（分析化学专业论文）药物与生物大分子相互作用的研究.pdf

山东大学硕士学位论文 摘要 蛋白质与核( 苷) 酸是构成机体重要的生物分子。蛋白质肩负着各种生理上的 功能，从整体上维持生物体新陈代谢活动的进行，是生物性状的直接表达者。核 ( 苷) 酸与生物的遗传变异、肿瘤的发生、病毒的感染、射线对机体的作用有着重 要关系。因此研究生物分子与小分子相互作用，建立高灵敏度、低检测限的生物 分子的测定方法，对分子水平上阐明生命的奥秘等方面具有重要的意义吐是当前 生物分析化学研究的前沿和热点之一。 本论文利用荧光技术、共振光散射技术、吸收光谱技术、圆二色光谱技术等 手段研究了小分子物质与生物分子的作用机理，建立了对核( 苷) 酸快速、准确、 简便且选择性的分析方法。论文共分五个部分。 论文的第一部分主要综述了蛋白质结构和性质、小分子物质与蛋白质相互作 用的研究方法和研究进展，以及核( 苷) 酸荧光探针研究进展和发展趋势。 论文的第二部分应用荧光光谱、紫外吸收光谱和圆二色光谱等方法研究了生 理条件下杀虫剂吡蚜酮( p y ) 与牛血清白蛋白( b s a ) 的相互作用机理。结果表 明，在生理条件下，p y 对b s a 有较强的荧光猝灭作用，其荧光猝灭方式以静态 猝灭为主。p y 通过氢键或范德华作用力与b s a 相结合它们的结合服从位点结 合模型，形成具有一定稳定性的1 ：1 的复合物。p ) r 的加入使b s a 骨架结构周围 微环境的极性发生了变化，导致b s a 的构象改变，a 一螺旋含量升高，发生了去 折叠过程。 论文的第三部分利用荧光光谱法、紫外光谱法、圆二色光谱法和荧光寿命等 方法研究了除草剂唑咪磺草胺( f l u m e t s u l a m ，缩写为f l u ) 与血清白蛋白之间 的相互作用机理。结果表明：f l u 可以显著猝灭b s a 的荧光，其猝灭机制为静 态猝灭。f l u 与b s a 的结合常数k 在2 9 9k 和3 0 9k 时分别为3 9 x 1 0 4l m o l 和 3 2 x 1 0 4l m o l ，两者之间存在一个结合位点。体系的焓变a l l 和熵变a s 分别为 1 5 1 9k j m o l 和3 7 0 6j ( m o l k ) ，说明f l u 与b s a 之间主要以静电引力相互结 合。根据f 6 r s t e r 非辐射能量转移理论，f l u b s a 间的结合距离为3 6n m ，能量 转移效率为o 2 2 。紫外光谱和圆二色光谱实验结果表明，f l u 可以导致b s a 构 n 山东大学硕士学位论文 象发生改变。 在论文的第四部分，用槲皮素作为荧光探针，建立了灵敏而选择性测定鸟嘌 呤的新方法。结果表明，在b r 缓冲溶液中，鸟嘌呤碱基加入到槲皮素体系中， 荧光强度显著增强且增强程度与鸟嘌呤碱基的浓度有良好的线性关系。该方法可 用于鸟嘌呤的测定。在最佳实验条件下，鸟嘌呤的线性范围为1 0 x 1 0 。9 9 0 x 1 0 6 m o l l ，检出限为2 0 x 1 0 。1 0m o l l ，干扰实验表明其它碱基对鸟嘌呤的测定影响较 小。机理研究认为，鸟嘌呤对槲皮素的荧光增强作用源于鸟嘌呤对槲皮素的荧光 增强来源于槲皮素超分子聚合物的解聚及乌嘌呤槲皮素氢键缔合物的形成。该方 法用于实际尿样中鸟嘌呤的测定，结果令人满意。 论文的第五部分研究了h p p c d 、a n s 和核酸的相互作用。研究表明， h p b c d 包结了a n s ，使a n s 的荧光强度显著增强，而核酸( f s d n a 、c t d n a 和y r n a ) 的加入，可使得体系的荧光强度降低，且降低程度大大超过a n s 一核 酸体系的荧光猝灭作用，体系的荧光猝灭程度与核酸的浓度在一定范围内具有良 好的线性关系，据此建立了测定核酸的新方法。f s d n a 、c t d n a 和y r n a 的线 性范围分别为：2 5 x 1 0 一3 0 x 1 0 。5 咖l ，5 0 x 1 0 母4 0 x 1 0 5g m l 和2 5 x 1 0 罐 5 0 x 1 0 g r , f l 。检出限分别为8 0 x 1 0 母g m l ，3 6 x 1 0 母咖l 和6 6 x 1 0 母g n d 。并成 功应用于合成样品中f s d n a 的定量测定。机理研究表明，h p p c d 与f s d n a 相互作用导致其双螺旋结构发生改变，从而使h p p c d a n s 更容易与核酸的 碱基发生作用，导致体系荧光猝灭。 本论文的主要特点： ( 1 ) 本文利用荧光、荧光寿命、紫外吸收、圆二色光谱等多种实验手段研究 磺酰胺类除草剂唑咪磺草胺( f l u m e t s u l a m ，缩写为f l u ) 和杀虫剂吡蚜酮( p y ) 与牛血清白蛋白之间的相互作用机理，丰富了农药等有机小分子与蛋白质作用的 研究。 ( 2 ) 研究发现，在弱酸条件下鸟嘌呤能明显增强槲皮素的荧光强度，而d n a 中其他三种基本碱基的干扰较小，据此建立了选择性测定鸟嘌呤的荧光光度法。 本法还具有操作简便、快速、线性范围宽、灵敏度高等特点。 ( 3 ) 研究发现，在p h 为4 2 0 的b r 缓冲溶液中，核酸的加入可使h p p - c d 1 1 1 山东大学硕士学位论文 a n s 体系发生荧光猝灭，且猝灭程度与核酸的浓度呈线性关系，从而建立了灵敏 测定核酸的荧光新方法，该方法简便、快速，具有较宽的线性范围。 关键词：唑咪磺草胺；吡蚜酮：蛋白质：槲皮素：鸟嘌呤：荧光；核酸；羟 丙基一b 一环糊精：卜苯氨基- 8 - 萘磺酸；圆二色光谱 山东大学硕士学位论文 a b s t r a c t p r o t e i n sa n dn u c l e i ca c i d s ( n u c l e o s i d e ) a r et h em a t e r i a lb a s eo fl i f e ，w h i c ht a k e o nd i v e r s i f i e dp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n p r o t e i n sa r et h ec a r r i e ro fm a n yp h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n s ，a n da 托a l s ot h ed i r e c te x p r e s s e ro fp h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r s n u c l e i ca c i d s ( n u c l e o s i d e ) a r er e l a t e dt oh e r e d i t y , t u m o r , t h ee f f e c to fv i r u sa n ds oo n s oi ti so f s p e c i a lv a l u et os t u d yt h ei n t e r a c t i o no fs m a l lm o l e c u l ew i 也b i o m o l e c u l e sa n dt o d e v e l o pt h eq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so fb i o m o l e c u l ew i t hh i g hs e n s i t i v i t ya n dl o w d e t e c t i o nl i m i t t h i sp r o j e c ti st h ef o r w a r dp o s i t i o na n dh o tp o i n ti nb i o c h e m i c a la n d b i o p h y s i c a lr e s e a r c h e s t h i st h e s i ss t u d i e st h ei n t e r a c t i o nm e c h a n i s mb e t w e e nb i o m o l e c u l e sa n ds m a l l m o l e c u l e su s i n gt h et e c h n i q u e si n c l u d i n gf l u o r e s c e n c e ，u v - v i s i b l e a b s o r p t i o n , c i r c u l a rd i c h r o i s m ( c d ) ，r e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g ( r l s ) a n df l u o r e s c e n c el i f e t i m e s o m er a p i d , a c c u r a t ea n dh a n d ya s s a y sa r ed e v e l o p e df o rn u c l e o s i d ea n dn u c l e i c i d s t h e m a i nc o n c l u s i o n sa r el i s t e da sf o l l o w s ： i nt h ef i r s ts e c t i o n , w es u m m a r i z e dt h es t r u c t u r ea n dc h a r a c t e ro fp r o t e i n , t h e r e s e a r c hm e t h o da n de v o l u t i o no f p r o t e i n w i t hs m a l lm o l e c u l e s ，a n dr e c e n t d e v e l o p m e n t so ff l u o r e s c e n c ep r o b ef o rb o t hn u c l e i ca c i d sa n dn u c l e o s i d e i nt h es e c o n ds e c t i o n , t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e np y m e t r o z i n e ( p y ) a n db o v i n e s e r u ma l b u m i n ( b s a ) w e r es t u d i e di np h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o nu s i n gf l u o r e s c e n c e ，u v a b s o r p t i o na n d c ds p e c t r o m e n i e s p yc o u l d s t r o n g l yq u e n c h t h ei n t r i n s i c f l u o r e s c e n c eo fb s ab ys t a t i cq u e n c h i n g t h eb i n d i n gc o n s t a n t so fp yw i t hb s aa t t w ot e m p e r a t u r e s ( 2 8 9ka n d2 9 9k ) a r e5 4 x1 0 4a n d2 7 x1 0 4l m 0 1 t h e r ew a sa s i n g l eb i n d i n gs i t eb e t w e e nl ya n db s a t h et h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r sw e r e c a l c u l a t e db yv a n th o f fe q u a t i o n , t h ee n t h a l p yc h a n g e ( h ) a n de n t r o p yc h a n g e ( s ) a r e - 41 8i o m o la n d - 81 7j ( m o l k ) ，r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h e a c t i n gf o r c eb e t w e e np ya n db s aw a sm a i n l yh y d r o g e nb o n da n dv a n d e rw a a l sf o r c e t h ea v e r a g eb i n d i n gd i s t a n c eb e t w e e nd o n o r ( b s a ) a n da c c e p t o r ( p ”w a so b t a i n e d ( r = 2 4n m ) t h ei n v e s t i g a t i o n so ft h eu v v i sa n dc ds p e c t r ao ft h es y s t e ms h o w e d v 山东大学硕士学位论文 t h a tt h es e c o n d a r ys t r u c t u r eo fb s aw a s c h a n g e d i np r e s e n c eo f p y i nt h et h i r d s e c t i o n , t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nf l u m e t s u l a m ( f l u ， n 一( 2 ，6 - d i f l u o r o p h e n y l ) 5 - m e t h y l ( 1 ，2 ，4 ) - t r i a z o l o ( 1 ，5 一a ) p y r i m i d i n e - 2 - s u l f o n a m i d e ) a n d b o v i n es e l u l na l b u m i n ( b s a ) w a si n v e s t i g a t e db yf l u o r e s c e n c e ，f l u o r e s c e n c el i f e t i m e ， u v a b s o r p t i o na n dc ds p e c t r o m e t r i e s as t r o n gf l u o r e s c e n c eq u e n c h i n gw a so b s e r v e d a n dt h eq u e n c h i n gm e c h a n i s mw a sc o n s i d e r e da ss t a t i cq u e n c h i n ga c c o r d i n gt ot h e s t e m v o l m e re q u a t i o n t h eb i n d i n gc o n s t a n t so ff l uw i n lb s aa t2 9 9 ka n d3 0 9 k w e r eo b t a i n e da s3 9 x10 4l t o o la n d3 2 x10 4l m o l ，r e s p e c t i v e l y t h e r ew a sas i n g l e b i n d i n gs i t eb e t w e e nf l u a n db s a t h et h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r se n t h a l p yc h a n g e ( h ) a n de n t r o p yc h a n g e ( s ) w e r ec a l c u l a t e da s 1 5 1 9k j m o la n d3 7 0 6j ( m o l k ) ， r e s p e c t i v e l y , w h i c hi n d i c a t e dt h a tt h ee l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o nf o r c ep l a y e dm a j o rr o l e s i nt h eb i n d i n gr e a c t i o no ff l u 、j i ，i t hb s a a c c o r d i n gt ot h ef 6 r s t e rn o n - r a d i a t i o n e n e r g yt r a n s f e rt h e o r y , t h ea v e r a g eb i n d i n gd i s t a n c eb e t w e e nd o n o r0 3 s a ) a n d a c c e p t o r ( f l u ) w a so b t a i n e d ( r = 3 6n m ) t h ei n v e s t i g a t i o n so ft h eu v v i sa n dc d s p e c t r ao ft h es y s t e ms h o w e dt h a tt h ec o n f o r m a t i o no fb s a w a sc h a n g e di np r e s e n c e o f f l u i nt h ef o m ls e c t i o n , i tw a sf o u n dt h a tg u a n i n ec o u l de n h a n c et h ef l u o r e s c e n c eo f q u e r c e t i n b a s e do nt h i s ，an e wm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fg u a n i n ew a s p r o p o s e d i nb r b u f f e rs o l u t i o n ( p h = 5 6 0 ) ，t h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fq u e r c e t i n s y s t e mc o u l db eg r e a t l ye n h a n c e db yg t 瑚i n ea n dt h ee n h a n c e di n t e n s i t yw a si n p r o p o r t i o nt ot h ec o n c e n t r a t i o no fg u a n i n ei nt h er a n g e1 0 l0 母9 0 l 矿m o f l ， i t sd e t e c t i o nl i m i t sw a s2 0x10 1 0m o l l i n t e r f e r e n c et e s ts h o w e dt h a t t h eo t h e rt h r e e b a s e si nn u c l e i ca c i dh a dl i t t l ee f f e c t so nt h ed e t e r m i n a t i o no fg u a n i n e a n dt h e m e c h a n i s ms t u d yi n d i c a t e dt h a tt h es t r o n gi n t e r a c t i o na n dt h ef o r mo f1 ：1 c o m p l e x b e t w e e ng u a n i n ea n dq u e r c e t i nr e s u l t e di nt h ed e p o l y m e r i z a f i o no ft h eq u e r c e t i n a g g r e g a t i o na n df l u o r e s c e n c ee n h a n c e m e n to ft h i ss y s t e m a c t u a ls a m p l e sw e r e d e t e r m i n e ds a t i s f a c t o r i l y i nt h ef i f t hs e c t i o n , w ef o u n dt h a tt h e r ew e r ei n t e r a c t i o n sa m o n gh i p c d ，a n s a n dd n a i tw a sf o u n dt h a tt h ew e a kf l u o r e s c e n c eo fa n sw a se n h a n c e dg r e a t l y b y t h ea d d i t i o no fh p b c d ，a n dd n ac o u l dq u e n c ht h ef l u o r e s c e n c eo ft h es y s t e m i n 山东大学硕士学位论文 b rb u f f e rs o l u t i o n ( p h = 4 2 0 ) ，t h ed e c r e a s e df l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yw a si np r o p o r t i o n t ot h ec o n c e n t r a t i o no f n u c l e i ca c i di nt h er a n g e2 5 x 1 0 喝3 0 x 1 0 5g m lf o rf s 阱认， 5 0 x 1 0 母一4 0 x 1 0 5g m 1f o rc t d n a , 2 5 1 0 5 0 x 1 0 。5 倒f o ry r n a t h e i r d e t e c t i o nl i m i t sw e r e8 0 1 0 母，3 6 x 1 0 母a n d6 6 x 1 0 母删( s n = 3 ) ，r e s p e c t i v e l y s a m p l e sw e r ed e t e r m i n e ds a t i s f a c t o r i l y t h ei n t e r a c t i o nm e c h a n i s mi n v e s t i g a t i o n i n d i c a t e dt h a th p p c dc o u l dc a u s et h ec h a n g eo fd o u b l eh e l i xs t r u c t u r ei nn u c l e i c a c i d , a n dt h e r e f o r eh p 一1 3 一c d - a n sc o m p l e xi n t e r a c t e dw i 也n u c l e i ca c i de a s i l y , w h i c hr e s u l t e di nt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yd e c r e a s e d t h ec h i e fc h a r a c t e r i s t i c so f t h i st h e s i sa r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) i nt h i st h e s i s ，w es t u d i e dt i l ei n t e r a c t i o nm e c h a n i s m sb e t w e e nb s aa n ds m a l l m o l e c u l a r ss u c ha san e wh e r b i c i d ef l u m e t s u l a ma n dan e w p e s t i c i d ep y m e t r o z i n e u s i n gf l u o r e s c e n c e ，f l u o r e s c e n c el i f e t i m e ，u va b s o r p t i o na n dc ds p e c t r o m e t r i e s ， w h i c he n r i c h e dt h er e s e a r c hi nt h ef i e l d so fh e r b i c i d ea n dp e s t i c i d e ( 2 ) i ti sf o u n dt h a tg u a l i n ec a ne n h a n c et h ef l u o r e s c e n c eo fq u e r c e t i n b a s e do nt h i s ， an e wm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fg u a n i n ei sp r o p o s e d t h em e t h o di s s i m p l e ， r a p i d ，s e n s i t i v ea n ds e l e c t i v e ( 3 ) i ti sf o u n dt h a td n a c o u l dq u e n c ht h ef l u o r e s c e n c eo ft h eh p p c d a n s s y s t e mi nb rb u f f e rs o l u t i o n ( p h = 4 2 0 ) ，a n dt h ed e c r e a s e df l u o r e s c e n c ei n t e n s i t y w a si np r o p o r t i o nt ot h ec o n c e n t r a t i o no fn u c l e i ca c i d b a s e do nt h i s ，an e wm e t h o d f o rt h ed e t e r m i n a t i o no fn u c l e i ca c i di sp r o p o s e d 。t h i sm e t h o di ss i m p l e ，s e n s i t i v ea n d q u i c k k e y w o r d s ：f l u m e t s t t l a m ，p y m e t r o z i n e ，p r o t e i n , q u e r e e t i n ，g u a n i n e ，f l u o r e s c e n c e ， n u c l e i ca c i d ，h p p c d ，a n s ，c d v n 山东大学硕士学位论文 f s d n a ： b s a ： h m t a ： 晡s ： f l u ： c d ： a d e n i n e ： t h y m i n e ： a n s ： i f ： i o ： i f ： 鱼精子脱氧核糖核酸 牛血清白蛋白 六次甲基四胺 三羟甲基胺基甲烷 唑咪磺草胺 圆二色谱 腺嘌呤 胸腺嘧啶 符号说明 c t d n a ： 小牛胸腺脱氧核糖核酸 y r n a ： 酵母核糖核酸 q u e r c e t i n ：槲皮素 b r ： b r i t o n r o b i n s o n 缓冲溶液 p y ： 吡蚜酮 g u a n i n e ：鸟嘌呤 c y t o s i n e ：胞嘧啶 h p - p c d ：羟丙基p 环糊精 1 苯氨基8 萘磺酸 c g t ：环糊精葡糖基转移酶 样品加入后体系荧光强度 r l s ：共振光散射 样品加入前体系荧光强度 加入样品后体系荧光强度的变化值 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明本声明 的法律责任由本人承担 论文作者签名：刍鑫蕴筵日期：鼋竺仝：量：兰垒 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文柘者签名：缒导师签名：址日期：2 掣 山东大学硕士学位论文 第一章绪论 蛋白质是生命的物质基础，它与生命的起源和进化、生物的营养、发育、遗 传和新陈代谢等生命活动都有着密切的联系。药物分子与蛋白质之间的相互作 用，直接影响药物在生物体内的分布、清除、活性、毒性以及药物代谢动力学性 质，在分子水平上研究药物分子和蛋白质的相互作用，对于阐明药物的作用机理 和进行药物设计以及开发新药具有重大的理论和实践意义。 核酸是遗传信息的主要载体，在生物的生长、发育和繁殖等活动中具有十分 重要的作用。核酸的结构直接影响其功能，并与致癌、抗癌有关。临床上使用的 许多抗癌、抗病毒药物以d n a 为作用靶点，通过与癌细胞或病毒的d n a 发生相 互作用破坏其结构，进而影响基因调控与表达，表现出抗癌或抗病毒性。因此从 生物分析化学的角度对# 酸以及相应碱基和核苷酸的定性、定量检测引起了分析 工作者的极大兴趣。 第一节血清白蛋白与有机小分子的相互作用 蛋白质是组成自然界中各类生命的基本物质，在生物体的生命活动中担负着 各种生理功能，从整体上维持生物体新陈代谢活动的进行，是生物性状的直接表 达者。血清白蛋白是血浆中含量最丰富的载体蛋白，是生物体内具有重要生理功 能的大分子，并且，血液中血清白蛋白浓度长期以来一直是检验健康和疾病的指 标。在蛋白质与药物等小分子化合物相互作用的研究中，白蛋白是目前研究的最 广泛的一种蛋白质。它能在体内与许多内源性物质及许多药物小分子作用，并具 有多个结合部位，起着重要的储存和运输作用。血清白蛋白分子与小分子问相互 作用的研究涉及许多相关学科，如生物学、化学、物理学等，因而加强各学科之 间的协作必将推动这一研究领域的进步。 血清白蛋白的结构和性质 血清白蛋白是机体循环系统中最丰富的蛋白，约占总血清蛋白含量的6 0 ， 且容易较大量、高纯度的制备。在各种各样的生物物理、生物化学与物理化学研 究中，血清白蛋白一直被用作模型蛋白【1 。本节简要介绍血清白蛋白的结构、 山东大学硕士学位论文 性质。 蛋白质的分子结构是蛋白质功能的物质基础。目前，人们普遍认为蛋白质是 一种含有d n a 编码的2 0 种l 型o t 氨基酸，通过a 碳原子上的取代基间形成的酰胺 键连成的、具有特定空间结构和生物功能的多肽键构成的生物大分子。随着氨基 酸数目、排列顺序、以及多肽链的数目和空间结构的不同，形成分子结构不同的 蛋白质。 蛋白质结构有不同的层次，人们为了认识的方便将其分为一级、二级、三级 和四级结构【2 ，3 】。在一级结构中，一致公认肽键为主要连接键，多肽是一级结 构的主体。一级结构决定高级结构，决定蛋白质的生物学功能。在一级结构的长 链中，存在不同的基团如一h ，一c = o ，一n h 2 ，- - c o o h ，一r 等等。它们之间 也可以相互作用，形成了分子的立体结构。这种分子中原子团间非键合的相互作 用，要比共价键弱得多，称为次级键，主要有氢键、疏水作用、盐键、范德华力 等。蛋白质的二级结构是指0 c 螺旋、p 折叠、p 转角和无规则卷曲等这些主链结构 单元在蛋白质分子中的各种具体组成情况。蛋白质的三级结构涉及蛋白质分子或 亚基内所有原子的空间排布，是多肽链折叠、卷曲的最终状态。具有三级结构的 蛋白质分子单体按一定方式聚合成蛋白质大分子，即为蛋白质的四级结构。 相对于其它蛋白质而言，血清白蛋白的结构简单，由一条单独的氨基酸多肽 链构成。两种重要的血清白蛋白常用于研究工作中，即人血清白蛋白( h u m a n s e r u ma l b u m i n ，h s a ) 和牛血清白蛋白( b o v i n e $ e r u n ：1a l b u m i n ，b s a ) 。 h s a 是由5 8 5 个氨基酸残基组成的单个肽链蛋白质，分子量约为6 6 5 0 0 。h s a 肽链含有3 5 个半胱氨基酸残基，仅3 4 位上有一个巯基，其余都为二硫键，二硫键 中有8 对组成交叉的二硫谴，只有接近n 端的是一个单个的二硫键。二硫键对维 系蛋白质空间结构的稳定性起着重要作用。h s a 含有十八个酪氨酸残基( t y r ) ，三 十个苯丙氨酸残基( p h e ) ，在2 1 4 位上含有一个色氨酸残基( t r p ) 。n 端为天冬氨酸 残基( a s p ) ，c 端为亮氨酸残基( l e u ) 。b s a 分子是由5 8 2 个氨基酸残基所形成的单 肽链蛋白质。b s a 的等电点为4 7 ，分子量为6 7 0 0 0 ，是一种典型的球状蛋白，性 质比较稳定，其结构与h s a 相似，分子量相近，二者的氨基酸序列高度相似，且 不同氨基酸均为保守性替换。而b s a 更价廉易得，故人们常研究药物b s a 的结 合情况，作为对h s a 结合情况的参考。 山东大学硕士学位论文 二血清白蛋白与药物分子相互作用的光谱法研究进展 用于研究药物分子与血清白蛋白的相互作用的方法主要有荧光光谱法、紫外 可见吸收光谱法和圆二色谱法等，其中荧光光谱法可以综合利用蛋白质和药物 相互作用时多方面的信息，因而成为主要的研究手段之一。 1 荧光光谱法 在小分子物质与血清白蛋白的相互作用研究中，荧光光谱法是一种应用广 泛、成果丰富有效的重要手段，它能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、 量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数，可以对体系的荧光生色团的结 构及其所处的微环境提供有用的信息。另外，用荧光光谱法研究蛋白质分子构象 还具有灵敏度高、选择性强、用样量少、方法简便、仪器价廉等优点【4 】。 通过考察蛋白质在相互作用前后的荧光强度变化，可以获得受、配体间的结 合强度并对其相互作用机理进行推测。血清白蛋白的内源荧光主要由色氨酸体 现，根据f o r s t e r 既量转移机理可以计算出小分子与蛋白质中色氨酸的距离，并由 此推测小分子与蛋白质结合的空间部位。小分子与蛋白质相互作用的类型以及小 分子对蛋白质构象的影响都可以在荧光光谱上获得信息。 1 1 研究内容与方法 1 1 1 结合常数及结合位数的测定 1 1 1 1s c a t c h a r d 方程： 将小分子配体与大分子结合看作是小分子配体与大分子特定部位的结合，在 此基 9 ih s c a t c h a r d 等【5 】推导了溶液平衡处理的理论公式o p s c a t c h a r d 方程，该方程 是描述生物大分子与小分子及离子相互作用的最常用、最经典的方程。其具体形 式为： ，c ，= ，一r k ( 1 ) 式中r 为每个蛋白质分子键合的药物分子的个数，c ，为游离药物的浓度，1 1 为结合 位点数，k 为结合常数。以，o 对r 作图，可得到n 、k 的值。若反应存在多种结 合位，上式变为： 3 山东大学硕士学位论文 ，= 月，k ，c ，“1 + k ，c 1 ) ( 2 ) 通过非线性拟合，可计算n i 、k i 、n i 、k i 分别表示结合位数和第i 位的结合常数。 该方法在应用时须知道反应体系中游离态药物的浓度，这一点用荧光法测定时常 不易做到，而且s c a t c h a r d 作图法所得结果往往不理想，因此，在研究药物分子 与蛋白质的结合反应中，s c a t c h a r d 作图法应用不多。张保林等 6 】曾用此法研究 了葸醌及黄酮类化合物与人血清白蛋白的结合反应，并计算求得了n 、k 的值。 1 1 1 2s t e r n - v oli n e r 方程与lin e w e a v e r - b u r k 双倒数方程 有机小分子与蛋白质发生作用时，可引起蛋白质内源荧光的猝灭，根据猝灭 机理不同，将有机小分子对蛋白质荧光的猝灭分为动态猝灭和静态猝灭。动态猝 灭是药物和蛋白质激发态分子之间的相互作用而导致的荧光猝灭，遵循 s t e m - v o l m e r 方程【7 】： 厶，= 1 + _ r o 【q 】= 1 + b 【q 】 ( 3 ) 式中凡为未加猝灭剂时蛋白质的荧光强度，朦示加入猝灭剂浓度为【纠时蛋白质 的荧光强度，k s v 称为猝灭常数。 静态猝灭是药物和蛋白质在基态时生成复合物，从而导致蛋白质荧光强度降 低。对于l ：l 结合的情况，可推导出公式： 厶，r = 1 + k q 】 ( 4 ) 式中k 为复合物的稳定常数，【翻为游离药物分子的浓度。根据此式作f oi f - q 图，可由回归直线斜率求得k 值。 荧光物质具有的荧光发色基团种类数不同，s t e r m v o l m c r 图表现形式不同。 若荧光物质只有一类荧光发色基团，s t e r m v o l m e r 图表现为一直线；若有两类荧 ： 光发色基团，发色基团的荧光不能完全被猝灭剂猝灭，贝u s t e r m v o l m e r 图将偏向 x 轴，这种情况常出现在极性或带电荷的化合物对蛋白质色氨酸残基荧光的猝灭 中，猝灭剂分子不容易渗透到蛋白质内部的疏水腔，仅仅猝灭了蛋白质表面的色 氨酸残基的荧光，此时可用修正后的s t e r m - v o l m e r 方程【8 ，9 】来处理： 厶= 1 ( f o 七【纠) + l f o ( 5 ) 式中凡表示无猝灭五d 时荧光体的荧光强度，蠊示有和无猝灭剂时荧光体 4 山东大学硕士学位论文 的荧光强度差值，q 为猝灭剂的浓度，石为被猝灭荧光体的荧光基团占总荧光基 团的分数，k 为s t e r m v o l m e r 猝灭常数。 另外，还可利用式( 4 ) 变形为双倒数公式【1 0 1 4 ，即l i i l e w e a v e r - b u r k 双倒数 方程： 1 ( i o i ，) = 1 i o + i ( i o k 【q 】) ( 6 ) 对于多结合位点的情况，张勇 1 5 】等提出了一个求取结合位点数的线性回归 公式：l g ( ( i o 一0 ) ) = l g k + n l g q ( 7 = ! 1 1 2 作用力类型的确定 蛋白质与有机小分子间的作用力属于分子间的弱相互作用，包括氢键、范德 华力、静电引力和疏水力。从热力学观点看，在一定的温度和压力下，有机小分 子与蛋白质的结合反应能否自发进行取决于体系的a g 。a g 玩 时，以p y 的起始 浓度代替其平衡浓度： k = ( 【玩】一【b 】) 【q 】”【b 】 一( 4 ) 在静态猝灭中，若所生成的络合物是非荧光性的，荧光体系的荧光强度与其 游离浓度成正比： 【别【风】= i ，i i o ( 5 ) 由( 4 ) 和( 5 ) 可得 l g ( i o - 6 ) b ) = l g k + n l g q ( 6 ) 实验发现在3 4 0d i t i 处，p y 及p y - b s a 络合物均不发射荧光，因此可用上述 方法计算平衡常数及结合位点数。实验所用猝灭剂p y 的浓度远远大于b s a 浓度， 因此可用猝灭剂p y 的起始浓度代替其平衡浓度进行计算。由f i g 2 实验数据， 根据式( 6 ) ，以l g ( ( 1 0 - i ) 0 ) 对l g 绘图，可得到线性回归曲线( 见f i g 3 ) 。 由直线的斜率和截距可求得在2 8 9k 和2 9 9k 时，p y 与b s a 结合常数k 分别为 5 4x1 0 4 和2 7 1 0 4l m o l ，结合位点数n 分别为1 1 、1 0 ，相关系数分别为0 9 9 9 ， 0 9 9 8 。可见p ) ，与b s a 之间形成较稳定的l ：1 复合物。 山东大学硕士学位论文 点04 84 64 4矗2 蛔 f i g 3p l o to f l o g ( ( f o d f ) v s 1 0 9c r y 2 4 吡蚜酮与b s a 作用力的确定 药物等有机小分子和蛋白质等生物大分子的作用力包括氢键、范德华力、疏 水作用力和静电引力等。判断药物有机小分子和蛋白质生物大分子的作用力类型 的热力学规律见下表： t a b l e1t h e r e l a t i o n s f f i pb e t w e e nt h eb i n d i n gf o r c e sa n dt h et h e r m o d y n a m i c p a r a m e n t s