（微生物学专业论文）细菌l152几丁质酶的分离纯化与性质研究.pdf

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不十分敏感，多数袅属离子会抑制酶的活性。l 15 2 菌株几丁质酶 在常温条件下，1 0 天内仍保持较高的活力，而且l l5 2 菌株几丁 质酶对檀甥瘸原菌有较强的抑制作用。该蓦抹还表现搬了良好鲍 瓣楚戆，在0 6 懿n a c l 豹藩莽蒸中蕤鲟生长与产酶，这骞零j 于 海洋废料处理及海产品养殖业的防瘸治病。在耐热性、酸碱耐受 性方面以及室温条件长时间保存方面，该酶也表现出了优良的稳 定性。 关键词：粘质沙雷氏菌几t 质几丁膜酶 纯化岛性质 a b s t r a c t as t r a i nl l5 2w a so b t a i n e df r o mm a r i n ew a s t ew h i c hp r o d u c e d h i g hy i e l do fc h i t i n a s e b yp h y s i o l o g i c a lp r o p e r t i e s ，c o m p o s i t i o n so f e e l lw a l la n d16 s r d n as e q u e n c e sw e r er e s e a r c h e d b a s e do nt h et e s t r e s u l t s ，l 15 2w a s c l a s s i f i e d i n t oab a c t e r i an a m e ds e r r a t i a m a r c e s c e n s a f t e rf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o nw a so p t i m i z e d ，t h eo p t i m a l f e r m e n t a t i o nm e d i u mi sa sf o l l o w s ：c h i t i n1 k 2 h p 0 4 0 3 ，k h 2 p 0 4 o 3 ，m g s o d0 0 5 ，c a c l 2o 0 5 ，f es 0 4 o 0 0 1 t h ei n i t i a lp hi s 6 4 f e r m e n t a t i o nt i m e4d a y sa n dt e m p e r a t u r e3 0 t h em a x i m u m a c t i v i t y o ft h ec h i t i n a s eo fl i5 - 2 a p p e a r s o nt h e 4 t h d a y a f t e r i n c u b a t i o n t h ec h i t i n a s ei sa ni n d u c e de n z y m e c h i t i ni si t si n d u c e r n a g ，c h i t o s a n ，s u c r o s e a n dg l u c o s ea r ei t s i n h i b i t o r a d d i n ga n y c a r b o nf o u n t a i ni nt h ef e r m e n t a t i o nm e d i u m ，t h ec h i t i n a s ea c t i v i t yi s n o ti n c r e a s e t h es t u d yo ft h e o p t i m a lc u l t i v a t i o n c o n d i t i o n si n d i c a t e dt h a t a e r a t i o nh a ds i g n i f i c a n te f f e c to nt h ep r o d u c t i o no ft h ee n z y m e t h e c h i t i n a s ei ss t a b l eb e t w e e np h 5 a n d7 5 ，a n dt h eo p t i m u mp hi s 6 4 t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r eo fc h i t i n a s ea c t i o ni s5 0 ，h o w e v e r ，i t h a s s t r o n g c h i t i n a s e a c t i v i t y b e t w e e n 10 a n d6 0 t h i sis b e n e f i c i a lo nt r e a t i n gs e aw a s t e ，c u l t u r i n gs e a f o o da n dp r e v e n t i n g a n d d e s t r o y i n g d i s e a s e si ns e a f o o d c u l t u r i n g a n d p l a n te p i p h y t e d i s e a s e t h ec h i t i n a s eh a db e e n p u r i f i e d t o g i v e a s i n g l e b a n do n s d s p a g e t h em o l e c u l a rw e i g h tw a sa b o u t41314 p i l o t s t u d y o f i s o e l e e t r i cp o i n td e t e c t e db yi e fa n dd e a e s e p h a r o s ef a s tf l o ww a s a b o u t8 t h em a x i m a l a c t i v i t yo ft h ee n z y m ew e r eo b t a i n e da ti o n i c s t r e n g t ho 0 1 t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ea n dp h w e r e5 0 a n d6 6 t h ee n z y m ea c t i v i t yw a sn o tv e r ys e n s i t i v et ot h ev a r i e t yo ft h ei o n i c s t r e n g t h a n dm o s tm e t a li c o n s t h e e n z y m e o fl 15 - 2 a p p e a r s e x e c e l l e n ts t a b i l i t y s oi tc a nb eg r e a t l yu s e dt o c u l t u r i n gs e a f o o d a n dp r e v e n t i n ga n dd e s t r o y i n gd i s e a s e si ns e a f o o dc u l t u r i n ga n dc r o p o f p l a n te p i p h y t ed i s e a s e k e y w o r d s ：s e r r a t i am a r c e s c e n s ；c h i t i n ；c h i t i n a s e ； p u r i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o n 2 ，。，。蠹耋薹纛茎耋耋主釜鹜警呈。蓦，。，。；黑。，。 前言 氕了“鬟( c h i t i n ) ，又称攀囊豢、荦竞震，怒迄今茇现懿爨然器巾 唯一一种带正电荷的搿食性动物纤维索，它是一种天然氨基多鞲e 是避霉袋褒滏嚣土零| 怒轰动鹣一秘薅熬貔凄。a 丁霞广泛分枣予 自然界中，在天然聚含物中熊贮量仅次于纤维索，是地球上第二 大擞物资源。然而，豳于它不溶予水、稀陵、稀碱和其它有机溶 裁，璇致长期疆来屁丁壤及筵酶簿产秘鑫没有受至l 薰筏。蠢剿 近几十年，它的理化特性、溆物活性、生理功能等才逐渐教人们 瘊认淡。 它能溶于胃酸，可被人体自身和食鼎中的溶菌酶等物质降解 或许多较小的分子，甚至摹分子。这榉宪戴熊穿透人体缀织，蕊 存程予巍液、淋巴、备脏器粒骨豁中，它其鸯人体亲帮德、杀麓 牲以及能排胆固醇、氯离予、重金属和放射性元素豹性熊，能够 蕊繇灌缩藏转移，添纯飘体缁胞，增强入体兔痰功能，谲整体液 酸碱度，从而对当前引起人们恐慌的非舆型性肺炎( s a r s ) 有 定颈转 擘爝，对瑗代人翳惠豹滢痖、一心麓盘簿瘸、糖屎菠、裹焱 压瘸、商窳瓣病、嬲辟病、辩病等有琢瓣的疗效。医此，适髓、 逶爨髓 态凡丁质，对维持掇终毽糜秽提褰撼瘸能力显键穗势爨 要。目前不仪将其作为功能憔保健食晶成用，而且用于菜些疾瘸 的治疗或辅助治疗也收到了w 喜的效果。在鄹本、韩国搬该产晶 嚣为绦跨穗瘫、预茨羧瘸、耱壹老纯籀饕建熬凌鹱洼绦憨食瑟， 丽鼠怒唯一被日本政漪准许畿传有疗效姻功能食品，又缀美国药 晶、鑫最警瑾弱援疆虢疑欧缀羝难生产，疆蠢箴为溅褰黛繇靛慧 养晶和保健品。随着现代医举、营养学和生命科学的发腥，科学 家们发现几丁质和壳聚糖( c h i t o s a n ) ，篡露特殊囊勺生物活燃和多秘 生璎溺苇瓤熊，可全方经谪节久俸瓿能，祷充入俸必需鸹纤维索， 增强机体免疫力，子1 9 9 1 年被国际学术器称为继蛋自质、脂类、 糖类、维生索帮矿秘鼷之器的夫类第6 生命要察。 山东大学硕士学位论文 几丁质在自然界几乎以相等的速率产生和消失，其降解主要 通过细菌和真菌分泌的几丁质酶来完成，或者通过脱乙酰作用形 成脱乙酰几丁质，再由脱乙酰几丁质酶降解。对几丁质降解酶系 的研究已经成为几丁质科学中的一个重要分支一一几丁质酶学 ( c h i t i ne n z y m o l o g y ) 。相对于几丁质研究中的其他方向，几丁质酶 学的研究发展最快，特别是发现了几丁质酶在生物体自溶，形态 发生和营养代谢中具有重要作用，同时几丁质降解产物在生命科 学、化工、食品工业、环境科学及农业等方面潜在的应用价值受 到越来越广泛的注意。 一、几丁质的分布、结构与性质 1 、几丁质的分布 几丁质广泛存在于甲壳纲动物、软体动物、昆虫、真菌、高 等植物以及海藻、动物关节、蹄、足等处，自然界每年生成的几 丁质大约有1 0 0 亿吨，是地球上除纤维素外数量最多，除蛋白质 外含氮量最高的天然有机化合物。几丁质作为多种物种的结构组 分，他们在生物界的分布大致如下： ( i ) 原核生物：虽然在化学组成上类似于肽聚糖的主链结构， 但是只有几丁质才能作为链霉菌芽孢的成分。 ( 2 ) 原生生物：几丁质可作为多种原生生物坚固的结构组分， 在纤毛虫和变形虫的孢囊壁中，在游动的硅藻中以及一些 绿藻和真菌细胞壁中都有分布。 ( 3 ) 真菌：几丁质普遍存在于真菌中，包括子囊菌、担子菌、 藻菌等含几丁质从微量到4 5 不等。据报道，像裂殖酵 母都已被证实含有少量却必须的几丁质。 ( 4 ) 动物：同脊椎动物不同的是，几丁质在无脊椎动物中是起 结构作用的物质。脊椎动物的关节、蹄、足的坚硬部分， 以及动物肌肉与骨接合处均有几丁质存在。蚕蛹的壳中几 丁质也不少。 n j 永大学硕士学位论文 兰皇曼鼍曼兰s , i l l l i l l l i 葛舅兰鲁詈詈曼皇皇詈皇皇墨暑黑嘲麓曹皇皇皇曼詈! 詈詈鼍! ! ! 邕鼎群皇! 皇皇曼 露翦，凡丁质帮壳聚穗主要是从虾、鬣竞中提取。由予虾、 蟹壳中的几丁质与蛋白质共价结合，以蛋囱聚糖形式存在，同时 伴生着碳酸钙，所以，融然制备几丁质的方法很多，但都大同小 异，主骚操作方法是脱镀和腮蛋白。如h a c k m a n 法、w h i s t l e r 和 b e m i l l e r 法、b r o u s s i g n a c 浚、p e n i s t o n 渡等。凌豆丁霞麓各壳凝糖， 主要方法是碱脱乙酰法，如p e n i s t o n 积j o h n s o n 法、k e n n e 和 l i n d b e r g 法等。由于目前人们所利用的几丁质、壳聚糖及其衔生物 主要怒邋过化学方法获得的，在制备过程中需用大量的酸碱，产 生大爨姻废承废料，严藏污染环境，教人们均姆e 光转囱了生物 方法。遴进徽皇秘陲释懿方法来获取窝巅强大量懿尼丁震、瓷聚 糖及其衍生物的优点是；产量大，效率商，人力、物力消耗少， 且不会造成环境污染。现在微生物降解几丁质、壳聚糖的方法已 经引起了人们广泛的关没。 2 、足t 瀵懿结梅 几丁质是n 一乙酰d 葡萄糖胺以1 3 一l ，4 一糖苷键连接越来的 直链多聚物，在自然界以各种结构类型存猩。目前，已经确定有 三种氢键相连的结晶体；n 一几丁质，由两条反向平行的链缀戚； 圣一足丁壤，由两条曩翔擎嚣链穆残；￥一足丁霞，壶三蘩镳篷 成，两条阉向，一条反向。近年来的研究发现，几丁质分予中盼 氨基弗j 全部置换成n 乙酰氨基基团，分子中还存在一些游离的 氨基基团，几丁质正是通过这种呈碱性的氮基基团与适当的离子 基团缝含成络舍物或者熬徐优合物。比如，在硅藻的脊上灏几丁 矮慈爱露荬恁结穗耪矮交联在一超；在囊藏缝庭壁孛，死了矮零 与b 一葡萄糖胺共价结合；在昆虫和其他无脊椎动物中，几丁质和 多种鬣自质联系在一起，以共价键或者非熬价键构成有序缡构。 几丁质也常涉及到与酚类以及脂类分子的栩互作用，并发嫩不间 程度豹矿讫 乍瘸，尤其怒锈化终用。 山东大学硕士学位论文 a b 图1a ：几丁质b ：脱乙酰几丁质 几丁质另外一个特点是它的去乙酰化作用，成为脱乙酰几丁 质，又称壳聚糖、壳聚糖，由n 一葡萄糖胺以b l ，4 一糖苷键连 接起来。脱乙酰作用在毛霉属的真菌中常有这种情况发生，这些 真菌的细胞壁中脱乙酰几丁质是主要的结构组分，另外在啤酒酵 母中脱乙酰几丁质是子囊孢子壁的主要成分。真菌中存在降解几 丁质的意义可能在于可以使它增加对几丁质溶解的抗性。降解也 可以发生在节肢动物中，这种降解可能与几丁质的结构需要经历 后来的延展有关。比如白蚁蚁后腹部的角质层，复眼的角质层等。 3 、几丁质的性质 ( 1 ) 几丁质的一般理化性质 前面已提到，几丁质是由数千个乙酰葡萄糖残基直线连接成 的线性多糖聚合物，有d 、1 3 、y 三种异构体。由f 不溶于水等， 在应用上受到限制，因而主要用来制备衍生物：一类是几丁质通 过脱乙酰基得到壳聚糖；另一类是几丁质彻底水解，最终产物为 氨基葡萄糖( 葡萄糖胺) 。采用不同原料和不同方法制备的几丁质的 山农大学硬士学位论文 i l l l 溶解度、分子量、乙酰基值、比麟度等有很大茇别。壳聚糖有d 、 两释异榴体。分予量约1 2 5 9 万，为无漠、鑫色或淡黄色结晶 性粉末或片状固体，在有机溶剂中不溶解。在浓酸中溶解并发生 降解，也可得到永解最终产物氨基葡萄耱。 ( 2 ) 物理性质 吸湿性 几丁质是高分子聚糖，因其分子中含羟基、氨基等极性基娜， 其吸湿牲强予由黎醇窝聚乙二酵，与透锈凄酸镳鹣吸滋性麴夔嚣 几，仅次于甘油，因此可用于化妆品。 藏貘瞧、残缝性 壳聚糖溶于水为粘稠胶体，可涂布在干燥玻片、纸张、橡胶 上，在玻鸶上霹戏为柔软透鞠蔟，骞一定抗控焱发，爨骞鞋瓣性、 通避性和防静电性。故可制成隐形眼镜片、美发护发用品。将壳 聚糠耪末懿成浓溶液，经湿法纺丝割褥继丝，篡丝线打结强度及 伸长率都很理想，敞可制成无纺布、手术缝合线、防火衣等。壳 聚糟静蔽潘惶、精弹性、成膜性耱纺织性，是开发各释医丽产晶 的熬础，特别是可制作手术缝合线、创可贴、人造皮肤膜、口腔 渍疡膜、越滤、反渗透、人工肾分离膜、止血丰孝辩、蓊褥载体簿， 而且利用其物理帆械性熊，制成粉状、膜状、胶状、棒状、针状， 徽球、颗糙剂等剂型。 ( 3 ) 化学健质 溶解性 几丁质为白饿无定形物质，由于分子间有强烈的氧键作用， 咒丁质不溶于水，可以滋凡丁矮在绝大部分滚裁孛娥予难溶状 态。据目前所知，几丁质仪能溶解于少数溶剂中，如六氟异丙醇、 六簸丙酮承讫物、毽乏咯浚黎夔戴纯铿溶液、一整氯酪秘滚酸簿。 壳聚糖分子有规熬性的立体构象和较强的分f 间氢键，在多数有 辍溶麓、承、碱串仍莲畈溶解。毽由予有氨摹，在舔羧中当 活殿足够等于一n h 2 浓度时，使。n h 2 质子化成n h3 + ，破坏原有 山东大学硕士学位论文 氢键鞠晶格，使分予膨胀并溶解。因瑟究聚糖可溶解在求援酸、 酒石酸、抗坏血酸等有机酸及盐酸、硫酸、硝酸、高氯酸簿无机 酸。巍聚糖的溶解度与戴分子量、脱乙觥度有关。一般说，分子 量越小，脱乙酰度越大，溶解度就越大。竞聚牾分子中的簸基f n h 2 ) ，曩奏碱性，因露，遥酸可敬生残慧粪，形残謦委蠢耱的 阳离予基团。 魇应性 儿丁质、壳聚糖在盐酸中于1 0 0 加热后发生水解，w 得到 氨蒸麓莓糖釜酸盐。冀辨，几丁质在浓碱f 4 0 6 0 n a o h ) 中 l o o 1 8 0 ( 2 热蒸，可黢去7 0 9 5 戆己虢基，生成壳聚耩。茬莞 乙酰赫程度与温度、时间、碱浓度有关，其分子量与所需时间有 关。巍聚糖含有多种功能基团，易发生酰化、酯化、羧基化、醚 化、磺酸他、羟基化、烷基取代等反应，通过化学修饰可擞成一 系列舆毒特臻功魏豹掰生耪。蘩巯酸跫鼗豢，其结褥与翳褰秘遥， 其蠢貔凝盘作鼷：壳聚糖与甲醛、成醛佟篇，生成交联瓷聚糖， 为一种阴离子交换树脂。 罄舍、吸附性 几丁质分子中含有羧基、氨基可以有效地螯舍或吸附滋滚中 懿羹袅攫蹇子、豢受惫麓载悬洼耪、骞裁纺f 翔絷辩、蛋褒瑗、 氨基酸、核酸、脂肪、蠢素等) 。可螯含企耩有h g 、p b 、z n 、 n i 、c r 、f e 、m n 、a g 、a u 、p t ，特别怒h g 、c u ，其次是f e 、 n i a 巍浆糖除用于贵熏鑫属( 包括铀、钚、稀土金属等) 捕黎分离 外，逑娥功豹嗣于镉、藜、铅、砷等的熬露。它的吸辩性搜它其 毒舔麓像护、赛重金震德嶷、凝集察澄i ；孽、瓣毒除污等重要劝麓， 除广泛甩于制药、化工精制分离等用途外，在食品业也有广泛功 能，如食品保鲜、饮料澄清、啤酒除雾、防腐、增稠等，烧现有 任何防腐剂、澄清剂等食物添加剂不能比拟的。此外，它逐能作 为农效、水产等生物瓒长翔，提裹生物抗瘸姥力。 啦东大学硕士学位论文 i i i 二、几丁质降解微生物及几丁质酶类 1 、几丁质、壳聚糖的嫩物降解机制 地球上每年几丁展的产出和消耗接：i 慝平衡，在这过程中微 生物越凑重要 # 用。诲多徽生勃具有分解几丁矮或轰聚耱鲍麓力， 霆为它露羹舅舞合成死丁蒺薅、壳聚羲稳、蔻丁囊聪乙蕺蘩薅等。 前面我们已经提到过，几丁质酶能水解凡丁质中n 乙酰，b ，d 。葡 萄糖胺间的1 3 一i ，4 一糖管键，是一种诱姆酶，几丁质、壳聚糖、 几丁二糖及部分水解的几丁质均能作为诱鼯物，而几丁单糖则不 麓。掇攒酶豹终矮部位秘酶解产兹豹不嚣，凡丁震酶可分为瓣耱： 癸讶鬃届丁质酶，竣足丁艨链静菲还原瞧寒端依次甥下几丁二糖： 内切烈几丁质酶，可在几丁质链的任一部位进行随机切割，产生 包括几丁二糖在内的几丁质寡糖。微生物几丁质酶绝大多数为外 切酶。遮两种几丁质酶分子水平的结构麓辫还未完全弄清，有待 于避疹磺究。麦聚蕤瓣戆终臻羁足丁凌麓糖鸯羹，缝拳辩炎聚糖 筚侮葡舔糖胺闯的一1 ，4 一糖营键，程傻壳聚糖逐步降解。几 丁质脱乙酰基酶最初是从真菌毛霉m u c o rr o u x i i 中分离纯化出的， 该酶魁微生物中降解几 ”质的主要反应机制酶之一，可催化脱去 几丁竣中n 乙酰葡萄糖骏上的乙酰基，馊之变成竞聚糖。该辩参 与奏蘩缀藏鏊煞形藏，与奏蘸在塞溶_ l 妻稔申缓戆壁裘艇毒荧，最 近又发现它参与植物和瘸原微生物的相甄根用。它在自然界的几 丁质降解中具有重要意义，在壳聚糖的酶法生产中具有巨大的应 用前景。 2 、建t 麓酶豹分类 嗣前，国际上对几t 质酶的分类方法不尽相同，但主嚣脊以 下几种方法： ( 1 ) 根据对几丁质的作用方式可将几丁质酶分为外切几丁威酶 移内识a 丁震酶，兹己述疑。 ( 2 ) 校攒酶盼分子结稳，s h i n s h i 等学者建议涛尼丁质酶分为三类 ( c l a s si 1 1 1 ) 。c l a s si 的特征是含有几丁质结合域( c b d ) 和催化 区，中间有可变交联区逢按。c l a s s i i 的主结构区与c i a s si 的相似 挚 山东大学硕士学位论文 i i i i l l l l l l 整是缺乏c b d 。c l a s s l i l 与髓两类凡丁屡酶璃不相露，毽无c b d 。 ( 3 ) 根据几丁质酶研究的深入以及分子生物学的发展，现在多将 几丁质黼分为六类。即( c l a s si 一) 。c l a s si 为碱性蛋白，主要 分布予滚泡中，在氨基酸结构上是由三个区域组成，有两个高度 保守区，二考中越具有哥交送。n 一末糍保守嚣是富含，令半麓氨 酸的几丁质结台区( c h i t i n b i n d i n g z o n e ，谯明h e v e i nz o n e ) ，约 4 0 个氦糖酸，这与麦芽擞鬃素及橡胶蛋白( h e v e i n ) 的结构鼹同源 性。有研究报道，橡胶爨白能与几丁质酶发生结合，在浓度较低 的情况下就熊对病原藏趣抑制作用。因此，这一结构域可熊参与 帮霓丁壤瓣缍合；c 一寒壤楚酶嚣催纯区( c a t a l y s i sz o n e ) ，怒尼丁 质酶起催亿作用的区域，也是几丁质酶的主要结构区域，二者是 通过一个多变的交联区( h i n g e ) 联接在一超。几丁质结合隧和催 化区怒两个高度保守区，而交联区是可变区。c l a s si 类几丁质酶 能被瘸琢蓠及其激发子、乙烯等因素所诱嚣，在体舞具有撩薅活 往；c l a s s i i 尼丁震酶是酸缝蛋叁，主要分露翟缎廉阉豫。与c l a s s l 类酶比较，其主要结构的氨基酸序列类似，但仅有类似c l a s sl 的酶催化区，而没有几丁脯结合区和交联激，它能被病原麓诱导， 在体外滗抑菌活性；c l a s s l i i 类几丁酶也为骏性蛋白，定位于胞间 骧。郝分戴基酸颞序毙较淡鞠，在氨萎酸露剃主弱释之翘其露缀 离酶露滚往，僵与i 、l l 焱酶无丽漂性，墩无凡丁囊结合酝。这 类酶虽艇溶菌酶活性，假据对其疏水群的分析，它具有一个含4 个天冬氯敬和谷氨酸残蕊的活性部位，能被瘸原菌、水杨酸诱导： c l a s s i v 类几丁质酶在结构上与c l a s si 搁似，也是由三个暇域组 瘫，毽凌足丁矮缝台嚣饔德铯送竣失了一魏氨基酸，魄c l a s sl 豹 氨基酸痔捌要少4 0 一5 0 个然基酸残基，这类几丁质酶成熟络梅序 列只含脊2 4 1 2 5 5 个氮熬酸，而c l a s si 炎酶含有3 0 0 个氨撼酸。 c l a s s i v 中成员之间的同源性在5 6 一6 3 之间，两与c l a s si 成员间 的同源髋是4 1 一4 7 ，但二卷在血清学上是不同豹；c l a s s v 类几丁 震酶是凌m e l c h e r 豢遂懿，葵净弼与绥蘸b a c i l l u sc i r c u l a 嚣s f 巧攒旁 孢稃麓) ，s e r r a t i a m a r c e s c e n s ( 黻鹱渗霉魄菌 孜s t r e p 。m v c e s p l i c a t u s n 够皱症 雾菌j 分泌到胞外的几丁质酶主要序列同源，是 出衮大学矮学毽论文 烟蕈在受到辨界胁遮诱导下产生的，已缒化剿疆融与之鞠关豹几 丁骥酶，分别为4 1 k d 精4 3 k d ，在n 端含育两个重复辩剐的几丁 质缩台区；c l a s s v i 在甄基酸序列上与前赢种无相似性。 不强裳懋弱且丁骥簿疑蠢不弱豹定挝。逐露c l a s s 类躐瞧凡 t 威酴定位于液泡中，褥其京酸性酶刚傻子服阀陈。一蹙研究诞 鹗，缨瞧逛凡丁矮酶黔定淀分奄与多欺鹣c 鲻涝捌有关。遴鬻 l 、 i 激几丁质酶与c l a s sl 类比较不仅缺滗n 端富含半胱氨酸的结 构域，丽且缺乏c 端序列，因而分泌予胞外。 3 、微生物几丁质酶及特性 鑫1 9 0 5 年b e n e e k e 蓄次报道了b a c i l l u sc h i t i n o v o r u s 足t 聱 孢杆菌) 能够产生几丁质酶以来，人们又相继巍多种微生物中发现 了几丁质酶釉壳聚糖酶。1 9 2 1 年，f o l p m e r s 发现了分解几丁质的 真蘩溜藏线麓在含有死丁葳鹃骧瘴上形成透骧瀚，获两话绢了这蹙 培势物内蠢炊溶性的几丁震憨的存在。1 9 3 8 年，z o b e l l 和r i n t e n b e r g 对海洋蓬的分解几了藤的缡德实验表嚼，凡丁艨的分解悬蠢予糖箭 键的断裂或氯基基团的脱落而致。1 9 2 9 年k a r r e r 和h o f m a n 用蜗牛 酶穗8 5 懿尼丁囊转织建n 己蔑氢基穗饕赣 n a g ) ，极大鼹臻鞠 了几丁质结构单位豹研究。1 9 3 1 年，g r a s m a n 翱r u b e n b a u e r 发骥 夔霉( a s p e r g i t l u s ) 熬墙葵液提取耪蕤熬尼丁溪分解痰臻霹捡测爨 来的还原物质。1 9 3 8 罐，z e c h m e i s r e r 镎证明沓胚乳中含宵葡萄糖 苷酶( 8 - g a l a c t o s i d a s e ) 和几丁绶酶，辩证明了凡丁质酶累中禽肖 轰二耱酶( c h i t o b i a s e ) 。1 9 5 0 年，j e u n i a u x 发璐献蜗牛弱遵中分裘 出的分解几丁质的缎麓巍从壤中分蔫出豹放线菌能产擞腿辫见 丁鹰酶，藏詹久稍又胰多种微生秘( 毽瑟缩菌、放线蘸、粪菌) ， 多种植物和动物中分离到了几丁质酶，弗对几丁质酶的理化特性及 耋终学季挚豫避幸亍了涤入麟突。 绷菌；释解几丁质的细藤分布广泛，g + 和g 一菌的许多餍帮 餐产生几丁豢簿，亵海洋孛，垂l 予浮游艇秘亵生长中毒麓薅熬羧 壳，积累了大量儿t 质，其降解菌主要以弧菌和发光细灏为主； 由焱大学硕士学整论文 土壤中禽肖大量分解凡丁质的细菌，由予壤环境鞍分离方法不 同，所报道的数目和种炎淡化较大。几丁爨糖和低水平的n 一兹酰 葡萄糖胺对细菌几丁质酶的诱导作用，具有慝重要的生态学意义。 真蘸：从壤中可以分离到一些降解凡丁质豹真菌，其分解 活经帮镶毽穗骰，菜些聚裘甚至超过绥菠，多数是d e u t e r o m y c e t e s ( 半知灏纲) 莉a s c o m y c e t e s ( 子囊聋纲) 0 弧a s p e r g i l l u s v e r t i c i l l i u m ，t h i e l a v i a h u m i c o l a ) 。这些种类的真菌嶷有特征性的诱导几丁质酶分解系统。 黻藏、嚣生动耱嚣藻类：糕菌缨静禁蹙耱类富舍足丁凌瓣， 饲翔：p h y s a r u m p o t y c e p h a l u m ( ：多买鳃落鳓产生鲍凡丁震酶笺合俸 系，土壤中的变形虫可以产生几丁质酶，参与几丁质颗粒的消化， 具有吞噬作用的纤毛虫可能具有消化几丁质的能力。有些硪藻能 够在真麓菌丝体上打洞翳吸取细胞液丽取食，几丁质酶在其中起 了关键雩罄翅。 微激物凡丁质酶对酸溅度及温度懿逶皮性较强，一般在p h 3 一1 0 范围都较稳定，温胰在4 6 0 均有酶活性；酶作用的最适 温度多农5 0 一6 0 ，濑度过高，酶活力襻易丧失。在一2 0 保 存，二警聪仍有酶活力。f e ”、f e 2 + 、z n 2 + 离子对酶的活性奔较大 静静蠲掺掰，瑟m 9 2 + 襄m n 2 + 离子蘩有一定鹣激活终熏。酶懿等逢 点一般程p h 3 6 8 6 之间。微生物几丁质酶的分子量范围一般在 1 9 1 1 0 k d 之间。微生物几丁质酶对底物具脊一定的专一性，一般 都可水解粉状几丁质，胶状几丁质，可溶性几丁质衍生物如乙二 醇凡丁矮鞠二乙醇几丁质及可溶牲的凡丁三糖、霆糖、戊耱帮己 耱等凡了寡耱。不髓永解澄芽耱、淀粉纛绥维素等壶足下二耱经 糖苷镳涟接而成的糖类。有的微生物如棉花黄萎病菌，金龟予绿 僵菌产缴的几丁质酶还能水解脱乙酰几丁脯。 目前看来，微生物几丁质酶大致有如下特性： 多撵毪 不黼微生物所产生的尼丁质酶鲍类剐、性质不尽裙同。魏： 链霉菌( s t r e p t o m y c e ss p a t c c l l 2 3 8 ) 产生两类几丁质酶，一类是内 切酶，鹦“一类是外切酶，而多数微生物只产生外切酶。东方诺卡 山东大学硕士学位论文 氏蘩( n o c a r d i ao r i e n t a l i s ) 蘩罄豹最适p h 5 。0 ，瀑疫为7 0 一7 s 。不 同来源的几丁质酶的分予鳖、等电点、影晌辩活性的金属离子等 也均存猩明显差异。 诱导性 多数微生物在含有凡丁矮培养基中才魏产生且丁质酶，怒诱 导酶。死丁震酶霜蠢些纾维素酶一襻是逶避诱导产生夔。a 了震、 脱乙酰几丁质、几丁质二耩及部分永解的几t 质可作为诱导物， 而几丁脯单糖则不能作为诱导底物。产生几丁质酶的微生物，一 般都熊猩以几丁质为主嚣碳氮源及一些微擞元素培养基中良好生 长，p h 7 0 左右，培养4 一1 0 天酶活性最鼹。毽足丁质来源不阉， 镦生貔秘耀几丁震效率耪产酶效率菇不蠢，这是获事镦生褥凡丁 质酶工作很重要的一条缀验，因为笔者在实验过程中使用了不同 来源的隔内外多种几丁质，其产酶曲线是不尽相同的。 分泌性 褒诱霉秘存在豹条终下，锾生兹产生黪巍魏努分泌且丁矮鹣。 b r u r b e r g 等磺究发现死丁旗酶只分泌裂缀臆静周闻质中，然两霄些 科学家则认为是分泌到腮外的。目前，关于分泌的具体机制尚不 清楚，但在认为其与酶的信号肽有关上大家达成了共识。假对信 号肽怎样引导及有的酶类弗不存在信号肽尚凭法勰释。 4 、 徼嫩锈几丁质酶帮壳聚糖酶的分子生物学特征 微缴物几丁质酶基因的表达是受受体诱导物系统所控制 般以几丁质或其降解产物作为诱导物。u l h o a 和p e b e r d y 认为几丁 质酶鏊瑕的诱导谊号是与缨胞表面不溶链聪物静匏理接皴蠢荚， 若磐筵，产足丁震酶徽系豹豹表嚣应当毒死丁厦浆专琵蔑受体， 但至今尚未证实。进一步的研究表明，几丁质酶的诱导也受8 。羟 基喹啉和放线菌酮的抑制，由于它们分别最r n a 抑制剂和撩白质 合成抑制剂，所以认为几丁质酶的诱导是从头合成的，即要经过 转录翻译戆过程。蘩萄耱戆翔裁几乎所套微生臻产生死丁璇懿， 氇浚磺微生谚几丁餍酶纂嗣静调控可髓渗及分解代滚耪隈遴机 制。 山东大学硕士学位论文 隧饕分子生鐾学技零豹逐蘧发震，辩攀_ i 痒考逶过大蘩瓣实 验，已发现了多种几丁旗酶和壳聚糖酶基因，检测或推断出它们 的序列缀成、结构，并将该基因进行克隆，构建出各种高效裟达 的基因工程产物。几丁成酶基因的结构与原核生物基因结构淡似， 由启动予、s d 序列缡戳送帮终止子序戮缎残。在研究镶裙莹 ( s t r e p t o m y c e s ) 豆丁震瓣豹毫凌子露，发溪其中懿藤淹重襞痔列 ( 3 5 0 b p ) 既负责对葡萄糖的抑制反应也负责跗几丁质诱导的反应， 并且发现起始密码子上游的。1 0 ，一1 2 ，一3 2 ，3 3 ，3 5 ，3 7 中的一个发生 突变就余使启动子失效。编码区通常可分为：分泌信号肽、催化 区、糕骚垂疆鍪曩源嚣耧咒丁覆结合嚣嚣令缝稳域组藏。滁了经 诧区程缨蘩中其有较离隧源性乡 ，其它的绫梅域差异较大。磷究 表明，多数细菌几丁质酶慕因以单拷贝形式存在于染色体上，其 有独立的启动子和终止予。此外，有些细菌的几丁质酶基网逐出 现在染德体上成簇排列的现象。 憋静谖来，嚣蓑象发臻夔镦生蘩咒了殿薅，英分子寄巍拿维 梅域，辩所谓酶催他结构域稆几丁质结合络稳域。成对比较联蓠 所知的所有细菌几丁质酶的催化结构域和几丁质结合结构域，发 现催化结构域相似性所占的百分比与几丁质结合结构域相似性所 占的酉分比之阕并无壹接芙系，说职这弼翻；结捣域是单独进化的。 纛簸不弼繇凌中分离褥别鼹羰生穆死丁袋瓣鏊因震其毒一定豹麓 源性，液明这些微生物可熊具有很远的进化关系。 三、凡丁质生物降解转化豹瘟媛 l 。蔻了震浚降解产物懿纛建 几丁质是自然界广泛存在的种可荐嫩的氨基多糖，前边我 们已经提过，整个生物圈姆年新增约一百亿吨。目前，国内外对 这类生物资源的开发利用产生了浓厚的必趣，在轻工、食蹄、医 药秘农觳等吝令领域誊蠢霹喜兹骚究残暴。毽垂手在实嚣癍耀孛 瑁量禳少，所以仍存在鬻严重的资源浪费，丽对环境污染阔遂也 越来越不容忽视。 4 山东大学硕士学位论文 几丁质对动植物而言是一种较难吸收利用的氮素来源，但通 过自然界存在的产几丁质酶的细菌、放线菌和真菌等微生物，可 以将几丁质有效地降解，并作为碳氮源加以吸收利用，进而转化 为菌体蛋白，这就为人类食品和动物饲料提供了一种潜在的蛋白 质资源。目前国外已就几丁质的降解及生物学转化开展一系列研 究。我国拥有漫长的长达18 0 0 0 公里的海岸线，几丁质资源极为 丰富，如果能通过生物技术变废为宝，不仅能保护环境，而且将 产生巨大的经济效益，因此目前国内学者已开始关注这一问题。 研究发现，壳聚糖是阳离子高分子物质，具有爽口甜昧，类 似砂糖，当它进入人体后，能聚集在带负电荷的脂肪滴周围，如 甘油三脂、脂肪酸等，使这些高能物质不被人体吸收而排出体外， 从而减少食品所提供的热量，达到减肥的目的。另外，壳聚糖是 阳离子膳食纤维，能和氯离子结合并排出体外。所以，将壳聚糖 添加到食品中，能防治人体因摄入过多氯离子而导致的高血压症。 胆汁酸是胆固醇在肝脏内转化生成的消化液，而且胆囊中有一定 的储量。研究表明几丁质和壳聚糖与体内胆汁酸具有较强的结合 能力，其作用机理与消胆胺基本相似，效果甚优。由于壳聚糖良 好的选择吸附性，通过对血液中低密度脂蛋白胆固醇的选择性吸 收来降低血液中胆固醇含量。为了保持胆囊中有一定的储量，胆 固醇在肝脏中加速转化生成胆汁酸，从而大大减少了进入血管中 的胆固醇的含量。将壳聚糖添加到食品中，食用后就可达到防治 心脑血管疾病的目的。几丁质的降解产物n 一乙酰葡萄糖胺能刺激 肝脏的迷走神经支网，引起全身副交感神经兴奋而使细动脉扩张， 血液流量增加，使肌肉细胞的氧气、血糖、脂肪酸的供量增加， 细胞间质中的二氧化碳和水分被排除，p h 值就会上升，胰岛素的 敏感度就会增加，从而缓解糖尿病症状。壳聚糖还可以通过调节 内分泌系统，提高能分泌胰岛素的细胞的数量，因此对糖尿病的 并发症的防治也很有效。 几丁质及其降解产物还具有保健功能，其保健功能并不限于 某些特定的器官，而是作用于人体全身。作为一种生物活性的天 然高分子化合物。其基本单位n 乙酰氧基葡萄糖是构成人体的重 山东大学硕士学位论文 要凌袋透餮囊羧戆缝戏攀元，与久薅蠢缀妊豹亲窝楚，鬣攘斥 作用。校据前面提及的功钷，割成以壳聚糖为主要原料盼惫物保 健品，也可以直接装入胶囊服用，不仅有刹于人体肠内双歧杆菌 的增殖，同时可抑制肠内有毒菌和腐败物质生成，增加人体内纤 维素的矮和量。作为人体於血剂一一可滚性铁壳聚糖络合物的暇 竣效暴徒子硫酸耍铁羚纛麓，壳聚耱与潼簸、亚i 盎酸等穗耱羧翻 成的可溶性壳聚糖一一臌肪酸络合物添加到减肥食品中，一方面 减少脂炎物质的吸收，促使其排出体外，搦一方面因与食晶中的 脂肪发嫩络合作用丽能肖效降低摄取的热爨，使食物热量大大下 降。 努终，篷霉雩| 莛重浚酶燕豆丁质舔分承解产生静氨鏊耱寡糖 素的研究进展。近年的研究结果表明，氮慕糖寡糖素在调节渤植 物细胞生命代谢活动中越着非常重要的作用。氨基糖寡糖索在动 物肠道中可调节微生物的代谢活动，改善肠道微生物区系的分布， j | l | | 激鸯聪予动物建康约徽黧戆f 擞双竣抒蘩、羲羧蓥) 戆生长；戴羚， 它其蠢擒商机体免疫力、掷制瓣瘩缨脆生长、降低盘压等象瑾活 性，同时还有抗菌防腐、保水保湿等功能性质。因此，氨熬糖寡 糖素裰医药、食品、化妆品等行业具有广泛的开发前景。同时， 氨基糖凑糖素可作为植物功能性调节剂，调节植物基因的荚潮茅 嚣蔽，诱导獯凌分泌凌魏懿，不毽胃淡调警壤携生长，又霹壤强 植物对瘸原性真菌敕摅性。为了获得具裔象物活性的氨萋糖寡耱 素，生物降解法具有不可替代的优越性，如反应条件温和，容易 控制，并可避免寡聚体结构的破坏。 事实上，2 0 0 0 年以来酌近几年中，我们隧续看到有关凡丁成 蹲簿产魏在莺内多 熬逐步广泛使震，在蘩瓣葶爨霹本( 蠢零y s k 公 司就怒专业生产几丁质降解产物的) ，几t 赝降解产物已经被应用 于食品界、医药界、化妆牖界。令我们欣喜的是，在我国潲到广 东，北刹黑龙江，以及我们山东省内的烟台、济南均已有相关公 司产翕e 帝，其中还包撅海归派学子剞楚戆赫型毫技寒企渡，这 一切舔瞪示着有关予死丁获降解产穆穰凡t 殛酶静相关产渡正逐 步走进“大群众的r 常生活中。 由畚大学颈士学位论文 2 几丁质酶在生物防治中的应用 峦于诲多癀暴爨蘧窝撬蛊敬足丁矮圣棼必基本结槐戏谂，死丁 质酶在生物防治中舆有重要作用。几丁质及其衍生物具有很强的 蘩藿锋霜，攘蓥作蠢l 夔死了蕨魏分子量瓣箨低孬灌强，龙戮稳分 子量为1 5 0 0 左右的低聚壳聚糖即氨基寡糖索的抗菌效果最好。壳 聚糖篱抗穗帮g 蕊戆抗蒸活洼，对g + 嫠翁敏感往嵩予g 。藿。当 壳聚糖浓度为5 m g m l ，壳隳糖的抑制g + 荫的抑菌率达7 5 1 0 0 ， 两对夭部分g 静静德率只在2 0 3 0 。壳黎糖静抗菌活经陡其浓度 增加而增强。试验袭明壳袋糖对照曲霉和寄生曲霉的生长以及黄 趋霉鬻素静产生稳肖捧裁佟魇，冀最佳抑茵浓度3 5 m g m l 。a e g h a t h 等研究发现巍聚糖具有抗真菌活性。壳聚糖在盐酸和醋黢溶 液中溶解后，其有一定的成膜性，可将箕涂于水果、蔬菜的表面 起到僳鲜的作用。s i v a n 和c h e t 获褥一株熊强烈分解凡丁质的真菌 木霉t r i c h o d e r m ah a r z i a n u m ，认为对许多植物致瘸菌的控制很有潜 力。除了应煺微生物外，搬有许多把几丁质施入壤以达到生物 防治的报道，认为它能刺激土壤几丁质分解菌的生长，诱导植物 分泌凡丁质藩，从黼增强攘貔抵抗瘸原懿感染魏害虫蜓戆力。 3 。几丁质酶崔抗瘸蒺困工程孛麴戏曩l 几丁质酶与植物防卫反应机制密切相关。许多离体抑菌实验 表爨，且丁矮酶怼戆壁孛禽有足丁葳戆粪墓毒擦涮俸瘸。茭终弱 机理可能是由于几丁质酶能够分解真菌的细胞壁。2 0 世纪求， t o y o d a 飘s t r e p t o m y c e sg r e s e u s 褥翻纯毒乏豹尼丁矮酶，强用这耱趸 丁质酶处理离体的大麦胚芽鞘以观察对于小费白粉黼( e r y s i p h 口 g r a m i n i s f s p h o r d e i ) 戆澎穗，缭莱发臻在短矮黪2h 内，病麓吸 器便被完全消解。当改变试验方法，以活体大麦胚芽鞘替代离体 静大麦轾芽鞘，荠将尼丁震酶注鸯孛律内，结莱离现两静情猛：正 在发商中的病菌吸器被完全消解；而已经成熟的病菌吸器经几丁 质酶箍理并采改变箕形状，僵菌缝酌 牵长却受到稚箍。基予这 研究结果，通过基因工程手段将几丁质酶基照导入大麦，玎望 山东大学硕士学位论文 获得抵抗白粉菌的大麦新品种。电镜观察结果熙示，几丁质酶常 作用于菌篓顶端新合成的几丁质藏，使顶端壁合成中的代谢平衡 被破坏，使顶端膨胀并融解，从瓶达到翔菌效果。从真菌胞壁组 成结构着，菇成熟胞壁最外层为凭定形葡聚糖朦；次外