（作物遗传育种专业论文）小麦蓝色胚乳相关cDNA序列的分离鉴定.pdf

摘要 本研究以小麦蓝粒单体5 f 加系为材料，构建了相关c d n aj 丈库和抑制 差减文库，并分离鉴定了一些与小麦蓝色胚乳表达相关的特亓性c d n a 序 列，其目的是阐明小麦蓝色胚乳性状表达的遗传基础和发现相关基因。 研究获得以下主要结果： 1 利用蓝粒小麦未成熟种子m r n a 构建了蓝粒相关c d n a 文库，最终 获得的未扩增文库约含i2 x 1 0 6 个克隆子；对部分文库扩增后获得的文库 滴度约为2 x1 0 9p f u m l 。 2 构建了小麦蓝色胚乳表达相关基因的抑制差减文库，文库约含1 0 0 0 0 个克隆子，插入片段多集中在1 0 0 5 0 0 b p 之间，平均长度约3 0 0 b p 。 3 筛选获得了1 6 个阳性克隆子，序列分析发现： ( 1 ) 9 个c d n a 序列在g e n b a n k 上能找到同源较高的相关序列，其 中3 涉及小麦醇溶蛋白基因序列、1 个涉及小麦低分子量谷蛋白亚基，这 些基因在小麦种子中一般表达较强，假阳性的可能性较大；另外5 个c d n a 序列可能分别涉及单氧化酶基因、丝氨酸蛋白酶抑制剂基因和与小麦籽粒 硬度相关的基因序列，以及2 个功能未知的小麦、水稻d n a 序列，它们 可能与蓝粒性状的表达有一定的相关性； ( 2 ) 7 个c d n a 序列在g e n b a n k 上没有找到较为匹配的序列，分析 认为这些序列可能与小麦蓝色胚乳性状的表达有关，而且没有相关的研究 报道，可能涉及新的功能基因。 4 对4 个候选e d n a 序列的表达特异佳分析发现：与玉米p 4 5 0 单氧化 酶基因相关的c d n a 序列3 及功能未知的c d n a 序列1 5 在蓝白粒未成熟 种子间差异表达，在蓝粒未成熟种子中的表达明显增强，说明它们可能与 蓝粒性状的表达相关：功能未知的c d n a 序列1 4 、1 6 在蓝粒未成熟种子 中特异性表达，可能代表了与蓝色胚乳表达高度相关的基因。 关键词：普通小麦，单体附加系，c d n a 文库，抑制差减杂交，蓝粒 种子，胚乳 a b s t r a c t t w ok i n d so fe d n al i b r a r i e sw e r ec o n s t r u c t e du s i n gt h e b lu e - g r a i n e d w h e a tm o n o s o m i ca d d i t i o nl i n e ：o n ew a sac o n v e n t i o n a lc d n al i b r a r y ，w h i i e t h eo t h e rw a sas u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ( s s h ) l i b r a r y s o m e b l u ee n d o s p e r mr e l a t e de d n as e q u e n c e sw e r ei s o l a t e d t h ep u r p o s eo ft h i s s t u d yw a st o u n d e r s t a n dt h eg e n e t i cb a s i so fb l u ee n d o s p e r md e v e l o p m e n ti n w h e a ta n df u r t h e re x p l o r et h er e l a t e dg e n e s ， t h er e s u l t sc a nb es u m m a r i z e da sf o l i o w ： 1 t h ec o n v e n t i o n a le d n a l i b r a r y f r o mb l u ew h e a ts e e d sw e r e c o n s t r u c t e d f o l l o w i n g t h em e t h o dd e s c r i b e d b y s m a r te d n a l i b r a r y c o n s t r u c t i o nm a n u a l t h eo b t a i n e du n a m p l i f i e dl i b r a r yc o n t a i n e da b o u t1 2 1 0 6c l o n e s t h et i t e ro ft h ep a r t i a la m p l i f i e dl i b r a r yw a s2 1 0 9p f u m 1 2 t h e s u p p r e s s i o n s n b t r a c t i v e h y b r i d i z a t i o nl i b r a r y f o rw h e a tb l u e e n d o s p e r m w a sc o n s t r u c t e d ，t h es s h l i b r a r y c o n t a i n e da b o u t10 0 0 0 i n d i v i d u a lr e c o m b i n a n tc l o n e sw i t ht h ee d n ai n s e r t sr a n g i n gf r o m10 0t o5 0 0 b a s ep a i r s ( b p ) a n dt h ea v e r a g es i z ew a sa r o u n d3 0 0 b p 3 at o t a lo f16 p o s i t i v ec l o n e s w e r eo b t a i n e d b ys c r e e n i n gt h es s h l i b r a r y s e q u e n c eh o m o l o g o u sq u e r y i n gi n d i c a t e dt h a t ： ( i ) n i n ee d n as e q u e n c e sh a dh o m o l o g u e si ng e n b a n k a m o n gt h e m ， t h r e es h o w e dh i g h h o m o l o g o u sw i t h w h e a tc t - g l i a d i n g e n e s a n do n ew i t h w h e a tg l u b 3 g e n e b e c a u s eo ft h e i rh i g h e re x p r e s s i o nl e v e l s ，t h e s eg e n e s m i g h tb ea r t i f a c t u a l l ye n r i c h e dd u r i n gs s hl i b r a r yc o n s t r u c t i o n t h er e s tf i v e e d n a s e q u e n c e sh a dh i g hh o m o l o g yw i t hw h e a tm r n a f o rs e r p i n ，z e am a y s p 4 5 0m o n o o x y g e n a s e ，p u r o i n d o l i n eg e n e sf o rw h e a tg r a i nh a r d n e s s ，a n dt w o u n k n o w n s e q u e n c e sf r o m w h e a ta n d r i c e ，r e s p e c t i v e l y t h e s e f i v ee d n a s e q u e n c e sm i g h t b e d i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dg e n e sr e l a t e dt ob l u ee n d o s p e r m ( 2 ) n oh o m o l o g u e s w e r ef o u n df o r t h er e s to fs e v e n d i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e d e d n as e q u e n c e si ng e n b a n k t h e s ee d n as e q u e n c e s m a yb e r e l a t e dt ot h ed e v e l o p m e n to fb l u ee n d o s p e r ma n d p r o b a b l yt h en o v e lg e n e s 2 4n o r t h e r nb l o t a n a l y s i s i n d i c a t e dt h a tf o u rc d n as e q u e n c e ss h o w e d b l u e e n d o s p e r ms p e c i f i ce x p r e s s i o nm a n n e r ，f o re x a m p l e ，t h ee d n a s e q u e n c e 3t h a th a dh i g hh o m o l o g o u sw i t hz e am a ) sp 4 5 0m o n o o x y g e n a s e ，a n dt h e c d n a s e q u e n c e15w i t hu n k n o w nf u n c t i o n ，s h o w e dh i g h e re x p r e s s i o nl e v e l i n b l u es e e d sc o m p a r e dw i t hi nw h i t eo n e ，w h e r e a st h ec d n as e q u e n c e1 4a n d l6o n l ye x p r e s s e di nb l u ew h e a ts e e d st h el a t t e rt w oe d n a s e q u e n c e sm a y b eh i g h l yc o r r e l a t e dt ot h ed e v e l o p m e n to fb l u ee n d o s p e r m k e y w o r d s ：c o m m o nw h e a t ，m o n o s o m i ca d d i t i o nl i n e ，c d n a l i b r a r y s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ( s s h ) ，b l u es e e d ，e n d o s p e r m 第一章文献综述 随着分子生物学理论及其相关技术的深入发展和广泛应用，植物基因 分离的研究已f j 趋深入，并成为目前生命科学研究领域的热点。 禾本科植物出于包括了普通小麦( t r i t i c u ma e s t i v u m ) 、水稻( o r i z a s a t i v a ) 、玉米( z e am a y s ) 等重要粮食作物和一些具有较高经济价值的牧 草、园林用草，其基因克隆的相关研究更是倍受关注。 通过对一些重要基因信息的研究，不但可以为利用转基因技术进行植 物遗传改良提供更为安全的基因资源，而且还可以为利用传统育种技术进 行多个优良性状的聚合育种提供理论基础。但是，由于禾本科植物的基因 组都较为庞大，获得适用于基因克隆的特殊材料也比较困难，其相关基因 的克隆研究要明显落后于动物和一些模式植物。尽管目前以水稻为模式植 物已丌震了较为系统的大规模基因组测序研究，并在水稻基因组测序研究 中取得了突破性进展，但获得的功能性基因还相当有限，禾谷类植物相关 基因克隆研究所依赖的基因信息仍主要来自其它物种。因此利用特殊材料 和高效实用的方法丌展禾谷类植物的基因克隆研究具有重要的理论意义和 广阔的应用前景，这对于基因组大小达1 6 1 0 10 b p 的普通小麦而言，则更 具有挑战性( s o m e r v i l l ee ta l ，1 9 9 9 ) 。 1 1 植物基因克隆的主要策略 基因是染色体上具有一定座位的遗传单位，是d n a 分子中一定长度 的核苷酸序列。植物的生长发育实际上就是在多种代谢和生理过程基础上 所发生的基因在时空上表达的综合现象。若想弄清楚植物各种生命现象发 生的规律，首先要深入研究基因的表达机理，因此，分离各种有价值的基 因就显得尤为重要。 目i j i 植物基因克隆的方法有很多种，大部分以动物研究的成功实践为 基础发展而来。基因克隆的途径从本质上可分为两种：即正向遗传学( 传 统遗传学) 途径和反向遗传学途径。前者以目的基因的功能表现为基础， 通过鉴定其产物或某种表型突变分离基因：后者则着眼于基因本身，通过 其特定的序列或其在基因组中的特定位嚣进行基因克隆。f 向遗传学途径 常见的方法有传统的功能克隆、表型克隆等；而反向遗传学途径则以图位 克隆、转座子标签技术等较为常见，在基因的功能信息未知又无适宜的相 对袭型用于表型克隆时，【二述两种方法较为常用：同时随着现代q - 物信息 学的发展，j 卷片技术、电子克隆等新概念基因克隆技术的出现，更为研究 者提供了方便、迅捷的方法。 尽管基因克隆的方法从本质上可以分为正向遗传学和反向遗传学两 种，但在基因克隆的具体实践中这两种方法往往是相互交织、棚互贯通的， 从而构成了丰富多样的基因克隆技术。 植物基因分离方法都是依据基因的基本特性创建的，基因的基本特性 包括：( 1 ) 基因具有特定的初级结构一核苷酸序列：( 2 ) 基因在染色体 上占据特定的位置；( 3 ) 基因编码特定的m r n a 、多肽和蛋白质；( 4 ) 基 因具有特定的功能或控制某种性状。 根掘基因的这些基本特性，就技术手段而言，基因的克隆方法可以主 要概括为以下几类：( 1 ) 以基因图谱为基础的图位克隆技术；( 2 ) 以 t - d n a 插入或转座子羼变为基础的表型克隆技术；( 3 ) 以基因功能为基础 的功能克隆技术；( 4 ) 以基因表达特点为基础的差异显示技术；( 5 ) 以同 源保守序列为基础的同源克隆技术等。 1 1 1 图位克隆技术 图位克隆( m a p b a s e dc l o n i n g ) 又称定位克隆( p o s i t i o n a lc l o n i n g ) ， 其基本原理是根据功能基因在基因组中都具有相对稳定的基因座，在利用 分予标记技术对目的基因进行精细定位的基础上，通过构建高密度的分子 连锁图和对分离群体的系统分析，找到与目的基因紧密连锁的分子标记， 然后利用该标记筛选大片段基因组文库( 如y a c ，b a c 等) ，从而构建目 的基因区域的物理图谱，然后再利用此物理图谱通过染色体步移 ( c h r o m o s o m ew a l k i n g ) 逐步逼近目的基因，或利用染色体登陆( 1 a n d i n g ) 、 跳步( j u m p i n g ) 和连接( 1 i n k i n g ) 等方法最终找到包含目的基因的克隆， 并通过遗传转化试验验证目的基因的功能。用该方法分离基因是根据目的 基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的d n a 顺序，也无需 预先知道其表达产物的有关信息，但需要较为系统的分子标记和物理图谱 构建等研究基础( n i l m a l g o d a e ta l ，2 0 0 3 ) 。 图位克隆的原理早在1 9 8 6 年就已经提出( c o u l s o n e ta l ，1 9 8 3 ) ，但是 由 - 当时所用的文库插入片段较小，币个克隆往往未能包含完整的基因， 而且可以利用的遗传图谱标记还非常有限，所以长时间并没有成功的研究 报道。直到1 9 9 2 年爿利用图位克隆技术首先在拟南芥上成功克隆了a b l 3 攮因( g i r a u d a te ta l ，1 9 9 2 ) 和f a d s 基因( a r o n d e le la l ，1 9 9 2 ) 。近卜几 年来，随着各种分子标记的开发及高密度遗传图谱和物理图谱的建立，图 位克隆技术得到了广泛应用，利用该技术已经从不同物种中克隆了许多有 价值的基因，如水稻抗白叶枯病抗性基因( s o n ge ta l ，1 9 9 5 ) 、番茄叶霉 病抗性基因( d i x o ne ta l ，1 9 9 6 ) 、拟南芥霜霉病抗性基因( m c d o w e 1e ta l ， 19 9 8 ) 、水稻分蘖基因( l ie ta l ，2 0 0 3 ) 等，使其成为目前植物基因克隆摄 为常见和有效的手段之一。 图位克隆技术原理简单，但是，在染色体步行过程中，需要大量的时 l 刈和精力进行术端分离和步行方向的确定，而且基因组中散布的重复序列 及克隆之间的空隙都会干扰步行的进行。因此，图位克隆在实际运用中困 难还是很大的。另外，获得紧密连锁的分子标庀是顺利进行图位克隆的重 要前提条件。所以，对于象普通小麦这种基因组庞大而且重复序列高、又 难于构建高密度分子标记图谱的植物而言，该技术应用起来相当困难。但 是，图位克隆技术在分离产物及作用机理未知的新基因，以及数量性状基 因座( q u a n t i t a t i v et r a i tl o c u s ，q t l ) 的克隆研究中显示出了一定的优势。 目前已经有许多重要作物，如水稻、番茄( l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u m ) 、玉 米等都已建立了高密度的分子的遗传图谱，随着水稻基因组计划等全基因 组测序工作的完成，这一基因克隆技术在植物基因克隆的研究中将展现出 更为广阔的应用前景。 1 1 2 表型克隆技术 1 1 2 1 转座子示踪技术 转座子( r e t r o t r a n s p o s o n ) 是染色体上一段可以移动的d n a 序列，它 可以从一个基因座位转移到另一个基因座位。当转座子插入到某个功能基 因内部或邻近位点时，就会使插入位置的基因失活，从而可能诱导产生突 变型。通过遗传分析可以确定某基因的突变是否由转座予引起，由转座子 引起的突变可用转座子d n a 为探针，从突变株的基因组( 文库) 。 | 钓墩 含垓转座予的d n a 片段，获得含有部分突变株d n a 序列的克隆，然后以 该d n a 序列为探针，筛选野生型植株的基因组文库、或设计特异性引物 进行插入位点旁侧序列的扩增、或采用质粒挽救技术( p l a s m i dr e s c u e ) 等， 最终得到完整的目的基因。 转座予作为插入诱导剂，已广泛应用于基因的鉴定和分离。在植物中， 已克隆的植物转座予有1 0 0 多种，其中最常用的是玉米的a c d s ，勋m ( e n ) 和m u 因子、拟南芥a r p h l 转座子、金鱼草( a n t i j r h i n u mm 可“s ) 的t a m 因子等( o s b o r n ee ta l ，1 9 9 5 ；杨琳等，2 0 0 0 ) 。由于a c d s 和s p m 转座 子家族在其它植物中也具有转座功能，因此这一基因标l 已系统可有效的应 用于其它植物。 转座子标签技术的策略是通过转座予在染色体上的插入和嵌合来克隆 基因，对于无紧密连锁分子标汜的功能基因采用这样的克隆办法是有效的。 该技术的前提条件是要筛选出转座子插入的突变体，在实际操作中，由于 转座频率往往很低，因此要求筛选突变体的群体较大( f l a d u n ge ta l ，2 0 0 4 ) ， 而且转座子对目的植物的转化，在有些植物中也受到一定的限制。另外由 于可供利用的转座子种类太少，且同一转座子在不同的植物中转座的频率 和活性相差很大，并且需要筛选大量的个体来鉴定转座子突变个体，限制 了转座子标签法的应用范围。同时，对于那些要在特定环境或特定发育阶 段才有突变表型的基因，往往由于看不到明显的突变表型而被忽略，使得 其选择效率大打折扣。另外，出于基因的功能补偿等机制的作用，即使有 基因产生了插入突变，也可能看不到明显的突变表型，这在普通小麦这类 多倍体物种中可能会显得更加突出，从而在很大程度上限制了该技术在普 通小麦基因克隆研究中的应用。但是出于它具有不需知道目标基因结构信 息的优点，因此仍是一个非常有用的方法。目前，此方法已经成功地应用 于玉米、番茄、烟草等植物的基因克隆研究中( j o h a le ta l ，19 9 2 ；j o n e se t “，19 9 4 ：w h i t h a me ta l ，1 9 9 4 ；d h a r m a p u r ie ta l ，2 0 0 1 ：s a n z a l f e r e z ， 2 0 0 3 ) 。 1 1 2 2t - d n a 插入诱变技术 与转座子标记法原理相似的还有t d n a 插入标记法。根癌农杆菌 ( a g r o b a c t e r i u mt u m e 向c i e n s ) t d n a 能够从农杆菌中转移并稳定地整合到 宿主綦因组中，从而使整合位置上的基因失活或产生突变。通过t - d n a 上 的标记基因( 如抗卡那霉素基因) 就可检测突变位置，进步得到与t - d n a 相连的d n a 片段。以此制备探针筛选野生型基因文库、或设计特异性引 物进行插入位点旁侧序列的扩增、或采用质粒挽救技术等，就可得到与突 变性状相对应的完整基因。目前，该方法己成功地应用于拟南芥 ( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 、烟草( n i c o t i a n al a b a c u m ) 、水稻等有关基因的分 离( m a r k se ta l ，1 9 8 9 ；h a y a s h ie ta l ，1 9 9 2 ：g l o v e re ta l ，1 9 9 8 ) 。另外， 在t - d n a 插入的基础上还发展了启动子陷阱( e n h a n c e rt r a p p i n g ) 技术和 增强子陷阱( p r o m o t e rt r a p p i n g ) 技术( t o p p i n ge ta l ，1 9 9 5 ：1 9 9 7 ) 可以 在一定程度上提高浚方法的效率。与转座子技术相比，t - d n a 插入尽管可 以在一定程度上扩大受体植物的范围，但它同样难以克服转座子技术的相 应缺点。 1 1 3 功能克隆技术 功能克隆就是根据目标性状的基本生化特性这一功能信息，在鉴定基 因的功能后进行基因克隆。其具体方法是：首先纯化相应的编码蛋白质并 测序同时构建c d n a 文库或基因组文库，e d n a 文库中基因的筛选根据情 况可采用不同的办法进行：( 1 ) 根据蛋白质的氨基酸测序结果，合成寡核 昔酸探针从e d n a 文库或基因组文库中筛选编码基因；( 2 ) 根据蛋白质的 氨基酸测序结果，合成简并引物，从基因组文库中通过p c r 扩增得到基因 的部分序列，再通过e d n a 文库筛选或是r a c e 技术得到基因的全部序列： ( 3 ) 制备相应编码蛋白的抗体探针，从c d n a 表达文库中筛选相应基因。 功能克隆是一种经典的基因克隆策略，很多基因的分离利用了这种策 略。其特点是用基因表达的产物蛋白来克隆基因。虽然某一性状的编码基 因是未知的，如果对其生理生化及代谢途径研究得比较清楚，就可以分离 和纯化控制该性状的蛋白质。功能克隆的关键是分离出高纯度的蛋白质， 只要有一个纯的蛋白质，得到特异的探针，这一方法是行之有效的。目前， 随着越来越多的细胞因子和生物活性蛋白的成功分离，功能克隆技术在许 多鐾凶的克隆中墩得了成功( m a s a h a r u ，1 9 9 7 ：w a n g ，1 9 9 7 ：k a n g e la l ， 2 0 0 4 ) 。例如，d a m e r v a l 等( 1 9 9 8 ) 分析玉米o p a q u e z 基因的近等基因系 之间的双向电泳蛋白图谱的差异，并从纯化差异蛋白入手，鉴定克隆了一 个新的转录激活因子基因。 理论上，功能馨因克隆只要知道目的基因表达产物即町，不存在物种 等因素的限制。但目前大多数基因产物还不清楚，即使基因产物已知，要 得到纯度可以满足氨基酸测序及抗体制备要求的蛋白质也有一定的困难。 另外，出于遗传密码的简并性，推导出特异的探针也并非易事。但是，随 着整个生命科学研究的深入以及蛋白质分离纯化技术的发展，功能基因克 隆将得到更加广泛的应用。 1 1 4 差别显示技术 许多基因的表达都具有时削、空间及表达量上的差别，这些差别在生 物体的生命活动中起着重要的调节作用。利用基因表达的差别克隆基因的 技术称为差别显示技术，目前己经发展了多种差别显示技术：如m r n a 差 别显示反转录p c r( d i f f e r e n t i a l d i s p l a y r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e p c r d d r t - p c r ) 技术：c d n a 代表性差异分析( c d n a r e p r e s e n t a t i o n a ld i f f e r e n c e a n a l y s i s ，c d n a r d a ) 技术等，用这些方法也相继克隆了一些基因。但是 上述方法普遍存在假阳性率高，上调表达难分析等缺点。抑制性差减杂交 ( s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ，s s h ) 技术的出现在一定程度上克 服了上述缺点。 1 1 4 1m r n a 差别显示技术( d d r t p c r ) m r n a 差别显示技术以分子生物学上广泛应用的p c r 技术和聚丙烯 酰胺凝胶电泳为基础，利用真核细胞m r n a3 - p o l y ( a ) + 尾，选取 o l i g o ( d t ) m n ( m = a c g ，n = a g c t ) 作为锚定引物，与m r n a 的p o l y ( a ) + 尾结合，并锚定紧靠p o l y ( a ) + 的两个碱基，在反转录酶作用下可将m r n a 群体反转录为c d n a ，然后以原o l i g o ( d t ) m n 和1 0 b p 随机引物组成成对引 物对不同来源的c d n a 进行p c r 扩增，将相同引物对不同来源c d n a 进行 p c r 扩增的产物并排在聚丙烯酰胺测序胶上电泳分离，由于扩增的c d n a 片段被放射性同位素或荧光素标记，通过放射自显影或显色，即可获得差 异表达基因扩增的条带，将差异表达的e d n a 条带叫收、克隆后，作为探 针通过n o t h e r n 杂交验证，即可用于基因表达分析和全基因分离、克隆等。 浚技术具有简便、灵敏、r n a 用量少、效率高，并町同时比较多种生 理状态细胞内m r n a 样品。d d r t - p c r 技术成功应用的关键因素之一是获 得高质量的r n a ，高质量的r n a 需满足两个条件：无d n a 污染且r n a 分子比较完整。该技术己成功地应用于与植物胚胎发育、形态发生、信号 传导、植物抗逆与抗病性及植物与病原菌互作有关的基因比较签定和克隆 匕( b a u e r ，1 9 9 3 ：v i s i o l ie la l ，1 9 9 7 ：l ie ta l ，2 0 0 4 )。 然而d d r t - p c r 技术技术也存在一些缺陷：( 1 ) 所得到的特异性e d n a 片段克隆假阳性比例高，有时甚至高达7 0 ；( 2 ) 凝胶中单条带可能由 种以上e d n a 片段所构成：( 3 ) 所获e d n a 可能仅代表着m r n a3 端的 非翻译序列：( 4 ) e d n a 扩增产物的量不仅取决于m r n a 的丰度，也取决 于引物与模板之间的特定匹配情况，匹配不合适常导致对基因表达差异的 错误认识。上述缺陷使差异显示技术的应用受到限制。因此，自1 9 9 2 年该 技术建立以来，许多研究都致力于对此技术进行改良和优化。一些研究者 通过延长、改进引物和优化p c r 循环参数来提高d d r t - p c r 技术的重复 性、降低假阳性率( d i a e h e n k oe la l ，1 9 9 6 ) ，同时m a l h o t r a ( 1 9 9 8 ) 、s m i t h ( 1 9 9 7 ) 等分别从n o r t h e r n 杂交、p c r 扩增和测序方法上对该技术进行改 进。p o l r i e r 等先对总r n a 进行扩增，然后用扩增产物a r n a ( a m p l i f i e d r n a ) 作为r t - p c r 模板，使灵敏度大大提高。随着此项技术的不断完善 和发展，还产生了一系列衍生技术，如r a p ( r n af i n g e r p r i n t i n gb v a r b i t r a r i l yp r i m e dp c r ) ，e d d ( e n h a n c e dd d ) ，f d d ( f l u o r e s c e n td d ) 等等，使浚项技术成为目前基因表达分析和分离克隆基因的常用方法。 1 1 4 2c d n a 代表性差异分析( c d n a r d a ) e d n a r d a 是继d d r t - p c r 法之后，以差减杂交为基础，由l i s i t s y n 等( 19 9 3 ) 创建的一种从基因组水平筛选和克隆基因的方法。1 9 9 4 年h u b a n k 等将r d a 进行改进，改进后的e d n a r d a 技术同时具各d d 和r d a 的优 点，克服了它们的许多不足。 c d n a r d a 的基本原理为：首先将材料根据要求分为试验组t ( t e s t e r ) 和驱动探针组d ( d r i v e r ) ，分别提取m r n a 并反转录成c d n a 。分别加上 接头后，以接头特异性引物进行p c r 扩增。扩增产物经限制性酶切后，列 t 群酶切产物连上新的接头，使之区别于d 群的c d n a 。用过量的d 群酶 切j “。物与经“修饰”过的t 群c d n a 混合，经变性后退火复性，t 与d 中 共有的序列成t - d 异源杂交分子，t 群中特有的序列形成t - t 同源杂交分 子，此外d 群同源序列形成d - d 同源杂交分子。然后，利用t 群新接头 的特异接头引物进行p c r 扩增，则具有t - t 结构的分子得到有效扩增。这 利差减杂交步骤可重复2 3 次，以尽可能去除共有序列，因为对差别片段 进行了有效的特异性富集，使差别基因得到分离、克隆( l i n ge la l ，2 0 0 3 ) 。 该技术具有二个突出优点：( 1 ) 免去了物理方法分离单双链的繁琐操 作，通过接头“修饰”设计借助p c r 手段即能使目的片段得到有效扩增， 可减少假阳性；( 2 ) 差减杂交在扩增后的c d n a 群体之| l 白j 进行，不再受供 试的m r n a 量的限制，拓展了差减杂交的研究范围；( 3 ) 一一次实验可分离 得到多个在t 和d 间表现差异的目的c d n a 克隆，并能发现与表型相关的 基因异常，检测基因的上调和下调表达。 但浚方法也存在一些明显不足：( 1 ) 目的基因间丰度的差异在数轮差 减杂交后的群体中保留下来，使得在后续的筛选工作中，由于杂交信号的 互相影响，高丰度的差异基因容易得到，低丰度的差异基因不易检出，而 低丰度的表达产物往往代表相对重要的基因，如大多数调节蛋白等；( 2 ) 利用浚方法分离出来的相应差别基因也可能与其表型无关，增加了后续的 鉴定工作量；( 3 ) 该方法对样品t 和d 的纯度要求很高，如果两组材料间 差别较大，则用此方法将达不到鉴定差别表达基因的目的( m i c h i e l se td ， 1 9 9 8 ) 。o n e i l l 等( 1 9 9 7 ) 对该技术进行了改进，增加了c d n a 合成中的 m r n a 量和杂交液中t 的用量，进一步降低了假阳性率，提高了灵敏度。 1 1 4 3 抑制滇减杂交法( s s h ) 在d d r t - p c r 和c d n a r d a 的基础上，d l a t c h e n k o 等( 19 9 6 ) 又发 明了一种新的分离差异表达基因的新方法。其依据的技术主要有：抑制p c r 和差减杂交。其基本程序为：首先，从待比较的两类材料中( t e s t e r 与d r i v e r ) 提取p o l y ( a ) + r n a ，并反转录为c d n a ( t c d n a 和d c d n a ) ，经识别四碱 摹位点产生平术端的限制性内切酶酶切后，t c d n a 等分为两份，分别加上 不同接头( 接头l ，接头2 ) 。然后，将过量的d c d n a 分别加入连有不同 接头的t 样品中，进行第一轮不完全杂交，每一杂交体系中均产生a ，b ， c ，d 四种类型分子。其中大多数形成异源杂交分子c ，少部分自我复性形 成同源杂交分子。对于t 中特有的序列( 目的序列) 则只能以二神形式存 在：自我变性形成同源杂交分子b ，或以单链形式存在于a 分子群体中。 第一轮杂交6 u 不同的目的e d n a 分子之问存在丰度差异，根据分子杂交的 二级动力学原理，高丰度e d n a 分子复性速度快于低丰度c d n a ，则经过 第轮杂交后，含量有差别的单链e d n a 基本趋于一致。将两份t c d n a 合并，再加新的d c d n a 进行第二轮杂交，经变性、复性后，将产生a ，b ， c ，d ，e 五种类型的分子。其中e 类型分子有一个重要特点，其5 端有两 个不同的接头，即接头1 和接头2 。具有两种接头的双链e d n a 片段是有 差别序列的片段，因为只有这种片段在第一次不完全杂交时不能与f 常的 d 配对，而在第二次杂交时才能自我配对。将交性后分子粘性末端补平， 以5 一端的两种接头序列为引物进行扩增。出于e 类型分子具有两种接头。 因此这种双链分子经指数扩增而得到富集( 图1 1 ) 。这一p c r 扩增的c d n a 群体，再用与接头内侧序列互补的另一对引物进行第二次巢式p c r 扩增以 进一步降低背景、富集差异表达c d n a s 。二次扩增的p c r 产物即可直接 用于构建差减e d n a 文库，又能用作杂交探针进行文库差示筛选，筛选出 来的克隆经n o r t h e r n 杂交验证，即可进行测序分析。 s s h 通过两次特异性杂交和两次p c r 特异性扩增，使得假阳性率大大 降低，目的序列富集程度较高，且丰度相对一致，这是它的显著优点。另 外，s s h 灵敏度很高，有实验证实，一次s s h 实验中可同时富集上百个差 别表达的基因，使其在基因克隆方面远远胜过d d r t - p c r 和e d n a r d a ( s t e i ne ta l ，1 9 9 7 ：刘军，1 9 9 9 ) 。该方法自1 9 9 6 年问世以来，便受到广 泛关注。到目前为止，在人类、动物方面已有许多成功的报道( v o ne ta l ， 1 9 9 7 ；k u a n g e ta l ，1 9 9 8 ) ，但在植物方面的应用还很少。 该方法需要材料的起始量大( 数微克m r n a ) ，对于一些稀有材料应 用此方法可能存在一些困难。另外，c d n a 酶切后的片段与接头连接时的 效率要高，否则难以发现有表达差异的基因。并且s s h 和c d n a r d a 均 不能同时进行数种平行材料之间的比较，一般只能有两种材判，并且材料 之问差别不能太大或太小。当需对数组材料进行比较时，d d 法还是人们 优先选择的方法。 t e s t e re d n a w i t h a d a p t o r l _ ) m 。一e e m d r i v e r c d n a l i n 似c e 蚓t e s t e rc d n a w i t ha d a p t o rz r 旷 叫 a 一 h 己= = = = - c 一 蚰- c , d 。l i = = = = 赶i p m 日亡) - 一c ) - 一 h a d dp r i m e r s - a m p l i f yb yp c r ad n pa m p 嘶c a t i o n 批 b n oa m p l i f i c a t i o n c i n e a fa m p l 【 i c a t l o n s _ 丁一吉。9 僦蓑飘嘴9 一s e q u e 。n c e 矧o n ；b 。m a l e n n smm e 斟蚺e m m e t u 镕s ， mg 帆fo v e f a b f * a 射：嚣塑怒黼糍2 娑茹c t i c 舢a f l y 州n e g a 。t h o n e st h 。e 曲。 s e e t h e a p p e n d i x f o r m o r ed e t a i l so ns u p p r e s s i o np c r j 圈1 1s s h 流程( 引自：w w w c o n t e c h c o r n ) f i g u r e1 is c h e m a t i cd i a g r a mo fs u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n 0 兰 1 1 5 同源克隆技术 1 1 5 1 基于同源序列的候选基因法 功能相似、由相同祖先进化而来的基因称为基因家族。根据基因家族 成员所编码的蛋白质结构中具有保：r 氨基酸序列的特点，发展了基于同源 序列的候选基因法( h o m o l o g y b a s e dc a n d i d a t eg e n em e t h o d ) 。其基本策略 为：首先根据基因家族各成员问保守氨基酸序列设计探针，然后筛选含该 撼因物种的e d n a 文库或基因组文库，并最终获得全长基因。该方法克隆 基因快捷方便，己经成功应用于多种基因的克隆( f u n k e n s t e i n ，1 9 9 1 ：舒 群芳，1 9 9 9 ；g a oe la l ，2 0 0 0 ；h a s h i m o t oe ta l ，2 0 0 3 ) 。另外，还可以根 据基因的保守区设计引物，以e d n a 或基因组d n a 为模板，用p c r 直接扩 增该基因的片段，从而衍生出p c r 扩增克隆技术，这是一种在已知植物基 因序列或氨基酸序列的基础上进行基因序列克隆的方法，但在根据氨基酸 序列设计引物得情况下，必须考虑密码子的简并性和不| 司物种中密码子使 用的偏好性。 1 1 5 2c d n a 末端快速扩增技术 e d n a 末端快速扩增( r a p i da m p l i f i c a t i o no fe d n ae n d s ，r a c e ) 技 术是近期发展起来的一种同源基因克隆技术，具有简单、快捷、廉价等优 点，是一种从低丰度的转录本中快速扩增c d n a 的3 和5 末端的简单有效 的方法。r a c e 技术主要通过p c r 技术由已知的部分e d n a 序列来得到完 整的c d n a 的3 和5 端，又被称为单边p c r ( o n e s i d e dp c r ) 或锚定p c r ( a n c h o r e dp c r ) ，它大体上由3 r a c e ，5 r a c e 和获得全长基因这3 部 分组成。 3 r a c e 首先利用m r n a 的3 末端天然的p o l y ( a ) + 尾巴作为一个引物 结合位点，以o l i g o ( d t ) 年l l 一个接头组成的接头引物( a d a p t o r p r i m e r ，a p ) 反转录m r n a ，得到加接头的第一链e d n a ，然后用一个基因特异引物g s p l ( g e n es p e c i f i cp r i m e r ，g s p ) 和一个含有部分锚定引物序列的引物 ( u n i v e r s a l a m p l i f i c a t i o np r i m e r ，u a p ；或a b r i d g e du n i v e r s a l a m p l i f i c a t i o n p r i m e r ，a u a p ) ，分别与己知序列区和p o l y ( a ) + 尾区退火，p c r 扩增捕获 位于己知信息区和p o l y ( a ) + 尾之间的未知3 m r n a 序列。为防止非特异带 的产生，可以进行巢式p c r 扩增。 5 ，r a c e 与3 r a c e 原理