（化学工艺专业论文）生物酶法制备黄粉虫抗菌肽的研究.pdf

一一删煳 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相 关知识产权属广西大学所有。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究 成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮 助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名： 谚扬冯 3 口9 年乡月衫日 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容； 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本； 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论衷的部分或全部内容。 请选择发布时间： 囹即时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) ：锄嗽武舢降胁日 生物酶法制备黄粉虫抗菌肽的研究 摘要 抗菌肽是一类分子量小、抗菌谱广、热稳定性好以及抗耐药性强的化 合物。目前主要从昆虫体内提取获得，但是得率低，没有应用价值。以昆 虫食品蛋白为原料，生物酶法制备抗菌肽是一种非常有效的方法。本文对 生物酶法制备黄粉虫抗菌肽进行了研究。 对比盐提法和碱提法提取黄粉虫蛋白的优劣，从蛋白质纯度、组成以 及结构分析入手，选择碱提法为黄粉虫蛋白的提取方法。碱提法最适提取 条件为：n a o h 浓度0 3 ，固液比1 ：2 0 ，温度4 0 ，时间2h ，可获得纯度 8 8 5 、得率为2 5 4 的黄粉虫蛋白质，s d s p a g e 电泳表征表明该蛋白组成 和脱脂蛋白相近。 以抑菌活性为指标，使用胰蛋白酶等八种酶进行水解试验，确定胰蛋 白酶为最佳用酶，其抑菌圈为1 4 6 2m m ，水解度为5 5 1 1 ；水解产物的 s d s p a g e 表征和扫描电镜分析表明黄粉虫蛋白大部分已经水解。在单因素 试验的基础上采用三因素三水平五个中心点的响应曲面方法对底物浓度 x l 、酶添加量x 2 以及酶解时间x 3 进行优化，回归模型为 y = 1 5 0 + 1 8 3 x 1 + 0 1 8 x 2 + 0 4 0 x 3 + 0 0 1 5x 1x 2 + 0 0 9 5x lx 3 + 0 1 4x 2 x 3 - 0 5 3 x l z + o 0 3 6 x 2 2 + o 1 l x 3 2 ，r 2 = o 9 9 6 7 。验证试验显示建立的回归模型准确可靠， 最优条件下抑茵圈直径为1 6 5 4m i l l 。酶解物s e c h p l c 分析表明分子量小于 3 0 0 0d a 和1 0 0 0d a 分别占9 9 2 0 和8 8 4 9 ，平均分子量为4 8 6 d a 。 使用截留分子量为1 0l a 和1k d a 超滤膜对水解产物进行超滤分离，获 得分子量小于1k d a 的抗菌肽粗品。然后使用s p s e p h a r o s ef f j i t 离子交换层 析对抗菌肽粗品进行分离纯化，获得一个活性锋，抑菌圈为2 1 8 8m m 。黄 粉虫抗菌肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓 度( m i c ) 分别为5 0l ag m l 一、1 0 0 l ag - m l 、1 0 0l ag m l 一。当浓度为1 2 0 i xg m l 。1 时，培养液( 初始菌落总数为1 1 0 6 c f u m l j ) 培养2 4h 后，大肠杆 菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌菌落总数均小于1 0 0c f u m l 。黄粉虫 抗菌肽具有良好的热稳定性，1 2 1 加热2 0m i n 后，对大肠杆菌、金黄色葡 萄球菌以及枯草芽孢杆菌的抑菌活性不变。黄粉虫抗菌肽p h 6 o 以下抑菌效 果优于中性和碱性条件。s e c h p l c 分析显示黄粉虫抗菌肽分子量小于10 0 0 d a 矛i 1 5 0 0d a 的多肽分别占9 9 6 2 和8 3 4 7 ，平均分子量为3 5 5 0d a 。 关键词：抗菌肽黄粉虫酶解抑菌活性蛋白酶 i i s t u d yo nt e n e b r i om o l i t o ra n t i b a c t e r i a lp e p t i d e s b yb i o e n z y m a t i ch y d r o l y s i s a bs t r a c t a n t i b a c t e r i a lp e p t i d e sa r eac l a s so fc o m p o u n dw h i c hh a sl o wm o l e c u l a r w e i g h t ，w i d e a n t i m i c r o b i a l s p e c t r u m ，s t a b l et h e r m o d y n a m i c s a n ds t r o n g a n t i - d r u gr e s i s t a n c e t h e yw e r em a i n l ye x t r a c t e df r o mi n s e c tb o d ya tt h ep a s t ， a n dt h ey i e l d sw e r et o ol o wt oa p p l yt ot h ea c t u a l e n z y m a t i cs y n t h e s i so f p e p t i d e si sap r a c t i c a la p p r o a c hw i t ht h ei n s e c ta n df o o dp r o t e i na sr a w m a t e r i a l s t h et e n e b r i om o l i t o ra n t i b a c t e r i a l p e p t i d e sw e r ep r e p a r e db yb i o e n z y m a t i c h y d r o l y s i si nt h i sa r t i c l e t h es a l ta n da l k a l ie x t r a c t i o no ft h et e n e b r i om o l i t o rp r o t e i nw e r ec o m p a r e d t h r o u g hp r o t e i np u r i t y , c o m p o s i t i o na n ds t r u c t u r ea n a l y s i s ，t h ef i n a lc h o i c ew a s a l k a l ie x t r a c t i o n t h eo p t i m a lt e c h n o l o g yo fa l k a l ie x t r a c t i o nw a s ：n a o h c o n c e n t r a t i o nw a so 3 ，s o l i d l i q u i dr a t i ow a s1 ：2 0 ，t e m p e r a t u r ew a s4 0 ， t i m ew a s2h u n d e rt h i sc o n d i t i o n ，t h ep u r i t ya n dy e i l do ft e n e b r i om o l i t o r p r o t e i nw a s8 8 5 a n d2 5 4 r e s p e c t i v e l y s d s - p a g ec h a r a c t e r i z a t i o ns h o w e d t h a tt h ec o m p o s i t i o no ft h ep r o t e i nw a sv e r yc l o s ew i t hd e f a t t e dp r o t e i n t h eb e s te n z y m ew a st y p s i nw h i c hc h o s e nf r o me i g h td i f f e r e n tp r o t e a s e sb y a n t i b a c t e r i a la c t i v i t ya sa ni n d e x ，a n t i b a c t e r i a lc i r c l eo ft h eh y d r o l y s a t e sw a s l4 6 2m n la n dd hw a s5 5 11 ；s d s - p a g ec h a r a c t e r i z a t i o na n ds e m a n a l y s e s r e v e a l e dt h a tt e n e b r i om o l i t o rp r o t e i n sh a db e e nh y d r o l y z e d at h r e ef a c t o r s i i i t h r e el e v e l sa n df i v ep o i n t so fr e s p o n s es u r f a c ee x p e r i m e n tw h i c hb a s e do nt h e s i n g l ef a c t o rt e s tf o rs u b s t r a t er a t i ox l ，e n z y m e s c o n t e n tx 2a n dh y d r o l y z et i m e x 3w a sd o n e t h er e g r e s s i v em o d e lw a sy _ 1 5 0 + 1 8 3 x l + 0 1 8 x 2 + 0 4 0 x 3 + 0 0 1 5 x lx 2 + o 0 9 5x lx 3 + o 14x 2 x 3 0 5 3x 1 2 + o 0 36 x 2 2 + 0 1 lx 3 2 ，r 2 = o 9 9 6 7 t h e a n t i b a c t e r i a lc i r c l eo ft h eh y d r o l y s a t e sw a s16 5 4m l nu n d e rt h eo p t i m a l c o n d i t i o n s t h es e c - h p l ca n a l y s i ss h o w e dt h a tt h em o l e c u l a rw e i g h to ft h e h y d r o l y s a t e su n d e r3 0 0 0d aa n d10 0 0d aw a s9 9 2 0 a n d8 8 4 9 r e s p e c t i v e l y , t h ea v e r a g ew a s4 8 6 5d a o n ec r u d ea n t i b a c t e r i a lp e p t i d ef r a c t i o nw h i c hm o l e c u l a rw e i g h tl e s st h a n1 k d aw a si s o l a t e df r o mt h eh y d r o l y s a t e sb yu l t r a f i l t r a t i o n t h e nav e r ys t r o n g a n t i b a c t e r i a la c t i v i t ye l u t e dp e a kw h o s ea n t i b a c t e r i a lc i r c l er e a c h21 8 8l r l l t lw a s g a i n e d f r o m s p - s e p h a r o s ef fc a t i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y o fc r u d e a n t i b a c t e r i a lp e p t i d e s t h em i n i n a li n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n ( m i c ) o ft h e t e n e b r i om o l i t o ra n t i b a c t e r i a l p e p t i d e s f o re s c h e r i c h i ac o l i ，s t a p h y l o c o c c u s a u r e u sa n db a c i l l u ss u b t i l i sw e r e5 0ug m l 一，10 0pg m l 一，10 0pg m l 1 r e s p e c t i v e l y w h e nt h ec o n c e n t r a t i o nw a s12 0 ug m l ，t h ea e r o b i cb a c t e r i a l c o u n to ft h ec u l t u r em e d i u m ( t h ec o u n tw a s1 10 6c f u m l 1a tt h eb e g i n n i n g ) w a sl e s st h a n10 0c f u m l f o re s c h e r i c h i ac o l i ，s t a p h y l o c o c c u sa u r e u sa n d b a c i l l u ss u b t i l i sa f t e rc u l t i v a t e d2 4h t h et h e r m a ls t a b i l i t ye x p e r i m e n t ss h o w e d t h a tt h et e n e b r i om o l i t o ra n t i b a c t e t r i a lp e p t i d e sh a dag o o dt h e r m a ls t a b i l i t y , t h e a n t i b a c t e r i a la c t i v i t yt ot h et h r e eb a c t e r i a sw a su n c h a n g e da f t e r121 h e a t2 0 m i n t h ea n t i b a c t e r i a le f f e c to ft h ea n t i b a c t e r i a lp e p t i d e sb e l o wt h ep h 6 0w a s i v s u p e r i o rt on e u t r a la n da l k a l i nc o n d i t i o n s t h em o l e c u l a rw e i g h t u n d e r10 0 0d a a n d5 0 0d aw a s9 9 6 2 a n d8 3 4 7 r e s p e c t i v e l y , t h ea v e r a g ew a s3 5 5 0d a k e yw o r d s ：a n t i b a c t e r i a lp e p t i d e ；t e n e b r i om o l i t o r ；e n z y m o l y s i s ； a n t i b a c t e r i a la c t i v i t y ；p r o t e a s e v 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 第一章绪论1 1 1 抗菌肽概述1 1 2 抗菌肽的分类1 1 2 1 内源性抗菌肽1 1 2 2 外源性抗菌肽3 1 3 抗菌肽的分子结构及理化性质4 1 4 抗菌肽抑菌机理5 1 5 抗菌肽和传统抗生素的区别。6 1 6 抗菌肽的制备方法7 1 7 抗菌肽的应用前景8 1 8 黄粉虫研究与应用进展l o 1 8 1 黄粉虫概述lo 1 8 2 黄粉虫成份分析。1 1 1 8 3 黄粉虫的营养价值及保健作用1 2 1 8 4 黄粉虫抗菌肽的研究进展1 2 1 9 课题研究的内容和意义1 3 1 9 1 主要研究内容13 1 9 2 课题研究的意义1 4 第二章黄粉虫蛋白的提取研究1 5 2 1 实验材料及试剂l5 2 2 主要仪器15 2 3 实验方法15 2 3 1 黄粉虫预处理15 2 3 2 提取方法比较16 2 3 3 蛋白质含量测定1 6 2 3 4 黄粉虫蛋白质分子量电泳表征1 7 2 4 实验结果与讨论1 8 2 4 1 热水处理温度的选择18 2 4 2 石油醚脱脂时间的确定1 9 2 4 3 盐提法和碱提法的比较1 9 2 4 4 碱浓度的确定2 l 2 5 本章小结2 2 第三章黄粉虫蛋白酶解工艺研究2 3 3 1 实验材料及试剂2 3 3 2 主要仪器2 3 3 3 实验方法2 4 3 3 1 黄粉虫蛋白和各种蛋白酶杀菌处理2 4 3 3 2 黄粉虫蛋白的酶解2 4 3 3 3 抑菌活性测定一管碟法2 4 3 3 4 水解度的测定2 4 3 3 5 酸沉多肽含量测定2 4 3 3 6 样品菌落总数的检测2 5 3 3 7 酶解产物s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 表征2 5 3 3 8 黄粉虫蛋白及其酶解产物的扫描电镜( s e m ) 分析方法2 5 3 3 9 黄粉虫蛋白酶解物的分子量分布测定2 5 3 4 实验结果与讨论2 6 3 4 1 黄粉虫蛋白及各种蛋白酶杀菌处理结果2 6 3 4 2 多肽标准吸收曲线的制作2 7 3 4 3 蛋白酶的筛选2 7 3 4 4 胰蛋白酶水解黄粉虫蛋白单因素实验3 0 3 4 5 响应曲面试验方法( r s m ) 优化胰蛋白酶水解反应条件3 3 3 4 6 胰蛋白酶水解最优条件验证3 9 3 4 7 最优条件下酶解物分子量分布检测结果4 0 3 5 本章小结4 0 第四章黄粉虫抗菌肽的分离纯化及其部分性质研究4 2 v t t 4 1 4 2 4 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 1 酶解物超滤分离结果4 5 4 4 2 阳离子交换层析p h 选择4 6 4 4 3 黄粉虫抗菌肽对几种常见菌种最低抑菌浓度( m i c ) 一4 8 4 4 4 黄粉虫抗菌肽不同浓度下的抑菌效果4 9 4 4 5 黄粉虫抗菌肽的热稳定性4 9 4 4 6 黄粉虫抗菌肽不同p h 下的抑菌效果5 0 4 4 7 黄粉虫抗菌肽分子量分布5 1 4 5 本章小结5 1 第五章结论与展望5 3 5 1 结论5 3 5 2 展望5 4 参考文献5 5 附录6 1 附录1 部分试验数据6 1 致谢。6 4 攻读硕士学位期间发表的学术论文6 5 v i i i 广西大学硕士掌位论文生物酶诗降u 备黄粉虫抗菌肽的研究 1 1 抗菌肽概述 第一章绪论 随着抗生素的广泛和长期使用，它的缺点正日益显露出来，其中最为突出的是它容 易造成细菌发生突变，产生抗药性。因为抗菌肽的作用机理不同于传统抗生素，它不易 造成细菌产生抗药性。所以，开发能代替传统抗生素的多肽抗菌物质是非常有意义的【l 】。 抗菌肽( a n t i b a c t e r i a lp e p t i d e ) 又叫抗生素肽( a n t i b i o t i c sp p t i d e ) 、抗微生物肽 ( a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e ) 。自从1 9 7 2 年b o m a n 等从天蚕蛹的血淋巴分离出第一例抗菌肽以 来，迄今为止，在昆虫中发现的抗菌肽已达2 0 0 多种【2 l 。现在发现抗菌肽广泛分布于细菌、 昆虫、植物、两栖动物、哺乳动物中( 包括人) ，具有广谱杀菌、抑病毒、抑杀肿瘤细胞 等活性，还能加速免疫和伤1 2 1 的愈合过程【3 】。 1 2 抗菌肽的分类 根据抗菌肽的来源，可分为内源性和外源性抗菌肽。 1 2 1 内源性抗菌肽 1 2 1 1 动物抗菌肽 动物抗菌肽又可分为昆虫抗菌肽、哺乳动物抗菌肽以及两栖动物抗菌肽。 ( 1 ) 昆虫抗菌肽 在自然界中，昆虫的数目非常众多，分布非常广泛，地球上每个角落几乎都存在昆 虫。昆虫具有很强的适应性，在漫长的生物进化历程中，逐渐形成了自己独特而高效的 防御机能。细菌侵入昆虫血淋巴后，就被受害昆虫通过吞噬作用和成瘤作用赶出循环系 统，含有细菌的吞噬细胞与其他的血细胞还可聚合在一起形成与脂肪体和围心细胞有关 的复合物。r n a 及特殊蛋白质的合成是昆虫免疫的第二步，这些特殊蛋白质对血淋巴的 抗菌功能起到关键作用。而抗菌肽与这些特殊蛋白质的关系是非常紧密的，是防御系统 中最重要的角色之一。到目前为止，在昆虫中发现的抗菌肽就达一百多种，根据它们结 构和功能可分为天蚕素类( c e r o p i n s ) 、昆虫防御素( i n s e c td e f e n s i n s ) 、富含脯氨酸抗菌肽 ( p r a l i n e r i c hp e p t i d e ) 、富含甘氨酸抗菌肽( g l y c i n e r i c hp e p t i d e s ) 1 4 1 。其中天蚕素类是发现 最早的昆虫抗菌肽，b o m a n 等1 9 7 2 年从人工诱导的天蚕免疫淋巴中分离提纯得到的两种 i 表1 1 一些昆虫抗茵肽的一级结构 t a b l e l - lt h ep r i m a r ys t r u c t u r eo fs o m ei n s e c t sa n t i b a c t e r i a lp e p t i d e 昆虫 防御 素 绿蝇防御素a 肉蝇肽a 粉虫防御素a a t c d l l s g t g n q h s a c a a h c l l r g n rg g y c n gk g v c v c r n a t c d l ls g t g i n h s a c a a h c l l r g n rg g y c n gk a v c v c r n f t c d v lf e l g t k l n s a a c g a h c l a l g r r g g y c n sk s v c v c r 肉蝇肽b l t c e i d r sc l l h c r l k g y l r ay c s q qk v c r c v q 富含 甘氨 酸抗 菌肽 鞘翅肽 s l q g g a p n f pq p s q q n g g w qv s p d l g r d d kg n t r g q i e i q n k g k d h d f a ag ，g k v i r g p nk a k p t w h v g gt y rr g 结构域： 肉蝇毒素i i ，g 1 1 3 7 凝集素g i 5 7 果蝇双翅肽 绿蝇双翅肽 d r l g r s i f r d v n r g v s d t l t k s v s a n l f r n d n h n l d a s v f r s d v r q n n g n 、i f o k t g g m l d ys h a n g h g l s l t d t h i p g f g d k m t a a g k u n u f h n d n h d i t a k a f a t r n l 、口d 认n u 阶胁i t u g g g i d y m f k m l o g g g g g q f g d g f g f a v q g g h q k u 丌s d n g r h r e i g l m g g y g o h l g g p y g n s e p s m ( u g s t y t y r f p 小f q l u g g g g g n r k d g f g u s u d a h q k u w t s d n g r h s i g u t p g y s o h l g g p y g n s r p d y r i g n g y s y n f g 肉蝇矧z ，g 2 2 0 1 裟粱嚣躲淼勰篇髑l 枞 ( 2 ) 哺乳动物抗菌肽 哺乳动物抗菌肽中研究最多的是防御素类抗菌肽，可分为两类：a 2 防御素和b 2 防 御素，都是富含精氨酸残基的阳离子肽，分子量为4k d a - 6k d a ，由2 8 4 2 个氨基酸残基 组成。防御素具有抗细菌、抗真菌、抗病毒及细胞毒性作用。 2 广西大掌硕士掌位论文生物酶法制- m - 黄粉虫抗菌肽的研究 ( 3 ) 两栖动物抗菌肽 两栖类动物皮肤经常暴露于非常恶劣的环境中，因此它们的皮肤能分泌出多种具有 抗菌作用的多肽。1 9 7 0 年，c s o r d a s 等发现了第一个具有溶血作用的蛙皮抗菌肽 b o m b i n i n r l 。两栖类动物的皮肤分泌液象一个小型的抗菌肽库，如欧洲蛙科动物r a n a p a l u s t r i s 皮肤分泌液中的抗菌肽可分离到的就有2 0 种以上【引。两栖动物种类的不同，得到 的抗菌肽在结构和种类上都有很大差异。地球上生存大约5 0 0 0 种的两栖类动物，c o n l o n 等估计，所有这些动物的皮肤分泌液中，共存在十万种以上不同的抗菌肽9 1 0 1 。 1 2 1 2 植物抗茵肽 这类抗菌肽又可分为硫堇( t h i o n i n s ) 、植物防卫素( p l a n td e f e n s i n s ) 、脂转移蛋白( l i p i d t r a n s f e rp r o t e i n sl t p s ) ，打结素类( k n o t t i n ) 、橡胶素( h e v e i n ) 、含4 个半胱氨酸抗菌肽等 5 类【1 1 1 。植物抗菌肽的共同特征是：富含半胱氨酸，而且所有的半胱氨酸都形成分子内 二硫键【1 2 1 。 1 2 1 3 微生物抗菌肽 微生物来源的抗菌肽是抗菌肽家族中的重要一员，包括环形肽、脂肽和糖肽，如短 杆菌肽、杆菌肽、乳酸链球菌肽和多黏菌素肽等。细菌素是最常见的一类细菌抗菌肽， 它能特异性地杀死有害菌而对自身无害。l a n t i b i o t i c 是一类由革兰氏阳性菌产生的抗菌 肽，其中乳酸链球菌素( n i s i n ) 是其中研究最为清楚的l a n t i b i o t i c 抗菌肽，也是目前已 经进入市场的抗菌肽之一，是最流行的多肽防腐剂1 3 】。一些由真菌产生的抗菌肽，如哌 珀霉素类( p 印t a i b 0 1 ) 抗菌肽，主要由木霉属土壤真菌产生【1 4 1 。 1 2 2 外源性抗菌肽 除了内源抗菌肽外，食物蛋白经酶解也能产生有效的抗菌肽，其中研究最多的是由 乳蛋白产生的乳源抗菌肽。乳蛋白长链中隐藏着许多抗菌肽片段，它们可以通过适当的 酶解而被释放出来，显示其抗菌活性。哺乳动物的乳汁中含有一种具有抗菌作用的蛋白 n q - 孚l 铁蛋白( l a c t o f e r d n ，l f ) ，其分子量约8 0k d a 左右，相对多肽来说要大得多。由于 分子量较大，l 啪热稳定性不好，容易受热失活。然而，1 9 9 1 年，h i r o a k i 等报道在p h 2 p h 3 、 1 0 0 1 2 0 处理5 分钟，l f 发生了降解，万万没想到的是，其降解片段也具有抑菌活 性，而且整体抑菌性能没有减弱反而有所增耐15 1 。由此可以推断，l 臃酸性条件下经热 处理后分解成了一些耐热的抑菌活性强于l f 本身的多肽。b e l l a m y 1 6 ，1 刀从l 盼子的氮端 进行了分解，分别得到了牛乳和人乳乳铁蛋白的具有抗菌活性多肽片段，并分别命名为 牛乳铁素( l a c t o f e r r i c i nb ) 和人乳铁素( l a c t o f e r r i c i nh ) 。l a c t o f e r d c i nh 分子中含有很多疏 3 广西大掌硕士学位论文生物酶法制畚黄粉虫抗菌肽的研究 水键和带正电荷的残基，具有两性性质；分子中的两个半胱氨酸是通过二硫键连接起来 的。在l 仲也存在此二硫键，但对抑菌活性并没有影响。l a c t o f e r r i e i nh 由4 7 个氨基酸残 基组成，其中有些区域是与l a c t o f e r r i c i nb 一致的，这些区域是具有抑菌特性的l 啪关键 结构。l a c t o f e r r i c i nb 的相对分子质量为3 1 0 0 左右，由2 5 个氨基酸残基组成，氨基酸序列 为： p h e - l y s c y s a r g - a r g - t r p g i n - w r p - a r g - m e t - l y s - - l y s l e u g l y - a l a - p r o s e r - i l e t h r - c y s - v a l - a r g - a r g - a l a - p h e 人们已经从乳铁蛋白、a 乳白蛋白，1 3 乳球蛋白、x ：- c s n ，1 酪蛋白做1 c s n ) ， 魄2 一c s n 的酶解液中得到了序列各异的抗菌肽【1 8 ，1 9 1 。 蛋清蛋白是另一个研究较多的获得外源抗菌肽的来源。h i s h a mr 等人从鸡蛋蛋清的 溶菌酶、卵转铁蛋白酶解液中获得了具有抗菌活性的多肽，经证实是这两种蛋白的功能 区域 2 0 , 2 1 】。卵白蛋白是禽类蛋蛋清中主要的蛋白质，占蛋清中总蛋白的5 0 左右。瑞士 人a n t o n i op e l l e g r i n i t 2 2 】等用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶将卵白蛋白水解获得了一些多肽片 段并研究了它们的抗菌性能。从胰蛋白酶水解产物中可获得五个抗菌肽：s a l a m ( 3 6 4 0 残基) ，s a l a m v y ( 3 6 - 4 2 残基) ，y p i l p e y l q ( 1 1 1 1 1 9 残基) ，e l i n s w ( 1 4 3 1 4 8 残 基) 以及n v l q p s s ( 1 5 9 1 6 5 残基) ；胰凝乳蛋白酶水解获得a e e 戳伸i l p e y l ( 1 2 7 1 3 8 残基) ，g i i r n ( 1 5 5 1 5 9 残基) 以及t s s n v m e e r ( 2 6 8 2 7 6 残基) 三个抗菌肽。这些抗 菌肽对枯草杆菌有很强的抑制作用，有些对真菌白色假丝酵母还有轻微作用。 除此之外，吴林泽【2 3 】利用蛋白酶水解罗非鱼下脚料获得的抗菌肽也属于外源抗菌 肽。经过对酶解液进行超滤后获得分子量小于lk d 的粗肽组分，再经离子交换和反相快 速蛋白质液相色谱分析，得到两种具有高活性的抗菌肽f 2 l 和f 2 2 ，它们分子量分别为5 2 8 6 和5 0 4 2 。f 2 l 对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度( m i c ) 分 别为4 7 2l ag m l 1 ，3 4 4l ag m l 一，6 5 4ug - m l 。f 2 2 对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金 黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度分别为2 5 5 | lg m l 一，3 2 8 l ag m l ，7 3 1l ig - m l 。 f 2 1 和f 2 2 抗菌肽具有较高的热稳定性，1 0 0 加热1 0 分钟m i c 几乎没有变化。贾久满等【2 4 】 利用蚯蚓自身的酶系对蚯蚓蛋白进行酶解获得了具有抗菌作用的酶解液，这也是获得外 源性抗菌肽的一个例子。 1 3 抗菌肽的分子结构及理化性质 抗菌肽在一级结构上有个共同的特点：分子量小，一般抗菌肽仅由1 2 5 0 个氨基酸 4 广西大掌硕士学位论文生物酶法制畚黄粉虫抗菌肽的研究 残基组成；其n 端富含赖氨酸( l y s ) 和精氨酸o 吨) 这两种碱性氨基酸，在自然条件下 分子带2 7 个正电荷；c 端富含缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸等非极性氨基酸，中间部位常为 脯氨酸，而且很多特定的位置都有一些较固定的氨基酸残基，这些固定的氨基酸残基对 抗菌功能起到不可缺少的作用。疏水氨基酸约占抗菌肽分子的5 0 ，促使其在溶液中形 成两亲分子【2 5 】。 抗菌肽的二级结构分为4 种类型，q 螺旋、b 折叠、环状结构和扩展片层，这些成 果是靠先进的二维核磁共振谱法、圆二色性分析及脂质体模拟实验获得的。q 螺旋是 一个很完美的既亲油又亲水的两亲结构，亲水区位于圆柱形分子纵轴的一边，且带正电 荷，而疏水区位于其对称面。这种两亲性结构对其杀菌功能起到关键作用，如果稍微改 变q 螺旋的螺旋度就会影响其抗菌活性。抗菌肽有许多较固定的序列，在氮端容易形 成q 螺旋，而中间容易形成b 折叠或铰链。具有q 螺旋的抗茵肽主要包括天蚕素、爪 蟾抗菌肽m a g a i n i n 、c m h e l m d i a 等，b 折叠肽有植物防御素、哺乳动物防御素、富含脯 氨酸和昆虫防御素等【2 6 1 。 抗菌肽的三级结构有两种，即由极性阳离子面和疏水面对称而成的两性结构以及由 正电荷区支撑疏水核心组成的翅状结构【2 7 1 。 抗菌肽是一类热稳定性高的碱性小肽，分子量很小，大多数等电点8 9 1 0 7 ，水溶 性好。由于抗菌肽的热稳定性好，将其和加热灭菌一起运用于食品加工将具有广阔的前 景。根据抗菌肽某些性质还可以对抗菌肽进行分离与纯化。比如根据它分子量小的特点 可以使用超滤的方法将抗菌肽和大分子蛋白进行有效的分离；根据它等电点较大的特点 用离子交换层析法将抗菌肽和蛋白杂质进行分离以达到纯化的目的。 1 4 抗菌肽抑菌机理 不同的抗菌肽作用模式是不同的，但有一点可以肯定，它们只有接近或结合细胞膜 时，高级结构的功能才发挥出来。抗菌肽在水溶液中不存在稳定的构象，这可能是其对 热稳定的原因所在。此外，抗茵肽要达到。一定得浓度才能发挥其活性，即在到达临界浓 度之前是没有任何活性的，这意味着抗菌肽是靠多聚体的形式发挥作用的【2 8 1 。 ( 1 ) 细胞膜攻击作用 目前这种机理是科学界普遍公认的。破坏细菌质膜结构或肿瘤细胞是大多数抗菌肽 基本的作用机制。这种机制的特点是细胞内溶物大量渗出，最终导致细菌和肿瘤细胞的 死亡。抗菌肽分子结构特点是上述机制运行的重要基础。带正电的抗菌肽与带负电的微 5 广西大学硕士学位论文生物酶淀订畚黄粉虫抗菌肽的研究 生物膜发生作用是细胞膜破坏机制主要特点。其杀菌的过程可描述为：首先抗菌肽分子 中两亲a 螺旋上的正电荷与细胞膜磷脂分子上的负电荷存在静电作用而发生相吸靠近， 然后依靠分子中碳端与氮端间柔性的连续结构，抗菌肽疏水端插进质膜当中，然后两亲 a - 螺旋也插进质膜当中，这样脂质双层有序的结构就受到破坏了，a - 螺旋的两亲性还可 使抗菌肽分子聚集起来，细胞膜上便形成了离子通道，细菌最终由于不能保持正常渗透 压而死亡【2 9 1 。 1 9 9 6 年，l o c k e y 3 0 】依靠免疫胶体和电子显微镜技术发现天蚕素a 结合到大肠杆菌膜 上，且产生一个直径为9 6 纳米的病灶，形成直径为4 2 纳米的孔洞，最后导致了细胞内 溶物渗出甚至细菌死亡。1 9 9 7 年，s i l v e s t r o t 3 1 1 研究发现，天蚕素a 低浓度下就可以引起 内溶物的渗出，由此推断天蚕素a 是经过改变膜离子的梯度来杀死细菌的。 ( 2 ) 抑制细胞呼吸作用 f e h l b a u m 等【3 2 】发现用一种英文名n q t h a n a t i n 的抗菌肽加入到细菌悬液中，1 小时后发 现细菌的呼吸作用比原来弱了，6 小时后细菌几乎没有呼吸作用。所以f e h l b a u m 推测这 种抗菌多肽是通过抑制细胞的呼吸作用来杀死细菌的。但是这种机理的具体过程目前还 没能弄清楚。b o b e k 等【3 3 】从人的唾液中提取到抗菌肽m u c 7 并试用于常见的杆菌、真菌 和球菌，发现m u c 7 对细菌和真菌的杀伤作用都很强。在超微结构中发现线粒体发生空 泡化、肿胀、嵴脱落和不规则的排列，核膜的界限模糊不清，有的发生破裂，内溶物溢 出。这表明抑制细胞呼吸作用可能是抗菌肽m u c 7 的作用机制。 ( 3 ) 抑制蛋白质及细胞壁合成 h a r d e r 等阴研究发现人的抗菌肽d e f e n s i n 3 可以抑制细菌的细胞壁合成，并使细胞壁 破裂穿孔，最后致使细菌死亡。 除了这些作用机理之外，很多科学家都提出不同的机理，比如对细胞核染色体的影 响【3 5 1 ，对癌细胞骨架的断裂作用【3 6 】，诱导细胞凋亡【3 刀等。 1 5 抗菌肽和传统抗生素的区别 ( 1 ) 化学结构不同：传统的抗生素多数结构较为复杂，分子中常含有环状结构； 抗菌肽是属于蛋白质，分子由氨基酸组成，一般都为直链结构。 ( 2 ) 杀菌机制不同：传统抗生素大多数都是通过抑制细菌细胞壁或d n a 的合成而 起到杀菌作用的，而抗菌肽主要是通过自身的正点荷与带负电的微生物细胞膜直接发生 作用，以致造成细胞膜