DNA印迹与杂交技术.ppt

第三节核酸分子杂交技术,DNA印迹与杂交技术RNA印迹与杂交技术,一、分子杂交的基本方法,Southern印迹法Northern印迹法斑点印迹杂交原位杂交Western印迹法液相杂交,固相杂交,二、核酸分子杂交的基本原理,具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知核酸序列称探针。,HybridizationofNucleicAcids,RNA,DNA1,DNA2,DNA,Southernhybridization,Northernhybridization,探针,（一）DNA变性与复性,DNA变性1、定义：某些理化因素导致两条DNA链间的氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性。,2、变性的方法：（1）热变性：温度升高到90100时，双链核酸分子链间的氢键完全断裂。（2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核酸分子链间的氢键断裂。（3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使双链核酸分子链间的氢键断裂。,3、变性后的理化性质变化：粘度降低密度增加紫外吸收值增加,复性1、定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。,2、复性过程（1）单链分子间碰撞形成局部双链（2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离（3）局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列（4）形成完整的双链分子,核酸的分子杂交,将带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混合在一起，其相应的同源区段就会退火形成双链结构。如果退火的核酸来自不同的生物有机体，所形成的双链分子就被称为杂种核酸分子。,三、SouthernblottingDNA印迹与杂交,1975年，英国EdwenSouthern创建定义：检测DNA杂交方法，即将DNA电泳分离、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。应用：基因组DNA的定性和定量分析基因诊断、分子克隆、法医学等,在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都必须通过毛细管或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”上去的，因此，核酸杂交也被称为“DNA印迹杂交”。,材料：尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜、二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE）,步骤：,第一将分离的核酸样品转移到固体支持物滤膜上核酸印迹转移,电泳凝胶核酸印迹法、,斑点和狭线印迹法、,菌落和噬菌斑印迹法,第二是将具有核酸印迹的滤膜与带有放射性或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交,杂交模式图,Southernbloting的主要步骤,1.待测DNA样品的制备、酶切2.待测DNA样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳3.凝胶中DNA的变性：碱变性4.Southern转膜(印迹)：毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法5.Southern杂交(预杂交、杂交、洗膜)6.杂交结果的检测,Southern凝胶转移杂交技术,1.待测DNA样品的制备、酶切DNA的提取原理：裂解细胞，使DNA释放，交替使用酚、氯仿两种蛋白质变性剂，有效去除蛋白质标准程序：酚酚-氯仿氯仿。,步骤解析,2.待测DNA样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳,bp1534994695515377237,ABCM,琼脂糖凝胶电泳,3.凝胶中DNA的变性：碱变性,凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的单链DNA，中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液。,4.Southern转膜(印迹)待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（如纤维素膜）上，即印迹。,4.1固相支持物的选择（1）理想的固相支持物应具备的特性具有较强结合核酸分子的能力不影响与探针的杂交反应与核酸分子结合稳定牢固具有良好的机械性能非特异吸附少,4.2常用的固相支持物硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本底低。缺点是DNA分子结合不牢固尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能力较上述两种膜低,4.3Southern印迹的常用方法（1）毛细管虹吸印迹法,利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。其基本原理是：容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上。,（2）电转法,利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。,（3）真空转移法,此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。,各种转移方法的比较i)毛细管虹吸法：操作简便，不需要特殊转移仪器，但转移效率低,（扩散法为70%，毛细管法80%）耗时多。ii)电转移法：效率高，耗时少，需特殊转移仪，对转移条件要求较严。iii)真空转移法：效率高，耗时最少，需特殊真空转移仪。,转移的最佳条件i)固定基质的选择ii)转移前预处理：DNA和RNA分子变性，蛋白质则需除去凝胶中的SDS。iii)大分子的转移对于分子量较大的DNA片段，必须进行原位断裂后再进行转移，断裂DNA分子最佳长度为1-2kb。其步骤是：0.25MHCl处理凝胶两次（每次15分钟）水洗0.5MNaOH/1MNaCl两次，每次15分钟转移。,5、Southern杂交1、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点预杂交液为不含DNA探针的杂交液2、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交3、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的DNA,6.杂交结果的检测,化学显色或放射自显影,标记的探针,探针,探针技能，它是指利用标记分子对其它分子的识别性而实现对后者进行检测的一种技能，我们把标记的分子叫探针（Probe）从化学和生物学意义上理解，探针是一种分子，它带有供反应后检测的合适标记物，并与特异靶分子反应。如抗体-抗体、外源凝集素-碳水合合物、亲合素-生物素、受体-配基（Ligand）以及互补核酸间的杂交均属于探针-靶分子反应。,（一）探针的种类,基因组DNA探针cDNA探针RNA探针寡核苷酸探针,（二）标记物理想标记物应具备的特性：,高度灵敏性不影响碱基配对的特异性不影响探针分子的主要理化性质对酶促反应活性无影响或影响不大检测方法具有高度灵敏性和高度特异性,标记物种类,核素标记物：32p、35s、3H非核素标记物半抗原：生物素、地高率配体：生物素是亲和素的配体荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等化学发光探针：标记物与某种底物反应发光，如生物素酰化的碱性磷酸酶可使发光底物发光,（三）标记方法体内标记法：将核素标记的化合物作为合成代谢的底物，在细胞合成代谢时使核素掺入到新合成的核酸分子中，如3H-胸苷可掺入到DNA中，3H-尿苷可掺入到RNA中,体外标记法：化学标记法：标记物分子上的活性基因与探针分子上的某些基因反应，标记物直接结合到探针分子上酶促标记法：标记物预先标记核苷酸，然后利用酶促法将标记的核苷酸掺入到探针上,酶促标记法切口平移法（nicktranslation),1、利用DNaseI在DNA双链上造成单链切口2、利用大肠杆菌DNA聚合酶I的53核酸外切酶活性在切口处将旧链从5末端逐步切除3、在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，以互补的DNA单链为模板依次将dNTP连接到切口的3末端-OH上，合成新的DNA链，同时将标记的核苷酸掺入到新的DNA链中,随机引物法,其原理是随机引物能与各种单链DNA模板结合，作为合成新链的引物，在DNA聚合酶的催化下，按53方向合成一新的DNA链，其核苷酸序列与模板DNA完全互补。另一单链DNA模板同样合成一条新的完全互补的DNA链。合成时，带放射性核素标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中,随机引物法所具有的优点：1、能进行双链DNA、单链DNA或RNA探针的标记2、操作简单方便，避免因DNaseI处理浓度掌握不当所带来的一系列问题3、标记活性高，标记活性可达108cpm/gDNA以上4、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记,（四）探针的纯化1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可去除dNTP和蛋白质2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷酸（80bp)等物质分离，常用凝胶基质是SephadexG-503、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此法则是利用离心的方式来纯化探针,四、影响杂交的因素1、核酸分子的浓度和长度：浓度越大，复性速度越快分子越大，复性速度越慢单链探针，浓度增加，杂交效率增加双链探针，浓度控制在0.10.5g，浓度过高影响杂交效率,2、温度：（1）DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低2025（2）RNA/DNA或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低Tm值（3）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5,3、离子强度：（1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率增加（2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度,4、甲酰胺：（1）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在3542杂交（2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶液在68杂交,5、核酸分子的复杂性：（1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长度；（2）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对杂交率取决于DNA的相对复杂性。,6、非特异性杂交反应：（1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异性吸附（2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脱脂奶粉。,五、其它分子杂交方法,Southern印迹法Northern印迹法斑点印迹杂交原位杂交Western印迹法液相杂交,固相杂交,（一）Northern印迹杂交1、Northernblot印迹杂交是指待测RNA样品经电泳分离后转移到固定支持物上，然后与标记的核酸探针进行固-液相杂交。2、基本原理和基本过程与Southernblot基本相同3、鉴别RNA4、探针可用DNA或RNA片段5、待测样品为总RNA或mRNA,IsolatemRNA(DifferentLengths),ProbewithlabeledDNA,Northern印迹与Southern印迹的不同点1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳中不变性2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理，Southern印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理3、靶核酸为RNA,（二）斑点印迹杂交(dotbloting),将RNA或DNA变性后直接点样于纤维素膜或尼龙膜上优点：简单、快速、可同时检测多个样品缺点：特异性不高、不能鉴别核酸分子量应用：确定DNA样品之间的同源性,（三）核酸原位杂交(insituhybridization),1.定义：将标记的探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交检测的方法。2.特点：能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究不需从组织或细胞中提取核酸能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态,核酸原位杂交的基本步骤,1.细胞或组织的固定：载玻片2.组织细胞杂交前的预处理用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质3.探针的选择和标记4.杂交5.杂交结果检测,1.荧光染色体原位杂交(FluorescenceinsituHybridization；FISH)基本原理是将DNA探针用荧光染料标记，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体上，来检测DNA序列在染色体上的定位。2.多色荧光染色体原位杂交(multicolorFISH;mFISH)3.比较基因组原位杂交(ComparativeGenomicHybridization；CGH),由原位杂交发展起的一些新技术,多色FISH（M-FISH技术）,荧光原位杂交,比较基因组原位杂交(ComparativeGenomicHybridization；CGH)利用两种不同的荧光分別标记两种不同細胞的GenomicDNA，再同时与正常的染色体进行hybridization，染色体上不同荧光间的强弱比值，由此比较而观察基因组中特定基因的拷贝数变化。CGH主要用于检测肿瘤组织DNA拷贝数变化（缺失、复制、扩增），并能将这些异常在染色体上定位。该方法通过同一次实验即可扫描整个肿瘤基因组DNA序列的增加或丢失。,（四）Western印迹法(Westernbloting),检测蛋白质，