（植物学专业论文）重庆特有植物缙云黄芩种群遗传多样性分化研究.pdf

摘要 曼曼曼皇曼曼曼量皇曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼皇i _ e 一。 i 曼曼皇曼曼皇量鼍曼曼曼皇曼曼曼曼曼曼曼曼 重庆特有植物缙云黄芩种群 遗传多样性分化研究 植物学专业硕士研究生：张家辉 指导教师：邓洪平副教授 摘要 缙云黄芩( s c u t e l l a r i at s i n y u n e n s i sc yw ue tc h o w ) 为唇形科( l a b i a c a e ) 黄芩属 ( s c u t e l l a r i al i n n ) 多年生草本植物，现仅存于重庆市缙云山少数相互隔离的“岛屿”状分布 的区域内，且数量正急剧减少，分布范围逐渐缩小甚至消失，具有濒危植物的特点。本研究 以目前仅存的1 0 个缙云黄芩种群为研究对象，采用形态学标记、h p l c 和i s s r 分子标记技术， 从形态学、生化和分子水平对缙云黄芩种群及个体的遗传多样性分化开展综合比较研究，以 期对其遗传多样性进行科学评价，为该物种及其它地方珍稀特有物种的保护、开发和利用提 供理论和实践依据。 经研究分析，得到如下结论： 1 ) 形态学水平的研究：对缙云黄芩包括茎、叶、花及果实在内的5 6 项形态特征进行测 量和统计分析，有4 5 项指标差异显著，占8 0 3 6 ，其中4 2 项达到极显著水平，占7 5 ，表 明形态特征在不同缙云黄芩种群间总体上差异显著；其中性状差异程度依次为花组 叶组 茎 组 果实组，特别是果实组的差异程度远小于其他三组。野外调查发现，缙云黄芩不同种群间 在营养器官尤其是叶的表观特征上出现较大差异，个别种群出现了叶表面光滑无毛或叶边缘 近全缘或叶片大小等与其它种群显著不同的特征。 本研究首次对缙云黄芩果实开展形态特征和萌发能力的研究，证实缙云黄芩在生长周期 内能产生成熟的可育的小坚果，果实的形状、大小、表皮凸起形态等特征在同组的缙云黄芩、 黄芩、粘毛黄芩和红茎黄芩之间存在明显差别，可将其作为种间鉴别的有效依据。 在形态学水平，各种群间遗传相似系数平均值为0 9 9 1 ，表明种群间虽有分化，但遗传相 似度仍较高；聚类时，l o 个种群可明显区分为2 个大的表征群，但其中s 0 5 种群与其它种群 遗传距离相对较远。 2 ) 生化水平的研究：首次成功建立了缙云黄芩h p l c 指纹图谱。实验结果显示，l o 个缙 云黄芩种群样品均具有1 4 个共有指纹特征峰，且相对峰面积值间差异不大；同时各种群样品 h p l c 图与共有模式对照指纹图谱的相似度均在0 9 7 以上，平均相似度为0 9 8 4 ，表明样品间 t 两南大学硕十学伊论文 i i i i i i| 存在着显著的相似性，说明不同种群缙云黄芩间存在较高的遗传同质性和较近的亲缘关系。 各种群间遗传相似系数平均值为0 9 6 9 ，表明各种群在生化水平上有较高的遗传相似性； 聚类时，1 0 个种群明显区分为2 个大的表征群，各表征群内种群间遗传距离相差不大。 3 ) 分子水平的研究：首次采用i s s r 分子标记技术对缙云黄芩种群间遗传多样性开展研 究，通过实验筛选出8 条重复性好、稳定性高、谱带清晰且呈现多态性的引物，共扩增出6 0 条可区分的d n a 条带，其中有2 1 条带呈多态性，占总扩增带的3 5 ；经分析，缙云黄芩种 群间遗传相似系数平均为o 9 1 4 ，表明种群间具有一定的遗传变异，但分化程度并不太高。 聚类时，遗传距离较近的种群首先聚在一起，然后再聚为2 个大的表征群，表明种群间 呈现出差异较大的分化趋势，其中s 0 5 种群也表现出与其它种群遗传距离相对较远。 4 ) 综合分析：利用形态学、生化和基因水平上的研究对缙云黄芩种群进行聚类并结合环 境资料进行分析，聚类结果在一定程度上是相一致的，1 0 个种群在三个水平上均可明显区分 为两个大的表征群，在每个表征群内某些地理位置较近或生境条件相似的种群在聚类时首先 聚在一起：可以看出，遗传距离的远近和地理位置及生境条件存在或多或少的联系。 通过比较，以采用形态学标记和分子标记技术开展研究得到的结果更为接近，而生化水 平的研究与受到环境因素的影响较大，因此结合分子标记和形态学标记的研究结果开展遗传 多样性研究是较为可靠的。根据实验结果可以判断，1 0 个种群中s 0 8 、s 0 9 与s 1 0 三种群之间 以及s 0 2 与s 0 3 种群间具有较高的遗传相似性，s 0 4 与s 0 6 种群间遗传距离也相对较近，而 s 0 5 种群则表现出与其他种群存在较大的差异性。 关键词：缙云黄芩形态h p l c is s r 遗传多样性 u a b s t r a c t s t u d i e so ng e n e t i cd i v e r s i t yo fs c u t e l l a r i a t s i n y u n e n s i s ，a ne n d e m i cs p e c i e sf r o m m t j i n y u no fc h o n g q i n g m a j o r ：b o t a n yg r a d u a t e ：z h a n gj i a h u i t u t o r ：p r o f d e n gh o n g p i n g a b s t r a c t s c u t e l l a r i at s i n y u n e n s i sc y w ue tc h o wi sp e r e n n i a ln a t i o n a lp l a n t , e x i s t i n gi naf e wi s o l a t e d a r e aw h i c hd i s t r i b u t ea si s l a n do nm t j i n y u no fc h o n g q i n g i t sq u a n t i t ya n dd i s t r i b u t i o n a r e d e c r e a s i n gf a s t l y i th a sb e e np r o v i d e dw i t ht h ec h a r a c t eo fe n d a n g e r e dp l a n t s t h i sp a p e rs t u d i e so n t h et e n p o p u l a t i o n so fs t s i n y u n e n s i sb ym e t h o d so fm o r p h o l o g i cm a k e r , h p l ca n di s s rt oa n a l y z e t h eg e n e t i cd i v e r s i t ys c i e n t i f i c a l l yt h r o u g hc o m p a r i n gw i t ht h el e v e l so fm o r p h o l o g i c ，b i o c h e m i s t r y a n dm o l e c u l a ro fp o p u l a t i o n , a n dt op r o v i d et h e o r i e sf o rp r o t e c t i o n , e x p l o i t a t i o na n du t i l i z a t i o no fs t s i n y u n e n s i sa n do t h e re n d a n g e r e dp l a n t s t h ef o l l o w i n gc o n c l u s i o n sa r ed r a w n ： 1 ) s t u d i e so nm o r p h o i o g i cl e v e l ：m e a r s u r i n ga n da n a l y z i n gt h e5 6c h a r a c t e r so fs t e m ，l e a f , f l o w e ra n df r u i to f s t s i n y u n e n s i s ，t h e r ea r e4 5g u i d e l i n e ss h o ws i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s ，u pt o8 0 3 6 ， 4 2g u i d e l i n e ss h o ws i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s ，u pt o7 5 t h e s ed a t a si n d i c a t et h a tt h ec h a r a c a t e so f s t s i n y u n e n s i si nd i f f e r e n th a b i t a t sa r es i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s t h ed i f f e r e n td e g r e ei sf l o w e r l e e f s t e m f r u i t d i f f e r e n tp o p u l a t i o n s n u t r i t o r i u ms h o ws i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s ，e s p e c i a l l yt h el e e r i n s o m ep o p l a t i o n s ，t h el e e fs h o wl u b r i c i t y , g l a b r o u s ，i n t e g r i f o l i o u sa n ds oo n ，w h i c ha r em o r ed i f f e r e n t t h a no t h e rp o p u l a t i o n s i nt h i sp a p e r , t h em o r p h o l o g i cc h a r a c t e ra n ds p r o u to ft h ef r u i to fs t s i n y u n e n s i si sa n a l y z e df o r t h ef i r s tt i m e t h er e s u l t si n d i c a t et h a t t s i n y u n e n s i sc a nf o r ma d u l ta n df e r t i l en u t s t h es h a p e s i z e a n de p i d e r m i so ft h ef r u i ta r em o r ed i f f e r e n ti nt h es e c t i o no fs t s i n y u n e n s i s ，s b a i c a l e n s i sa n ds v i s c i d u l a t h e s ed i f f e r e n c e sc a nu s et od i s t i n g u i s ht h es p e c i e s i nt h em o r p h o l o g i cl e v e l ，t h ea v e r a g ev a l u eo fp o p u l a t i o ng e n e t i cs i m i l a r i t yi s0 9 91 ，i n d i c a t i n g t h a tp o p u l a t i o n sa r es i m i l a r c l u s t e r i n ga n a l y s i ss h o wt h a tt h e10p o p u l a t i o n sc a l lb ed i s t i n g u i s h e dt o t w op h e n o n s ，t h eg e n e t i cd i s t a n c eo fs 0 5i sf a r r e rt h a no t h e rp o p u l a t i o n s i i i 两南大学硕十学伊论文 2 1s t u d i e so nb i o c h e m i s t r yl e v e l ：u s eh p l ct os e tu p f i n g e r p r i n to fm e d i c i n a l - p l a n t t s i n y u n e n s i sf o rt h ef i r s tt i m e t h er e s u l t ss h o wt h a tt h e10p o p u l a t i o n sh a v e14c o m m o np e a k s ，t h e r e l a t i v ep e a l ( a r e ai ss i m i l a r c o m p a r e dw i t ht h em u t u a lm o d e ，t h es i m i l a r i t i e so f10s a m p l e sa r e h i g h e rt h a no 9 7a n dt h ea v e r a g es i m i l a r i t yi s0 9 8 4 t h e s er e s u l t si n d i c a t et h a te v e r yp o p u l a t i o nh a s h i g h e rg e n e t i ch o m o g e n e i t ya n dn e a r e rg e n e t i cr e l a t i o n s h i p t h ea v e r a g ev a l u eo fg e n e t i cs i m i l a r i t i e si s0 9 6 9 ，i n d i c a t i n gt h a tp o p u l a t i o n sh a v eh i i g h e r g e n e t i cs i m i l a r i t yi nb i o c h e m i s t r yl e v e l c l u s t e r i n ga n a l y s i ss h o wt h a tt h e10p o p u l a t i o n sc a l lb e d i s t i n g u i s h e dt ot w op h e n o n s ，t h eg e n e t i cd i s t a n c eo f p o p u l a t i o n si np h e n o ni ss i m i l a r 3 ) s t u d i e so nm o l e c u l a rl e v e l ：u s ei s s r t oa n a l y z eg e n e t i cd i v e r s i t yo f & t s i n y u n e n s i sf o rt h e f i r s tt i m e t h e r ea r e8p r i m e r sh a v eb e e ns e l e c t e df o ri t sg o o dr e p e a t a b i l i t y , s t a b i l i t ya n dc l e a r s 仃a p s t h e s ep r i m e r sa m p l i f y6 0s 仃a p si na 1 1 t h e r ea r e2 1s 仃a p ss h o wd i v e r s i t y , u pt o3 5 t h e s e r e s u l t ss h o wt h a tt h ea v e r a g ev a l u eo fg e n e t i cs i m i l a r i t yo fp o p u l a t i o n si s0 914 ，i n d i c a t i n gt h a tt h e p o p u l a t i o n sh a v eg e n e t i cv a r i a t i o n ，b u tt h ed e g r e eo fg e n e t i cv a r i a t i o ni si n d i s t i n c t i v e c l u s t e r i n ga n a l y s i s s h o wt h a tt h e10p o p u l a t i o n sc a nb e d i s t i n g u i s h e dt ot w op h e n o n s ， i n d i c a t i n gt h a tp o p u l a t i o n ss h o wad i s t i n cd i f f e r e n t i a t i o n , a n dt h eg e n e t i cd i s t a n c eo fs 0 5i sf a r r e r t h a no t h e rp o p u l a t i o n s 4 ) f i n a lc o n c l u s i o n ：t h er e s u l t so fg e n e t i cd i v e r s i t ya n a l y s i si nt h el e v e l so fm o r p h o l o g i c ， b i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a ra r es i m i l a r t e np o p u l a t i o n sc a nb ed i s t i n g u i s h e dt ot w op h e n o n sa te a c h m e t h o d i ne v e r yp h e n o n ，t h ep o p u l a t i o n sw i t hn e a rg e o g r a p h i c a lp o s i t i o no rs i m i l a rh a b i t a tc a l lb e c l u s t e r e df i r s t l y f r o mt h i sc o n c l u s i o n , t h eg e n e t i cd i s t a n c ea m o n gp o p u l a t i o n si sr e l a t e dt o g e o g r a p h i c a lp o s i t i o na n dh a b i t a t c o m p a r e dw i t ht h et h r e em e t h o d s ，u s i n gm o r p h o l o g i cm a k e ra n dm o l e c u l a rm a k e rc a ng a i n s i m i l a rr e s u l t s b i o c h e m i s t r ya n a l y s i si sa f f e c t e db ye n v i r o n m e n te l e m e n t s s ou s i n gm o r p h o i o g i c m a k e ra n dm o l e c u l a rm a k e rt oa n a l y z et h eg e n e t i cd i v e r s i t yo fst s i n y u n e n s i si sd e p e n d a b l e f r o m t h es t u d i e s a m o n gt h e10p o p u l a t i o n so f t s i n y u n e n s i , s 0 8 、s 0 9a n ds10h a v eh i g h e rg e n e t i c s i m i l a r i t y , s 0 2a n ds 0 3a l s oh a v eh i g h e rg e n e t i cs i m i l a r i t y , o n l ys 0 5i sv e r yd i f f e r e n tf r o mo t h e r s k e y w o r d s ：s c u t e l l a r i at s i n y u n e n s i s ；m o r p h o l o g y ；h p l c ；i s s r ；g e n e t i cd i v e r s i t y i v 独创性声明 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已 加了特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、 同仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。 学位论文作者： 猁 签字日期： 渺7 年 易月丁 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的 规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘， 允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院( 筹) 可以将 学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：栅 导师签名： 签字日期：珈孑年易月，日签字日期：呷年多 引言 曼曼量曼鼍i _ mm m 曼鼍曼曼皇曼曼曼曼曼量曼皇 己l吉 ji 口 缙云山位于重庆市北碚区境内，地理位置为北纬2 9 0 4 8 2 5 ”2 9 0 5 1 5 3 ”、东经 1 0 6 0 2 0 1 8 ”1 0 6 0 2 4 4 2 ”，总面积1 8k m 2 ，海拔1 8 0 9 5 1 5i l l ，于2 0 0 0 年被批准成立 国家级自然保护区。缙云山自然环境多样，植物种类丰富，森林植被繁茂，是长 江中上游保存较为完好的亚热带常绿阔叶林和植物种质基因库【l 捌。 缙云山地处我国中亚热带，具典型的亚热带季风湿润性气候特征，四季分明， 夏热多雨，冬暖多雾，年均气温1 3 6 ，极端最高气温3 6 2 ，极端最低气温4 6 ，年平均降雨量为16 1 1 8m m ，年平均相对湿度为8 7 。土壤以酸性黄壤及水 稻土为主，缙云山保护区主要植被为常绿阔叶林、暖性针叶林、竹林、常绿阔叶 灌丛，另外还有亚热带灌草丛和水生植被1 3 j 。 据重庆市缙云山自然保护区管理处、重庆市植物园对缙云山的植物资源调查 结果表明，缙云山有维管植物2 0 2 科、8 7 0 属、1 7 0 1 种( 包括亚种、变种、变型) 。 其中蕨类植物3 8 科、7 4 属、15 3 种：裸子植物7 科、2 5 属、4 6 种；被子植物1 5 7 科、7 7 1 属、1 5 0 2 种【1 1 。以缙云山植物作模式标本命名的共3 8 种，如缙云黄芩 ( s c u t e l l a r i a 船i n y u n e n s # c yw u e tc h o w ) 、缙云槭( a c e r w a n g c h i if a n g ) 、缙云 四照花( d e n d r o b e n t h a m i a f e r r u g i n e af a n g ) 、缙云紫珠( c a l l i c a r p ag i r a l d i ih e s s ee x r e h d ) 等。 缙云黄芩为缙云山特有分布种，隶属于唇形科( l a b i a c a e ) 黄芩属( s c u t e l l a r i a l i n n ) ，多年生草本植物，主要生于海拔6 7 0 8 2 0m 的林荫下，尤其是水沟边或路 旁林沿等较阴湿但又有一定光照的环境中，主要以根茎进行克隆繁殖，因而种群 中多由许多无性系分株构成。在自然环境中，缙云黄芩种群呈相互隔离的“岛屿 状分布，种群数量少，各种群之间距离相对较远，且每一种群占领空间狭窄，分 布范围在进一步缩小；其生境多为小路、阶梯或水沟边，遭践踏、攀折等人为破 坏比较严重，导致个体数量不断减少，己经处于濒危状态【4 j 。 以往对该物种的研究主要集中在采用野外群落学调查方法、种群生态学研究 方法等对缙云黄芩( 营养器官) 进行形态分化和形态变异数量分析、群落特征和 种群生态位研究、从等位酶上反映遗传多样性等方面【5 。1 0 】，对缙云黄芩遗传多样分 化的研究较少，尤其从形态学、生理生化和分子水平多角度、多层次地开展遗传 多样性分化的综合研究还未见报道。本研究采用形态学标记、生化标记和分子标 记相结合的分析方法，开展缙云黄芩遗传多样性分化的综合研究，探索科学的遗 传多样性分析方法，以期对缙云黄芩的遗传多样性进行科学评价，为该物种及其 它地方珍稀特有物种的保护、开发和利用提供理论和实践依据。 两南大学硕+ 学位论文 第1 章文献综述 1 1 遗传多样性概论 1 1 1 遗传多样性涵义及其意义 广义上讲，遗传多样性是指生物所携带的遗传信息的总和【1 1 , 1 2 】。狭义地讲，遗 传多样性是指种内基因的变化，包括种内显著不同的种群间和同一种群内的遗传 变异【1 3 】，亦称基因多样性。遗传多样性是生物多样性的基本组成部分，是生态多 样性和物种多样性的基础，是生物多样性的核心。对某一个物种来说，遗传变异 可以发生在种群水平、个体水平、组织和细胞水平以及分子水平上【l 4 。 遗传多样性是每种生物所固有的特性，是长期适应与进化的产物。一个种群 若要存活并长久地生存下去，不但应有适应现有环境的能力，更重要的是应有顺 应环境变化的能力。通常，一种遗传结构只能适应一种环境，对于干变万化始终 不一的环境，只有通过遗传学上的多样性来适应。对于任何一个物种来说，物种 遗传多样性或变异性越丰富，对环境变化的适应能力就越强，而适应性强的物种 更容易扩展其分布范围和开拓新的环境。反之，一个物种遗传多样性下降意味着 适应环境变化的能力降低，而且直接导致该物种的退化。种内遗传多样性的保持 也有助于维持物种和整个生态系统的多样性水平，可以减慢由于适应和进化所导 致的灭绝过程【1 5 1 引。 理论推断和大量的实验证明，生物种群中遗传变异的大小与其进化速率成正 比。所以，对遗传多样性的研究可以揭示物种或种群的进化历史( 起源的时间、 地点、方式) ，也能为进一步分析其进化潜能和未来的命运提供重要的信息【1 2 】。不 仅如此，它还可以帮助我们正确地了解不同分类群间的亲缘演化关系，为生物的 分类和进化研究提供有益的资料，为系统发育分类系统的建立提供佐证。 研究遗传多样性根本上是为了解物种起源、预测种源适应性、估算基因资源 分布、进行种质资源开发与利用、进行杂交育种的亲本选配等，但最终目的是保 护物种的多样性【1 9 1 。 1 1 2 遗传多样性的研究方法 植物遗传多样性研究多采用标记方法。遗传标记指可追踪染色体、染色体片 断或某个基因位点在家系中传递的任何一种遗传特性。通常遗传标记具有两个基 本特征，即可遗传性和可识别性。因此，生物的任何有差异的表型和基因突变型 均可作为遗传标记【矧。遗传标记研究一般分为四个层次，一是形态标记，这是最 为直观的利用物种表型的差异进行分析的手段；二是细胞学标记，这是借助于显 2 第1 章文献综述 微镜对物种在细胞水平上所进行的形态结构间差异分析；三是生化标记，主要是 比较物种在生化代谢上的不同；四是分子标记，它是比较物种在d n a 序列上存在 的差异，包括重要基因的克隆、功能分析和利用。 1 1 2 1 形态标记 形态标记是利用植物的外部形态特征来区分某些特殊个体的标记方法，分为 质量性状标记和数量性状标记【2 1 1 。一般而言，形态标记选用生物特定的肉眼可见 的外部特征特性，如植物的株高、叶形、果实颜色等。由于简单直观，容易观察 记载，是最直观也是最简单易行的方法，可以在短期内对所研究物种的遗传变异 水平有一个最基本的认识。长期以来，对物种的分类及资源鉴定都是以形态标记 为主要的或初步的指标1 2 2 。有许多学者都利用形态标记研究了物种的遗传多样性， 如何子灿等2 3 1 研究了猕猴桃的叶表皮毛微形态特征的多态性；k u r a k i n 冽研究欧洲 云杉和西伯利亚云杉不同种群苗期子叶数量的变异，子叶数量和千粒质量、亲本 林分的地位级、纬度和经度呈相关性。尽管表型多样性是遗传多样性研究的重要 内容之一，但由于表型性状受基因型和环境双重作用，相同的基因型在不同环境 影响下常表现出不同的性状，而相同表型又可能涉及不同的基因型，表型变化有 时不能真实地反映遗传变异因而在遗传多样性研究中受到一定限制【2 5 1 。 1 1 2 2 细胞学标记 细胞学标记是以染色体的差异为基础，明确显示遗传多样性的细胞学特征。 研究表明，任何生物的种群中都存在着或大或小的染色体变异，这些变异在进化 中起着十分重要的作用。染色体的结构变异包括缺失、重复、倒位和易位4 种类型。 从现有资料来看，导致遗传多样性的变异主要是倒位。另外，重复也可导致遗传 多样性。在染色体的形态结构变异中，染色体的长度、着丝点的位置、随体的有 无、b 染色体的数量及在不同种群中的分布等方面的变异，都可导致丰富的遗传多 样性2 6 1 。孟爱平等【2 7 】研究了桦木科植物的染色体数目差异，石大兴等1 2 8 1 对云杉的 胞核学研究发现云杉属内各种间的核型差别不大。细胞学标记虽然可以克服形态 标记的某些不足，但是细胞学标记材料需要花费较大的人力和较长的时间来培育。 同时，某些物种对染色体数目和结构变异的反应敏感，有些则适应变异的能力较 差。因此，到目前为止，可利用的细胞学标记仍屈指可数【2 9 1 。 1 1 2 3 生化标记 生化标记是通过比较物种在生化代谢上的不同来研究物种起源进化的标记。 目前生化标记多采用等位酶分析技术。等位酶是同一基因位点的不同等位基因所 两南大学硕十学伊论文 曼| i i 曼曼曼皇曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼量鼍曼曼曼曼曼量皇璺曼曼舅舅曼曼曼曼曼曼寰 编码的催化同反应的不同分子形式。研究等位酶分析技术极大地扩展了人们对 生物遗传变异和进化的认识。在分析过程中，只要取少量( 0 1 0 5g ) 植物的新鲜 材料就可以进行，并且在电泳得当，染色合适时结果明确，可比性强。汤圣祥等p u j 应用1 2 个等位酶位点对具有代表性的44 0 8 份中国栽培稻种质资源进行了遗传多 样性分析；赵茂林掣3 1 1 对赖草属内5 个物种的1 5 份材料进行了s o d 1 等3 个生化 遗传标记的分析，结果显示这3 个生化标记电泳图谱上的差异，可作为5 个物种 问、种内产地间和产地内材料间等各个层次上相互区分的生化遗化标记。同时， 等位酶分析也存在一些缺陷，全部酶也只是反映很少一部分基因，所选酶的所有 基因也未必都能表达在酶谱上，因此结果未必代表了全部变异形式f 3 2 】。 此外，次生代谢物标记鉴定也用于遗传多样性的分析评价。该方法是将植物 中所含特定次生代谢物的种类与含量作为鉴定品种的标记。最早使用的是对酚类 物质的鉴定，s i n g h a l 和p r a k a s h 通过鉴别氧化后酚类物质所显示的不同颜色来鉴定 小麦品种；c o o k e 等利用酸性香草醛试剂与大豆种皮中的单宁反应显示不同的颜色 用于品种鉴定；m o r g e n 利用h p l c 技术分析园艺作物花丝中色素的含量与种类，并 以此作为鉴定花卉品种的标记【捌；侯建军等采用h p l c 和光合色素分析的化学分类 方法对2 1 种( 株) 常见的典型赤潮生物进行了分类分析p 训。另外可以作为次生代 谢物鉴定标记的参数还有很多，如与油菜品种品质有关的芥酸、水果类作物中与 抗病性有关的小分子酚类物质以及种子中植物激素的类别与变化等。 1 1 2 4 分子标记 分子标记是指以个体间核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是d n a 分子水平 遗传变异的直接反映。随着遗传多样性研究的深入发展，遗传多样性标记已从传 统的以表型识别为基础的形态标记、以染色体的结构和数目为特征的细胞学标记 以及具有组织、发育和物种特异性的等位酶标记拓展到了目前广泛开展的以d n a 多态性为基础的d n a 分子标记。它具有以下优点：直接以d n a 的形式出现，没有 上位性效应，不受环境和其他因素的影响；多态性几乎遍及整个基因组：表现为 中性标记；不影响目标性状的表达，与不良性状无必然连锁；有许多分子标记为 共显性；部分分子标记可分析微量d n a 和古化石样品。 目前遗传多样性研究中已开发出十几种d n a 标记，其中应用较多的分子标记 技术主要有：r f l p ( 限制性片段长度多态性) 、r a p d ( 随机扩增多态性) 、a f l p ( 扩增片断长度多态性) 、i s s r ( 简单重复序列区间多态性) 、s s r ( 简单重复序列 多态性) 、s n p ( 单核苷酸多态性) 等。其中r f l p 是基于d n a 杂交的分子标记； r a p d 、i s s r 、s s r 都是基于p c r 扩增的d n a 标记，不同的是r a p d 采用的是随机 引物，而i s s r 、s s r 贝d 是采用特异引物；a f l p 是基于p c r 与限制性酶切技术结合 4 第1 章文献综述 曼曼曼曼曼量舅舅曼曼曼曼曼曼曼ii 一_ _ 一一i ；i 曼 i 舅曼曼曼曼皇曼曼鼍 的d n a 标记；s n p 贝j j 是完全摒弃了经典的凝胶电泳，以最新的d n a 芯片技术为基 础的分子标记【1 7 , 3 5 】。 1 1 2 5is s r 标记 i s s r ( i n t e r - s i m p l es e q u e n c er e p e a t ，即简单重复序列间标记) 是由z i e t k i e w i c z 等【3 6 】1 9 9 4 年创建的一种简单序列重复区间扩增多态性新型的分子标记，它的生物 学基础仍然是基因组中存在的s s r 。i s s r 标记根据植物广泛存在s s r 的特点，利用 在植物基因组常出现s s r 本身设计引物，无需预先克隆和测序。用于i s s r p c r 扩 增的引物通常为1 6 1 8 个碱基序列，由1 4 个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚 定碱基组成，从而保证了引物与基因组d n a 中的s s r 的5 或3 末端结合，避免了s s r 在基因组上的滑动，大大提高t p c r 扩增的专一性【3 7 】。s s r 在真核生物中的分布是 非常普遍的，并且进化变异速度非常快，因而锚定引物的i s s r p c r 可以检测基因 组许多位点的差异【3 8 1 。i s s r 通常为显性标记；呈孟德尔式遗传；具有很好的稳定 性和多态性；d n a 用量少；技术要求低；成本低廉；且p c r 扩增时退火温度在5 2 左右，保证了p c r 扩增的可重复性，因而是一种非常理想的构建分子图谱的分子标 记技术。目前，i s s r 已成功地用于小麦3 9 4 0 1 、马铃薯【4 l 】、柑橘【4 2 1 、桃【4 3 1 、欧洲和 日本落叶松、欧洲草莓【4 5 1 、苹果 4 6 1 等作物的遗传图谱的构建以及遗传多样性的 研究。 1 2 缙云黄芩及同属植物研究进展 1 2 1 缙云黄芩的生物学特性 缙云黄芩隶属于唇形科黄芩亚科( s c u t e l l a r i o i d e ab r i q ) 黄芩属黄芩亚属( s u b g s c u t e l l a r i a ) 下的顶序黄芩组( s e c t t a c h y m a c r i s a h a m i l t ) 宽叶黄芩亚组( s u b s e c t p e r e g r i n a eb o i s s ) ，在形态上接近于同属的滇黄芩( s c u t e l l a r i aa m o n e ac h w r i g h t ) ， 主要区别在于缙云黄芩叶无柄或具极短的柄，仅分布于重庆北碚缙云山【47 1 。 缙云黄芩为多年生草本；根茎匍匐，在节上生纤维状根。茎直立，高3 0 6 0c m ， 四棱形；在棱上具微翅，沿棱上被向上的短柔毛，余部近无毛，常呈暗紫色，不 分枝或少分枝。茎下部叶细小，圆形至卵形，长不及1c m ，先端急尖，基部浅心 形，茎中部以上叶卵状披针形至披针形，通常最上部者最大，长4 8c m ，宽1 5 - 3 5 c m ，先端尾尖至尾状渐尖，基部圆形至浅心形，均边缘具远离波状具胼胝体的齿， 坚纸质，上面绿色，下面淡绿色或微黄紫色，两面近无毛或无毛，侧脉3 对，与 中脉在上面多少明显下面突出；叶柄近无或极短，长o 5 4m l t l ，腹凹被凸，被短 柔毛。花对生，组成一侧向上8 1 0c m 的总状花序，总梗长2 3c m ，花梗长3m m ， 下部1 3 有一线形长不及1 耻n 的小苞片，狭披针形，长1 1 5r n m ，无柄，无毛， s 柏南大学硕t 学位隆正 早落。花萼k25 外密被短栗毛及具腺仃肯的微柔毛，盾片甲展，局17 5 m m 。 花冠白色，但檐部淡红至紫色，长17 19c m ，外疏被具节微柔毛：冠筒前方基部 曲膝状，中翔：宽25i n l n ，向上渐宽，至喉部宽边5i t i i i l ，山曲于曲膝处疏被小疏柔 毛：冠椎2 唇形，r 唇靛状，先端微m ，下唇中裂片三角形状卯彤，基部宽4m m ， 先端微凹，两侧裂h 卵形，宽2r n m 。雄蕊4 ，二强，花丝扁平，中部以下具纤毛。 花盘肥厚，前方膨大；子房柄长( ) 5m m ，花柱细长。了房光滑，4 裂，后对裂片 较大。成熟坚果末j 1 l 。花期4 5 月1 4 s l ；( 图11 ) 图1 1 缗云黄苓外形图 f i g 1 1 t h e m o r p h o l o g yo f s c u t e u a r i a t s i n y u n e n s i s 122 黄芩属植物药用开发研究进展 1221 黄芩属植物药用化学成分 黄芩属植物约3 0 0 种，世界广布，我同有1 0 0 余种，本属植物的根茎供药用 冈而国内外对本属植物研究较多。黄芩属化学成分研究始于1 8 8 9 年，至今已从该 属5 0 多种植物中分离m 了多种类型的化学成分，其中主要是黄酮类化合物，其它 成分还有萜类、苯己醇诫类、饼醇、氧基酸、生物碱和微量元素等，但种类最多、 生物活性最显著的是黄酮类化台物，其次是二萜类化合物； 6 第1 罩文献综述 ( 1 ) 黄酮类化合物 黄芩属植物普遍含有黄酮类化合物，现已从该属植物中分离并确定结构的黄 酮类化合物有1 2 6 个，仅从黄芩中就分离出了4 7 个f 5 0 , 5 1 】，这些黄酮类化合物的基 本母核有以下几类：黄酮和黄酮醇类、二氢黄酮和二氢黄酮醇类、查耳酮类、双黄 酮类和较少见的黄酮木脂素类，其中以黄酮类为绝大多数。本属植物中普遍存在的 黄酮类化合物有黄芩苷、黄芩苷元、汉黄芩苷、汉黄芩素、千层纸素a 、白杨素、 芹菜素等，以上这些成分可作为黄芩属植物的特征性成分。 ( 2 ) 二萜类化合物 近年来从黄芩属植物中分离得到的二萜类化合物均是新克罗烷型二萜。自 1 9 8 7 年从半枝莲中分离出黄芩属第一个二萜s c u t e l l o n ea ，至今已从该属2 0 多种植 物中发现了近8 0 个新克罗烷型二萜【5 2 】。此类化合物的生物活性主要表现在它们有 很强的昆虫拒食活性，其中有些还对一些植物致病真菌的孢子发芽和生长有一定 的抑制作用。 ， ( 3 ) 微量元素 近年来，夏元初、周济桂、李蕙明、张志明5 3 5 6 1 等对黄芩微量元素也进行了 较为详细研究。结果显示，不同地区所产黄芩中均或多或少含有c u 、f e 、m n 、n i 、 z n 等微量元素。 1 2 2 2 黄芩属植物药用成分的药理作用 目前药理上已经证实黄芩属黄酮具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗病毒、抗菌、 降压，利尿等多种生物活性；此外，作为治疗高血压和艾滋病的辅助药物的前景 也是广阔的。 、( 1 ) 抗癌黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素对癌细胞增殖都有一定的抑制作用。 黄芩苷对人肝癌细胞株的5 0 细胞生长抑制所需浓度为2 0m g l 。1 5 7 】，黄芩素对人 乳腺癌细胞株m d a m b 4 3 5 增殖的抑制，其i c 5 0 为5 9g g m l 。远大于槲皮素的i c 5 0 ( 1 4 0g g m l 1 ) 。o k i t a 5 8 】等发现黄芩素、黄芩苷抑制肝癌细胞的增殖呈剂量依 赖关系，与细胞周期无关。h u a n g 5 9 】等的实验结果提示黄芩素的抑制增殖作用在于 直接抑制与生长相关的信号因子、蛋白酪氨酸激酶以及减少生长因子的m r n a 表 、- 达o ( 2 ) 抗氧化黄芩苷、黄芩苷元、汉黄芩苷、汉黄芩苷元等具有酚羟基结构， 对过氧化脂质的生成具有明显的抑制作用。黄芩素对铁诱导的鼠肝线粒体脂质过 氧化抑制力为e d 5 0 s 5n r n o l m g _ 蛋白。作为治疗癫痫的日本和汉药t j 9 6 0 中的成 分之一，黄芩素是其中已知主要成分中最强的自由基清除剂。s a t o l 6 0 l 等的实验证实， 汉黄芩素能抑制减少还原型辅酶i i ( n a d