（应用化学专业论文）柚皮挥发性成分分析及其提取分离研究.pdf

北京工商大学硕士学位论文 摘要 柚是我国传统水果，资源丰富。柚皮一般作为废物处理，不仅造成资源极大 浪费，而且污染了环境，所以进行该资源的综合利用具有良好的社会效益和经济 效益。近年来，国内学者对柑桔类果皮的综合利用做过许多探索和尝试，但柑桔 类果皮的综合利用仍缺乏多级加工和深度加工，特别是柚皮的综合利用尚未引起 足够的重视。 本文首先采用同时蒸馏萃取、超临界二氧化碳萃取的方法制备样品，结合气 质联机分析了柚皮挥发性成分组成。结果表明，柚皮挥发性成分主要是由萜烯 类化合物和醇类、醛类、酮类以及酯类等含氧化合物组成；与蜜柚皮挥发性成分 比较，沙田柚外皮挥发性成分中具有柚子特征香气的化合物圆柚酮的含量较高， 达到2 7 2 9 ；同时蒸馏萃取法和超临界二氧化碳萃取法比较，超临界二氧化碳萃 取法所得沙田柚外皮挥发性成分中萜烯类化合物的含量高于总含量的6 0 ，圆柚 酮的含量低于总含量的2 ，采用同时蒸馏萃取的方法所得圆柚酮含量较高。 本文研究了柚皮挥发性成分提取工艺。在同时蒸馏萃取柚皮挥发性成分工艺 研究中，用沙田柚外皮挥发性成分的提取率及挥发性成分中圆柚酮的质量分数作 为考察指标，对比分析了同时蒸馏萃取连续蒸馏l o b 和分段蒸馏提取柚皮油的提 取率及其成分的变化。结果表明，连续蒸馏l o b 挥发性成分提取率( 1 2 7 ) 低于 4 - 时段挥发性成分提取率的和( 2 0 5 ) 。在不同蒸馏时段提取的挥发性成分中， 第四时段圆柚酮的质量分数最高，达到4 9 9 0 。此外，采用正交试验确定了同时 蒸馏萃取沙田柚外皮挥发性成分的较佳工艺：油浴温度1 6 0 。c 、料水比例1 ：1 2 、 蒸馏时间7 h 、溶剂量l o o m l ；在此条件下所得柚皮挥发性成分提取率为1 0 9 ， 圆柚酮质量分数为3 6 1 2 。 在超临界c 0 2 萃取柚皮挥发性成分工艺研究中，以提取率和摹取物中含氧化 合物的质量分数作考察指标，考察了萃取压力、萃取温度、c 0 2 流量、萃取时间 等因素对实骀结果的影响。结果表明，萃取温度是影响提取率的 要因素，而萃 取压力是影噼l 挥发性成分中含氧化合物质量分数的主要因素。综台单因素实验和 f 交试验，确定了获得较高提取率( 1 1 2 ) 时，超临界c 0 2 萃取交佳工艺条件： 柚皮挥发性成分分析及其提取分离研究 萃取压力2 7 m p a 、萃取温度加、二氧化碳流量3 3 i h 、萃取时间l h 。综合单因 素试验和正交试验，确定了获得较高质量分数( 1 2 8 2 ) 含氧化合物的工艺：萃取 压力2 5 m p a 、萃取温度3 8 、二氧化碳流量3 0 l 伍、萃取时间1 h 。 本文初步对高速逆流色谱法分离柚皮挥发性成分中的有效成分圆柚酮进行 研究。采用薄层色谱法确定了高速逆流色谱溶剂体系，正己烷乙酸乙酯甲醇 水( 8 ：2 ：5 ：2 ) ，此时固定相保留率为8 5 嘶。采用上相作为固定相，下相作为 流动相，泵流速l m l m i n ，转速7 0 0 r m i n 进行分离实验，所得流分通过液质联 机进行了分析，圆柚酮含量达到6 5 3 2 。 关键词：柚皮；圆柚酮；同时蒸馏萃取；超临界萃取；高速逆流色 谱 北京工商大学硕士学位论文 a b s t r a c t p o m e l oi st h et r a d i t i o n a lr u i t 托s o h i i nc h i n a , w 五o s cp e e l sw 眦t r e a t e da s w a s t e st r a d i t i o n a l l y ，c a s i n gg r e a tr c s o u r o el o s sa n de n v i r o n m e n t a lp r o b l e m t h u s , t h e i ru t i l i z a t i o nh a ss o u n ds o c i a la n de c o n o m i cb e n e f i t s m a n ys c h o l a r sh a v eb e e n d e v o t e dt ot h er e s e a r c ho fc i t r u sp e e l sf o rd e c a d e s , b u tm u l t i - l e v e la n dd e e p p r o c e s s i n gf o ri t sc o m p r e h e n s i v eu s e ，e s p e c i a l l yp o m e l op e e l su s e 9a r es t i l li n c r a d l e t h ev o l a t i l ec o m p o n e n t sw e r ea n a l y z e db ys i m u l t a n e o u sd i s t i l l a t i o ne x t r a c t i o n , s u p e r c r i t i c a lc 0 2e x t r a c t i o nc o m b i n i n gw i t hg c - m si nt h i sp a p e r t h er e s u l t s s h o w e dt h a t ：p o m e l op e e l s v o l a t i l e c o m p o n e n t sm a i n l yc o n t a i nt e r p e n o i d s ， o x y g e n a t e dc o m p o 岫凼s u c h 勰a l c o h o l , a l d e h y d e k e t o n e sa n de s t e r s b yt h e c o m p a r i s o no fc o m p o n e n t so fm ip o m e l o ，i tw a so b s c r v e dt h a ts h a t i a np o m e l o c o n t a i n e dt h e h i g h e s tm o u n to fn o o t k a t o n e , w h i c h i s r e p r e s e n t a t i v eo ft h e c h a r a c t e r i s t i ca r o m a , 印t 02 7 2 9 b yc o m p a r i s o no fs d ea n ds u p e r c r i t i c a lc 0 2 e x t r a c t i o n , i tw a sd i s c o v e r e dt h a tt h em o u n to ft e r p e n o i d si nv o l a t i l ec o m p o n e n t s e x t r a c t e db ys u p e r c r i t i c a lc 0 2e x t r a c t i o nw a sh i g h e rt h a n6 0 ，a n dn o o t k a t o n e a m o u n tw a sl o w e rt h a n2 ，n e v e r t h e l e s s ，t h ea m o u n to fn o o t k a t o n ee x t r a c t e db y s d ei sh i g h e r e x t r a c t i o np r o c e s so ft h ev o l a t i l ec o m p o n e n t si l lp o m e l op e e l sw c t cs t u d i e di nt h i s p a p e r i nt h er e s e a r c ho fe x t r a c t i o np r o c e s so fv o l a t i l ec o m p o n e n t si np o m e l op e e l s b ys d e , e x t r a c t i o ny i e l do fv o l a t i l ec o m p o n e n t si ns h a t i a np o m e l os k i np e e l sa n d p e r c e n t a g eo fn o o t k a t o n ei nt h ec o m p o n e n t sw e r eu s e d 弱i n s p e c t i o ns t a n d a r d t h e e x t r a c t i o ny i e l da n di t sc o m p o n e n t c h a n g e so fp o m e l op e e lw i t h i n1 0h o fc o n t i n u o u s d i s t i l l a t i o n ，a n ds u bd i s t i l l a t i o nb ys d e w e r ec o m p a r e da n da n a l y z e d i te x h i b i t e d t h a tt h ee x t r a c ty i e l di nc o n t i n u o u s1 0ho fd i s t i l l a t i o n ( 1 2 7 ) w a sl e s st h a nt h a to f t o t a lf o u rt i m ei n t e r v a l s ( 2 0 5 ) a m o n gt h ev o l a t i l em o u n te x t r a c t e da td i f f e r e n t d i s t i l l a t i o nt i m ei n t e r v a l s ，t h eo u ei nt h e4 t hp e r i i dg o tt h eh i g h e s t ，u pt o4 9 9 0 1 柚皮挥发性成分分析及其提取分离研究 b e s i d e s ，o p t i m a lc o n d i t i o n sf o re x t r a e t i o no fv o l a t i l ec o m p o n e n t si ns h a t i a np o m e l o s k i np e e lb ys d ew c i eo b t a i n e db yo r t l a o g o n a lt e s ta sf o l l o w s ：o i lb a t ht e m p e r a t u r e ： 1 6 0 ：m a t e r i a l s w a t e rr a t i o ：1 ：1 2 ；d i s t i l l a t i o nt i m e ：71 1 ；s o i v c n ta m o u n t ：1 0 0m 1 u n d e rt h i sc o n d i t i o n , t h ee x t r a e t i o ny i e l do fv o l a t i l ec o m p o n e n t so fs h a t i a nl m m e l o s k i np e e lw a s1 0 9 a n dt h eq u a n t i t yp e r e e n t a g co fn o o t i m t o n ei ne s s e n t i a lo i lw a s 3 6 1 2 i nt h ee x t r a c t i o no fv o l a t i l ee o m p o n c n t si np o m e l op e e l sb ys u p c r c r i t i e a lc 0 2 t c e l m o l o g y ，a p p l y i n gt h ee x t r a c t i o ny i e l da n dl e r e e n t a g co fo x y g e n a t e de o m p o t m d s i nt h ee x t r a c ta sp a r a m e t e r s ，t h ei n f l u e n c eo fe x t r a c t i o np r e s s u r e ，l e m p c r a t u r e ，t i m e , a n dc 0 2n u xw c r cs t u d i e d i ts h o w e de x t r a c t i o nt e m p e r a t u r ew a st h ek e yf a c t o ro n e x t r a c t i o ny i d d , a n dt h ep r e s s u r e 碍髑i m p o r t a n tt oo x y g e n a l e dc o m p o u n dp e r c e n t a g e o fv o l a t i l ec o m p o n e n t c o m b i n i n gs i n g l ef a c t o rt e s ta n do r t h o g o n a lt e s t , o p t i m a l p r o c e s sc o n d i t i o n sw e o b t a i n e di no r d e rt og e th i g h e rc x t z a e t i o nr a t e ( 1 1 2 ) w h i c hw a ss u m m a t j z e da sb e l o w ：e x t r a c t i o np r e s s u r e ：2 7 m p a ；t e m p e r a t u r e ：4 0 1 2 ； 0 9 2f l u x ：3 3 i _ 1 1 ；t i m e ：1 1 1 b ys i n g l ef a e l o rt e s t sa n do r t h o g o n a lt e s t s ，t h ee o n d i t l o n s f o rg e t t i n go x y g e n a t e dc o m p o u n d sw i t hh i g h e rp e r c e n t a g e ( t 2 8 2 1w a sd e t e r m i n e d a s ：e x t r a c t i o np r e s s u r e ：2 5 m p a ；t c m p c r a t u r e ：3 8 1 2 c 0 2f l u x ：3 0 i _ l a ；t i m c ：l l a u s i n gh s c c ct oi s o l a t e t h ea c t i v ec o m p o u n do fn o o t k a t o n ci nv o l a t i l e c o m p o n c n t so fp o m e l op e e l sw 勰s t u d i e di nt h i sp a p 口1 kh s c c c s o l v e n ts y s t e m o fi s o l a t i o no fn o o t k a t o n cw a sd c t e r m i n e x lb yt ice o l o r i m c t r i cm e t h o dt h a tw a s h c x a n e ：e t h y la c e t a t e ：m e t h a n o l ：w a t e re q u a l e dt o8 ：2 ：5 ：2 ，a n ds t a t i o n a r yp h a s e r e t e n t i o np e r c e n t a g ew a s8 5 8 6 u t i l i z i n gu p p e rp h a s ea st h es t a t i o n a r yp h a s ea n d l o w e rp h a s e 舔m o b i l ep h a s e ，h s c c cr o t a t i o n 删w i l t s7 0 0 r r a i n ，a n dp u m pf l o w l m l m i na se x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s ，t h es e p a r a t e dn o o t k a t o n ew a si d e n t i f i e d s u c c e s s f u l l yb yl c - m s a m dt h eq u a n t i t yp e r c e n t a g eo fn o o t k a t o n ew a s6 5 3 2 k e y w o r d s ：p o m e l op e e l s ；n o o t k a t o n e ；s d e ；s u p e r c r i t i c a le x t r a c t i o n ； h s c c c i v 北京工商大学学位论文原御性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作所 取得的研究成果。除了文中已经注明引用的内容外。论文中不包含其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体， 均已在文中以明确方式标明。本声明的法律后果完全由本人承担。 学位论文作者签名：壅丝日期：卿年多月f 7 日 北京工商大学学位论文授权使用声明 本人完全了解北京工商大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生 在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属北京工商大学。学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许学位论文被查阅和借 阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复 制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后遵守此规定) 学位论文电子版同意提交后，可于口当年口一年口二年后在学校图 书馆网站上发布，供校内师生浏览。 学位论文作者签名： 导师躲监r 期：斗蝴刁日 北京工商大学硕士学位论文 1 1 研究背景 1 1 1 柚 第一章绪论 柚c i t r u s 删l ) ，又名文旦，抛，是芸香科柑橘属常绿果树，乔木，高 5 1 0 米，幼枝有刺，叶大而厚，卵圆形，翼叶较大呈心脏形。总状花序，白色， 雄蕊2 0 - 2 5 ，花粉丰实；子房球形，花柱早凋。果重约5 0 0 - 2 0 0 0 9 ，果形有球圆、 扁圆、椭圆、梨圆等形状。果皮质厚而粗，油泡凸起，果肉灰白、粉红及至红 色等颜色。种子5 0 - 1 0 0 粒、楔形或马齿状，子叶白色、单胚。 我国柚类品种繁多，据不完全统计，传统品种、地方品种和近年选育的新 品种( 系) 约有1 2 0 种，现有栽培面积约6 6 7 万公顷，产量约踟万吨，栽培面 积较大的有广西恭城沙田柚、福建平和官溪蜜柚、玉环文旦柚、梁平平顶柚、 四川脆香甜柚、福鼎四季柚、江西斋婆柚等，小面积或零星栽培的有五布柚、 平山柚、永嘉早香柚、安江香柚、晚白柚、金香柚、渡口柚等。我国柚类主要 栽培区为南亚热带与中亚热带地区，即广西、广东、福建、四川、湖南、江西、 浙江、湖北、云南、台湾等省区，产量高、品质好。此外，江苏、海南、西藏、 安徽等省区也有少量种植，但产量及品质不及主产区1 1 i 。 柚周身是宝，具有很高的栽培、绿化和综合利用价值。柚果实，风味独特， 酸甜可口，富含多种维生素、氨基酸及微量元素。柚子的花、幼枝和果皮均含 挥发性成分，果皮挥发性成分具有新鲜、甘甜、柔和的柑橘香气，可用来调配 人造香柠檬油、柠檬油，也用于调配食用香精和日用香精，在最终加香食品中 浓度约为1 0 m 1 5 m g l 【g 【2 】。目前柚皮及果实都已被应用于医药业，化橘红为化 州柚未成熟或近成熟的干燥外层果皮，是理气化痰、健胃消食之常用中药。药 材以广东化橘红最为著名，辛香之味最为醇厚，是特产药材，从柚皮提纯的化 合物如酬柚酮、生物碱类、香豆素类、黄酮类化合物、柠檬苦素类和其它三萜 类化合物，经过临床应用发现具有调节血压、抗凝血、保肘，抗肿瘤、抑菌、 治疗呼呲道疾病和糖尿病等功效。林捷等1 3 1 研究了柚皮提取物对细菌、酵母、 柚皮挥发性成分分析及其提取分离研究 霉菌的抑制作用。实验结果证明：柚皮提取物对苏云金芽胞杆菌、卵黄色八叠 球菌和从酸泡菜中分离出的混合细菌群有较强的抑制作用，对大肠杆菌、沙门 氏茵和黑曲霉的抑制作用较差，对啤酒酵母、红酵母和青霉无抑制作用；柚皮 提取物的抑菌作用受p h 值的影响不大。贾冬英等1 4 1 对柚果皮中黄酮类化合物、 类柠檬苦素、天然色素及柚皮挥发性成分的化学组成、药理作用及应用等进行 了介绍。黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗过敏、抗病毒、抗炎、降低毛细血管脆 性、抑制血小板凝聚等药理作用。产生这些活性作用的机制是多方面的，且与 黄酮类化合物的结构密切相关，可能通过抑制多种有关酶的活性或作为自由基 清除剂或金属离子的络合剂等途径发挥上述作用l 列。抗癌性和昆虫拒食性是类 柠檬苦素具有的主要生物活性，有些类柠檬苦索还具有抗菌性和抗病毒性。 k e i j i ( 6 等人发现类柠檬苦素对中枢神经系统具有刺激作用。能缩短小鼠麻醉后 的睡眠时间。类柠檬苦素是通过诱发动物体内一种解毒酶。即谷胱甘肽s 一转移 酶( g l u t a t h i o n cs - t r a n s f e r a s e ，g s n 的活性达到抑制实验动物肿瘤生长的作用【7 。， 它们对化学物质诱导的肺癌、胃癌和皮肤癌有抑制作用。利用其昆虫拒食性可 将类柠檬苦素开发成一种绿色农药，即新型生物安全杀虫剂用于农业上的虫害 防治，这既减少了对环境的污染，又减少了有毒杀虫剂进入人和动物体内的机 会，为人类健康带来福音。柚果皮挥发性成分具有祛痰、止咳、平喘、促进胃 肠蠕动、促进消化液分泌、镇痛、溶解胆结石及抗菌消炎等作用i s 。 1 1 2 柚皮及其化学成分 柚皮一般作为废物处理，不仅造成资源极大浪费，而且污染了环境，所以 进行该资源的综合利用具有良好的社会效益和经济效益。近年来，国内许多学 者对柑桔类果皮的综合利用做过许多探索和尝试，但柑桔类果皮的综合利用仍 缺乏多级加工和深度加 ，特别是柚皮的综合利用尚未引起足够的重视。国外 柑橘加工业发达国家的经验表明，搞好皮渣综合利用，不仅可提高原料综合利 用率，降低生产成本，提高附加值和经济效益，而且可以减少环境污染，这己 成为现代化柑橘加工中刁、可忽视的重要环节。 1 1 2 1 柚皮挥发性成分提取及分析 目前分析柚皮挥发竹成分常用的提取方法有：水蒸汽蒸馏法、同时蒸馏誊 2 北京工商大学硕士学位论文 取法、压榨法、溶剂浸提法、超临界二氧化碳萃取法以及微波辐射法1 9 。每种 方法都具有一定的优点和局限性。 水蒸气蒸馏法：是应用最广泛的一种方法，该法设备简单，容易操作，成本 低，但是该法的提取时间较长，挥发性成分得率低( 柚皮油得率为0 9 ) 。唐课 文等【1 川利用水蒸汽蒸馏法提取柚皮挥发性成分，并利用g c - j l s 联用技术进行了 鉴定。杨晓红等【1 1 荆用水蒸气蒸馏的方法对柚皮进行了挥发性成分提取，并利 用g c - j s 联用技术分析了蜜柚果皮挥发油的化学成分。周永红等【1 2 】利用水蒸气 蒸馏的方法对柚皮进行了挥发性成分提取，并利用g c - m s 联用技术分析了沙 田柚果皮挥发油的化学成分。 同时蒸馏萃取法其萃取原理是将水蒸气蒸馏和馏出液的溶剂萃取两步合二 为一，使样品蒸气和萃取溶剂在装置中充分混合，反复萃取。由于同时蒸馏萃 取法所获得的是挥发油在有机溶剂中的溶液，体积较大，便于操作，避免了通 常蒸馏法提取挥发性成分时在器壁上吸附损失及转移微量挥发性成分时的操作 困难，因此是目前使用较广泛的萃取方法【1 3 l 。同时蒸馏萃取法最明显的缺点是 长时间高温蒸煮会使热不稳定性物质变质，影响香精油的天然香气。 压榨法：该法应用面不如蒸馏法广，主要应用于柑橘类挥发性成分的生产。 由于其生产过程在室温下进行，所以能保持挥发性成分原来的香气和品位，但 其提取时间更长，挥发性成分得率较蒸馏法低( 柚皮油得率为0 3 ) 。 溶剂浸提法：该法是利用有挥发性并能很好地溶解植物芳香油的有机溶剂， 从芳香原料中提取挥发性成分，提取时间较压榨法短。龚盛昭等【1 4 】利用溶剂浸 提法，通过实验筛选，得到了柚皮挥发性成分提取的最佳工艺条件：采用石油醚 为提取溶剂，m ( 石油醚) ：m ( 柚皮) = 2 4 ：1 ，回流提取两次，每次提取6 0m i n 。 提取液进行真空浓缩，得挥发性成分粗产品。往挥发性成分粗产品中加入乙醇 溶解，放入5 冰箱中冷冻过夜，抽滤，滤液进行真空浓缩，即得挥发性成分， 产率约为1 9 6 。 超临界二氧化碳萃取法：是2 0 世纪8 0 年代发展起来的较新提取法，超临界流 体( s c f ) 是超过临界温度和临界压力的j i 凝缩性的高密度流体，它的性质介于 气体和液体之间，兼具二者的优点，具有优异的溶剂性质。一般说来，物质的溶 解能力与其密度成正比关系，s c f 的密艘可通过压力的变化在大范围内变化。 3 柚皮挥发性成分分析及其提取分离研究 在萃取过程中，利用压力变化使溶媒的溶解能力发生大幅度变化，可以有选择地 溶解目的成分，而不溶解其他成分，从而达到所需要的分离纯化目的。用超临界 萃取方法生产天然产品时，一般用c 0 2 作为萃取剂。这是因为c 0 2 是惰性气体， 安全无毒，无污染，制取费用低，用其作萃取溶媒，操作条件较温和，制取的产 品纯度高。该法的操作压力和温度对提取结果的影响至关重要。与传统操作方法 相比，超临界0 0 2 具有以下优点嘲：( 1 ) 临界温度低( 3 1 1 1 2 ) ，临界压力适中 ( 7 3 8 m p a ) ，c 0 2 是惰性气体，因此对一些热敏性物质和耐热性差的物质无降 解变质作用。( 2 ) c t h 是一种非极性溶剂，对非极性化合物有较高的亲和力。 能够从天然物质中选择性分离有效成分或脱除某种成分。( 3 ) c 0 2 的化学稳定 性好，无毒、无色、无味、不污染提取物和环境，不存在溶剂残留问题。( 4 ) c 0 2 价廉易得。( 5 ) c t h 具有防止氧化，抑制细菌等作用。 ( 6 ) 工艺简单，效 率高，能耗低。香精油的得率较高。张晨等f 1 6 】采用沙田柚皮作为实验材料，研 究在c t h 超临界流体萃取时，粉碎度、温度、压力、萃取时间等条件对挥发性成 分提取率的影响，得到萃取沙田柚皮挥发性成分的最佳条件为1 3 m p a ，加， 萃取时间1 h 。 微波辐射法( 即微波辅照诱导萃取法) 是近年发展的从天然物中提取香料的 一种新技术。它是利用一种波长极短、频率很高的辐射能来加热物料，物料组 织内部的水是极性分子，能吸收微波透过介质的能量，使物料内部温度突然升 高。由于微波辐射所产生的热量仅限于天然物如香料物的维管束组织的内部， 所以在天然物料的维管束和腺胞系统中升温更快，并且能保持此温度直至其内 部压力超过细胞壁膨胀的能力，致使细胞破裂，位于细胞内的香料物质就从细 胞壁流出、传递、转移至周围的萃取介质，进而在较低的温度下被萃取介质捕 获并溶解其中，过滤分离残渣后即得萃取物。微波辐射法最大的特点是萃取时 间短，产物得率高。陈纯馨等 9 1 利用微波辐射法提取柚皮的挥发油。结果表明 最佳的萃取条件为：1 0 0 9 果皮在3 6 0 w 下，用3 0 0 m l 正己烷萃取5 0 s ，柚皮油得 率为1 7 3 。 不同产地的柚皮中所含挥发性成分不同，人们利用g c - m s 技术对各地的 柚皮挥发性成分进行了分析，并对其组分进行了鉴定。 根据李运明等【1 7 1 对柚皮挥发性成分的分析得知，柚皮挥发性成分含萜烯较 4 北京工商大学硕士学位论文 多。其中单萜化合物1 1 种，倍半萜化合物有3 种，分别占挥发性成分的9 1 5 6 和0 4 4 ，可见由单萜和倍半萜所构成的萜烯化合物为其主要成分。单萜化合 物中，主要是柠檬烯、月桂烯、4 蒎烯、桧烯、芳樟醇和柠檬醛等，分别占8 6 1 3 ， 2 5 6 ，0 9 8 ，o 7 5 ，0 5 3 和0 2 0 。倍半萜化合物中，石竹烯、圆柚酮和 律草烯分别占0 2 7 ，0 1 3 和0 1 4 ，在鉴定出的脂肪醛类中，辛醛、癸醛和 壬醛等质量分数较高，分别占0 8 9 ，0 4 1 和0 1 2 ，而在酯类中，三乙酸甘 油酯、乙酸香叶酯和乙酸辛酯分别占3 3 8 ，0 0 4 和0 1 2 ，在醇类中，月桂 醇、1 屯松油醇和十五醇各占o 3 2 ，0 0 8 和0 1 1 。 杨晓红等【1 1 l 利用水蒸气蒸馏的方法，采用g c - m s 联用技术分析了蜜柚果 皮挥发油的化学成分，分离出5 3 个组分，鉴定了圆柚酮( 1 2 7 4 ) 、柠檬烯 ( 4 0 6 ) 、口萜品醇( 3 9 8 ) 、口荜澄茄油烯( 2 吣) 、芳樟醇( 1 2 6 ) 等 3 6 个化合物。 周永红等【1 2 1 利用水蒸气蒸馏的方法，采用g c - m s 联用技术分析了沙田柚 果皮挥发油的化学成分，共分离出5 6 个组分，鉴定了其中的5 2 种化合物，占挥 发油质量分数的9 8 5 4 。其主要成分为m 柠烯( 6 2 铝) 、大茴香脑( 9 5 0 ) 、 圆柚酮( 5 6 0 ) 、伊芳樟醇( 2 3 3 ) 及卢石竹烯( 2 2 6 ) 等。 1 1 2 2 圆柚酮 圆柚酮( n o o t k a t o n e ) ，又称作诺卡酮，属于雅槛蓝烷( e r e m o p h i l l a n e ) 系的双环 倍半萜酮【蚓。在2 0 世纪6 0 年代从阿拉斯加黄柏( c h a m a e e y p a r i s n o o t k a t e n s i s ) 油 和柚子皮油中发现，并鉴定了其特有的结构。纯的圆柚酮为白色晶体，分子试 为c 1 5 h 2 2 0 ，熔点为3 6 3 7 。c ，沸点为1 2 5 0 - 1 3 0 0 。c 0 5 n u n h g , a 2 0 v + 1 8 9 。，溶于 乙醇等有机溶剂，不溶于水。圆柚酮天然存在于柑橘、圆柚中，具有圆柚、柑 橘、橙子的气味，并带有甜的果皮、木香香韵。圆柚酮可用于调配圆柚、橙子、 热带水果等食用香精，在最终加香食品中浓度约为l o m g k g 2 j 。 圆柚酮在柚皮挥发性成分中含量很低，一般不能从柚皮挥发性成分中单离 获得，同时由于其存补：多种立体异构体1 ，2 ，3 和4 ( 见图1 - 1 ) ，而它的香气 与分子的立体结构密切相关，结构上稍有变化就将导致香气特征的变化。因此 其合成引起了化学家们的极大兴趣。o h h l o t d ”i 对此做了比较系统的研究。不同 结构圆柚酮的香气特自j 见表1 - 1 。 柚皮挥发性成分分析及其提取分离研究 。镕骖j 1 2 盼孵4 图1 - 1 圆柚酮的立体异构体 表i = i 不同异构体圆柚酮的香气特征 该产品的价格非常昂贵，根据r e d o u k i a nr 啪a r c hn e w s 的2 0 0 2 年资料显 示，国际市场上含量9 8 的圆柚酮售价为3 5 0 0 美元俺，含量5 0 的圆柚酮售价 为2 0 0 0 美元l 【g 。目前，工业上最简单的合成方法是利用直接氧化柑橘油中的 倍半萜馏分巴伦西亚烯制备圆柚酮。见图1 - 2 ，1 为巴伦西亚烯、2 为圆柚酮。 但是，由于目前都是采用一些非环境友好的氧化剂，这些氧化剂包括三氧化铬、 铬酸叔丁酯、乙酰丙酮酸钴和其它一些重金属的盐类 2 0 - 2 2 | 。这些金属化合物的 使用对环境造成了污染，同时生产圆柚酮的设备投资较大、产品成本高，工业 化生产相当困难。 蹄型m 图1 2 工业合成圆柚酮的方法 6 北京工商大学硕士学位论文 1 1 3 高速逆流色谱 植物性挥发性成分是来源于植物枝、叶、根茎、树皮、树干、果实、花、 蕾和树脂等组织的挥发性组分。目前，挥发性化学成分研究多数还局限于采用 气一质联机间接鉴定其化学组成，而为了更有效准确地搞清挥发性成分中某些成 分的化学结构，解释挥发性成分的药理作用，直接分离挥发性成分中的有效成 分并进行深入研究将非常必要。目前国内关于柚皮挥发性成分气一质联机分析的 文献报道有很多，但就其有效成分的分离未见文献报道。 天然产物在当今的医药、化妆品、香料以及食品添加剂等工业领域扮演着 越来越重要的角色。从天然产物资源中分离天然产物活性成分具有很多的困难 和问题。因为我们感兴趣的化合物通常仅以很低的含量存在于极其复杂的介质 中。色谱方法一直是天然产物的分离纯化中的主要手段，尤其是吸附色谱，在 天然产物分离中应用较多的吸附色谱技术主要有薄层色谱( 1 1 c ) 和高效液相 色谱( 唧l c ) ，薄层色谱作为一种开放式的色谱系统，t l c 影响因素较多， 重现性差，定量不够准确，有色谱柱对样品组分的吸附、粘染、变性、失活等 不良影响，精密度较差，这些都制约了它在天然产物指纹图谱研究中的应用； h p l c 在分离复杂介质中的化合物时可以达到很高的分辨率，即h p l c 具有很 高的精密度，但其对于样品的前处理要求很高，对于色谱柱的固体支撑物对吸 附能力很强的物质不易进行洗脱，在后续的分析中容易造成色谱峰拖尾现象。 所以就吸附色谱而言，物质在色谱柱的固体填充物上的不可逆吸附和交性是固 相色谱所遇到的共同问题，并且从分析规模到制备规模的放大所需要的费用也 相当的昂贵。 高速逆流色谱( c o u n t e r c u r r e n tc h r o m a t o g r a p h y ，简称c c c ) 是一种无需任 何固体支撑体的液一液分配色谱分离技术，被分离物质根据其在互不混溶的两相 溶剂中的分配系数的不同而达到分离。由于不使用固体支撑介质，因而避免了 样牖的不可逆吸附和样品组分的化学变性等问题，使样品的完全回收成为可能， 别适用于分离极性物质和具有生物活性的物质，流色谱分离技术已经被证明是 一种非常有效的制备和半制备手段，近十年来已被广泛应用于天然成分的分离 纯化。由于不使用固体支撑介质，逆流色谱还有着许多传统的液相色谱分离手 段所没有的其它优点：c c c 在进行分离的过程中有着，睫大的灵活性，同一根螺 7 柚皮挥发性成分分析及其提取分离研究 旋管柱可以通过改变不同的溶剂体系来分离不同极性的化合物；对样品的前处 理没有太多的要求，不必担心粗样会污染和损坏分离柱；同一根c c c 柱可以用 于分析量级( 几毫克) 也可用于制备量级( 几十克) 的分离。与h p l c 相比，h s c c c 进样量较大，最多可达几克，是h p l c 的1 0 4 1 0 5 倍；而与常压和低压色谱相 比，h s c c c 的分离能力强，有的样品经过1 次分离就可以得到1 个甚至多个单 体，并且分离时间也较短，一般几个小时就可以完成1 次分离。 总的来说，与传统的液相色谱法相比较，h s c c c 分析方法避免了有效成分 被固相载体的不可逆吸附和峰形拖尾等缺点；且具有不使用固相载体，样品粗 提物可进样分离，分离纯化与制备可同步完成，有机溶剂消耗少，无损失、无 污染，具有分离效率高、样品回收率高、重现性好、适用范围广、快速和大制 备量分离等优点。由于h s c c c 的溶剂系统组成与配比可以是无限多的，理论 上，任何极性范围的样品都可用它得到分离；而且h s c c c 对样品的预处理要 求低，仅需简单的提取，甚至不用前处理都可达到很好的分离效果。 逆流色谱在天然活性成分中的应用几乎没有任何限制，几乎可以应用到各 级各类天然活性成分领域。由于有足够多的两相溶剂系统可以选择，从非水相 两相体系，到有机相一水相体系，再到双水相两相体系都可以应用，因而使该 项技术即可用于脂溶性样品的分离，也可用于中等极性、强极性甚至水溶性样 品的分离，应用范围非常广泛。同时，其洗脱方式灵活多样，可以以正相或反 相进行洗脱，也就是说流动相可以是上相或下相、有机相或水相。既可以使用 单一流动相，也可以依次使用不同的流动相，甚至可以使两相溶剂同时双向流 动，实现真正连续的逆流色谱过程。h s c c c 还可以实现多种形式的梯度洗脱过 程，如p h 梯度、极性梯度等；进样量可从毫克级到克级，进样体积可从几毫 升到几十毫升；既可用于天然产物粗提物的去除杂质，也可用于最后产物的精 制，甚至直接从未经任何处理的粗提物一步纯化到达纯品。 尽管逆流色谱具有许多其它色谱分离方法不可替代的优点。但是h s c c c 的理论体系尚未完善，逆流色谱技术发展到今天，它的更广泛的应用还受到一 些因素的制约。首先在溶剂体系的选择上还没有非常系统成熟的理论来指导。 一般依靠实验者的经验和混合分相试验来解决此问题，不仅耗时费力，而且很 难选择到最佳溶剂系统。具体选择一种可以达到理想分离效果的溶剂似系还需 8 北京工商大学硕士学位论文 要有相当的经验因素。 h s c c c 制备分离能力决定于仪器参数和溶剂体系的选择。仪器参数选择 特点有：( 1 ) 转速越高，越易产生乳化现象；( 2 ) 流速越大，固定相越易损失， 所需流动相量大大增加；( 3 ) 进样量太大，峰间距变窄，峰型变宽，至于同一 进样量，改变体积或浓度，分离情况相似。 两相溶剂系统选择应符合以下原则：( 1 ) 溶剂不造成样品的分解和变性； ( 2 ) 为保证固定相保留值合适，溶剂体系的分层时间小于3 0 s ；( 3 ) 目标样品 的分配系数( k ) 接近于1 ，容量因子( 口) 应大于1 5 。( 4 ) 上下两相体积大致 相等，以免浪费溶剂：( 5 ) 尽量采用挥发性溶剂，以方便后续处理，易于物质 纯化；( 6 ) 在大量级的分离中，一般能在固定相完全溶解样品的情况下获得最 好分离；( 7 ) 在分析中，最好用流动相溶解样品。经典的溶剂体系有正己烷一 水相甲醇体系、乙酸乙酯一正己烷一水相甲醇体系、卤代烃一水相甲醇体系、 水相正丁醇体系等俐，以下两种疏水性范围很宽的体系对很多样品都比较适 合：正己烷乙酸乙酯正丁醇甲醇水；氯仿甲醇水。对于未知样品混合物， i t o 认为一般先采用正己烷乙酸乙酯甲醇水( 1 ：1 ：1 ：1 ) 或氯仿甲醇水 ( 1 0 ：3 ：刀尝试，再根据目标组分的分配系数调整溶剂组成。如果需要疏水性 更强的体系，建议用乙醇代替甲醇；需要亲水性更强的体系，加入盐( 乙酸铵等) 或酸( 三氟乙酸或乙酸) 。还有人提出正丁醇乙酸乙酯水( 3 ：2 ：5 ) 适于分离极 性大的物质，而正庚醇乙酸乙酯甲醇水( 6 ：1 ：6 ：1 ) 适于弱极性和非极性体 系【纠。 佟晓杰【刎等和饶畅掣2 5 1 分别用正己烷一乙酸乙酯一乙醇一水( 6 ：3 ：2 ：5 ) 和正 己烷一乙酸乙酯一甲醇一水( 1 ：1 ：1 ：1 ) 体系从红豆杉的粗提物中分离纯化了紫 杉醇、三尖杉宁碱( c e p h a l o m a n n i n e ) 、巴卡亭( b a c c a t i n ) ；v a n h a e l e n 【2 6 】以石油醚 c o p 4 0 6 5 ) 一乙酸乙酯一甲醇一水( 5 0 ：7 0 ：舳：6 5 ) 为两相体系从紫杉醇的混合 物中分离得到了纯的紫杉醇和三尖杉宁碱( c e p h a l o m a n n i n e ) ；c a o 等【卅通过半 制备型h s c c c 应用正己烷一乙酸乙酯一甲醇一水( 1 ：1 ：1 ：1 ) 、( 3 ：3 ：2 ：3 ) 、 ( 4 ：4 ：3 ：4 ) 三种溶剂系统经过二次分离，从紫杉中分离出紫杉醇及其类似物； r c c i 伊i 西e s i 鹪等f 2 町以氯仿一甲醇一水r9 ：1 2 ：8 ) 从龙胆根的甲醇萃取物中分离得 到了1 个裂环烯醚萜苷，从h a l e n i ac a m p a n u l a t a 中分离得到了2 个裂环烯醚萜 9 柚皮挥发性成分分析及其提取分离研究 苷类；f u l l a s 等i 冽以氯仿一甲醇一水( 7 ：1 3 ：8 ) 从a b r u sf r u t i c u l o s u s 的叶中分离出 了4 个甜味三萜苷；d u 掣3 0 l 采用正己烷一乙酸乙酯一甲醇一水( 1 2 ：2 4 ：1 6 ：9 ) 体系从甜瓜提取物中分离了两种四环三萜类化合物葫芦素b 和葫芦素e ；o k a 掣3 1 】乙酸乙酯一正丁醇一水( 2 ：3 ：5 ) 体系从栀子中分离出京尼平苷、顺式藏 红花素以及反式藏红花素等栀子黄成分；d i a l l o 等 3 2 1 用氯仿一甲醇一异丁醇一水 ( 7 ：6 ：3 ：1 ) 的系统从积雪草的抽提物中分离了2 个结构非常相似的皂角苷，1 个是积雪草苷、1 个是m a d e c a s s o s i d e ，它们仅在同一支链上有所不同，前者是 h ，后者是o h ；余佳红掣3 3 1 从银杏叶中以氯仿一甲醇一水( 4 ：3 ：2 ) 系统分离制 各得到白果内酯；d u 等从穿心莲( a n d r o g r a p h i sp a n i c u l a t an e e