（预防兽医学专业论文）禽流感病毒型特异性单克隆抗体的制备及初步应用.pdf

摘要近年来，禽流感的暴发与流行给养禽业的发展和公共卫生安全造成了严重的危害。做好禽流感的诊断与监测显得尤为重要。禽流感病毒亚型众多且变异性强，给检测带来了很大困难。因此，本研究制备了一株针对禽流感病毒n p 蛋白的型特异性单克隆抗体，经过鉴定及初步应用，用该单抗初步建立了一种快速的针对禽流感抗原的胶体金试纸条检测方法，以期用于禽流感的监控。1 单抗的制备：蔗糖梯度离心纯化的h 9 n 2 亚型a i v 免疫小鼠。经p e g 法融合，用建立的间接e l i s a 方法筛选，三次克隆后得到一株分泌针对h 9 、h 7 、h 5 三种亚型禽流感病毒抗体的单克隆杂交瘤细胞株( a 1 2 8 4 ) ，三株仅分泌针对h 9 亚型流感病毒抗体的单克隆杂交瘤细胞株( g 4 a 3 、c 9 c 2 、g t a 9 ) 。2 单抗的鉴定：对四株单抗进行了亚类鉴定，仅对a 1 2 8 4 株进行了染色体、亲和力等其它特性的鉴定。a 1 2 8 4 株、g 4 a 3 株、g 7 a 9 株、c 9 c 2 株单克隆抗体亚类分别为i g m 、i g g l 、i g g l 、i g g 2 a ，轻链均为k 链。杂交瘤细胞a 1 2 8 4 染色体数目为9 8 条，其单抗针对h 9 、h 7 、h 5 三种亚型禽流感病毒的亲和常数k 分别为3 1 7 1 0 ”、3 1 7 1 0 ”、5 5 1 0 ”，上清及腹水的e l i s a效价分别为l ：1 0 4 、1 ：1 矿。免疫印迹分析表明，a 1 2 8 4 株单抗是针对禽流感n p 蛋白的型特异性单抗。3 单抗的初步应用：a 1 2 8 4 株腹水经优球蛋白沉淀法纯化后与胶体金标记，应用于胶体金试纸条检测试验，金标a 1 2 8 4 株单抗与h 9 、h 7 、h 5 三种亚型禽流感病毒反应结果呈阳性。通过制备和初步应用禽流感病毒n p 蛋白特异性单克隆抗体，为进一步临床应用打下基础，为禽流感乃至人禽流感的诊断提供一种有用试剂和快速、准确、实用的诊断方法。关键词：禽流感，n p ，单克隆抗体a b s t r a c to u t b r e a k sa n dp r e v a l e n c eo fa v i a ni n f l u e n z a , e s p e c i a l l yt h eh i g h l yp a t h o g e n i cf o r m ，c a l lb ed e v a s t a t i n gf o rt h ep o u l t r yi n d u s t r ya n dr e p r e s e n t i n gs e r i o u st h r e a t st oh u m a nh e a l t h s e r i e so fs u b t y p e sa n dr a p i dv a r i a t i o no fa i vr e s u l ti ng r e a td i f f i c u l t yi nd i a g n o s i s i nt h i ss m d 5ah y b f i d o m ac e l ll i n ew h i c hs e c r e t e dm o n o e l o n a la n t i b o d ya g a i n s tt y p e s p e c i f i ci n f l u e n z aan u c l e o p r o t e i n ( m c a ba n t i - n p )w a sp r e p a r e da n di d e n t i f i e d i ti ss u g g e s t e dt h a tt h em c a bh a st h ep o t e n t i a lt ob eu s e di nd e v e l o p i n gar a p i d ，e a s ya n da p p l i e di m m u n o - g o l df i l t r a t i o na s s a yf o rd e t e c t i o no fa n t i g e nt oa v i a ni n f l u e n z av i r u sf r o ma v i a ns p e c i e sa n de v e nf r o mh u m a n 1 p r e p a r a t i o no fm c a b s ：t h es p l e n o e y t eo fb a l b cm i c ei m m u n i z e dw i t ht h ep u r i f i e da v i a nh 9 n 2i n f l u e n z av i r u sw e r ef u s e dw i t hs p 2 0m y e l o m ac e l l s f o u rs t r a i nm c a b st oa v i a ni n f l u e n z aw e r ee s t a b l i s h e da f t e rs c r e e n i n gb yi n d i r e c te l i s aa n ds u b e l o n i n gb yl i m i t i n g d i l u t i o n ，w h i c hw e r en a m e da sa 1 2 8 4 ，g 4 a bc 9 c 2a n dg t a 9 ，r e s p e c t i v e l y a v i a nh 9 ，h 7 a n dh 5i n f l u e n z av i r u sc o n t a i n e dt h er e c o g n i z e de p i t o p e so ft h em c a ba 1 2 8 4 ，a n dt h ee p i t o p ed e f i n e db yt h eo t h e r sw a so n l yf o u n do na v i a nh 9i n f l u e n z av i r u s 2 fi d e n t i f i c a t i o no f m e a b s ：t h ei m m u n o g l o b u l i ns u b c l a s s e so f a j 2 8 4 c 9 c 2 。g 4 a 3a n dg 7 a 9w e r el g m ，l g g 2 a , i g g l ，a n di g g lr e s p e c t i v e l ya n dt h el i g h tc h a i n so f w h i c hw e r ea l lc a t e g o r i z e di n t oc h a i nk a l b 4m c a bh a d 9 8c h r o m o s o m e s i t sa f f i n i t yc o n s t a n t sa g a i n s ta v i a nh 9 h 7a n dh 5i n f l u e n z av i r u sw e r e31 7 x 1 0 1 0 ，3 1 7 x 1 0 o a n d5 5 x 1 0 1 0 ，r e s p e c t i v e l y t h e e l i s a t i t e r s o f c u l t u r es u p e r a t a n ta n d a s c i t i e sw e r e1 ：1 0 4a n d l ：1 0 5 1 1 1 er e s u l to f w e s t e r nb l o t t i n gr e v e a l e dt h a tt h em c a ba 1 2 8 4c o u l dr e a c tw i t ha v i a ni n f l u e n z av i r u sn u c l e o p r o t e i n ( n p ) 3 a p p l i c a t i o no fm e a b s ：t h ea s c i t e so fm c a ba 1 2 8 4w e r ep u r i f i e dw i t he u g l o b u l i np r e c i p i t a t i o n ，a n dt a g g e dw i t hc o l l o i d a lg o l d s ，t h e nt h ei m m u n o g o l df i l t r a t i o na s s a yw a sd e v e l o p e dt oe x a m i n ea v i a ni n f l u e n z av i r u s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep o s i t i v eo u t c o m ew a sg a i n e dw i t ha v i a nh 9 ，h 7 a n dh 5i n f l u e n z av i r u s t h ep r e p a r a t i o na n dp r e l i m i n a r ya p p l i c a t i o no ft h em c a ba n t i n pw i l lc o n t r i b u t et ot h ef a r t h e ri m p r o v e m e n to ft h ed e c t e c t i o no fa v i a ni n f l u e n z a sa n t i g e na n dt op r o v i d eau s e f u lt o o la n da s s a yf o rd i a g n o s i so f a l ，a n de v e no f h u m a n - a v i a ni n f l u e n z a k e yw o r d s ：a v i a ni n f l u e n z a , n u c l e o p r o t e i n ，m o n o c l o n a la n t i b o d yi l英文简称a g i da ia l vc e l i s ad f ad i g f ad m s od o t _ e l i s ae i ae l i s ag a lg l ug rh ah ih p a iluk dl 。v sm lm 2m a 砌( e rm c a bm gm l nm ln an i符号与缩略语( a b b r e v i a t i o n s )英文全称a g a rg e ll m m u n o d i f f u s i o na v i a ni n f l u e n z aa v i a ni n f l u e n z av i r u sc o m p e t i t i v ee l i s ad i r e c tf l u o r e s c e n ta m i b o d yd o ti m m u n o g o l df i l t r a t i o na s s a yd i m e t h y ls u l p h o x i d ed o te n z y m e - l i n k e dl m m u n o s o r b e n ta s s a y se n z y m ei m m u n o a s s a ye n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y sg r a mg a l a c t o s eg l u t a m i ca c i dg r a v i t yh e m a g g l u t i n i nh a e m a g g l u t i n a t i o ni n h i b i t i o nt e s t sh i g l l l yp a t h o g e n i ca v i a ni n f l u e n z ak i l o d a l t o nl y s i n em a t r i xp r o t e i nlm a t t i xp r o t e i n2m a r k e r sp r o t e i n sm o n o c l o n a la n t i b o d ym i l l i g r a mm i n u t em i l l i l i t e rn e u r a m i n i d a s en e u r a m i n i d a s ei r t h i b i t i o nv中文全称琼脂免疫扩散试验禽流行性感冒禽流感病毒竞争酶联免疫吸附试验直接免疫荧光斑点免疫渗滤试验二甲基亚砜斑点酶联免疫吸附试验酶免疫测定酶联免疫吸附试验克半乳糖谷氨酸重力血凝素血凝抑制试验高致病性禽流感国际单位千道尔顿赖氨酸基质蛋白1基质蛋白2标准蛋白单克隆抗体毫克分钟毫升神经氨酸酶神经氨酸酶抑制试验n pn s ln s 2o do i ep ap a g e1 ) b lp b 2r n pr p mr t p c rs d ss p f7 r m bww e s t e m b l o tw h 0d a bu jn a n o m e t e rn u c l e o p r o t e i nn o n s t u c l u r a lp r o t e i n1n o n s t u c t u r a lp r o t e i n2o p t i c a ld e n s i t yw o r l do r g a n i s a t i o nf o ra n i m a lh e a l t hp o l y m e r a s eap o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i sp o l y m e r a s eb 1p o l y m e r a s eb 2r e c o m b i n en pr o u n d sp e rm i n u t er e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o ns e c o n ds o d i u md o d e c y ls u l p h a t es p e c i f i cp a t h o g e nf r e e3 , 3 ，5 ，5 - t e t r a m e t h y lb e n z i d i n ew a l tw o r l dh e a l t ho r g a n i z a t i o n3 - 3 l d i a m i n o b e n z i d i n em i c r o l i t e rv i纳米核蛋白非结构蛋白l非结构蛋白2光密度值世界动物卫生组织聚合酶a聚丙烯酰胺凝胶电泳聚合酶b l聚合酶b 2重组核蛋白转每分反转录聚合酶链式反廊秒十二烷基磺酸钠无特定病原体3 , 3 5 ，5 - 四甲基联苯胺瓦特蛋白印迹世界卫生组织二硝基联苯胺微升独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名时间：珂年1 月汀日关于论文使用授权的说明本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究监轹莉帆坷钏月话日导师签名：洲色终时间：竹年，月珀第一章引言禽流感( a v i a i l i n f l u e n z a ，a i ) 是由正粘病毒科流感病毒属a 型流感病毒引起的禽类传染病f l j 。根据禽流感病毒致病性的不同，将禽流感病毒分为高致病性、低致病性和无致病性三种阱。世界动物卫生组织( w o r l do t g a n i z a t i o nf o ra n i m a lh e a l t h ，o i d 将高致病性禽流感 h i g h l yp a t h o g e n i ca v i a ni n f l u e n z a , h p a i ) 列静a 类传染病，我国将其列为一类动物疫病i ”。1 禽流感概述1 1 病原学流感病毒( i n f l u e n z a v i r u s ，i v ) 是单股负链r n a ( - s r n a ) 病毒。基因组分8 个节段，编码1 0 种蛋白质，分别为聚合酶b 1 ( p o l y m e r a s e b i ，p b l ) 、聚合酶b 2 ( p o l y m e r a s e b 2 ，p b 2 ) 、聚合酶a ( p o l y m e r a s ea 。p a ) 、血凝素( h e m a g g h t i n i n ，h a ，裂解为h a l 和h a 2 ) 、神经氨酸酶( n e u r a m i n i d a s e ，n a ) 、核蛋白( n u c l e o p r o t e i n ，n p ) 、基质蛋白1 ( m a t r i x p r o t e i nl ，m i ) 、基质蛋白2 ( m a t r i x p r o t e i n2 m 2 ) 、非结构蛋白l ( n o n s t u c t u r a lp r o t e i n l 。n s l ) 、非结构蛋白2 ( n o n s t u c t u r a lp r o t e i n2 ，n s 2 ) 。根据核蛋白和基质蛋白的抗原性不同将流感病毒分为a 、b 、c 三型，a 型流感j “泛存在于禽类、人类及其它动物，c 型流感存在于人类和猪，b 型流感仅存在于人类。禽流感病毒属于a 型流感病毒1 1 】；根据病毒粒子表面的血凝素和神经氨酸酶的糖蛋白，将a 型流感病毒又分为1 5 个h 亚型和9 个n 亚型p j 。在人类以前仅发现3 种h 抗原( h i 、h 2 、h 3 ) 和2 个n 抗原型( n i 、n 2 ) ，而所有h 亚型和n 型均可在禽流感病毒中找到。2 流感病毒遗传变异“在自然界中，不变的生物是不存在的。但像流感病毒这样变异频繁、幅度之大还是少有的。流感病毒变异是人们普遍关心和感兴趣的一个问题，因为它与流感疾病的发生和流行密切相关。流感病毒的变异主要有致病性变异、相变异和抗原性变异。致病性变异包括宿主适应性变异、冷适应变种和条件致病性变异。宿主适应性变异是指流感病毒在某一培养系统如鸡胚或小鼠中连续传代后，其繁殖滴度逐渐升高，致病性逐渐增强，但同时也伴随着对另一种宿主毒力的减弱。近来已发现，宿主选择也会导致流感病毒抗原性变异。a 型流感病毒一般不能在低温下( 2 5 ) 生长。但经逐步降低培育温度、连续传代获得的流感病；霉，其对人的致病性减弱，这种变异即冷适应变种。条件致病性变异是指病毒在某种条件f 不能繁殖，但在另一种条件下却能复制，这种变化是由于病毒粒基因发生了缺损。相变异是指原生相( o r i g i n a lp h a s e ) 或o 相与转生相( d e r i v a t i o np h a s e ) 或d 相之问的变异。原生相是指流感病毒只能在鸡胚羊膜腔中生长，感染的羊水只凝集人或豚鼠的红细胞，而几乎不凝集鸡的红细胞。转生相是指毒株在鸡胚适应传代后，获得了在鸡胚尿囊腔复制的能力，同时还获得了与凝集人及豚鼠一样好的凝集鸡红细胞的能力。这种相别的实际意义目前还不清楚，只是在血清学诊断时，挑选转生相毒株作为测定抗原较好，这样会提高诊断的灵敏度。抗原性变异主要是指a 型和b 型流感病毒表面h a 和n a 的抗原性变异，尤其h a ，因它所产生的抗体能中和病毒感染。病毒逃避宿主免疫系统的记忆识别所产生的抗原性变异与它的抗原特性和结构改变密切相关，一旦抗原性发生转变，常常引起世界性流感大流行。抗原性漂移( a n t i g e n t i cd r i f t ) 和抗原性转变( a n t i g e n t i cs h i f t ) 是流感病毒h a 和n a 变异的两种形式。抗原性漂移是所有流感病毒共有的。目前认为是由于编码h a 蛋白基因一系列点突变( p o i n t m u t a t i o n )的累积导致了氨基酸序列改变的累积，改变了h a 蛋白分子上的抗原位点。其次，由于序列出现丢失( d e l e t i o n ) 和插, k ( 1 n s e r t i o n ) ，但这种现象不多见。除此之外，还有分子内重组( i n t r a m o l e c u l a rr e c o m b i n a t i o n ) ，这在分节段的负链病毒中是罕见的。近来研究表明，流感病毒h a l 基因每年每个核苷酸变异的机率为3 1 0 4 1 0 一，而细胞染色体d n a 突变率仅为1 0 1 4 1 0 1 1 。其中，在编码h a l 基因区所发生的核苷酸替换中，约4 0 5 0 导致氨基酸序列的改变即编码突变，而病毒粒其它基因节段，甚至h a 2 基因，这种改变的机率大大低于h a l 区。抗原性转变是a 型流感病毒所特有的。关于它的机理有很多说法，以人流感病毒为例，其中自然选择学说和动物源学说较被人们所接受。自然选择学说认为流感病毒的变异是由人群免疫压力造成的，流感病毒的抗原性变异有一个从量变到质变的连续过程。动物源学说认为流感病毒大流行株的出现与动物流感病毒密切相关。但动物源学说又分成两种观点：直接导入和基因重配( g e n e t i cr e a s s o r t m e n t )学说。直接导入学说认为流感病毒大流行是动物流感病毒直接传人人群的。基因重配学说则认为流感病毒大流行株是人和动物流感病毒通过基因重配而来。猪因既能感染禽叉能感染人流感病海，因此人们认为人和禽流感病毒在猪重配后形成新亚型流感病毒，然后传到人。这种看法是否正确仍需得到事实来证实。此外，a 型流感病毒n a 蛋白也同样会发生漂移和转变。其它结构和非结构蛋白的基因，它们也能发生核苷酸序列的改变导致蛋白分子上氨基酸序列的替换，甚至也能发生相互间基因重配。但这些改变不是机体免疫压力所致，并在流行病学上没有明显的意义。然而，m 1 和n p 的基冈特性及其所编码的蛋白抗原性变异在流感病毒分型和种间突破上具有重要意义。1 3 流行病学禽流感病毒呈世界性分布，可感染几乎所有野生禽及家禽。人们认为禽是流感病毒基因天然的和巨大的贮存库，是a 型流感病毒新亚型起源的重要物质基础i s , 6 1 。近几年，禽流感正在全球不断爆发、流行面越来越广。不仅在亚洲和南、北美洲出现禽流感的报道，甚至在一些饲养条件非常严格的地区或地理条件非常封闭的地域也令人惊讶地爆发了禽流感。如在2 0 0 3 年2 月，在欧洲的荷兰爆发了高致病性禽流感，随之传播至相邻的比利时和德国。安第斯山脉和太平洋使智利与其它国家高度隔离，但也于2 0 0 3 年爆发了禽流感n 。随后，2 0 0 4年以来在东南甄，甚至前不久在俄罗斯也有a l 的暴发和流行的报道。2 0 0 5 年4 到6 月问，中国青海湖鸟岛爆发的h 5 n 1 导致大量迁徙鸟死亡口】，迁徙鸟在流感流行链条中扮演重要角色，进行全球流感监测非常重要h 。除此之外，h 9 n 2 亚型低致病性禽流感在世界许多国家及地区普遍流2中国农业大学硕士学位论文第一章引言行【”】。1 9 9 6 2 0 0 0 年间，我国h 9 n 2 亚型禽流感占感染鸡群的9 3 8 9 ，为影响我国养禽业的主要亚型l j “。在1 9 9 7 年的香港h s n i 事件发生中，h 9 n 2 病毒是除h 5 n 1 外自活鸡分离最多的一个亚型【1 2 】，但中国大陆流行的h 9 n 2 流感病毒与c k h k 1 5 6 9 7 ( h 5 n i ) 毒株内部基因的供体q a h k g 1 9 7 ( h 9 n 2 ) 有明显差异【l “，与韩国、巴基斯坦等地的h 9 n 2 分离株隶属于不同的进化分支，进一步表明h 9 n 2 亚型禽流感的发生与流行和地域分布有一定的相关性【j4 ” l q 。禽流感对家禽生产和国际贸易的严重影响导致全球对它的高度关注。但更重要的是，禽流感已经成为一个重要的公共卫生安全问题。1 9 9 7 年在香港【1 7 】、2 0 0 3 年在荷兰 ”1 、以及2 0 0 4 年1 、2 0 0 5 年在东南亚a l 都造成了人的感染死亡，其中涉及n - 种禽流感亚型( h 5 n 1 、h 7 n 7 、h 9 n 2 ) ，严重影响着公共卫生安全，因此防控禽流感成为全世界急待解决的问题。同时，由于禽流感病毒，。泛存在于各种野鸟，理论上讲从地球上消灭禽流感病毒几乎是不可能实现的目标，因此，控制禽流感也将是一项需要长期面对的任务 2 0 l 。2 禽流感病毒型特异性蛋白研究概况核蛋白( n p ) 和基质蛋白( m ) 是流感病毒型特异性蛋白，同型内各亚型间n p 和m 蛋白高度保守，可通过鉴定这两种蛋白确定流感病毒的分型。但由于同型流感病毒之间n p 和m 蛋白仍然存在抗原位点的差异，尤其n p 蛋白的这种差异又体现在宿主特异性上，因此可借助针对n p蛋自的单克隆抗体进一步鉴定流感病毒的种属特异性，如鉴定从人体内分离到的某一分离株是否是禽源。因此，核蛋白和基质蛋白及其单抗在禽流感乃至人禽流感的鉴别诊断中起着十分重要的作用。2 1 核蛋白( n p ) 研究概况2 1 1n p 蛋白基本生物学特点核蛋白是由流感病毒基因组片段5 编码的单体磷酸化多肽，分子量约6 0 k d ，它是构成病毒梭农壳的主要蛋白成分【1 l ，占病毒颗粒总蛋白的2 5 i “1 。在三种类型的流感病毒之间，n p 局部保守，在病毒进化过程中变异率很低，a 型流感病毒的n p 序列与b 型的有3 8 的同源性，与c型的有2 2 的同源性。核蛋白分子至少具有3 个独立的抗原位点，通过用单克隆和多克隆抗体进行研究，发现在所有被测a 型流感毒株中都有一个共同位点，针对这一位点的单抗可抑制病毒r n a 分子的体外转录。但n p 的单克隆抗体不能给动物提供被动保护，用提纯的核蛋白免疫动物，也只能产生很微弱的抗感染能力【l 】。另外，n p 还存在t c 细胞的识别表位【4 1 。2 12 n p 蛋白生物学功能n p 决定流感病毒的宿主特异性。s c h o l t i s e k 通过系统发生分析n p 基因结构表明，所有的哺，l 动物流感病毒都问接或直接源于a i v ，n p 结构变化在其宿主的变化中起了决定性作用口“。n p 对a i v 的复制及感染能力有影响，m a n d l e r 等通过对a i v 温度敏感变异株的研究证实了主里查些盔兰鎏圭兰皇鎏耋，。，。，。，。，量二茎，：耋。这- - a 2 3 。此外。m e d c a l f 等“1 、k o b a y a s h i 等p s i 、e l t o n 等的研究也在不同程度上证明了这一点。n p 能够刺激机体产生细胞免疫反应，从而起到交叉保护作用。v o e t e n 等2 ”、美国v i c a l 公司研究者口”、m a r g a r e tl i u l 2 ”、k o d i h a l l i 等【2 8 】分别从抗原加工递呈机理和交叉保护性的角度证实了这一点。2 2 基质蛋白( m ) 研究概况22 1m 蛋白基本生物学特点m 蛋自由病毒基因组片段7 编码，在病毒粒子总蛋白中含量最大，约占其总量的3 0 - 4 0 。流感病毒的基质蛋白有两种，即m 1 和m 2 。m 1 蛋白分子量约2 6 k d ，是维持病毒形态的主要结构蛋白，具有型特异性，是流感病毒分型的依据之一。m 1 单克隆抗体不能给动物提供被动保护。m 2 蛋白分子量约1 5 k d ，是一种跨膜蛋白，主要以四聚体形式存在于感染细胞的细胞膜上，另外，也是病毒囊膜上的蛋白组分之一。m 2 氨基酸序列很保守，同源性高达9 0 。针对m 2 氮举端的单克隆抗体可抑制病毒蚀斑的增大，起作用方式与抗神经氨酸酶抗体的作用方式相同”1 。2 2 2m 蛋白生物学功能流感病毒的m 1 具有多种功能，除维持病毒粒子的形态外，还能调节病毒转录酶的活性，此外，在于代病毒粒子装配方面也起着重要作用。流感病毒m 2 的主要作用是，在h a 合成过程中作为质子通道控甫0 高尔基体内的p h 值；在病毒脱壳时酸化病毒粒子的内部环境；另外，在病毒装配过程中也有作用l l 】。3 禽流感病毒型特异性单克隆抗体研究进展n p 和m 蛋白作为一种型特异性抗原，其蛋白本身及抗体在交叉保护免疫和禽流感人禽流感构鉴别诊断中的重要作用备受人们关注型特异性单克隆抗体的开发与应用己成为禽流感研究的热点之一，它主要被应用于各种e l i s a 方法和免疫荧光方法。1 9 8 5 年，英国的m e q u i l l i n 等制备了分别针对a 型流感病毒n p 或m 蛋白及b 型流感病毒n p 和h a 蛋白的单克隆抗体，并建立了区分a 、b 型流感病毒的免疫荧光方法口。1 9 8 9 年，芬兰的n i k k a d 等采用免疫荧光方法筛选杂交瘤细胞制备了区分a 型流感病毒和b 型流感病毒的单龟隆抗体，并应用该单克隆抗体建立了一次孵育时问分辨( t i m e r e s o l v e d ) 免疫荧光方法，该方法检测a 、b 型流感病毒仅需1 0 分钟 3 0 l 。1 9 8 9 年法国的c h o m e l 等利用针对a 或b 型流感病毒n p 蛋白的单克隆抗体建立了快速鉴别a 或b 型流感病毒的抗原捕获e l i s a 方法【3 1 】。1 9 9 0 年，i ) e b o e r 等以a i v n p 单克隆抗体建立的双抗体夹心阻断e l i s a ，检测人和马、鸡、猪、雪貂、鸭、鼠和海豹等动物血清中的a 1 v 抗体p “。1 9 9 5 年，丹麦的g l i k m a n n 等制各了四株针对a 型流感病毒n p 或m 蛋白的单克隆抗体，这些单抗无血凝抑制和病毒中和活性，应用这些单克隆抗4中国农业大学硕士学位论文第一章引言体建立了检测a 型流感病毒( h 1 n i 和h 3 n 2 株) 的抗原捕获e l i s a 方法p 。同年，g l i k m a n n等还制各了四株针对b 型流感病毒n p 蛋白的单克隆抗体，并应用这些单克隆抗体建立了检测b型流感病毒的抗原捕获e l i s a 方法p 4 】。1 9 9 8 年，s h a f e r 等利用杆状病毒中表达a i vn p 并制各了h i p 单克隆抗体，建立了竞争e l i s a ( c e l i s a ) ，检测各种禽血清，同时进行琼脂免疫扩散试验( a o i d ) 以作比较。结果显示，c e l i s a 是一种快速、特异、灵敏、经济，可进行大量禽流感【雠清样品检测分析的方法mj 。1 9 9 9 年，日本的n a k a g a w a 等使用流感病毒b n a g a s a k i 1 8 7 株制各了分别针对b 型流感病毒n p 蛋白、m 蛋白和h a 蛋白的单克隆抗体，并建立了b 型流感病毒的快速检测方法p “。2 0 0 1 年，v a r e c k o v a 等用两个针对a i v n p 保守位点的高亲和力单克隆抗体建立了单抗一步酶免疫捕捉法( e 1 a ) 和时间分辨荧光免疫测定法( t r f l a ) 用以检测临床感染动物的鼻咽冲洗物中a i v 抗原，两种方法均达到了较高的敏感性和特异性f 37 1 。2 0 0 4 年，日本的h a s e g a w a 等制各了针对a 或b 型流感病毒的单克隆抗体并应用这些单抗研制成功了侧向流动诊断试纸条( 1 a t e r a lf l o wt e s ts t r i pd e v i c e ) j 。国内禽流感单克隆抗体研究开展的较晚，且制各的单抗多针对血凝素。2 0 0 4 年，孔品等制各了针对h 5 亚型h a 蛋白的单抗及与h 5 和h 9 亚型禽流感病毒均反应的单抗 3 9 】。2 0 0 5 年，马秀丽等制各了两株针对n p 蛋白的单克隆抗体【”1 。2 0 0 4 年，王泽霖等建立了针对a 型流感病毒群特异性蛋白的单抗介导的斑点免疫金渗滤法( d o ti m m u n o g o l df i l t r a t i o na s s a y , d i g f a ) 快速检测禽流感病毒9 “。4 禽流感诊断方法研究进展禽流感诊断方法的研究、开发与应用越来越受到人们的关注。传统的诊断方法与近年来发展起来的分子生物学诊断方法以其不同的特点应用于科学研究和临床诊断。4 1 禽流感传统诊断方法禽流感常用的传统诊断方法主要有病毒分离、琼脂免疫扩散试验( a g l d ) 、血凝血凝抑制试验( h a h i ) 、酶联免疫吸附试验( e l i s a ) 、免疫荧光法( i f t ) 等。病毒分离是流感病毒最传统的诊断方法之一。它的一个最主要的优点是可以对病毒做进一步抗原特性分析和基因特性的研究，同时也可用于疫苗制备及药物敏感性试验，因此，仍然是实验窀常用诊断方法之一。但由于其过程周期长、涉及到动物实验、生物安全难于掌控等，使这种方法的应用具有定的局限性。琼脂免疫扩散试验是利用n p 或m 的抗原型特异性特点检测禽流感抗原或抗体。琼脂扩散试验目前主要以琼脂免疫双扩散方法为主，其操作简单，既可以定性也可以定量，但检测敏感性较低。1 9 7 0 年b e a r d 首先建立了用于a i v 检测的a g i d 方法。1 9 9 7 年，赵增连等采用在琼脂中加入3 p e g - - 6 0 0 0 的方法使a g i d 的敏感性加强【“。2 0 0 0 年，李海燕等用0 5 9 m l 的n p 4 0 处理病毒蛋白作为a g i d 试验用抗原，能检出a i 各亚型血清，并与新城疫( n d ) 、马立克病( m d ) 、传染性支气管炎( i b ) 等1 5 种其它禽类疫病的阳性血清没有交叉反应 4 ”。同年，邓国华等利用杆状病毒表达的禽流感病毒核蛋白建立了琼扩诊断方法，该抗原可以特异地定性检测出所有1 5个禽流感病毒亚型的抗血清，并与我国广泛流行的1 5 种禽类其它病原体的抗血清无交叉反应m 1 。血凝，血凝抑制试验是利用禽流感病毒血凝素蛋白凝集鸡红细胞的特性检测禽流感亚型特异性抗原或抗体。该方法同样具有易操作、可定性、定最的特点，但受到各亚型之间无交叉反应的限制。由于h i 试验的试验条件要求较低，它既是w h o 进行全球流感监测所采用的普及方法，也是目前国内养禽生产对禽流感感染和免疫的主要检测手段。目前，我国哈尔滨兽医研究所已经具有h 1 h 1 5 和n 1 n 9 的标准诊断及分型抗原和血清，并以此为基础建立了相应的h i 检测方法，具有较高的特异性和准确性”。酶联免疫吸附试验是将抗原或抗体吸附于固相载体，在载体上进行酶免疫反应，底物显色后用肉眼或分光光度计测定结果。具有敏感性高、一次性检测样本多、试验时间短、易操作等特点，因此该方法自问世以来就备受临床诊断的青睐。同时，将该方法与单克隆抗体相结合，更增强其特异性、均一性及可重复性。所以，诊断禽流感抗原的e l i s a 方法的研究和应用多集中于由禽流感病毒单克隆抗体介导的酶联免疫方法，n p 或m 蛋白的单克隆抗体在e l i s a 中的应用尤显突出。1 9 7 4 年，j e n n i n g s 等首先用e l i s a 方法对流感病毒免疫后抗体产生规律进行检测。之后，e l i s a 诊断方法的研究在国内外发展很快，主要集中在诊断试剂、诊断介质的改进和诊断时间的缩短上。在诊断试剂的改进上，经历了由全病毒到纯化的病毒蛋白到纯化的表达蛋白的过程，经历了从多克隆血清到单克隆抗体的过程。1 9 8 0 年，m a s i h i 等使用纯化的核蛋白建立了检测流感病毒型特异性抗体的e l i s a 方法，作者认为e l i s a 比间接免疫荧光和补体结合试验更敏感1 4 。1 9 9 8 年，e m z h o u 等利用秆状病毒为载体表达的核蛋白建立了竞争酶联免疫吸附试验( c o m p e t i t i v ee 1 。i s a ，c e l i s a ) 方法检测流感病毒抗体，随后s h a f e r a l 等将该方法改进通过对1 6 5 1 份a g i d a i v刚性血清检测，结果表明该方法同a g i d 结果一致性很高，并且特异性更强，敏感性更高”j 。目前国外c e l i s a 方法已经成为成熟的诊断方法应用于生产中的a 1 v 抗体检测。2 0 0 0 年，李海燕等使用杆状病毒表达n p 蛋白做为包被抗原建立了禽流感间接( 重组核蛋白) e l i s a 诊断技术( r n p e l i s a ) ，对3 1 3 8 份鸡血清进行了检测，证明r n p - e l i s a 与全病毒间接e l i s a 、a g i d 以及h l 的符合率分别为9 9 9 、9 7 1 、9 8 8 并且能够1 0 0 检出a g i d 阳性以及h i 疑似阳性的样品，其灵敏性更高，可以在微克水平检出禽流感病毒的抗体1 4 9 , 5 0 1 。1 9 8 9 年法国的c h o m e l 等利用针对a 或b 型流感病毒n p 蛋白的单克隆抗体建立了快速鉴别a 或b 型流感病毒的抗原捕获e l i s a 方法，该方法的鉴定时问为3 h p “。1 9 9 0 年，丹麦的h o m s l e t h 等对抗原捕获e l i s a ( 兔抗a 型流感病毒l g g 作为捕获抗体，抗a 型流感病毒n p 蛋白单克隆抗体作为检测抗体) 和病毒分离方法进行了比较，结果表明抗原捕获e l i s a 敏感度8 8 ，特异性1 0 0 阳性符合率1 0 0 ，阴性符合率9 6 。对组织培养物中h 3 n 2 和h 1 n i 毒抹的最小检出量为1 2 n g i ”j 。1 9 9 5 年，丹麦的g l i k m a r m 等制备了四株针对a 型流感病毒n p 或m 蛋白的单克隆抗体并利用这些单克隆抗体建立了检测a 型流感病毒( h i n i 和h 3 n 2 株) 的抗原捕获e l l s a 方法，与常规病毒分离相比该方法灵敏度1 0 0 ，特异性9 8 3 p “。在诊断介质的改进上，1 9 9 2 年，法国的d u v e d i e 等报导了检测a 型流感病毒的膜免疫渗滤试验，其作用时间3 0 分钟，与病毒分离培养相比灵敏度7 1 ，特异性1 0 0 i s 3 1 。国外基于这种方6中国农业大学硕士学位论文第一章1 引言法的试纸条已经上市，其检测时间为1 5 2 0 分钟，现己在医学临床得到应用p 4 ，”5 “。1 9 9 3 年，s h o d i h a l l 等用硝酸纤维素纸膜或硝酸纤维素膜代替微量反应板建立了双抗体夹心e l i s a 方法，大大缩短了诊断时间，并且具有较高的特异性和灵敏性，结果判定不需要特殊仪器，可用肉眼直接判定1 57 i 。1 9 9 9 年，李海燕等建立了d o t - e l i s a 诊断技术，既可用于禽流感抗体的早期检测，也可用于抗体的监测，感染3 4 天即可检测到抗体，检测期达1 1 4 天，其结果易于判定，适用于现场监测及流行病学调查p 。2 0 0 4 年，日本的h a s e g a w a 等制备了针对a 或b 型流感病毒的单克隆抗体并应用这些单抗研制成功了侧向流动诊断试纸条，1 5 分钟以内可以检测鼻、咽拭子中的a 或b 型流感病毒l ”l 。2 0 0 4 年，国内研制成功了h 5 亚型抗原捕获e l i s a 方法【6 ，针对a 型流感病毒群特异性蛋白的单抗介导的斑点免疫金渗滤法( d o t i m m u n o g o l d f i l t r a t i o na s s a y , d i g f a )快速检测禽流感病毒j ，针对h 5h a 蛋白为基础的用于禽流感h 5 距型诊断的胶体金免疫层析方法1 6 2 】。随着诊断试剂和诊断介质的改善，禽流感诊断时间也得到了很大程度上的缩短。免疫荧光试验是将抗原、抗体结合特性与荧光素标记技术相结合的诊断方法。因此，禽流感病毒单克隆抗体也在这里得到了充分的应用。1 9 8 5 年，英国的m c q u i l l i n 等制备y 针对a 型流感病毒h i p 和m 蛋白及b 型流感病毒n p 和h a 蛋白的单克隆抗体并建立了区分a 、b 型流感病毒的免疫荧光方法【6 ”。1 9 8 9 年，芬兰的n i k k a r i 应用单克隆抗体建立了一次孵育时间分辩免疫荧光方法，该方法检测a 、b 型流感病毒仅需l o 分钟j 。1 9 9 4 年，斯洛伐克的v a r e k o v f i 等制备了四株针对a 型流感病毒的单克隆抗体并采用其中的两株建立了检测a 型流感病毒的时间分辩免疫荧光方法1 6 5 】。在美国，1 9 9 4 年基于直接免疫荧光( d i r e c tf l u o r e s c e n ta n t i b o d y , d f a ) 和酶免疫测定( e n z y m ei m m u n o a s s a y , e i a ) 方法的试剂成熟上市，s t e e d 等对这两种方法和病毒分离进行了比较，病毒分离敏感性9 3 、e i a 6 7 、d f a 4 7 ，病毒分离特异性1 0 0 、e i a 9 8 、d f a 9 9 ，作者认为快速e