（果树学专业论文）桃果实几个乙烯信号转导相关基因的克隆及其表达.pdf

山东农业大学硕士学位论文 中文摘要 乙烯是调控植物生长发育重要的气态植物激素，其生理作用最终是通 过其信号转导途径实现的。肥城桃( p r u n u sp e r s i c a f e i c h e n g ) 为一地方 特色名产，是典型的呼吸跃变型果实，对乙烯作用极为敏感。本实验从肥 城桃果实中成功克隆了与乙烯信号转导有关的4 个全长基因，并在转录水 平上研究了p p e i l s 和p p e b f l 的表达特性，主要结果如下： 1 根据植物乙烯转录因子e i l ( e i n 3 1 i k e ) 家族的氨基酸和核苷酸保 守区序列，设计简并引物，采用r t - p c r 从成熟桃果实中分离了两个5 7 1 b p 的e i l 同源基因片段。随后运用r a c e 技术，分别扩增得到了两个包 含完整开放阅读框( o r f ) 及非编码区序列( u t r ) 的乙烯转录因子的 c d n a ，即p p e i l l 和p p e i l 2 。它们分别为20 8 6b p 和25 5 7b p ，编码蛋 白大小均为6 0 1 个氨基酸。虽然p p e i l l 和p p e i l 2 在氨基酸水平上的同 源性仅为4 2 ，但在n 末端d n a 结合功能域可高达8 6 。聚类分析结 果表明，两者分别属于e i n 3 e i l 家族两类不同乙烯转录因子成员。 2 在g e n b a n k 中获得的e s t 序列基础上，分别通过5 r a c e 和3 r a c e 技术结合得到全长为30 5 7 b p 的p p e b f l ，包含l9 4 1b p 的o r f 、 2 4 8b p 的5 u t r 和8 6 8b p 的3 u t r ，编码蛋白的分子量为6 8 9 6k d ， 推测等电点为7 4 1 。根据e s t 库中的核苷酸序列，设计特异引物进行p c r 扩增，结果得到了l2 6 3b p 的p p e r f l 全长基因，包含一个7 0 8b p 的 o r f 。序列分析表明，p p e r f l 与番茄、拟南芥、苹果和葡萄等在d n a 结合功能域的约5 8 个氨基酸中，同源性可达6 8 4 一l o o ，且在该区域 中存在1 个0 【螺旋和3 个反平行链构成的b 折叠结构。该序列与拟南芥、 葡萄、豌豆等植物的氨基酸同源性为5 8 8 躺7 5 ，属于同一类e r f 家 族成员。 3 实时荧光定量p c r 表明，在花器官及花后4 0 天的幼果中，p p e i l s 和e p e s f l 表达量较高，随着果实的成熟，表达量有增高的趋势；2 0 c 时。 1 u l l 外源乙烯明显促进p p e i l s 和p p e b f l 的表达，且随时间延长表达量 增加：而1p l l1 一m c p 处理则抑制p p e i l s 和p p e b f l 的表达。 关键词：桃；乙烯信号转导；基因克隆；表达 桃果实几个乙烯信号转导相关基因的克隆及其表达 j 1一 -lo c l o n i n l 兽a n de x p r e s s i o no is e v e r a lg e n e se n c o d i n g e t h y l e n es i g n a lt r a n s d u c t i o ne l e m e n t si np e a c hf r u i t a b s t r a c t e t h y l e n ei sag a s e o u sp l a n th o r m o n et h a tp l a y sak e yr o l ei nm a n y p r o c e s s e s t oe x p l o r et h er o l e so fe t h y l e n ei np l a n tf u n c t i o n s ，i ti si m p o r t a n t t o k n o wt h em o l e c u l a rd i s s e c t i o no fs i g n a lt r a n s d u c t i o n p e a c h ( e r u n u sp e r s i c a f e i c h e n g ) i sas p e c i a ll o c a lp r o d u c ta n dt y p i c a l l yc l i m a c t e r i cf m i t ，w h i c hi s s e n s i t i v e l ya f f e c t e db ye t h y l e n e i nt h i se x p e r i m e n t , f o u rg e n e se n c o d i n g e t h y l e n es i g n a lt r a n s d u c t i o ne l e m e n t si np e a c hf r u i tw e r ec l o n e d s t e a d y - s t a t e t r a n s c r i p t l e v e l so fp p e i l sa n dp p e b f lw e r ea s s e s s e db yq u a n t i t a t i v e r e a l t i m ep c r t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 t w oe d n af r a g m e n t s ，n a m e da sp p e i l1a n dp p e i l 2 ，w e r ei s o l a t e d f r o mm a t u r ep e a c hf r u i tb yr t - p c ru s i n gd e g e n e r a t ep r i m e r sc o r r e s p o n d i n g t ot h ee i n 3 e i lc o n s e r v e dr e g i o ns e q u e n c e ，b o t h5 a n d3 e n ds e q u e n c e so f t h et w oc d n a sw e r ec l o n e du s i n gr a c et e c h n i q u e p p e i l1a n dp p e i l 2 w e r e20 8 6a n d25 5 7b pi nl e n g t h ，r e s p e c t i v e l y , w h i l et h ep r e d i c t e do p e n r e a d i n gf l a m e s ( o r e ：) o ft h e i rc d n a sw e r eb o t hi 8 0 3b p t h es i m i l a r i t y b e t w e e np p e i l1a n dp p e i l 2w a so n l y4 2 a ta m i n oa c i d1 e v e l ，b u t8 6 b e t w e e nd n a - b i n d i n gd o m a i n so ft h et w oc d n a s t h er e s u l t so fp h y l o g e n i c a n a l y s i si n d i c a t e dt h a tp p e i l 1a n dp p e i l 2c o u l db ec l a s s i f t e di n t ot w o d i f f e r e n tg r o u p so fe i n 3 e i lp r o t e i nf a m i l y 2 a c c o r d i n gt ot h en u c l e i ca c i ds e q u e n c ef r o me s td a t a b a s e ，s p e c i f i c p r i m e r sw e r ed e s i g n e da n da30 5 7b pe d n af r a g m e n tc o n t a i n i n g3 a n d5 u n t r a n s l a t e dr e g i o nw a sa m p l i f i e db yr t - p c rf r o mr i p e n i n gp e a c hf r u i t t h e e d n a ，n a m e dp p e b f l ，c o n t a i n sa l lo r f w h i c hi s19 41 b pi nl e n g t h b a s e d o nt h en u c l e i ca c i ds e q u e n c ef r o me s td a t a b a s e ，s p e c i f i cp r i m e r sw e r e d e s i g n e da n da7 6 5b pe d n af r a g m e n tc o n t a i n i n g3 u n t r a n s l a t e dr e g i o nw a s a m p l i f i e db yr t - p c rf r o mr i p e n i n gp e a c hf r u i t t h ee d n a ，n a m e dp p e r f l ， 2 山东农业大学硕士学位论文 c o n t a i n sa no r fw h i c hi s7 0 8b pi nl e n g t h p p e r f lc o n t a i n sah i g h l y c o n s e r v e d ，p l a n t - s p e c i f i cd n a b i n d i n gd o m a i n ，w h i c hi sc o m p o s e do ft h r e e l b - s h e e t sa n do n e0 【- h e l i x m u l t i p l ea l i g n m e n to ft h ee r fc o n s e r v e dd o m a i n s s h o w st h a tp p e r f lh a s6 8 4 - 1 0 0 i d e n t i t yt oe r fh o m o l o gi no t h e rp l a n t s p p e r f ls h a r e dh i 曲s i m i l a r i t ya tb o t hn u c l e o t i d ea n dp o l y p e p t i d el e v e lw i 也 c o r r e s p o n d i n gs e q u e n c e sf r o ma r a b i d o p s i s ，g r a p ea n dp e a 3 q u a n t i t a t i v er e a l - t i m ep c ra n a l y s i sr e v e a l e dt h a tp p e l l sa n dp p e b f l g e n ee x p r e s s e da td i f f e r e n tl e v e l si np e a c hf l o w e r sa n dd i f f e r e n tr i p e n i n gs t a g e o ff r u i t s a c c u m u l a t i o no fp p e i l sa n dp p e b f lt r a n s c r i p t sc l e a r l yi n c r e a s e d a f t e r1 u 1 lo fe x o g e n o u se t h y l e n et r e a t m e n tf o r12ha n d2 4ha t2 0 c p p e i l s a n dp p e b f lm r n a sa c c u m u l a t i o nw e r ea f f e c t e db ylu l lo f1 - m c pi np e a c h f r u i t sa t2 0 c am a r k e dr e d u c t i o no fs p e c i f i ct r a n s c r i p ta c c u m u l a t i o nw e r e d e t e c t e di n1 - m c pt r e a t e dp e a c h e s 。 k e yw o r d s ：p e a c h ；e t h y l e n es i g n a lt r a n s d u c t i o n ；g e n ec l o n i n g ； e x p r e s s i o n 3 英文缩写及其中英文对照表 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行 科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮 助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本 声明的法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文 的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送 交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授 权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手 段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术信 息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据 库，并向社会公众提供信息服务。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：蕉翘登 导师签名：望幽 日 期：挚盟生坦! ! 亘 桃果实几个乙烯信号转导相关基因的克隆及其表达 1 前言 果实是人类重要的食物成分。果实成熟是植物复杂的发育调控过程， 伴随着色泽、硬度、组织、香气、风味和营养成分等成熟特性的急剧变化， 同时涉及到一系列成熟衰老基因的表达与调控( 雷东锋等，2 0 0 0 ： a l e x a n d e r & g r i e r s o n ，2 0 0 2 ) 。通过调控成熟衰老相关基因的表达，进而 延缓果实成熟衰老进程的研究，已成为采后研究领域中令人关注的前沿科 学问题( 罗云波，1 9 9 5 ) 。近年来，借助于拟南芥和番茄等模式植物一些 研究成果，果实成熟的分子生物学，特别是与乙烯作用相关的果实成熟控 制方面取得了很大进展。果实成熟的分子生物学研究，不仅对揭示果实成 熟的生理机制具有重要的理论意义，而且可为实践中人为地调控这个过 程，以获得贮藏性好、品质优良的品种奠定基础。 乙烯对植物生长发育过程如幼苗生长、开花、结实、叶片脱落、果 实衰老、病原体反应等有着广泛而深远的影响( a b e l e se ta 1 ，1 9 9 2 ；k u l a e v a & p r o k o p t s e v a ，2 0 0 4 ；l i & g u o ，2 0 0 7 ) 。乙烯与果实的成熟关系密切， 包括多糖水解、有机酸变化、硬度下降、香气增加、涩味消失和色泽变化。 这一系列变化的基础是乙烯的诱导，导致果实成熟过程中在m r n a 和蛋 白质水平上发生变化( w a n ge ta 1 ，2 0 0 2 ) 。研究表明，乙烯并不直接参与 植物的生理反应，而是经过一系列信号转导，通过调控编码执行某一特定 生理功能酶的基因转录表达，而在这个基因的启动子区域往往有该激素的 应答元件( s o l a n oe ta 1 ，1 9 9 8 ；h o e b e r i c h t se ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 1 1 乙烯和非乙烯对果实成熟衰老的控制 乙烯是调控跃变型果实成熟所必需的、分子结构极简单的气体物质。 这已经在包括乙烯生物合成和感受抑制剂的分析、改变乙烯生物合成转基 因植物、以及通过分析番茄永不成熟突变体n r ( n e v e rr i p e ) 等诸多方面 被证实。 通过对蛋白质体内和体外合成的研究表明，果实成熟期间m r n a 水 平和蛋白质发生了很大变化。使用r n a 合成抑制剂或蛋白质合成抑制剂 可延缓果实成熟进程，表明果实成熟过程受基因及其表达产物的调控。通 过对乙烯生物合成或者乙烯感受受到抑制的转基因植株以及成熟突变体 4 山东农业大学硕士学位论文 果实细致分析表明，跃变型果实成熟受乙烯和果实发育的共同调控 ( l e l i e v e re ta 1 ，1 9 9 7 ；w h i t e ，2 0 0 2 ) 。例如，编码乙烯生物合成限速酶 的a c s ，它本身最初在果实成熟过程中的启动是通过一个发育信号系统 而不是乙烯。基因表达分析结果表明“非乙烯介导 或“发育调控 规则 对番茄果实的许多成熟相关基因有重要影响( o i o v a n n o n i ，2 0 0 1 ) 。 根据果实的呼吸和乙烯生物合成速率，果实可分为呼吸跃变型和非呼 吸跃变型两类。呼吸跃变型果实，如番茄、桃、苹果和香蕉等采后具有典 型的乙烯释放高峰和呼吸高峰现象。研究表明呼吸高峰是由乙烯刺激而产 生的，去除环境中的乙烯或施加乙烯抑制剂( a v g 、a o a 、a g + 等) 能延 缓或抑制果实成熟。而施加外源乙烯或其同系物( 如丙烯) 能加速果实成 熟。乙烯对桃果实的呼吸跃变、叶绿素分解、糖分积累和转化、有机酸成 分变化、芳香物质形成和转化，以及果实组织软化等均产生重要影响 ( s a l t v e i t ，1 9 9 9 ) 。非呼吸跃变型果实，如草莓、葡萄、柑橘等在成熟过 程中没有出现呼吸高峰，乙烯含量保持在一个较低水平。乙烯对于非跃变 型果实同样具有促进成熟衰老的作用。 大量结果显示，乙烯是通过调节果实中的基因表达而影响成熟过程 的。通常认为果实中存在2 个乙烯生物合成调节系统：系统i 乙烯存在于 非跃变型果实和未成熟的跃变型果实中，为低水平的基础乙烯合成；系统 i i 乙烯为跃变型果实成熟时乙烯自我催化大量合成的乙烯。跃变型果实系 统i i 乙烯的产生可被系统i 乙烯或外源乙烯启动。 1 2 乙烯的生物合成 植物体内乙烯生物合成的途径为：m e t s a m _ a c c 一乙烯，其中 a c c 是乙烯生成的直接前体，a c s 和a c o 是乙烯生物合成过程中的关 键酶，两者均为多基因家族编码，并受伤害、果实成熟信号的调控( y a n g & h o f f i n a n ，1 9 8 4 ：徐昌杰等，1 9 9 8 ) 。 a c s 是一种以磷酸吡哆醛( p l p ) 为辅基的酶，对s 腺苷甲硫氨酸 ( s a m ) 具有立体专一性，是乙烯合成途径中的限速酶( k e n d e ，1 9 9 3 ) 。 a c s 最初是由a d a m s 和y a n g 于1 9 7 9 年从番茄果皮中分离出来，同年 b o i l e r 证实番茄组织中a c s 的活性。a v g ( m i n o e t h o x y v i n y l g l y c i n e ，氨 基羟乙基甘氨酸) 和a o a ( a m i n o - o x y a c e t i ca c i d ，氨基氧乙酸) 能强烈地 桃果实几个乙烯信号转导相关基因的克隆及其表达 抑制该酶的活性( n a k a j i m ae ta 1 ，1 9 9 0 ) 。编码a c s 的基因最早是从西 葫芦中分离出来的，金勇丰等( 2 0 0 0 ) 和t a t s u k i 等( 2 0 0 6 ) 先后从桃果 实中分离出a c s 同源基因。迄今研究的所有植物中的a c s 都是由一个以 上的基因所编码，其中在番茄中已克隆了9 个a c s 同源基因，l e a c s 2 和 l e a c s 4 与番茄果实乙烯大量释放有关；在拟南芥中也克隆了7 个a c s 同 源基因( v o g e le ta 1 ，1 9 9 8 ：s a m a c he ta 1 ，2 0 0 0 ) ，每个a c s 基因的表 达具有器官和刺激的特异性，并随植物发育、环境和激素信号差异表达 ( k e n d e ，19 9 3 ：z a r e m b i n s k i & t h e o l o g i s ，19 9 4 ) 。 乙烯生物合成途径中最后一个步骤是a c o 将a c c 氧化生成乙烯， 把外源a c c 供给植物组织就能使乙烯产生量增加，表明这个酶是植物体 内固有的，一般不成为乙烯生成的限速酶。推测a c o 的活性可能依赖于 细胞结构的完整性，因此用传统的生化方法不能分离到a c o ，但通过在 酵母中表达一个番茄成熟相关e d n ap t o m l 3 鉴定了a c o ( h a m i l t o ne t a 1 ，1 9 9 1 ) 。由于该c d n a 推导出的氨基酸序列与烷酮3 羟化酶的序列 同源，用提取该酶的方法首次从甜瓜中分离到有活性的a c o ( v e r v e r i d i s & j o h n ，1 9 9 1 ) ，并发现完整的a c o 活性可被f e 2 + 和抗坏血酸所恢复。 目前，从桃果实中分离了至少3 个a c o 同源基因( 金勇丰等，1 9 9 8 ： c a l l a h a ne ta 1 ，1 9 9 2 ，1 9 9 3 ) 。 有关乙烯生成与果实成熟的研究大多数是以番茄系统，特别是以成熟 阶段果实的乙烯生物合成为基础，减少乙烯生成的反义a c s 和反义a c o 番茄品种导致果实成熟明显受阻。 1 3 乙烯信号转导研究进展 1 3 1 拟南芥乙烯信号转导研究进展 目前已有很多关于拟南芥乙烯信号转导方面的综述，介绍了乙烯反 应突变体的筛选鉴定( w a n ge ta 1 ，2 0 0 2 ) 、乙烯信号转导元件的组分分 离( 王中风和应铁进，2 0 0 4 ) 、信号转导相关元件在植物发育过程和逆境 胁迫下的表达模式( c h e ne ta 1 ，2 0 0 5 ) 、亚细胞定位以及乙烯信号转导 与其他激素信号转导的交互作用( 安丰英和郭红卫，2 0 0 6 ：陈涛和张劲松， 2 0 0 6 ) 等。 山东农业大学硕士学位论文 研究发现，乙烯处理黑暗条件下的拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 后， 一些黄化幼苗对乙烯的“三重反应 ( 即下胚轴膨胀变短，顶端钩状芽弯 曲加剧，茎杆偏向水平生长) 表现明显不同。通过这种方法，人们从拟南 芥中分离得到了许多乙烯合成和信号转导发生改变的突变体，包括乙烯不 敏感型突变体和组成型乙烯反应突变体两大类( b l e e c k e re ta 1 ，1 9 8 8 ) 。通 过双突变体分析，推导出拟南芥中乙烯信号转导途径的线性轮廓，即乙烯 _ e t r 家族- c t r l _ e i n 2 _ e i n 3 ( e i l s ) 一e i 疆( e r e b p s ) _ 乙烯生 理反应，其中e t r 是乙烯受体，c t r l 是乙烯信号转导途径和乙烯反应 的负调节因子，e i n 2 是功能还不十分清楚的跨膜蛋白；e i n 3 ( e i l s ) 和 e r f 都是乙烯信号转导过程中的转录因子，在细胞核中起作用。研究表 明，转录调控机制是调控乙烯反应的主要机制( g u o & e c k e r ，2 0 0 4 ；c h e n e ta 1 ，2 0 0 5 ；安丰英和郭红卫，2 0 0 6 ) 。 拟南芥乙烯信号转导途径始于5 个成员构成的乙烯受体家族，紧接着 是具有蛋白激酶活性的c t r l 。e t r l 和c t r l 都是乙烯信号转导的负调 控元件。乙烯结合于受体后其负调控活性，然后引起下游具有正调控活性 的e i n 2 的表达，从而引发乙烯各种生理反应。 l 311e t r 家族 c h a n g 等( 1 9 9 3 ) 利用染色体步移和定位克隆方法第一次克隆了拟南 芥e t r l 基因，并获得其完整的基因序列。目前为止，从拟南芥中共分离 了5 个乙烯受体基因，分别为e t r l ( c h a n ge t a l ，1 9 9 3 ) 、e t r 2 ( s a k a i e ta 1 ，1 9 9 8 ) 、e r s l ( h u ae ta 1 ，1 9 9 5 ) 、e r s 2 、e i n 4 ( h u a & m e y e r o w i t z ， 1 9 9 8 ) 。五个受体中任意一个发生突变，都能够引起植物组织对乙烯敏感 性的改变，说明它们都参与了乙烯的感受( g u o & e c k e r ，2 0 0 4 ) 。乙烯受 体蛋白的结构通常可分为感受器( s e n s o r ) 结构域、组氨酸激酶( h i s t i d i n e k i n a s e ，h i ( ) 结构域和响应调节器( r e s p o n s er e g u l a t o r ，r r ) 结构域( c i a r d i e ta 1 ，2 0 0 1 ：s t e p a n o v a & e c k e r ，2 0 0 0 ) 。根据蛋白结构特征可把拟南芥 乙烯受体分为两个亚族。一个亚族( e t r l 家族) 由e t r i 和e r s l 组成， 另一个亚族( e t r 2 家族) 由e r s 2 、e t r 2 、e i n 4 组成( h u a & m e y e r o w i t z ， 1 9 9 8 ) 。早期研究一直认为乙烯受体是定位于细胞膜上，乙烯信号转导研 究的一个突破是发现乙烯受体主要存在于细胞内质网上( c h e r te ta 1 ， 7 桃果实几个乙烯信号转导相关基因的克隆及其表达 2 0 0 2 ) 。v o e t v a n v o r m i z e e l e 和g r o t h ( 2 0 0 3 ) 获得了高效表达e t r l 的 大肠杆菌，能够大量分离纯化该蛋白质，这将有助于乙烯受体蛋白质功能 的深入研究。最近研究表明，拟南芥e t r l 可以作为其他蛋白参与乙烯信 号转导的媒介( r e s n i c ke ta 1 ，2 0 0 6 ；z h o ue t 以，2 0 0 7 ) 。 1 3 1 2c t r l c t r l 基因是用t - d n a 标签法从插入突变引起的一个突变体中克隆出 来的，失去功能的c u l 突变体表现出组成型乙烯反应，表明c t r l 基因编码 蛋白是乙烯信号传递途径中的负调控因子。c t r l 的n 末端类似于哺乳动 物r a f 蛋白激酶家族的催化区域，但c 端与r a f 激酶家族的相似性很低 ( j o u a n n i ee ta j ，1 9 9 9 ) 。尽管拟南芥中仅存在单个c t r l ，但多数果实中 c t r 可能不是唯一的，推测它们在果实成熟中的作用可能较为复杂。近来 研究表明，m a p k 激酶级联反应参与了乙烯信号转导( y o oe ta 1 ，2 0 0 8 ) 。 c t r l 可能通过剧a 7 2 到删的途径，或者通过m a p k 激酶级联反应直接影 响e i n 3 ，进而调控乙烯信号转导途径。 1 3 1 3e i n 2 e i n 2 介导了蛋白激酶c t r l 和转录因子e i n 3 e i l 之间的信号传递， 是乙烯和胁迫反应共有的一个双功能蛋白质，连接了不同的激素信号途 径，编码一个跨膜蛋白质( a l o n s oe ta 1 ，2 0 0 3 ) 。e i n 2 的n 末端疏水区 域类似于n r a m p 蛋自家族。e i n 2 的c 末端亲水域与已知蛋白质没有同源 性。过量表达全长e i n 2 或n 末端( 氨基酸1 - 4 8 0 ) 的植株没有表现出组 成型乙烯反应或乙烯过敏反应。在e i n 2 突变体中过量表达e i n 2 的c 末 端导致组成型激活一些而不是全部的乙烯反应，并且恢复了突变体对除草 剂和茉莉酸( j a ) 的反应。这些结果表明e i n 2 的n - 末端对于从上游感 受乙烯信号是必需的，乙烯信号传递到下游组分需要e i n 2 的c 末端，并 且说明e i n 2 参与了胁迫反应。最近研究表明，e i n 2 可以被e t p l 2 两个 f b o x 蛋白参与的泛素途径降解( q i a oe ta 1 ，2 0 0 9 ) 。 1 - 3 1 4e i n 3 和e l l s e i n 3 e i l s 是位于细胞核内的乙烯信号转导元件，它可以识别启动子 区含有初级乙烯反应元件( p e i 也) 的目标基因，而p e r e 序列不仅存在 于下游e r f 的启动子区，还存在于一些果实成熟、衰老相关基因的启动 山东农业大学硕士学位论文 子区，如a c o ( b l u m ee ta 1 ，1 9 9 7 ；l a s s e r r ee ta 1 ，1 9 9 7 ) 。 e i n 3 基因克隆为早期乙烯信号转导途径中的细胞核调控提供了直接 证据( c h a oe la l ，1 9 9 7 ) 。乙烯反应伴随着许多基因的表达( d e i k m a ne la 1 ， 1 9 9 8 ) 。除受乙烯调节外，e i l 还可以通过e b f l 和e b f 2 两个专一f b o x 蛋白参与的s c f ( s k i p c u l l i n - f b o x ) 蛋白酶体( p r o t e a s o m e ) 降解通路 进行调节( g u o & e c k e r ，2 0 0 3 ：p o t u s c h a kc ta 1 ，2 0 0 3 ) 。拟南芥e i n 3 突 变体不表现三重反应，并且依赖乙烯的基因表达降低，表明e i n 3 是乙烯 信号传递途径中的一个重要调节因子。 e i n 3 是一个可与d n a 结合的核定位蛋白质，被认为是乙烯转录因 子。在这个多基因家族成员中，e i n 3 、e i l l 和e i l 2 可以拯救e i n 3 的突 变表型。这表明e i n 3 、e i l l 和e i l 2 均参与了乙烯信号转导，同时也解 释了为什么e i r d 突变体只能引起部分乙烯不敏感。在e i n 2 突变体中过量 表达e i n 3 可导致组成型乙烯反应，证实了e i n 3 作用于e i n 2 的下游。 e i n 3 e i l s 蛋白家族在结构上有几个明显的特点：( 1 ) n 末端有一个 富含酸性氨基酸的结构域：( 2 ) 有一个脯氨酸富集区；( 3 ) 一个回文结构； ( 4 ) 几个高度碱性区域；( 5 ) 靠近c 末端几个多聚天冬酰氨或多聚谷氨 酰氨重复。这些结构被认为是转录激活结构域所具有的特征( m i t c h e l l & t j i a n ，1 9 8 9 ) 。 1 3 。1 5e b f e b f l 和e b f 2 是两个定位于细胞核上，并且与e i n 3 蛋白专一结合 的f b o x 蛋白，它们在拟南芥各种器官中组成型表达。研究结果表明，拟 南芥泛素介导的蛋白质降解通路参与了乙烯反应的调节，它是通过调节作 为转录因子的e i n 3 水平而实现的( g u o & e c k e r ，2 0 0 3 ；p o t u s c h a kc ta 1 ， 2 0 0 3 ) 。在无乙烯条件下，e i n 3 是一种半衰期仅为3 0m i n 的蛋白质，很 不稳定，乙烯或a c c 处理可增加e i n 3 稳定性。e i n 3 除受乙烯调节外， 还可以通过e b f l 、e b f 2 参与的s c f 蛋白酶体( p r o t e a s o m e ) 降解通路 进行调节。当e b f l 或e b f 2 发生突变后，植物会相应表现出对乙烯反应增 强，这与e i n 3 稳定性增加有关，而当e b f l 和e b 亿双突变会因e i n 3 高表 达而导致植株发生乙烯组成型反应。两者中任意一个f b o x 过表达植株由 于造成e i n 3 降解而相应表现出对乙烯敏感性降低。s c f 复合体通路的专 桃果宴几个z 烯信号转导相关基闻的克降皮其表达 一抑制剂( m g l 3 2 或m g l l 5 ) 也会造成植株中e i n 3 的增加，而作用广 谱的蛋白质生物合成抑制剂p e f a b l o c 则对e i n 3 水平没有影响( g u o e e k e r ，2 0 0 3 ) 。这些结果说明f - b o x 蛋白参与的e i n 3 降解途径在乙烯信 号转导过程中起调控作用( 图11 ) 。 。：_ 一“一“”5 。”揣扩器 目m 陬槲* m 州m h “ mp 舢t 帅舯妇 蛐| i 酣 图1i 拟南芥e 烯信号转导的模式 f i g ll ap r o p o s e d m o d e lo r c m v l o n es i g n a l t r a n s d u c t i o n i n a r a b j d o p s i s ( g u o e e k e r , 2 0 0 3 ) 虽近研究表明，e b f l 和e b f 2 又可进一步被乙烯信号转导组分e i n 5 所调节( o l m e d oe ta l ，2 0 0 6 ：p o m s c h a ke ta l ，2 0 0 3 ) 。它们之间的关系 如下图所示( 图l2 ) 。 晶嚣邮 h * n 4 p 一 图i2e i n 5 在乙烯信号转导中的作用 f i 9 1 , 2 t h er o l eo f e i n 5 i n t h ee t h y l e n es i g n a l t n m s d u c t t h np a t h w a y ( o l m e d oe a l ，2 0 0 6 ) 、 眦呲 | | 莹 帆 一 m+日 叩 山东农业大学硕士学位论文 1 - 3 1 6e r f ( e r e b p ) e r f ( e t h y l e n e r e s p o n s ef a c t o r ) 属于植物特有的一个反应因子基因家 族，位于乙烯信号转导途径的下游，含有高度保守的a p 2 区域。拟南芥 a p e t a l a 2 相似蛋白中含有2 个a p 2 区域( b e n n e t t & l a b a v i t c h ，2 0 0 8 ； c a r a & g i o v a n n o n i ，2 0 0 8 ) 。e r f l 是利用烟草乙烯反应元件结合蛋白 e r e b p l ( o h m e t a k a g i & s h i n s h i ，1 9 9 5 ) 的互补片段从拟南芥的e d n a 文库中筛选得到的，它是一个受乙烯诱导的基因，并且依赖于e i n 3 ，在 e i n 3 1 突变植株中检测不到e r f l 的表达，认为e r e i 是在e i n 3 下游起 作用( s o l a n oe ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 蛋白质结构分析表明，该结构域约由5 7 个氨基酸组成，可形成1 个 a 螺旋和3 个反平行链构成的卢折叠结构。仅螺旋可能是通过它的疏水侧 面与d n a 的大沟相互作用参与d n a 结合，肛折叠负责识别所调控基因 的启动子序列。e r f 结构域中的n 末端是碱性亲水区，其中位于n 端的 1 9 2 2 个富含碱性和亲水性的氨基酸残基称作y r g 元件。蛋白质三维分 析显示在n 端含有3 个伊折叠，能够起到识别顺式元件作用，其中位于 第二个伊折叠的1 4 位和1 9 位氨基酸残基的差异与顺式元件结合直接相 关。e r f 结构域的c 末端含有由4 2 4 3 个氨基酸组成的r a y i ) 元件，由 r a y d 元件中1 8 个高度保守的氨基酸核心区域形成一个双亲a 螺旋，参 与其它转录因子和d n a 的相互作用( a l i e ne ta 1 ，1 9 9 8 ) 。e r f 基因是 e i n 3 e i l l 的直接作用目标，能够与乙烯诱导基因启动子的g c c b o x 结 合，其超表达突变体表现组成性乙烯反应，说明e r f 是正的转录调控因 子( o h m e t a k a g i & s h i n s h i ，1 9 9 5 ：k l e e ，2 0 0 4 ) 。e i n 3 二聚体能够与e r f l 的启动子区域特异结合，在转录水平上调控e r f i 表达。无论e i n 3 的来 源如何，它都能识别e r f l 上的特异目标位点( s o l a n oe ta l 。，1 9 9 8 ) 。e r f l 过表达植株与e i n 3 过表达植株在乙烯反应方面表现很大的相似性，表明 e r f l 调节只有e i n 3 介导的乙烯反应这一条信号转导途径( s o l a n oe ta 1 ， 1 9 9 8 ) 。 e r f l 能特异结合位于拟南芥的几丁质酶基因和大豆几丁质酶5 b 基 因启动子区域的g c c b o x 。g c c b o x 是一个1 1b p 序列的 t 从g a g c c g c c ，含有结合需要的核心序列g c c g c c 。e r f l 能启动下 桃果实几个乙烯信号转导相关基因的克隆及其表达 游的乙烯应答，在植物体内过量表达e r f l 基因会产生组成型乙烯反应表 型，如部分的三重反应和几丁质酶基因的表达等( s o l a n oe ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 f u j i m o t o 等( 2 0 0 0 ) 从拟南芥中分离了e r f 基因家族的5 个成员，它们 受乙烯和非生物胁迫( 如低温、高盐、干旱) 的差异调节。 值得注意的是，并非所有的e r f 成员都编码转录活性因子，还有一 些基因编码抑制型转录因子。从诸多乙烯反应来看，乙烯相关的表型变化 应是由一些基因的激活和抑制引起的。也就是说，还有一些乙烯反应相关 基因没有e i n 3 结合元件，其启动子上也没有g c c b o x ，即转录因子与 e i n 3 和e r f l 都没关系，而是有另外不周的特异结合因子。或许它可参 与乙烯信号的更下游反应，这些证据可能对完成乙烯调控的基因表达研究 极为重要。 目前为止，拟南芥中发现1 2 个亚族1 2 2 个e r f 基因( n a k a n oe ta 1 ， 2 0 0 6 ) 。拟南芥e r f 基因在植株逆境胁迫和生长发育过程中具有重要作 用。慨( 第1 族e r f ) 、d r e b 2 s ( 第族五灯) 、a t e b p ( 第族职f ) 和a t e r f l 4 ( 第族五灯) 参与低温和热胁迫等抗逆反应( n o v i l l oe ta 1 ， 2 0 0 7 ：o f i a t e s h n c h e ze ta 1 j2 0 0 7 ) ，d d f s ( 第族e r f ) 参与赤霉素的 合成( m a g o m ee ta 1 ，2 0 0 4 ) ，l e p ( 第族e r f ) i 周控幼苗发育( w a r de ta 1 ， 2 0 0 6 ) ，而d r l ( 第族e 足f ) 则是雄蕊形成的关键因子( n a ge ta 1 ，2 0 0 7 ) 。 研究显示，逆境相关基因的启动子区多具有g c c 盒( b r o w ne ta 1 ， 2 0 0 3 ) ，但迄今尚未发现果实成熟、衰老相关基因在启动子区含有g c c 盒。因此，e r f 如何与目标基因联系进而调控果实成熟进程有待阐明。 1 3 2 番茄乙烯信号转导研究进展 番茄是研究果实成熟衰老机制的一个理想模式材料。由于拟南芥对于 果实成熟衰老作用机制研究的局限性，所以随着拟南芥中乙烯信号转导轮 廓的提出，人们迅速展开了对番茄乙烯受体及信号转导的研究，并已取得 了很大的进展( a d a m s p h i l l i p se ta 1 ，2 0 0 4 a ) 。 番茄丰富的生理生化和分子遗传学知识背景，使其成为研究乙烯反应 和果实成熟衰老的理想模式植物( a l e x a n d e r & g r i e r s o n ，2 0 0 2 ) 。目前， 番茄的6 个乙烯受体基因( l e e t r l 6 ) 已分别被分离和定性( l a s h b r o o k e ta 1 ，1 9 9 8 ：t i e m a n & k l e e ，1 9 9 9 ；w i l k i n s o ne ta 1 ，1 9 9 5 ) ，其中l e e t r 3 山东农业大学硕士学位论文 ( 即n r ) 基因定位在番茄的第9 号染色体上，序列分析发现n r 突变体 就是由于n r 蛋白质3 6 位上单个碱基突变而使p r o 变成l e u 造成的。n r 突变体除果实不能正常成熟外，还显示出乙烯不敏感突变株的多效突变效 应，具体表现为：不表现乙烯的三重反应，叶柄不易脱落，叶和花瓣衰老 进程明显推迟等( l a n a h a ne ta 1 ，1 9 9 4 ) 。 在拟南芥中仅分离了一个c t r l 基因，但从番茄中已分