实验一 血涂片的制备(1).doc

实验二、血涂片的制备和血细胞的观察目的要求1.掌握血涂片的的制备方法2.认识红细胞及各种白细胞的典型形态基本原理涂片技术是制备血液样品最常用的技术。将血液样品制成单层细胞的涂片标本，染色后可对血液中各种细胞形态进行形态观察、细胞计数、细胞大小测量等工作。实验用品1.器材：医用一次性采血针、酒精棉球、镊子、经脱脂洗净的载玻片；2.试剂：Wrights染液：Wrights色素粉末0.1g，溶于60 ml甲醇。 方法与步骤1采血 采血前用70酒精棉球消毒人的指腹或耳垂，干后用采血针刺破指腹或耳垂的皮肤；动物采血时先将耳部剪毛，酒精消毒后，刺破动物耳部皮肤，挤去第一滴血不要（因含单核白细胞较多）。2涂片 挤出第二滴血置于载玻片的一端，再取另一张边缘光滑的载玻片，斜置于血滴的前缘，先向后稍移动轻轻触及血滴，使血液沿玻片端展开成线状，两玻片的角度以45为宜（角度过大血膜较厚，角度小则血膜薄），轻轻将载玻片向前推进，即涂成血液薄膜（图2-2）。推进时速度要一致，否则血膜成波浪形，厚薄不匀，初学者可把玻片放在桌上操作。3染色 待涂片在空气中完全干燥后，滴加数滴Wrights染液盖满血膜为止，染色13 min。然后滴加等量的缓冲液（pH6.4）或蒸馏水，使其与染液均匀混合，静置25 min。用蒸馏水冲去染液，吸水纸吸干。4镜检 显微镜观察可见人红细胞为凹圆盘形，无核，淡红色，缘部分染色较深，中心较浅，直径7-8微米。白细胞数目少，为圆形。颗粒白细胞（1）嗜中性颗粒白细胞：体积略大于红细胞，细胞核被染成紫色分叶状，可分1-5叶，直径10-12微米；（2）嗜酸性颗粒白细胞：略大于嗜中性白细胞，细胞核染成紫色，通常为2叶，胞质充满嗜酸性大圆颗粒，被染成鲜红色，直径10-15微米；（3）嗜碱性颗粒白细胞：体积略小于嗜酸性白细胞，细胞质中有大小不等被染成紫色的颗粒，颗粒数目较嗜酸性白细胞的颗粒少，核1-2叶，染成淡蓝色，直径10-11微米。无颗粒白细胞（1）淋巴细胞：可观察到中、小型两种。小淋巴细胞与红细胞大小相似，圆形，核致密，染成深紫色。周围仅一薄层嗜碱性染成淡蓝的细胞质。中淋巴细胞较大，核圆形。直径6-8微米。（2）单核细胞：体积最大，细胞圆形。胞质染成灰蓝色。核呈肾形或马蹄形，染色略浅于淋巴细胞的核。直径14-20微米。 血小板为不规则小体，直径2 - 3微米。其周围部分浅蓝色，中央有细小的紫红色颗粒，聚集成群。 实验报告内容绘制人血涂片镜下图血涂片是通过特定的方法将血液按一定方向均匀涂开的过程，微观上使细胞是由球形变为平面形或近平面形平铺在载玻片上。血涂片的显微镜检查是血液细胞形态学检查的基本步骤，特别是对于各种血液病的诊断和鉴别诊断，具有重要价值。 血涂片制备是否合格、染色的好坏直接关系到检验结果的质量。 （一）血涂片制备1. 载玻片的准备 新载玻片常带有游离碱质，须用浓度为 lmol/L 的HCl浸泡24h，再用清水彻底冲洗，干燥后备用。旧载玻片要用含洗涤剂的清水中煮沸20min，洗掉血膜，再用清水反复冲洗，最后用0.95L/L乙醇浸泡1h，干燥备用。使用载玻片时，不要用手触及玻片表面，保持玻片清洁、干燥、中性、无油腻。2.血涂片制作方法 取血液标本一滴置载玻片的一端，以边缘平滑的推片一端，从血滴前沿方向接触血液，使血液沿推片散开，推片与载玻片保持 3045 度夹角，平稳地向前推动，血液即在载玻片上形成薄层血膜(图11)。图 21 血涂片的制作步骤示意图涂片的厚薄与血滴大小、推片与载玻片之间的角度、推片时的速度及血细胞比容有关。血滴大、角度大、速度快则血膜越厚；反之则血膜越薄。一张良好的血涂片，要求厚薄适宜，头体尾明显，细胞分布均匀，血膜边缘整齐并留有的空隙。下面是几种血涂片效果模式图及形成原因 (图l2) 。图 22 几种血涂片效果比较（二）血涂片染色染色的目的是使细胞的主要结构，如细胞膜、细胞质、细胞核等染上不同的颜色，以便于镜下观察识别。血涂片染色包括两个过程：固定和染色。固定是将细胞蛋白质和多糖等成分迅速交联凝固，以保持细胞原有形态结构不发生变化。常用的染色方法有瑞特染色法 (Wright)、姬姆萨染色法(Giemsa)等。1.瑞特（Wright）染色法本法的特点是将固定和染色合并在一起进行，手续简便，染色时间短，对白细胞特异性颗粒着色较好，但对核的着色略差。（1）瑞特染料由酸性染料伊红和碱性染料美蓝组成的复合染料。伊红为钠盐，有色部分为阴离子。美蓝为氯盐，有色部分为阳离子。美蓝和伊红的水溶液混合后，产生一种不溶于水的伊红化美蓝 (ME)中性沉淀，即瑞特染料，溶解于甲醇中，即成为瑞氏染液。甲醇的作用一方面使ME溶解，并解离为M 和E ，两种有色离子可以选择性地与细胞内不同成分结合。另一方面因其具有强大的脱水作用，可将细胞瞬间固定，蛋白质被沉淀为颗粒状或者网状结构，表面积增加，提高对染料的吸附作用，增强染色效果。（2）缓冲液pH6.46.8的磷酸盐缓冲液，其作用是使染色环境维持在弱酸性，达到最佳的染色效果。（3）细胞的着色原理 细胞的着色既有化学的亲合作用，又有物理的吸附作用。不同的细胞由于其所含化学成分不一样，化学性质各不相同，所以对染料的亲合力也不一样。细胞中的碱性物质与酸性染料伊红结合染成红色，因此，该物质又称为嗜酸性物质。如红细胞中的血红蛋白及嗜酸粒细胞中的嗜酸性颗粒等与伊红结合。细胞中的酸性物质可与碱性染料美蓝结合而染成蓝紫色，该物质又称嗜碱性物质。如淋巴细胞胞质及嗜碱粒细胞的颗粒为酸性物质，与碱性染料美蓝结合。中性颗粒呈等电状态与伊红美蓝均可结合，染淡紫红色为中性物质。另外细胞核蛋白主要由脱氧核糖核酸和强碱性的组蛋白等组成，与酸性伊红结合染成红色，但因核蛋白中还含有少量的弱酸性物质，与碱性美蓝作用染成蓝色，因含量太少，蓝色反应极弱，故也被染成紫红色。原始红细胞和早幼红细胞的胞质含有较多的酸性物质，与美蓝亲合力强，故染成较浓厚的蓝色；随着细胞的发育，晚幼红细胞阶段既含有酸性物质，又含有碱性物质（ Hb），既能与碱性染料美蓝结合，又能与酸性染料伊红结合，故染成红蓝色或灰红色；当红细胞完全成熟，酸性物质彻底消失后，只与伊红结合，则染成粉红色。图 23 瑞特染色原理示意图（ 4）pH对细胞染色的影响细胞着色对氢离子浓度十分敏感。细胞各种成分均由蛋白质构成，由于蛋白质是两性电解质，所带电荷的正负数量随溶液 pH值而定。对某一蛋白质而言，如果环境的pH小于其等电点（PI），则该蛋白质带正电荷即在酸性环境中正电荷增多，易与酸性伊红结合，染色偏红；相反，当环境的pH大于PI即在碱性环境中负电荷增多，则易与美蓝结合染色偏蓝。因此，要使用清洁中性的载玻片、优质的甲醇做溶剂和用缓冲液(pH6468)来调节染色时的pH值，达到满意的染色效果。（ 5）染色效果分析正常情况：血膜外观呈淡粉红色或琥珀色。显微镜下，成熟红细胞呈粉红色。白细胞胞质中颗粒清楚，并显示出各种细胞特有的色彩，细胞核染紫红色，核染色质结构清楚。染色偏酸：红细胞和嗜酸粒细胞颗粒偏红，白细胞核呈淡蓝色或不着色。染色偏碱：所有细胞呈灰蓝色，颗粒深暗；嗜酸粒细胞可染成暗褐色，甚至紫黑色或蓝色；中性颗粒偏粗，染成紫黑色。（三）血涂片染色的质量控制1载玻片必须非常洁净，中性，无油脂。不清洁或非中性的载玻片会造成细胞特别是红细胞形态发生改变，导致假性的异常形态红细胞出现。非中性的载玻片还会影响染色环境的pH值，带油脂的载玻片会使细胞分布不均匀。2良好血涂片的“标准”。血膜由厚到薄逐渐过度，血膜的体尾交界部位红细胞分布均匀，既不重叠又互相紧靠相连。3. EDTA抗凝血液制备血涂片。由于EDTA能阻止血小板聚集，如需在显微镜下观察血小板形态时可采用，但EDTA抗凝血有时能引起红细胞皱缩和白细胞聚集，所以应根据情况恰当选择。4. 白细胞较低和需浓缩白细胞的标本处理。为获得较多白细胞，可将抗凝血适当离心，使密度相同细胞集中并分层，然后取红细胞层上薄的灰白色层（有核细胞和血小板较集中)涂片、染色。该方法非常适合于白细胞减低患者的白细胞分类计数及红斑狼疮细胞检查。5. 血细胞比容与涂片关系。血细胞比容高于正常时，红细胞较多，血液粘度较高，用较小的角度涂片，可获得满意的血膜。相反，血细胞比容低于正常时，血液粘度较低，需用较大角度涂片。6.新配制的瑞氏染液处置。新配制的瑞氏染液包括瑞姬染液，pH偏碱，染色效果不太理想，需在室温放置一段时间，其中美蓝逐渐转变为天青B。在密封条件下，贮存时间愈久，转化的天青B愈多，染色效果愈好。7.染色过深、过浅的处理。染色过深、过浅与血涂片中细胞数量、血膜厚度、染色时间、染液浓度、pH值密切相关。对于重要的标本可采用先试染的方法，根据试染效果调节第二次染色方式。纠正染色过深可缩短染色时间或稀释染液。纠正染色过浅可延长染色时间。如果标本片有限出现了染色过深、过浅的情况，可用如下办法挽救：染色过深可加少量缓冲液覆盖血膜部分褪色，在显微镜下观察褪色情况及时终止。染色过浅可重加染色液和缓冲液复染，也要在显微镜下观察及时终止。瑞氏染液英文拼写 Wrights stain 是由酸性染料伊红和碱性染料美蓝组成的复合染料，溶于甲醇 。后解离为带正电的美蓝和带负电的伊红离子。使用方法瑞氏（Wrights staim；美蓝伊红）染色： 1瑞氏染料是由碱性染料美蓝（Methvlem blue）和酸性染料黄色伊红（Eostm Y）合称伊红美蓝染料即瑞氏（美蓝伊红）染料。 2用甲醇作瑞氏染料溶剂，即成瑞氏染液。甲醇是瑞氏染料良好溶剂，有两种作用： （1）甲醇使瑞氏染料中美蓝（M）与伊红（E）在溶液中离解，可使细胞成分选择性吸附其中的有色物质而着色。 甲 醇 ME（瑞氏染料）-M+ + E- 在配制的瑞氏染液中美蓝如放置过久即可氧化而含有天青，美蓝天青与伊红化合物能使核染成紫红色，但不能使胞浆染为蓝色，多余美蓝就可以使胞浆染成蓝色，染色主要是化学作用，是离子彼此结合的反应。 （2）甲醇具有强大的脱水力，可将细胞固定在一定形态及增加细胞结构的表面积，提高细胞对染料吸收作用，同时由于甲醇吸附染色液中的水，使染色液升温，加速染色反应。 染液配制(1) 瑞氏染液配制： 瑞氏染料 830gm或1g 甲醇（AR） 500ml或600ml 先称干燥（事先放入温箱干燥过夜）瑞氏染料放置乳钵内，用乳棒轻轻敲碎染料成粉末，再行研磨至听不到研芝麻声即呈细粉末，加少许甘油或甲醇溶解研磨，使染料在乳缸内显“一面镜”光泽，而无染料粉粒沉着。 再加较多量甲醇研磨呈一面镜光亮，静置片刻，将上层液体倒入一清洁储存瓶内（最好用甲醇空瓶），再加甲醇研磨，重复数次，至乳钵内染料及甲醇用完为止，摇匀，密封瓶口。 存室温暗处，储存愈久，则染料溶解、分解就越好，一般储存3个月以上为佳。 (2) 缓冲液： 缓冲液作用： 染色对氢离子浓度是十分敏感的，据观察pH值的改变，可使蛋白质与染料形成的化合物重新离解。 缓冲液须保持一定的pH使染色稳定，PBS的pH 一般在6.46.8， 偏碱性染料可与缓冲液中酸基起中和作用，偏酸性染料则与缓冲液中的碱基起中和作用，使pH恒定。 缓冲液配制（pH6.46.8，弱酸性）： 配方1 ： 配方2： 1% KH2PO4 30ml M/15 KH2PO4 73.5 ml 1% Na2HPO4 20ml M/15 Na2HPO4 26.5ml H2O(新鲜) 加至1000ml 置室温黑暗处，瓶口密封，防止霉菌污染，如有污染则应报废。 染液鉴定瑞氏或姬姆萨染色液鉴定：刚配好或放置一个月以上的染液可进行下列鉴定： 1取1滴染液于乳白玻板上，自行迅速扩散开，其颜色变紫红色，且有伪足形成。 2取1滴染液加1滴缓冲液，染液由深蓝色立即变为紫红色