（分析化学专业论文）核（苷）酸的荧光增强效应及其分析应用.pdf

在壹；奎盖出壅鑫堂亟土主焦适塞煎嚣 摘要 核( 菅) 酸是生命现象的物质基础。它对生物的生长、遗传、变异等现象都起 着重要的决定作用。它与遗传、肿瘤的发生、病毒的感染、射线对机体的作用都有 重要关系。而探针技术是研究核( 苷) 酸结构、功能、定性、定量的重要手段。剥+ 核( 苷) 酸探针的研究己成为生命科学领域的前沿课题。本论文从探索新的核( 苷) 酸荧光探针、研究其相互作用机理和发光机理出发，以荧光为主要研究手段进行了 研究。 论文的第一部分综述了核( 苷) 酸荧光探针和稀土共发光效应的研究进展及其 分析应用，共引用了2 1 6 篇文献。 在论文的第二部分中，首次研究了鸟苷酸( g m p ) 体系中稀土共发光效应。研 究发现，l 0 + 、g d 3 + 、s c 3 + 和y 3 + 都能够增强t b g m p 体系的荧光强度，其中g d 3 + 的增强效应最大。同时，实验了t b g d g m p 体系荧光产生的最佳条件，即t b ”浓 度为3 0 x 1 0 m o l l ，g d ”浓度为1 0 x 1 0 。m o l 1 ，p h 为8 1 3 的n h 4 c 1 一n i - 1 3 为缓冲溶液。 在此条件下，建立了g m p 的浓度与体系的荧光强度之间的线性方程，并将该效应应 用于g m p 的检测中，线性范围为3 x 1 0 一3 x l o m o l 1 ，检出限为3 9 x 1 0 一m o l l ，并 对合成样品进行了检测，得到较好的结果。与t b g m p 法相比，该法的检出限比其 低一个数量级，并具有较宽的线性范围。同时，本文对络合物的形成及其发光机理 进行了研究。认为，t b - g m p 和g d g m p 络合物通过氧桥形成一网状结构，它们之间 的能量传递是通过络合物之间的氧桥来实现的。 在论文的第三部分中，首次在a t p 体系中发现了稀土共发光效应。实验结果表 明，在t b - a t p - p h e n 体系中加入l a “、g 矿、l u ”、s c 和r + 能产生稀土共发光现象， 其中g d3 + 的增强效应最大。本文实验了共发光产生的最佳条件，并且将其应用于a t p 的测定中。体系的最佳条件如下：t b ”浓度为2 o x l o m o l 1 ，g d “浓度为 1 0 x 1 0 m o l 1 ，p h e n 浓度为2 o x l 0 1 m o l 1 ，p h 为7 0 的1 0 9 6 的h m t a 缓冲溶液。在 最佳条件下，体系的荧光强度与a t p 的浓度在l x l 0 4 5 x 1 0 “m o l l 范围内成线性关 系，体系的检出限达到5 4 1 0 o i i 。比t b a t p p h e n 体系的检出限约降低4 0 倍。 该法已用于a t p 辅酶药片中a t p 含量的测定，取得了满意的结果。实验指出，该方 法具有较宽的线性范围和较好的灵敏度。此外，本文还对该效应产生的机理进行了 较为深入的研究，探讨了络合物的形成。认为在t b g d a t p p h e n 体系中，分别形成 t b a t p - p h e n 和g d a t p p h e n 络合物。它们聚集在一起形成大的聚集体，通过分子 内和分子间能量转移将两络合物吸收的能量转移到t b l + 上，使得体系的荧光强度明 堡垒堑二些壅塑鏊鲨鳖垦墼 显增强。同时提出了在络合物中a t p 和p h e n 间存在堆积效应，a t p 吸收的能量通过 堆积效应转移给p h e n ，然后再转移到t b “上的可能的能量转移通道。 在论文的第四部分中，主要研究了十六烷基溴化吡啶( c p b ) 与t b g d d n a 体 系的相互作用。结果表明，c p b 的加入能够使已有体系的共发光现象得到明显的增 强，且该体系的荧光强度与核酸的浓度在一定范围内成线性关系。将该体系用于 d n a 和r n a 的检测中，线性范围分别为1 x 1 0 1 - l x l o g t m l 和9 1 0 一一i x l o g m l ， 检出限分别为4 1 x l o 。g m l 和3 2 x 1 0 1 9 m 1 。另外，我们对实际样品进行了测定， 实验结果令人满意。我们对该效应产生的机理进行了较为深入的研究，认为c p b 和 核酸通过静电引力和氨键作用力使核酸在c p b 上发生聚集而生成了阳离子表面活性 剂一核酸离子络合物。而g d ”和t b ”能够分别与核酸上的磷酸根键合，分别形成t b - 核酸- c p b 和g d - 核酸- c p b 络合物。吸收能量后，通过分子间能量转移将能量传递到 t b 3 + 上，从而增强铽离子的特征荧光。另外，体系中钆络合物的浓度远大于铽络合物 的浓度，因而每一个铽络合物周围均被许多钆络合物包围，形成了一个“能量绝缘 壳”，减少了能量损失，提高了荧光量子产率。 本论文的主要特点： 1 首次发现并研究了核营酸体系中的稀土共发光效应并将其应用于核苷酸的测 定中。这对于核菅酸的研究是一个重要进展。本方法为稀土共发光效应的应用开辟 了一个新的领域，同时也为核苷酸的检测提供了一个新的荧光探针，该效应使g m p 和a t p 的检出限降低卜2 个数量级。与核苷酸的其它荧光光度法相比，本方法具有 操作简便、快速、线性范围宽、灵敏度高等优点。 2 提出了核苷酸体系中稀土共发光效应的作用机理。在t b g d - g m p 体系中，认 为它们之间可能通过氧桥连接成网状络合物，同时通过氧桥实现了能量在络合物之 间的传递。在t b g d p h e n a t p 体系中，认为稀土离子与a t p 、p h e n 之间能够形成 t b a t p - p h e n 和g d a t p p h e n 络合物，两络合物能够聚合在一起形成一大的聚集体。 同时配体a t p 与p h e n 之间还存在着芳环堆积效应。这种堆积效应不仅增强了络合物 的稳定性，同时也使得a t p 上的能量能够p h e n 转移给t b ”。 3 实验发现，通过表面活性剂引入，使得核酸体系的共发光现象得到明显的增 强。实验结果表明，c p b 和核酸通过静电引力和氢键作用力使核酸在c p b 上发生聚 集而生成了阳离予表面活性剂一核酸离子络合物，而g d ”和t b 3 + 分别与核酸上的磷酸 根结合，从而形成三元络合物。表面活性剂的加入不仅减小了分子间的距离，使得 分子间能量传递更加容易，同时也减小了来自溶剂分子的碰撞所造成的能量损失。 上述研究不仅为核( 苷) 酸检测提供了新的灵敏荧光探针，扩大了稀土共发光 效应的应用范围，而且也丰富了稀土共发光中能量传递理论的研究。 关键词：稀土共发光效应核酸鸟苷酸三磷酸腺苷稀土离子 a b s t r a c t n u c l e i ca c i d sa n dn u c l e o s i d ei st h em a t e r i a lb a s eo f a l ll i f e t h e ya r et h ec a r t i e ro f g e n e t i ci n f o r m a t i o na n da l s oa r et h ed e t e r m i n a t i v ef a c t o rf o rs p e c i e s c o n t i n u a t i o na n d e v o l u t i o n t h e yn e a r l yr e l a t et oh e r e d i t y ，t u m o r ，t h ee f f e c to fv i r e s ，a n ds oo n ，p r o b e t e c h n i q u ei st h ei m p o r t a n tm e a n sf o rt h er e s e a r c ho ft h e i rs t r u c t u r e ，f u n c t i o n q u a l i t a t i v e a n dq u a n t i t a t i v ea n a l y s e s s ot h er e s e a r c ho ft h ep r o b eo fn u c l e i ca c i da n dn u c l e o s i d e b e c a m et h ef o r w a r dp o s i t i o na n dh o tp o i n ti nt h eb i o s c i e n c e r e s e a r c h b yu s i n gt h e c o m m o ns p e c t r o f l u o r i m e t e r ，t h i st h e s i sp e n e t r a t e st h en e wp r o b eo fn u c l e i ca c i da n d n u c l e o s i d e ，s t u d i e s t h et h e i ri n t e r a c t i o na n dl u m i n e s c e n c em e c h a n i s m t h em a i n c o n c l u s i o na r el i s t e db e l o w ： i nt h ef i r s ts e c t i o n ，w es u m m a r i z er e c e n td e v e l o p m e n t so ff l u o r e s c e n tp r o b eo fb o t h n u c l e i ca c i d sa n dn u c l e o s i d e 蛆dc o 1 u m i n e s c e n c ee f l e e ta n d2 1 6r e f e r e i l c e sa r ec i t e d i nt h es e c o n ds e c t i o n ，t h ec o l u m i n e s c e n c ee f f e c to fg m pw a sf i r s tf o u n d e x p e r i m e n t s h o w e dt h a tl a 3 ，g d 3 + ，s c 3 十a n dy 3 + a l lc a i le n h a n c et h ef l u o i e s c e n c eo f t b g m ps y s t e m ， a m o n gw h i c hg d ”h a st h eg r e a t e s te n h a n c e m e n t u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h e e m h a n c e di n t e n s i t yo ff l u o r e s c e n c ei si np r o p o f t i o nt ot h ec o n c e n t r a t i o no fg m pi nt h e r a n g ef o r m3 1 0 一t o3 x 1 0 4 m o l 1 t h ed e t e c t i o nl i m i ti s3 9 x l o m o l 1 i nt h es t u d yo f m e c h a n i s m ，w ep r o p o s e t h a tb o t ht ba n dg d c o m p l e x c a l lf o r mb i g g e rn e t l i k ec o m p o u n d b yt h el i n ko f t h eo x y g e nb r i d g e ，t h r o u g hw h i c h t h ee n e r g ya b s o r b e db yg d c o m p l e xm a y t r a n s f e rt ot 0 3 + o ft o c o m p l e x i nt h et h i r ds e c t i o n , i ti sf o u n dt h a tt h ef l u o r e s c e n c eo ft b - a t p p h e ns y s t e mc a nb e e n h a n c e d b yl d + ，g d 3 + ，l u 3 + ，s e 3 + a n dy s + ，a m o n gw h i c hg d 3 + h a st h e g r e a t e s t e n h a n c e m e n t u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h ee n h a n c e di n t e n s i t yo ff l u o r e s c e n c ei si n p r o p o r t i o nt ot h ec o n c e n t r a t i o no f a t pi nt h er a n g ef o r mi x l 0 7t o5 x 1 0 一m o l l t h e d e t e c t i o nl i m i ti s5 4 x 1 0 9m 0 1 1 w h i c hi sa b o u t4 0t i m e sl o w e rt h a n t h a to ft h e t b a t p p h e ns y s t e m t h ep r o p o s e dm e t h o di st h em o s ts e n s i t i v ef l u o r e m e t r yo fa t p s o f a r t h es t u d i e si n d i c a t e dt h a ti nt h et b g d a t p p h e ns y s t e m ，t h e r ei sb o t ht b - a t p p h e n a n dg d a t p p h e nc o m p l e x e s ，t h e ya g g r e g a t et o g e t h e ra n d f o r mal a r g ec o n g e r i e s p h e ni s t h em a i ne n e r g yr e s o u r c ei nt h i ss y s t e m i tc a l lp r o v i d et h ee n e r g yt ot b 3 + d i r e c t l ) ，a n d m a k et b 3 + e m i ti t sc h a r a c t e r i s t i cf l u o r e s c e n c e i na d d i t i o n ，b e c a u s e o ft h e s t a c k i n g i n t e r a c t i d n so fa r o m a t i cr i n g sb e t w e e na t p a n dp h e n ，t h ee n e r g ya b s o r b e db ya t p c o u l d a l s ot r a n s f e rt ot b 3 + t h r o u g hp h e n t h e r e f o r e ，t h es o u r c eo f t h ee n e r g ) 7o ft b + i sm o r e e n h a n c e d ，a n dt h ef l u o r e s c e n t i n t e n s i t ya l s oi se n h a n c e d i nt h ef o r t h s e c t i o n ，w es t u d i e dt h ei n t e r a c t i o no f c e t y l p y r i d i n eb r o m i d e ( c p b ) a n dt h e s y s t e mo ft b - g d - d n a t h ee x p e r i m e n ti n d i c a t e dt h a tt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo ft b c p b n u c l e i ca c i ds y s t e mc a l lb ee n h a n c e db y l a 3 + ，g d 3 + ，l u 3 + ，s c 3 + a n dy 3 + ，o fw h i c h g d ”h a sm u c he n h a n c e m e n t u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n ，t h ee n h a n c e di n t e n s i t yo f f l u o r e s c e n c ei si np r o p o r t i o nt ot h ec o n c e n t r a t i o no fn u c l e i ca c i d si nt h er a n g e9 10 8t o l x l 0 g m lf o ry e a s tr n a ，1 x 1 0 7t o l x l 0 。5 l i l lf o rf i s hs p e r md n a t h ed e t e c t i o n l i m i t sa r e3 2a n d4 1 n g m l ，r e s p e c t i v e l y s y n t h e t i ca n dr e a l s a m p l e sw e r ed e t e r m i n e d s a t i s f a c t o r i l y t h i sm e t h o d h a s g o o ds e n s i t i v i t ya n ds t a b i l i t y t h em e c h a n i s m s t u d yi n d i c a t e st h a tc p b c o u l dc o m b i n ew i t ln u c l e i ca c i d st h r o u g h b o t he l e c t r o s t a t i cf o r c e sa n dh y d r o p h o b i ef o r c e s ，t h e ng d 3 + a n dt b ”w e r eb o u n dt o p 0 4 3 0 fn u c l e i ca c i da n df o r m e dt b - n u c l e i ca c i d c p ba n dg d - n u c l e i ca c i d c p b c o m p l e x e s ，r e s p e c t i v e l y w h e nt h es y s t e m w a se x c i t e d ，d n a c p ba b s o r b e dl i g h te n e r g y a n dt h e nt r a n s f e r r e di tt ot b ”t h r o u g hb o t hi n t r a m o l e c u l a re n e r g yt r a n s f e ri nt b n u c l e i c a c i d - c p bc o m p l e xa n di n t e r m o l e c n l a re n e r g yt r a n s f e rb e t w e e ng d n u c l e i ca c i d c p ba n d t b n u c l e i ca c i d - c p bc o m p l e x e s i na d d i t i o n ，i tw a sf o u n dt h a tt h eg a d o l i n i u mc o m p l e x a c t e dn o to n l ya st h ee n e r g yd o n o rb u ta l s ot h ee n e r g y - i n s u l a t i n gs h e a t h ，w h i c hi m p r o v e d t h en n o r e s c e n c eq u a n t u m y i e l d t h ec h i e f c h a r a c t e r i s t i c so f t h i st h e s i sa r ea sf o l l o w s ： 1 f i r s tf o u n d i n ga n dr e s e a r c ht h er a r ee a r t hc o l u m i n e s c e n c ee f f e c ti nt h es y s t e m so f n u c l e o s i d e ，a n da p p l y i n gi tt ot h ed e t e r m i n a t i o no f n u c l e o s i d e s ，s u c h a sg m pa n da t p i t i sag r e a tp r o g r e s so ft h er e s e a r c ho nt h en u c l e o s i d e t h i sm e t h o de x p l o r ean e w a r e af o r t h ea p p l i c a t i o no ft h el a x ee a r t hc o l u m i n e s c e n c ee f f e c ta n da l s op r o v i d en e wf l u o r e s c e n t p r o b e so f t h ed e t e r m i n a t i o n o f b o t hg m pa n da t p s p e c i a l l y ，t h ed e t e c t i o nl i m i to f g m p a n da t pc a nf a l l1 - 2o r d e rb yu s i n gt h i sm e t h o d c o m p a r e dt oo t h e rf l u o r e s c e n tm e t h o d s ， t h e s em e t h o d sa r ev e r ys i m p l e ，r a p i da n ds e n s i t i v e 2 s t u d y i n g t h ea c t i o nm e c h a n i s mo f c o l u m i n e s c e n c ee f f e c ti nt h es y s t e mo fn u c l e o s i d e i nt h et b g d g m ps y s t e m ，w ep r o p o s e dt h a tb o t ht ba n dg dc o m p l e x e sm a y f o r m b i g g e r n e t l i k e c o m p o u n db yt h e l i n ko ft h eo x y g e nb r i d g e ，a n dt h r o u g hw h i c ht h ee n e r g y a b s o r b e db yg d c o m p l e xm a y t r a n s f e rt ot b 3 + o ft b c o m p l e x i nt b _ g d p h e n - a t ps y s t e m r a r ee a r t hi o nc a nc o m b i n ew i t ha t pa n dp h e nt h r o u g he l e c t r o s t a t i cf o r c e s a n df o r m t b a t p p h e n a n dg d a t p ，p h e nc o m p l e x e s t h e s ec o m p l e x e s c a na s s e m b l eab i g c o n g e r i e s p h e np r o v i d e s t h em a i ne n e r g yt ot b ”f o ra t p ，t h e r eh a st h es t a c k i n g i n t e r a c t i o no fa r o m a t i cr i n g sb e t w e e ni ta n d p h e n s ot h ee n e r g ya b s o r b e db ya t pc o u l d a l s ot r a n s f e rt ot b 3 + t h r o u g h p h e n t h e nt h es o u r c eo f t h ee n e r g yo ft b 3 + i si n c r e a s e d ，a n d t h ef l u o r e s c e n ti n t e n s i t ya l s oi se n h a n c e d 3 f o u n d i n g t h a tt h ec o l u m i n e s c e n te f f e c ti nt h en u c l e i ca c i d ss y s t e mc a nb ee n h a n c e d g r e a t l ya f t e ra d d i n gt h es u r f a c t a n t e x p e r i m e n tr e s u l tp r o v et h a tc p bc a np r o m o t et h e a s s e m b l yo f n u c l e i ca c i d st of o r mc a t i o n i cs u r f a c t a n t - n u c l e i ca c i da s s e m b l e da s s o c i a t eb y b o t he l e c t r o s t a t i cf o r c e sa n dh y d r o p h o b i cf o r c e s t h ea d d i n go fs u r f a c t a n tn o to n l y s h o r t e n st h ed i s t a n c eo ft w om o l e c u l e s ，b u ta l s or e d u c et h ee n e r g yl o s sf r o mt h ec o l l i s i o n o fs o l v e n tm o l e c u l e t h er e s e a r c ha b o v en o to n l yp r o v i d et h en e wa n ds e n s i t i v ef l u o r e s c e n tp r o b eo ft h e d e t e r m i n a t i o no fn u c l e i ca c i d sa n dn u c l e o s i d e s ，e n l a r g et h ea p p l i c a t i o no fr a r e e a r t h c o 1 u m i n e s c e n c ee f f e c t ，b u ta l s oe n r i c ht h er e s e a r c ho nt h em e c h a n i s mo fe n e r g yt r a n s f e r j nc o 1 u m i n e s c e n c ee f f e c t k e y w o r d s ：r a r ee a r t hc o l u m i n e s c e n c ee f f e c t ；n u c l e i ca c i d s ；a t p ；g m p ；r a r e e a r t hi o n s 原创挂声髓 本人郑重声甥：浙至交熊学谴论文，是本人在导辩的指导下，独 立进行研究所取褥的成果。除文中已经注明弓l 用酶内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均融在文中以明确方式标明。本人完 全意识弼本声瞬豹法律责任盘本入承担。 一扩 7 论文作者签名：盗霆日期：遗翌墨：! ：! ， 关手学位论文使霁l 授投的声蠢莠 本人完全了解山东大学有关保熟、使用学位论文的撬定，阕意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 离容缡入有关数据库避行检索，可强采焉影印、缩印或葜袍复制手段 保存论文和汇缀本学位论文。 ( 保密论文在解密聪应遵守此规定) 谂文 乍豢签名：耄盈导师签名：毒避豳 期：童壁b 芏立厂 r l s ：共振光散射 c t d n a ：小牛胸腺脱氧核糖核酸 f s d n a ：鱼精予脱氧核糖核酸 y r n a ：酵母核糖核酸 g m p ：鸟苷酸 a t p ：三磷酸腺苷 b s a ：牛血清蛋白 h s a ：人血清蛋白。 s d b s ：十二烷基苯磺酸钠 s d s ：十二烷基磺酸钠 s l s ：十= 烷基硫酸钠 符号与缩写 c t m a b ：十六烷基三甲基溴化铵 c p b ：十六烷基溴化毗啶 h m t a ：六次甲基四胺 t f i s ：三羟甲基氨基甲烷 t t a ：三亚乙基四胺 t o p o ：三辛基氧膦 p h e n ：邻菲哕啉 i m s ：样品体系共振光散射的强度 i f 体系的荧光强度 l i 荧光强度的增强值 堡童i 童童 些查查耋堡圭兰堡丝塞墨= 耋 第一章绪论 核( 苷) 酸是生命现象的物质基础。它对生物的生长、遗传、变异等现象都起着 重要的决定作用。在生物体内，核酸常与蛋白质合成核蛋白，不同生物体，甚至不 同细胞的核酸，由于其化学组成，核苷酸排列顺序等的差别而各有不同。因而，从 生物分析化学的角度对核( 苷) 酸等的结构、定性、定量检测及其与探针作用机理 的研究引起了分析化学工作者的极大兴趣【1 1 4 。现已证明，许多疾病的发生，特别 是困扰人类的癌症均与体内遗传物质核( 苷) 酸的变化有着密切关系 1 5 1 7 。 如果能通过较简单的测试方法快速、准确地提供生物体内核( 苷) 酸浓度或其结构 方面的信息，搞清基因突变的原因、药物与核( 苷) 酸作用的机制，将会对疾病诊 断、新型抗癌药物的筛选，以及最终战胜人类的死敌癌症都有重要的意义 【1 8 2 5 】。将荧光技术、共振光散射技术、吸收光谱技术、透射电子显微技术及分子 模拟等手段相结合，在体外研究药物与核( 苷) 酸的作用机理，研究药物对核( 昔) 酸形态结构变化的影响，并建立其灵敏的测定方法，对新型生物大分子探针的筛选 有着直接的指导作用f 2 6 3 9 。 最初的核( 苷) 酸探针是用放射性同位素( 3 2 p 、坨5 i 或3 5 s ) 标记的。尽管此方法 具有较高的检测灵敏度，但由于放射性同位素本身固有的缺点以及所用仪器的限制， 使得该方法的发展受到一定的影响为此，以高灵敏的非放射性核( 苷) 酸探针标 记物来取代经典的同位素标记探针的研究获得了蓬勃发展 4 0 】。 电化学探针、发光探针，特别是荧光探针技术、共振光散射技术由于其方法简 便，灵敏度高等优点，已成为研究生物大分子的重要技术之一。将荧光探针技术、 光散射技术等光谱技术应用于核( 苷) 酸的定量、结构及作用机理等方面的研究， 是目前研究的前沿和热点之一【4 1 4 7 】。共振光散射技术是在普通荧光分光光度计上 进行测量的光散射分析技术。在研究生物大分子的识别组装和聚集时出现丰富而灵 敏的信号3 0 ，3 9 ，4 8 5 0 ，因而在生物分析化学研究中具有广阔的前景e 本部分主要 介绍荧光光度法的发光探针的研究现状及发展趋势e 第一节核苷酸荧光测定技术的研究进展 1 1 荧光探针 荧光技术在核( 苷) 酸的研究中有着广泛应用，激发光谱、发射光谱、发射峰 的位置、荧光偏振、能量转移、荧光寿命、荧光强度等参数可以对核( 苷) 酸荧光 堡童；奎童 当垂奎耋瑟耋耋堡冀奎篁戛塞 生色团的结构及其所处的微环境提供有用靛信息。 f o n n o s o 最翠发现一塑核苷酸及酵璐r n a 可班增强铽( 1 i d 静发光，著撬出这 种敏化的发光与d n a 中的鸟嘌呤碱藻的存在可能商关 5 1 】。而后，r i n g e r 5 2 j f d t o p a l 5 3 1 分别研究了不同梭酱酸积多聚棱巷酸对铽( i i i ) 荧光增援的程度，它们褥 融共同静结论是鸟礤玲( g ) 碱基残基魄箕它碱基( a 、c 、t 、u ) 豹孩营酸憨受有 效地发生铽( 1 i d 的能量转移以敏化其发光。此外对于5 g m p t b 的体系研究【5 4 】 也表明了这点：当t b 3 + 办s 入到g m p 巾，会弓l 起g m p 的荧光强发降低移t b 3 + 荧光 强度的稽热，蕊这静瑗象被认为是由予在5 - g m p - t b 钵系中发生了分子内能爨转 移的缘故，糊篡它的碱基不存在这种现敷。当用2 9 0 h m 的光激发时，酵母t r n a p ” 健镀( m ) 蛉荧光增强f 5 5 】。谗多大脑擗蘸t r n a 爱密码琢含4 麟尿嘧啶在3 4 2 n m 豹光的激发下，可出现4 一虢骧嘧蓰惫铽( i 珏) 襄铸( i i d 的能量转移 5 6 1 ，丽箕它躐 罄所转移的能匿很少 5 7 】，t r n a 对铽( 1 1 i ) 和铕( 1 1 1 ) 荧光的加强可用于t r n a 的 梅象变纯、热变性的研究1 5 s 】。 铕( 1 i d 的时间分辩发射光谱邑蠲予铸( 1 i i ) 的狻瞽酸配继环境豹研究f 5 9 3 。 k l a k a m p 等 6 0 1 利用激光诱导铕( 1 i d 和铽( h i ) 离予的荧光研究了含和不含鸟嗓呤 竣营酸及核棼酸共聚甥黪络擒。通过离子激发态寿禽抟分扳褥出，对含鸟螵岭核蕾 酸体系，1 铕( i i t ) 具有两种类型结台艇点。一种是强结合，有两个水分子，舅有6 或7 个配位慕米自核苷酸熬聚物，井形成核苷酸共聚物缔合体：另外一种是弱结合， 鸯6 或7 令零分子，还鸯l 或2 令配像赢寒蠡核营羧基聚甥。对不害鸟嗓呤核潆酸 体系，碱基的配位可能邋进水分子桥戳氛键方式与铕( i i i ) 结合，丽对于翦者，与 铕( i i i ) 配位的可能是鸟嘌呤碱基n 7 或c 6 - 0 。慈兹祥等 6 1 1 从核蟹酸中不同的碱 基缝橡入芋，捷出不嗣竣装酸黯鬣( 毽 茨竞敏诧程发豹不嗣与碱基孛是否存在c 5 0 有关。他们撼出核苷酸敏他的铽( ) 麓光的两个强鬻条件是， 1 ) 含磷酸基：( 2 ) 至少含一个c = o 。 p a t t y 等溺瞎+ 终揲镑辫】磅究了黢链d n a 孛靛肇谴镑配谤凝。磷究表明，c 碱 基对t b 3 + 韵荧光增强幅成太子d c m p ；d g m p 齐j - t b 3 + 旋光增强幅度夫子g 。双键d n a 错配中g g 镄配的增强幅度最大；其次摄c a ，g a 和c c 错配。利用t b 3 + 荧光的增强 霹裁凌圭| 羹捡测d n a 双键审黪苹链锘懿。 慈云祥游在研究中发现【6 3 ，6 4 j ，当向铽( i i d 按酸的体系中自# 入p h e n 时体系的 荧光强度会大大提高它们把铽( 1 i d ，p h e n 配合物作为荧光探针，并将其应用予热 2 作者：李蕾 山东大学硕士学位论文第一章 变性的小牛胸腺d n a 、鱼精予d n a 、酵母r n a 及各种核酸和聚核菅酸的系统研究。 结果表明，在p h e n 存在下，所有的核苷酸对铽( i i i ) 的荧光均有较大的增强作用， 这就为h p l c 分离荧光检测各种核苷酸提供了可能性。迸一步观察不同核苷酸在有 无p h e n 情况下对铽( i i i ) 荧光增强的比值i o i 发现，这些核苷酸可以分为三类：( 1 ) 腺嘌呤核苷酸类，它们的i o i 值在1 5 0 2 3 0 之间：( 2 ) 鸟嘌呤核苷酸类，i o i 值在 0 5 1 o 之间；( 3 ) 其它核苷酸类，1 0 i 值在l o 5 0 之间。上述结论说明，铽( i i i ) 一p h e n 配合物可以作为腺嘌呤碱基专荧光探针，而且可以根据i 矾值的差别对各种核苷 酸加以区分。 另外，对t b p h e n a t p 体系的研究发现，t b p h e n 与t b - p h e n - a t p 的荧光光谱 相似但强度增强1 5 倍，因此提出a t p 的荧光光度法【6 5 】。 1 2 荧光衍生化反应 由于，某些荧光试剂对于某一核酸碱基、核( 苷) 酸具有较高的分子识别能力。 因此，荧光试剂可以被用来进行生物核苷、核营酸的灵敏检验。一些荧光试剂如乙 二醛水合三聚体、氯乙醛、溴乙醛、氯乙酸、氯乙氰和苯乙醛等，已经报道被应用 于碱基、核( 苷) 酸的选择性荧光检测中。 1 2 。1 氯乙醛类的衍生化 1 9 7 1 年k o c h e t k o v 等人【6 6 】发现化学修饰对于研究d n a 和r n a 的结构和功能是 十分重要的，并且发现了9 氮甲基腺嘌呤和1 氮甲基胞嘧啶与氯乙醛的如下反应： 。西詈 n篙紫n p i i 1 j c h 3 孙 e h n _ c h 3 该反应的反应条件温和，并且在2 7 0 - 2 9 0 n m 处有强紫外吸收。 1 9 7 2 年s e c r i s t 等人 6 7 】发现腺苷和腺嘌呤核苷酸与氯乙醛反应生成1 ，n 6 _ 乙烯 类衙生物，该衍生物具有很强的荧光。同时，b a 玎i o 6 8 发现在p h 为3 5 时，胞嘧啶 童耋：奎薹 童篓奎兰翼圭耋篁墼橐篓三蓁 核苷能迅邀与氯乙醛反应，面p h 为4 5 是腺营的缀饿反应条件。a v i g e d 和d a m t e l 6 9 利用该反威检测到浓度低于1 0 p m o t 的腺嘌呤。丽后，人们利用该反成避行了系 列的研究【7 0 - 7 5 】。 貌黔，在氯乙醛懿磺究蘩勰主，久锅又尝试麓骚究与其筵稳糖议麴涣乙醛、氯 乙氰和氯忍馥与嘌岭和嘧睫藏其相应的核苷酸的衍生化反应f 7 6 7 8 。以溴乙醛代替 氯乙醛进行衍生化反应可以使梭莳酸的衍生物产爨提高2 0 。而且该衍生化反应的 最佳反应祭馋是在8 0o c 时加热1 5 分铀，这将有幂l 予防止更多的核营酸水解，但是 美孛不怼豹蹙溪己鹜是菲囊受产菇，弱黠，憨蝥秘岛啜岭懿毽台黪毯可以与溪乙醛 反应，毽怒它们衍生纯产物的荧光强度要比豫骠冷静弱l o 倍。使鹅糕乙氯份衍生纯 试剂 7 9 】w 以对胞苷进行选择性荧光反应，而且税察验条件下，腺噪岭仅能产生非常 弱的荧光衍生物，而其它的核静黢碱基均不会产生荧光。 由予这秘臻生诧反应迸弦缀慢，需要有缀长泔阕的魏热过程。对予氯乙醛来说 要在1 0 0 。c 下加热3 孬分镑p 5 】或者在鬣温下熬煞2 4 ，j 、麓【g 锈。蓑辩予及应活往援离 的溴乙醚米说，需要在1 0 0o c 下加热8 分钟( 7 6 1 。由于在高温下核替黢都不是很稳 定，特别是在弱酸性条件下【7 6 ，8 l 】，核苷酸的降解是不可避免的。例如a t p 能够水 解产生a m p 和a d p ，这就会使褥a t p 的荧光蜂强度有所下降。为了髂决这个间题， 天察尝试缀短燕热懿添，菠麓较塞夔酸囊竣食鸯e d t a 戆缓洚溶滚，毽莛倭然不麓 很好地解浃这个问题。 1 ，2 2 荤甲酰甲醛类的衍生化 1 9 7 2 每，y u k i 等人f 8 2 1 娥先报道了乙二醛水食三聚体与腺嘌呤的反应，其衍生 纯爱应豢农1 0 0 。c 下热热畿达三个小黠，辑生产物兵鸯荧兜，据姥霹叛溅定稼嘌呤 的含量。以屠，入们对魏进行了一系裂豹研究【8 3 嘏5 】。结果表鳃，笨乙醛、3 ，4 - 二 甲氧基举甲酰甲醛( d m p g ) 、3 ，4 - 亚甲二氧熬苯甲酰甲醛( m d p g ) 、4 一甲氧基 苯甲酰甲麟( m p g ) 和3 ，4 ，5 ，三甲氧基苯甲酰甲酸( t m p g ) 作为苯甲蘸； 甲醛( p g o ) 的类戗物均麓作舞鸟嗫呤髑篡拔( 萤) 酸的荧光徽鸯纯试剂。o h b a 等人对于d m p g 、