n so fs p rb i o s e n s o r su s i n ge x a m p l e s f r o mav a r i e t yo fb i o l o g i c a ls y s t e m s s p rb i o s e n s o r sc a l lm e a s u r et h e i n t e r a c t i o n so fb i o m o l e c u l e sd i r e c t l yw i t h o u tt h en e e df o rl a b e l i n g t l i s f e a t u r eh a sa l l o w e dt h e s ea n a l y t i c a li n s t r u m e n t st ob e c o m eac e n t r a lt o o l f o rc h a r a c t e r i z i n ga n dq u a n t i f y i n gb i o m o l e c u l a ri n t e r a c t i o n s d u et ot h e f a s tr e s p o n s ea n dh i 曲s e n s i t i v i t yo fs p r - b a s e db i o s e n s o r sc o m p a r e dt o o t h e rt e c h n o l o g i e ss u c ha se n z y m eo rr a d i o l a b e l i n gm e t h o d s ，b i o s e n s o r s c a nb eu s e dt os t u d yal a r g ev a r i e t yo fb i o m o l e c u l a rm e c h a n i s m s ， r a n g i n g f r o mp r o t e i n p r o t e i n , a n t i b o d y a n t i g e n ，a n dr e c e p t o r l i g a n d i n t e r a c t i o n st ot h ec h a r a c t e r i z a t i o no fe v e nl o wm o l e c u l a rw e i g h t c o m p o u n d s t h eb i10 0 0s p ri n s t r u m e n tc o m b i n e dw i t haf l o wi n j e c t i o n ( f i ) d e v i c ew a su s e df o rt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nd r u ga n dp r o t e i n ，a n d a l s of o r t h en e ws y s t e mo fa n a l y z i n gd n a s e q u e n c ea m p l i f i e d l y t h r o u g ha “l a y e v b y - l a y e r w a y , t h e 11 一m e r c a p t o u n d e c a n o i ca c i d ( m u a ) w a si m m o b i l i z e do nt h eg o l d - c o v e r e dg l a s st of o r mam u a m o n o l a y e r , b yc a r b o d i i m i d em e t h o d s ( n h s e d c ) t h em u aw a s a c t i v a t e da n db s aw a sc o u p l e dt ot h ec a r b o x y l i cg r o u p so nt 1 1 es u r f a c e t h eu n r e a c t e ds i t e so nt h es u r f a c ew e r eb l o c k e db ya m i n o e t h a n o l h c l ( a e ) t h e nd r u gd i c l o f e n a cs o d i u m ( d f s ) w a si n j e c t e dt of l o wo v e rt h e b s as e n s o r 珊l e nt h ei n t e r a c t i o nh a p p e n e d t h es i g n a lo fs p rc h a n g e d t h ew o r kd i s c u s s e das e r i e so fs p rs e n s o r g r a m sc o r r e s p o n d i n gt ot h e d f so fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s t h es i g n a lp r e s e n t e dg o o dl i n e a r r e l a t i o nt ot h ec o n c e n t r a t i o n sb e t w e e n5 0t o3 0 0r u n o l l ，w h i c h d e m o n s t r a t e dt h a tt h es p e c i f i ci n t e r a c t i o nh a so c c u r e d i tp r o v i d e s c e r t a i n s i g n i f i c a t i o na b s t r a c t l y t o s t u d y t h ec h a r a c t e r i s t i co f d r u g s b e c a u s eo ft h ep r o t e i ns e n s o r ，w e c a nu t i l i z et 1 1 em o d e lt o i n v e s t i g a t et h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e nt h ep r o t e i na n do t h e rd r u g s h y b r i d i z a t i o no ft h ed e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ( d n a ) t a r g e tf o l l o w e d b y t h ea s s o c i a t i o no ft h eb i o t i n - t a g g e dd e t e c t i o np r o b e sy i e l d sa “s a n d w i c h f at h r e e c o m p o n e n td o u b l e s t r a n d e d ) a s s e m b l y t h ee n z y m e c a nb em o d i f i e do nt h ed n ad u p l e x e s c o v e r e ds u r f a c ev i ai n t e r a c t i o no f t h eb i o t i nt a g sw i t ht h es t r e p t a v i d i n - h r pc o n j u g a t e s ( s a - h r p ) t h e i i 硕士毕业论文 a b s t r a c t 皿姆一b i o c a t a l y z e d o x i d a t i o no f4 - c h l o r o - 1 一n a p h t h o l ( q di nt h e p r e s e n c e o f h 2 0 2 a n dt h e s u b s e q u e n tp r e c i p i t a t i o n o f b e n z o c h l o r o h e x a d i e n o n ec o v e r e do nt h em u l t i l a y e r s b e c a u s eo ft h e i n s o l u b l ep r o d u c t ，t h es p rs i g n a lw a sa m p l i f i e dd r a m a t i c a l l yt oa r r i v ea t a n a d e q u a t e l y 1 0 wd e t e c t i o n 1 i m i t t h em e t h o di ss h o w nt ob e r e p r o d u c i b l e a n dt op o s s e s sh i 曲s e q u e n c es p e c i f i c i t y o d nt a r g e t c o n c e n t r a t i o na sl o wa s10f m o l lc a nb em e a s u r e du s i n gt h ep r e s e n t m e t h o d 。 k e yw o r d ss u f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e ( s p r ) ，b o v i n es e r u m a l b u m i n ( b s a ) ，d i c l o f e n a cs o d i u m ( d f s ) ，e n z y m e - p r e c i p i t a t i o n ， a m p l i f i c a t i o n i i i 硕士毕业论文符号说明 s p r f i d n a 缸i a n h s e d c a e b b s d f s b s a b i o c n p b s s a h i t p 肿 符号说明 s u f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e 表面等离子体激元共振 f l o wi n j e c t i o n 流动注射 d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d 脱氧核糖核酸 1l - m e r c a p t o u n d e c a n o i ca c i d1 l 一巯基十一酸 n h y d r o x y s u c c i n i m i d en - 羟基硫代琥珀酰亚胺 3 - e t h y l 一( 3 - d i m e t h y l a m i n o p r o p y l ) 一1 一c a r b o d i i m i d e h y - d r o c h l o r i d e 卜( 3 - - - 甲氨丙基) 一3 - 乙基碳二亚胺盐酸盐 a m i n o e t h a n 0 1 h c i 氨基乙醇盐酸盐 b o r a c i cb u f f e rs o l u t i o n 硼酸缓冲液 d i c l o f e n a cs o d i u m 双氯酚酸钠 b o v m es e r u ma l b u m i n 牛血清白蛋白 b i o t i n 生物素 4 - c h l o r o 1 - n a p h t h o l4 一氯萘酚 p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n 硼酸缓冲液 s t r e p t a v i d i n - h o r s e r a d i s hp e x i o d a s ep o l y m e r 抗生素一过氧化物酶共聚体 h o r s e r a d i s hp e x i o d a s ep o l y m e r 过氧化物酶 硕士毕业论文 第一章前言 第一章前言 1 1 表面等离子体激元共振( s p a ) 的发展历史和研究现状 表面等离子体共振( s p r ) 其实是一种常见的电磁现象。纳米金对5 0 0 - 7 0 0 n m 光的吸收就源于s p r ，其特点是吸收波长随金粒直径和颗粒聚集数增大而增加， 因此成为纳米材料的一种表征方法。表面拉曼现象也是一种s p r 现象，其研究 已经有些年头了。 关于s p r 的研究，可以上溯到1 9 0 2 年，当时w o o d 1 】在做光栅反射研究时， 首次发现了表面等离子体子共振现象，当他用一个连续的偏振光源垂直照射一 块金属薄片时，在背景中观察到一些明暗相间的谱带，不能用光栅的干涉理论 进行解释，随之成谜。这是关于s p r 这一电磁场效应的最早记载。1 9 4 1 年，f a n o 嘲把这种现象解释为在金属空气界面上表面电磁波的激发。随后，有人提出了 体积等离子体子( v o l u m ep l a s m o n s ) 的概念，认为这是在金属中体积电子密度的 一种纵向波动。1 9 5 7 年，r i t c h i e 3 1 从理论上阐述了在电磁波传输过程中，金属 薄片的边界上应存在能量损失峰，他认为富电子导体表面的电子可发生相干涨 落，或形成表面等离子体振荡。随后很快，t l 曲a d a 一4 l 于1 9 5 9 年便从理论上对 s p 进行了准确的描述。随后，p o w e l l 和s w a n 通过实验证实了s p 的客观存在p 】。 1 9 6 0 年s t e m 和f a r r e l l 6 】考虑到这种共振现象发生的条件而将其命名为“表面等 离子体激元”( s u r f a c ep l a s m o n ) 。 从理论上讲，表面等离子体激元来源于m a x w e l l s 理论的等离子体公式，在 其中金属的自由电子视为高密度的电子“液体”，而表面等离子体激元就是这 种“液体”在表面的密度流动，沿着金属电介质的界面传播。1 9 6 8 年o t t o 7 1 和 1 9 7 1 年k r e t s c h m a n n $ 1 分别提出了有里程碑意义的实验研究系统，即棱镜耦合衰 减全反射( a r r ) 结构1 7 - 9 ，从此，s p 的理论研究便有了检验依据，实际应用研究 也有了原理性仪器。o t t o 指出有两种方法可以激发s p r ，用电子穿透金属薄膜 或是用光照射金属表面，而k r e t s e h m a n n 提出的k r e t s e h m a n n 型结构也成为了 s p r 传感器研究的基础。 1 9 7 6 年a b e l e s 开创性地将s p r 用于光学材料表面有机固相薄膜的光学性 质的研究【1 0 】。1 9 8 3 年，瑞典l i n k 6 p i n g 理工学院应用物理实验室l i e d b e r g 等人 把它应用i 9 6 蛋白质与其抗原相互作用的测定中【1 1 1 ，引起了人们的高度重视， 有关s p r 传感器的研究逐渐成为国际传感器领域的研究热点。s p r 技术最重要 的特点是可以现场实时监测传感器表面生物分子之间结合或离解反应进行的情 况，进而获得有关分子结构变化和化学键合的信息，计算反应的动力学常数， 硕士毕业论文 第一章前言 确定反应物的种类、浓度和质量，而不需要对反应物进行标记和纯化。因此， 特别适合于生物分子之间相互作用的研究。基于这些优势，s p r 的研究逐渐进 入高峰期，许多科研团体尝试用各种方法s p r 性能及简化仪器系统，或尝试用 s p r 仪测量不同的生化物质，s p r 生物传感器开始全面的从实验室走向市场。 随着s p r 的商品化，这方面的工作越来越多。有关s p r 的文章增长迅速， 据不完全统计，从2 0 0 0 年到2 0 0 7 年初，仅在e l s e v i e r 里面检索文章就达2 4 8 0 多篇，美国化学会( a m e r i c a n c h e m i s t r y s o c i e t y ，a c s ) 数据库有关s p r 的文献 有1 0 7 0 多篇。研究的领域越来越广泛，实验方法越来越多【1 2 - 1 4 1 。 国内从事s p r 研究的有中国科学院化学研究所、长春应用化学所、电子所、 力学所、上海细胞生化所、吉林大学、湖南大学、清华大学等，研究集中在传 感分析及其仪器研制方面。我们所从2 0 0 4 开始尝试s p r 研究，搭建了高灵敏 度的s p r 仪( 目前已经商业化) ，尝试分析生物分子间的相互作用，目前正在 进行蛋白质构象变化、相互作用、蛋白质一d n a 相互识别以及d n a 的检测等方 面的研究。 1 2s p r 的理论基础 s p r 是一种非常灵敏的表面光谱技术，它利用了金属电介质溶液界面产生 表面等离子体激元极化( s u r f a c e p l a s m o n p o l a r i t o n s ，s p p s ) 时，金属( a u ，a g ， c u 。a 1 ) 表面的光区加强效应。 s p p s 是光子和等离子体激元耦合的表面电磁波，沿着金属电介质表面传 播，可以用来提高各种光谱测量的灵敏度【1 5 6 1 。与s p p s 有关的光区强度在离 金属界面2 0 0n n l 范围内呈指数衰减【l 1 9 1 。通过s p p s 最简单的形式，s p r 反射 率可以用来测定金属表面吸附的薄膜的折射率和厚度。椭圆偏振是另外一种可 以用来测量薄膜的折射率和厚度的表面技术，但是在超薄膜( 4 0n l l l ，视基底而 定) 的测量中它的灵敏度不如s p p t 2 。 s p p s 是由金属电介质界面的处于谐振的电子与光能的祸合产生的【1 2 ，1 3 1 只有用p 一偏振光激发才能产生，并且传播矢量或者波矢量，位于金属表面的 平面。s p p s 振幅在金属电介质界面是最大的，随着远离界面的距离呈指数关 系衰减【1 7 1 9 2 1 。这主要是因为在金膜空气界面的表面等离子体激元形成的相关 电场，随着远离金膜表面而呈指数衰减，如图1 1 所示【2 2 】。此图给出了e 2 e 0 2 与 距离金膜表面远近的关系，e 是表面等离子体激元电场，e 0 是入射辐射电场。 e 2 e 0 2 值在s p r 最小反射率角度4 3 5o 处计算。在金膜表面，e 循0 2 为7 4 ，相应 于电场增强8 6 。这个增强随着远离金膜表面而呈指数衰减，当在1 6 4n l t l 处达 到1 e ，这给出了一个表面等离子体激元可探测的大体范围。许多的表面光谱技 2 硕士毕业论文第一章前言 术利用了这种增强，包括拉曼、荧光和二次谐振的发生。 、。 一 【口 o 0 02 3 4 0 0 d i s t a n c ef r o ma us u r f a c e | n m 图1 1 表面等离子体激元的电场强度是金膜距离的函数 f i g u r e1 - 1e l e c t r i cf i e l ds 仃c n g ho f t h es pw a v e s a saf u n c t i o no f d i s t a n c ef r o mt h eg o l ds u r f a c e 表面等离子体激元在金属电介质界面的分布关系如式1 1 所示【2 l ，2 3 1 ： 国= c k 带公式( 1 1 ) 式( 1 1 ) 中，c o 是光的频率，c 是光速，k 光子的波矢量，e m 和分别是金 属和电介质的介电常数。s p p s 在金膜空气界面的分布关系如图1 - 2 中实线所 示，由式( 1 1 ) 计算所得。在计算时，按照金的自由电子气相理论，也就是把金 属的介电常数s i n 近似为金的整体等离子体激元的频率( 约为2 6 ，0 0 0 c m l ) ， 曲线达到一个渐进的频率1 0 p ( 2 1 2 ) ，约为1 8 ，5 0 0e r a 1 。在这个特定的界面上超 过这个频率，表面等离子体激元就不能产生。 硕士毕业论文第一章前言 毛 妥 、 3 图1 - 2 表面等离子体激元极化( s p p s ) 在金属空气介面的分布关系 f i g u r e1 - 2t h ed i s p e r s i o nr e l a t i o n s h i pf o rs pp o l a r i t o n s ( s p p s ) a tag o l d a ki n t e r f a c e 光在空气中传播的分布关系如图1 - 2 中点线所示( c o = c k ) ，s p p 分布曲线通 常位于此直线的右边，所以需要结合光栅或是棱镜来在金属一电介质界面激发 s p p s l l 3 1 。其结合方式有两种，分别是趾t s c h m a i l n 【8 1 和o t t 0 1 7 构型方式。如图所 示： m _ a + k r e t s c h m a n n 构型 k r a s c h m a n nc o n f i g u r a t i o n a _ m 一- o t t o 构型 o t t oc o n f i g u r a t i o n 图1 3 在金属一电介质界面激发表面等离子体激元常用的两种构型方式 f i g u r e1 - 3t h et w op o s s i b l ec o u p l i n gc o n f i g u r a t i o n st oe x c i t es p p sa tam e t a l - d i e l e c t r i ci n t e r f a c e 其中，a ，m ，p 分别代表电介质、金属和棱镜。两种检测装置都是p 偏振 光的衰减全反射，使用三角形或是半球形棱镜，其构成材料均为折射率较大的 4 硕士毕业论文第一章前言 石英或是普通光学玻璃。 k r e t s e h m a n n 构型中金属薄膜直接与棱镜接触，金属膜的厚度小于一个波长 ( 通常为5 0 r i m ) 。衰减光波在金属薄膜中透过并在金属膜待测物的界面处发生 表面等离子体激元共振。金属薄膜的厚度将对测定结果有很大的影响，因为它 直接影响到金属膜待测物界面处衰减光波的大小，若厚度超过衰减光波的有效 深度，则衰减光波在金属膜内将衰减至很小，不能到达界面；另一方面，若金 属膜过薄，那么共振效果不能达到最佳。而o t t o 构型是电介质位于棱镜和金属 的中间，其间被一层空气或样品隔开。要求这一夹层的厚度严格等于入射光的 波长，否则消失波与探测光不能在样品与金属界面耦合刚。o t t o 结构适用于晶 体等一类表面需要保护的样品的研究，它的操作难度大，一般不用。 由于k r e t s c h m a n n 构型易于制作和操作，所以现在常用的仪器装置般都 采用k r e t s c b m a n n 构型。由光源发出的p 一偏振光以一定的角度入射到棱镜中， 在棱镜与金属的界面处将发生反射和折射。当入射角o o 大于临界角0 c 时，光线 将发生全内反射。这种情况下，电场在金属与棱镜界面并不立即消失，而是向 金属介质中传输振幅呈指数衰减的消失波。该消失波可以与金属薄膜内的自由 电子作用，形成表面等离子体激元。消失波的平行矢量表达如下： = ，( ( 。0 s m 口 公式( 1 - 2 ) 式( 1 2 ) 中i l o 是棱镜的折射率，0 是入射光角度。这种经过改进的光的分布曲线 如图1 - 2 中的短曲线所示( 邗k 。m s i n e ) 。这条线与s p p 分布曲线相交于一点， 标为( j o e x ，记为激发频率，在实验中对应于1 5 ，8 0 0 c m 1 ( 6 2 3 8 r i m ) 。在这一点上， 满足k p 。= k 印的条件，消失波与表面等离子体激元将发生共振，在棱镜与金属 界面处的全内反射条件被破坏，产生衰减全内反射现象，使得入射光的能量将 转化为表面等离子体激元的能量，从而使反射率出现一个最小值，此时的角度 称为s p r 的共振角( 0 曲。有机薄膜在金属表面的形成会使s p r 分布曲线发生 移动得到较大的k 。值，反过来就需要高的入射角来满足共振条件。由此，我 们就可以根据s p r 共振角度的位移来检测表面的反应。 表面等离子体激元共振光谱主要受金属膜的种类、厚度、吸附介质的厚度、 折射率、入射光的波长等因素的影响。 1 3s p r 传感器的特点 1 3 1 样品无需标记，对样品无损 s p r 能测无标记分子，特别适合于天然生物分子的研究。这也是s p r 能在 5 硕士毕业论文 第一章前言 近十几年迅速发展的主要原因之一。 1 3 2 灵敏度高，无背景干扰 s p r 一般能检测到“n m o l l ”量级的组分，如利用放大技术，其检测限可 达到“f m o l l ”水平【2 5 】。s p r 检测限与介电常数变化幅度有关。凡传感表面及 其附近介质的介电常数变化幅度越大或待测物组分越靠近传感表面，就越容易 被观测到。通过表面修饰将目标分子拉靠到表面，可提高检测灵敏度。同理， 增加待测分子体积也可以提高检测灵敏度。当然，如对象过大，超出消失波的 作用范围，则灵敏度反而会下降，甚至无法检出。 实验中产生的电场在金属电介质界面最强，以后呈指数衰减，因此溶液本 体对其基本没有影响。 1 3 3 能进行现场实时动态分析 s p r 响应时间约在o 1 数量级【2 6 。9 】，可以监测在此时间尺度内的任何识别时 间和反应过程，即可进行现场或实时的动态观测。 1 3 4 可现场模拟观测 通过修饰改造分析环境，s p r 能模拟各种环境特别是生物环境，适合与体 外模拟研究某些生物反应和识别过程。 1 3 5 具备定量与尺寸分析能力 介电常数与物质的浓度和大小成比例，故s p r 信号也是物质浓度和分子大 小的函数 3 0 , 3 1 1 。据此可建立定量测定方法，可开发成一种新的尺寸分析方法。 1 3 6 通用性与选择性兼备 s p r 检测介电常数及其变化，而介电常数是物质的普遍特性，所以s p r 普 遍可用。如通过表面修饰引入各种识别机制，则s p r 可在复杂介质中探测出微 量的目标组分，所以它也是高选择性的分析方法。 1 4s p r 生物传感器的应用 通过以上的分析，我们可以看出s p r 技术可以用于提供金属薄膜表面的介 电层的物理性质信息，主要是由于以下两个原因： 1 、产生的s p 在金属们r 电层界面最大，随着远离金属表面而呈指数衰减。 这样就使这种技术对金属价电层界面的光谱性质特别灵敏，并且不受介电层物 质整体性质的影响或是其它接触物质的影响。 6 硕士毕业论文 第一章前言 2 、s p r 光谱的共振角度和形状受金属或是紧靠金属表面的介电层的光谱性 质的影响很大。 s p r 作为研究生物分子相互作用的全新手段，几乎可以检测所有的生物分 子，如蛋白质、多肽、d n a 、多糖、脂质体、小分子化合物，甚至噬菌体、细 胞等，从而用来研究分子问有无结合以及相互作用的亲和力、结合解离的快 慢，分析结合位点和结合顺序，并且寻找受体、配体、底物、疾病靶点和药物 等，因此其在蛋白质组学、信号转导、药物研发、遗传学分析和食品监控等领 域的应用发展迅速，其作用也日益重要。 1 4 1 生物分子的相互作用 s p r 作为一种新颖和重要的传感技术原理，已经在气体分析、生物识别研 究中发挥作用，其中关于生物分子识别的研究，正日益加强。s p r 能模拟各种 环境，特别是生物环境，借助多种识别原理，比如免疫识别、氢键、空间配合、 超分子作用等，人们发展了高灵敏、高选择性的的传感方法，包括小分子识别、 配体作用、蛋白吸附、抗原抗体作用、d n a 及r n a 杂交、蛋白d n a 作用等。 由于s p r 技术可以现场实时动态地检测反应的进行，并且不需要对反应物进行 标记，可以直接测量分析物及其复合物的浓度和质量改变，所以它被广泛地应 用于研究分子之闻的相互作用，用以测定生物分子相互作用的动力学亲合参数。 另外，以s p r 研究手性识别也很有潜力。 1 4 1 1 遗传学分析 短链核苷酸探针经常用来傲分析和治疗的试剂。利用s p r 技术很容易检测 完全互相匹配与单碱基错配的d n a 探针之间的结合动力学差异，因此可以分 辨末端与内部错误。p e r s s o n l 3 2 等的工作表明，将临床上的d n a 样品扩增后， 利用s p r 技术和8 核苷酸探针可以非常快速的检测出其中的点突变。n a k a t a a i 等d 3 - 3 5 也提出了利用s p r 技术检测d n a 错配的新方法。将合成好的嵌入配体 如吡啶二聚体( d i m e r i cn a p h t h y r i d i n e ) 、氨基毗啶二聚体( a m i n o m a p h t h y r i d i n e d i m m e r ) 或吡啶重氮喹诺酮( n a p h t h y r i d i n e - a z a q u i n o l o n eh y b r i d ) 固定在c m 5 芯片上，可以分别检测含有g - g c - t 、c - c 、g a 等错配碱基的异源双链d n a 。 与传统错配的检测方法相比，该方法具有明显的优势：如固定的配体可重复使 用：无需标记；检测快速：灵敏度和特异性高等。当然，s p r 错配检测的方法 也有一定的局限性，目前还不能检测g - t c - a 、a - a 屉t 错配( 随着合适配体 的设计将会解决) ，另外，它只能证明存在某种错配，而不能反映同一分子内错 配的数目及位置，但由于技术的优势，其发展仍有很大潜力。n a k a t a n i 等【3 6 l 还 在s a 芯片上用固定的大豆抗草甘膦基因序列的寡核替酸为探针，实时检测大 7 硕士毕业论文第一章前言 豆中的抗草甘膦基因，以确定是否为转基因大豆。以上应用表明s p r 是一种方 便、快速、灵敏、自动化地检测错配、点突变和遗传修饰的工具。 1 4 1 2 蛋白质组学 蛋白质组学是在蛋白质水平上动量、动态、整体性地研究生物体，旨在阐 明生物体全部蛋白质的表达模式和功能模式的领域。而蛋白质组功能模式的研 究主要集中在蛋自质间相互作用的网络关系上【”l 。蛋白质的相互作用能产生许 多效应，例如，它可以改变蛋白质的动力学特性、形成特异底物作用通道、生 成新的结合位点、使蛋白质失活、改变蛋白质对其作用底物的专一性等。了解 蛋白质的相互作用不仅有助于反应机理的研究，还可以寻找新的药物靶点和疾 病的标志分子等。s p r 技术已经成为蛋白质组学研究中的重要手段，可以筛选 配体受体，揭示蛋白相互作用，分析复合物的组装顺序以及结合位点等。 f i t z 等【3 s 】利用s p r 技术从1 0 0 多株细胞的粗提液中筛选到鼠动脉内皮生长 因子f i t 4 的配体，并研究了配体的基因表达和功能，从丽奠定了f l t 4 配体在 淋巴细胞分裂中作用的研究基础。s e i j it a k a y a i i l a 等悃s p r 检测到野生芸苔 花粉鞘提取物与s 位置相关糖蛋白( sl o c u s - r e l a t e dg l y c o p r o t e i n ，s l r l ) 有较强 麴结合活性，进而从花粉鞘提取物分离出两种s l r l 结合蛋白，并对其进行动 力学测定，得到了两种s l r l 结合蛋白与s l r l 的亲和力。 1 4 1 3 新药开发与药物筛选 新药研发的核心是药物靶点的发现以及药物分子药靶相互作用机制的研 究。s p r 技术因其实时、高通量、特异性及能在天然状态下研究药物分孑与靶 点的相互作用，为新药研发提供了有力的工具，在药物筛选、药物分子靶点坚 定及先导药物化合物结构优化方面有羞广泛的应用。 m e c h u l a m 等f 4 0 l 利用突变和s p r 等技术发现，人类免疫缺陷病毒1 型 ( h u m a ni m m u n o d e f i c i e n c y v i r u st y p el ，h i v - 1 ) 糖蛋白( g l y c o p r o t e i n , g p l 2 0 ) 高 度保守的1 3 1 6 1 3 1 73 - 发夹结构对于g p l 2 0 和c c r 5 的结合是非常关键的，这不 仅有助于了解h i v 的侵染机制，还为艾滋病的治疗抑制剂的设计提供了新的靶 点。 p a r k 等【4 l 】在开发抗癌肢类药物中运用了s p r 技术。人类乳腺癌、卵巢癌和 结肠癌会产生致癌h e r - 2 n e u 变异体( h e r - 2 n e u 是一种原癌基因，位子人染 色体1 7 q 2 l ，编码1 8 5k u 的跨膜糖蛋白受体) 。虽然与h e r - 2 n e u 结合的单克 隆抗体表现出使癌细胞反转恶性表型和具有治疗可能性的特点，但是用抗体作 为治疗药物会受到自主免疫系统的限制，并且抗体的分子量也很大，在治疗应 用上有一定的限制。p a r k 等设计了1 5k u 的类肽a h n p ，通过s p r 动力学分 8 硕士毕业论文 第一章前言 析显示其与h e r 2 的亲和力非常强( ) = 1 5 0r i m ) 。体内实验和体外实验也均证 明该类肽物质能抑制癌细胞的增殖、癌组织和肿瘤的形成，是一种有效的治疗 药物。 在药物筛选方面，k h a t i 4 2 得到了2 5 种针对h i v o lg p l 2 0 有高亲和力的2 - 氟嘧啶r n a 适配体( 2 - f l u o r o p y r i m i d i n e c o n t a i n i n gr n a a p t a m c r ) 。c i m i m n 等1 4 j j 研究了8 种类似紫杉醇的抗癌化合物和已在临床中使用的7 种h i v - 1 蛋白酶 抑制剂化合物，与脂膜和血浆蛋白( 人血清白蛋白和l - 糖蛋白) 的相互作用， 以判断这些药物的膜吸收特性和在血浆中的分布、转运情况。s i g u i e r 等用 h p a 芯片研究有效成分或抗原与s m b v t m 的结合速度和稳定性。此种方法样 品用量很少，而且也可以快速观察复合物的形成，从而筛选针对抗原最好的 s m b v t m ，并了解其形成过程。c h e n 等m 】用双通道的s p r 在线检测猪胆汁中 的磺胺甲嘧啶( s m z ) 和磺胺嘧啶( s d z ) ，同时检测了6 5 0 个样，证明了s p r 同 样适用于兽医药物的检测。 1 4 1 4 抗原抗体的研究 免疫反应是抗体与相应抗原之间的一种选择性的特异结合反应，此特异性 决定了免疫反应是一种高灵敏度、高选择性的反应。s p r 技术应用于免疫分析 当中可以识别抗原的种类、测定抗原的浓度、获得抗原抗体结合的动力学常数。 s p r 技术首次用于传感器的研究就是免疫传感器。l i e d b e r g l l l 增人在1 9 8 3 年用 s p r 研究了i g g 抗体在金膜表面的吸附，建立了一种灵敏、简便的检测i g g 的 方法，也开创了s p r 技术在生物传感器方面的应用。后来人们也建立了许多的 研究体系，进一步提高了检测的灵敏度。 n o e l l 4 6 i 构建的抗体表达载体( 含重链基因或轻链基因) 转染c o s 7 细胞， 以s p r 技术分析上清液和靶抗原的相互作用，在无需纯化抗体的条件下获得目 标抗体和靶抗原的结合动力学，由此证明了抗体重链片断为抗体亲和性的重要 结构基础，而轻链片段则在稳定抗体抗原相互作用时起作用，从而为免疫球蛋 白结构功能研究提供重要依据。 在特定的自身免疫导致的神经系统疾病中，血清中抗神经节普脂g a n g l i o s i d e 抗体滴度是反映病症退行或进展的一个重要生化指标，a l a e d i n i 等1 4 7 1 应用s p r 技术成功地检测了自身免疫神经系统疾病患者体内特异性抗体( a n t i g m i g a n g l i o s i d ea n t i b o d i e s ) 滴度，并证明以s p r 技术检测特异性抗体相比于传统的 e l i s a 技术在灵敏度、精确性及检测速度方面皆有优势。 1 4 1 5 食品检测 s p r 技术在食品成分检测，质量控制等领域发展迅速。因为此种方法具有 9 硕士毕业论文 第一章前言 实时分析、灵敏度高、样品需求量小的特点，现在已被用于检测食品中是否含 有转基因产品、筛查环境和食品中的致病微生物、检测肉及乳制品中的抗生素 含量和兽药残留，以及食品中维生素含量。 r a s o o l y 4 8 1 使用b 1 a c o r e 3 0 0 0 设计了一种s a n d w i c h 方法来快速检测食品中 葡萄球菌肠毒素b ( s t a p h y l o c o c c a le n t e r o t o x i n b ，s e b ) 。c a l d o w 等 4 9 1 发展了用 s p r 技术来检测蜂蜜中的泰乐菌素含量的可靠方法。检测时，先将蜂蜜用磷酸 缓冲液溶解，后用固相萃取管进一步收集和清洗，与泰乐菌素的特异性多抗混 合后，流过已固定有泰乐菌素的芯片表面检测。此种方法的检测能力可以达到 2 5 “g k g ，其检测结果与l c m s m s 方法是相符的。 1 4 2 动力学的研究 目前，很少有其他方法，能像s p r 那样轻而易举的研究生物分子的识别和 生化反应的动态过程，这种实时、现场研究动力学问题的能力使s p r 能立于众 多分析方法之林。通过s p r 技术不仅可以了解分子结合的特异性，还能精确计 算分子结合的动力学数据，包括结合解离速率和平衡结合解离常数。这在研究 抗原航体，配体受体，药物腐靶等结合过程中非常重要。 在s p r 测定中，一个反应物要固定在柔性的葡聚糖表面上，这样会限制分 子的旋转和扩散，使之与溶液中测定的方法有所不同。d a y 等【5 0 1 分别用s p r 技 术、等温滴定热量测定( i s o t h e r m a lt i t r a t i o nc a l o r i m e t r y ) 和停留荧光法 ( s t o p p e d f l o wf l u o r e s c e n c e ) 测定小分子c b s d n s a 与碳酸酐酶i i ( c a r b o n i c a n h y d a r s ei i ) 的平衡常数、热力学常数和速率常数。结果显示，基于表面的 b i a c o r e 技术与基于溶液测定的方法所得到的数据是一致的，从而证明s p r 技 术是动力学测定的可靠方法。s p r 所测量的动力学范