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基于四种基因的蝇科分子系统学研究 基于四种基因的蝇科分子系统学研究 专业：动物学 硕士生：韩小磊 导师：贾凤龙副教授 摘要 世界上蝇科种类约有4 5 0 0 余种，我国蝇科如今记录数目超过6 0 个属、1 2 7 5 种，约占世界种类1 4 以上。蝇科昆虫是重要的卫生昆虫，对其进行包括系统学 等多方面的研究是十分重要的。本文通过选取细胞色素c 氧化酶亚基i ( c o i ) 、 i i ( c o i i ) 及1 6 sr d n a 基因和核基因1 8 sr d n a 四种基因作为分子标记，对蝇 科的系统发育关系进行进一步探讨。 提取了蝇科7 亚科1 2 属3 7 种的基因组总d n a ，从g e n b e n k 下载蝇科1 2 种的c o i 、c o i i 与蝇科1 种的1 6 sr d n a 和1 8 sr d n a 基因。从而获得了长度1 5 0 6 b p 的c o i 基因序列3 9 条；获得长度为6 6 6b p 的c o i i 基因序列3 9 条；获得长 度为5 2 9b p 的1 6 sr d n a 基因序列3 8 条；获得长度为1 9 1 5b p 的l g sr d n a 基因 序列3 8 条。然后测定了丽蝇科的大头金蝇和绯颜裸金蝇的四种基因序列做外群。 利用c l u s t a l x l 8 3 、m e g a 4 0 、p a u p 4 0 等系统发育软件对d n a 序列的碱基组 成、碱基替换、遗传距离等进行分析，碱基替换饱和性分析表明要分析的序列具 有较强的系统发育信号。采用最大简约法( m p ) 、邻接法( n j ) 、最大似然法( m l ) 等对c o i 、c o i i 、1 6 sr d n a 和1 8 sr d n a 数据集以及四种基因的联合数据集进 行蝇科的系统发育关系重建。最后得出了如下结论： l 、蝇科种类的c o i 、c o i i 和1 6 sr d n a 基因片段都表现出明显的a + t 含量 偏向性( 大于7 0 0 ) ，而1 8 sr d n a 基因的a + t 含量与g 含量相差不大。 转换和颠换比( t s 爪) 与遗传距离具有依赖性，线粒体基因转换频率明显小于 颠换，而核基因转换频率明显大于颠换。 2 、采用n j 、m p 和m l 分别构建c o i 、c o i i 、1 6 sr d n a 、1 8 sr d n a 和联 中山大学硕士学位论文 合基因5 个数据组的系统发育树，在得到的1 5 个系统树中，同一基因不同建树 方法相差不大，而不同基因构建的系统树有明显区别，说明所选目的基因片段适 合不同的分类群及分类单元。c o i 和1 8 sr d n a 基因建树效果最好，c o i 在属级 水平分类效果较好，而1 8 sr d n a 能很好区别亚科阶元，c o l l 分析结果较凌乱。 总体来说，所研究的各个亚科之间的系统关系可以表示为( ( ( m u s c i n a e ， s t o m o x y i n a e ) 、a z e l i i n a e ) 、( ( r e i n w a r d t i i n a e 、a t h e r i g o n i a e ) 、( m y d a e i n a e 、 c o e n o s i i n a e ) ) ) 。 3 、本研究不同建树方法都支持将s t o m o x y i n a e 作为一个族置于m u s c i n a e 中； 支持r e i n w a r d t i i n a e 与a t h e r i g o n i a e 具有较近亲缘关系：支持m y d a e i n a e 与 c o e n o s i i n a e 具有很近亲缘关系，但不支持将二者分为两个亚科。 4 、本研究结果显示，各个亚科或族的种属基本都能很好聚集到一起。支持 m u s c a 为进化上一个单系，其中ms o r b e n s 和彪l a r v i p a r a 为姊妹群，膨v e n t r o s a 与m u s c a 其它种类相距较远；无论何种建树方法，都支持将a c to r i e n t a l i s 所在 的a c r i t o c h a e t a 从a t h e r i g o n a 分离出来；各种方法对4 种基因的分析显示了m x a n t h o m e l a e n a ，mc o n v e x i f r o n s 和肱f l e w h e r i 在系统发育上的血缘关系。跏 n u d i s e t a 在c o i 的n j 和m l 树及1 8 sr d n a 的m l 树中，均与a t h e r i g o n i n a e 相 聚，这可能是由于环境压力造成的趋同进化的结果。 总体来说，本文研究结果与国际上公认的蝇科八个亚科( a c h a n t h i p t e r i n a e ， a t h c r i g o n i n a e ，a z e l i i n a e ，c y r t o n e u r i n i n a e ，c o e n o s i i n a e ，m u s e i n a e ，m y d a e i n a e 和 p h a o n i i n a e ) 的分类地位相符合，结果大多支持范滋德( 2 0 0 8 ) 的亚科分类系统。 研究表明，所选四种基因能很好解决蝇科高级阶元的系统发育关系。 关键词：蝇科、系统发育、c o i 、c o i i 、1 6 sr d n a 、1 8 sr d n a 基于四种基因的蝇科分子系统学研究 一一一_ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ - _ - 一 m o l e c u l a rp h y l o g e n yo ft h ef a m i l ym u s c i d a e b a s e do i la n a l y s i so ff o u rg e n e s m a j o r ：z o o l o g y n a m e ：h a nx i a o l e i s u p e r v i s o r ：p r o f j i af e n g l o n g a b s t r a c t m o r et h a n4 5 0 0s p e c i e so fm u s c i d a es p e c i e sh a v eb e e nd e s c r i b e di nt h ew o r l du p t on o w a b o u t6 0g e n e r aa n d12 7 5s p e c i e so ft h ef a m i l ya r er e c o r d e di nc h i n a i ti s n e c e s s a r yt ou n d e r s t a n dt a x o n o m i ca n dp h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p sf o rt h ei m p o r t a n t m e d i a c a lf a m i l y i nt h i sp a p e r , f o u rg e n e s ，c o l ，c o i i ，16 sr d n a a n d18 sr d n at h a t a r ep o p u l a r l yu s e df o rs t u d y i n gp h y l o g e n e t i cr e a l a t i o n s h i p sa m o n gm u s c i df l i e s ，w e r e s e l e c t e da sm o l e c u l a rm a r k e r sf o r t h es t u d ya b o u tp h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p so f m u s c i d a e t h eg e n o m i cd n aw e r ee x t r a c t e df r o m3 7s p e c i e s ，b e l o n g i n gt o1 2g e n e r ao f7 f a m i l i e so fm u s c i d a e t w e l v ec o i ，c o i lg e n e s ，o n e16 sr r n aa n do n e18 sr r n a g e n e sw e r ed o w n l o a d e df r o mn c b i a t o t a lo f3 9s e q u e n c e so fc o l ，t h el e n g t ho f 1 5 0 6b p ；3 9s e q u e n c e so f c o i i ，t h el e n g t ho f 6 6 6b p ；3 8s e q u e n c e so f1 6 sr d n a ，t h e l e n g t ho f5 2 9b p ；3 8s e q u e n c e so f1 8 sr d n a ，t h el e n g t ho f1 9 1 5b pw e r eo b t a i n e d t h eg e n e so fc h r y s o m y am e g a c e p h a l aa n da c h o e t a n d r u sr u f f f a c i e so fc a l l i p h o r i d a e w e r es e l e c t e da so u t g r o u p t h eb a s ef r e q u e n c i e s ，b a s es u b s t i t u t i o n sa n dg e n e t i c d i s t a n c e so fd n as e q u e n c e sw e r ea n a l y z e db yu s i n gc l u s t a l x l 8 3a n dm e g a 4 0 p h y l o g e n t i cs i g n a lw a st e s t e dv i ab a s es u b s t i t u t i o ns a t u r a t i o na n a l y s i s r e s u l t ss h o w t h e r ew e r es t r o n g e rp h y l o g e n e t i cs i g n a li nt h ed a t at e s t s c o i ，c o i i ，16 sr d n a ，18 s r d n ag e n es e q u e n c e sa n dc o n b i n e dd a t as e tw e r ea d o p t e da sm o l e c u l a rm a r k e r , a n d m p , n ja n dm lm e t h o d si nm e g a 4 0a n dp a u p 4 0w e r eu s e dt or e c o n s t r u c tt h e p h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p s f o l l o w i n gr e s u l t sw e r eg o t t e n ： i i i 中山大学硕士学位论文 1 t h ec o l ，c o i ia n d16 sr d n ag e n es e q u e n c e so fm u s c i d a es p e c i e ss h o w e d h i g h l ya + tb i a s ，谢t i la v e r a g em o r et h a n7 0 0 c o n t e n to fa + to f18 sr d n a s h o w e dn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c ew i t ht h ec o n t e n to fc + g c o n t r a r i l y c o n v e r s i o na n d t r a n s v e r s i o nr a t i o ( t s 厂r v ) w a sd e p e n d e n to ng e n e t i cd i s t a n c e m i t o c h o n d r i a lg e n e c o n v e r s i o nf r e q u e n c yw a ss i g n i f i c a n t l ys m a l l e rt h a nt r a n s v e r s i o n s ，a n dn u c l e a rg e n e c o n v e r s i o nf r e q u e n c yw a ss i g n i f i c a n t l yg r e a t e rt h a nt r a n s v e r s i o n s 2 t h ep h y l o g e n e t i ct r e ea b o u t3 9s p e c i e so fm u s c i d a ew e r ec o n s t r u c t e du s i n gn j ， m pa n dm l al i t t l ed i f f e r e n c ew a ss h o w e db yd i f f e r e n tw a y si nt h es a m eg e n ef r o m t h e15p h y l o g e n e t i ct r e e s h o w e v e r ，t h ed i f f e r e n tg e n et ob eu s e dt oc o n s t r u c t p h y l o g e n e t i ct r e e sw e r es i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n t i ti n d i c a t e st h a tt h es e l e c t e dg e n e f r a g m e n t si nt h i sp a p e rw e r es u i t a b l ef o rd i f f e r e n tt a x o na n a l y s i s ，o fw h i c hc o la n d 18 sr d n ag e n ew e r et h eb e s t c o iw a sf ri nt h eg e n e r a ll e v e la g a i n s t18 sr d n a s u i t a b l ei ns u b f a m i l i e s h o w e v e r ，t h er e s u l to fc o i ia n a l y s i sw a sm o r em e s s y t h e i n f e r r e dr e l a t i o n s h i pw a s ( ( ( m u s c i n a e ，s t o m o x y i n a e ) ，a z e l i i n a e ) ，( ( r e i n w a r d t i i n a e ， a t h e r i g o n i a e ) ，( m y d a e i n a e ，c o e n o s i i n a e ) ) ) 3 i nt h i ss t u d y , a l lt h ec o n t r i b u t i o nm e t h o d ss u p p o r t e ds t o m o x y i n a ea sat r i b ei n t h em u s c i n a e ，r e i n w a r d t i i n a ea n da t h e r i g o n i a eh a v i n gac l o s eg e n e t i cr e l a t i o n s h i p ， m y d a e i n a ea n dc o e n o s i i n a eh a v i n gac l o s eg e n e t i cr e l a t i o n s h i p t h er e s u l t sd i dn o t s u p p o r tm y d a e i n a ea n dc o e n o s i i n a e 嬲v a l i ds u b f a m i l i e sr e s p e c t i v e l y 4 t h er e s u l t ss h o w e dt h a tm o s to fs p e c i e sa n dg e n e r ao fe a c hs u b f a m i l ya n d 仃i b ec o u l dc l u s t e rt o g e t h e r a l ls p e c i e so fg e n u sm u s c as l w a y sc l u s t e r e dt o t e t h e rv e r y w e l ls u g g e s t e dt h a tg e n e r am u s c ab em o n o p h y l y m s o r b e n sa n dm 1 a r v i p a r a s h o w e dt ob es i s t e rg r o u p s mv e n 衍o s aw a ss e p a r a b l ef r o mo t h e rs p e c i e so fm u s c a a l lt h ec o n t r i b u t i o nm e t h o d ss u p p o r t e dt h a ta c r i t o c h a e t as h o u l db es e p a r a t e df r o m t h eg e n e sa t h e r i g o n a t h er e s u l t su s i n ge a c hm e t h o df o ra n a l y z i n gt ot h ef o u rg e n e s s h o w e dt h ec l o s ep h y l o g e n e t i er e l a t i o n s h i p s a m o n g 彪x a n t h o m e l a e n a ，肱 c o n v e x i f r o n sa n d 膨f l e t c h e r i t h er e s u l t so fn ja n dm lt r e e so fc o lg e n ea n dt h e m lt r e eo f18 sr d n ag e n es h o w e dt h a ts y n u d i s e t ag a t h e r e s 、析t ha t h e r i g o n i n a e t h i sm i g h tb ed u et oe n v i r o n m e n t a ls t r e s sc a u s e db yt h er e s u l to fc o n v e r g e n t e v o l u t i o n t v 基于四种基因的蝇科分子系统学研究 t h er e s u l t so ft h i ss t u d yw a sb a s i c a l l yc o n s i s t e n t 、析t ht h es y s t e mo fm u s c i d a e p o p u l a r l ya c c e p t e db ym o s tm u s c i d e s t s ( a c h a n t h i p t e r i n a e ，a t h e r i g o n i n a e ，a z e l i i n a e ， c y r t o n e u r i n i n a e ，c o e n o s i i n a e ，m u s c i n a e ，m y d a e i n a ea n dp h a o n i i n a e ) t h er e s u l t s r o u g h l ys u p p o r t e dt h et a x o n o m i cs y s t e mi ns u b f a m i l yl e v e l ( f a n ，2 0 0 8 ) t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h ef o u rs e l e c t e dg e n e sc o u l dw e l ls o l v et h ep h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p so f m u s c i d a ei nh i g h e rt a x a k e y w o r d s ：m u s c i d a e ，p h y l o g e n e t i c ，c o i ，c o i i ，16 sr d n a ，18 sr d n a v 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：舞鞋喃 日期： 2 川年5 月z 1 e l 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版。有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆、院系资料室被查阅。有权将学位论文的内容编入 有关数据库进行检索。可以采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。 保密论文保密期满后适用本声明。 学位论文作者签名：韩1 磊 剔磴名滔t 礁 e l 期： 2 ，l o 年岁月2 1 日 基于四种基因的蝇科分子系统学研究 1 蝇科研究现状 1 1 蝇科简介 第一部分前言 蝇科m u s c i d a e 是双翅目有瓣蝇类中仅次于寄蝇科的一个大科，呈世界性分 布，几乎遍及各个角落( 范滋德，2 0 0 8 ) 。目前世界己知约有4 5 0 0 余种，即使在 某些无人区或近北极地区，蝇科种类在昆虫中都占有很大比例，如在我国可可西 里无人区，在海拔高于5 0 0 0m 的地方，棘蝇属p h a o n i a 和胡蝇属d r y m e i a 等蝇 科种类和数量占绝大部分( 王明福，2 0 0 6 ) 。但是，更多的蝇科种类是出现在人 类居住区、生活区附近，其中很多种类是多种病原体的重要传播媒介，与人类生 活息息相关( 贾德胜，2 0 0 8 ) 。我国蝇科昆虫的种类也十分丰富，据统计，我国 蝇科如今记录数目大约1 2 7 5 种( 含亚种) ，大致可分为1 0 个亚科，6 0 个属，约 占世界该科总种数1 4 以上( 范滋德，2 0 0 8 ) 。 蝇科是完全变态昆虫，生活史包括卵、幼虫、蛹、成虫四个阶段。卵基本为 长卵形。幼虫即为蛆，水生型，高度特化，无头型，仅仅1 对口钩在外面可见， 表皮一般具骨化棘、雕刻和疣突，前气门指状突最多可达1 4 个，体后有后气门， 无气门杆；口器般多变，但口钩腹面无齿，适于粪食、腐食、植食和肉食。蛹 称围蛹，在第二腹节上有1 个呼吸角。成蝇体长一般在2m m - l om m 之间，胸 部后小盾片不突出，下侧片无鬃( 夜蝇亚科e g i n i i n a e 除外) ，这是蝇科重要特征； 成虫c u l + a n l 脉不达至翅缘，a r l 2 脉的延长线同c u l + a i l l 脉延长线的相交点在翅膀 的外方；后胫亚中位无真正的背鬃，即使有刚毛状鬃也偏于后背方，后足第一跗 节一般无基腹鬃；雌性后腹部各节均无气门，比较特殊的是毛脉蝇亚科的毛脉蝇 属a c h a n t h i p t e r a 保留有第六气门( 薛万琦，1 9 9 6 ) 。 1 2 蝇科的分类系统 中山大学硕士学位论文 蝇科m u s c i d a e 作为科有效名称最早由l i n n a e u s ( 1 7 5 8 ) 在自然系统第 十版中提出，在该著作中，他主要依据口器和触角的形态特征将双翅目分为1 0 属。之后，l a t r e i l l e ( 18 0 2 ) 、m e i g e n ( 18 0 3 ) 、w e i d e m a n n ( 18 2 4 ) 、r o b i n e a u d e s v o i d y ( 1 8 3 0 ) 等蝇类分类学家对蝇科昆虫进行了大量的描述，其中实际包括大量的丽 蝇科( c a l l i p h o r i d a e ) 和麻蝇科( s a r e o p h a g i d a e ) 等有瓣蝇类，直到b r a u e r & b e r g e n s t a m m ( 1 8 8 9 ) 、g i r s e h n e r ( 1 8 9 3 ) 、m a l l o c h ( 1 9 3 6 ) 等对蝇类进行了一系 列的修订，将大量属于丽蝇科和麻蝇科的种类分离出来，才使蝇科m u s c i d a e 家 族( 相当于现在的m u s c o i d e a ) 基本得到了纯化。 德国昆虫学家h e n n i g ( 1 9 6 5 ) 对世界蝇科各群在卵、幼虫、两性成虫各项 特征，包括额、触角、喙、翅、腋瓣、各部鬃序，特别是两性尾器中的雌性尾器 及地史发展结合前人成果做了详细讨论，并运用他创立的单系群和二分法等支序 原则，为蝇科分亚科提出了新的见解，绘出了蝇科及其近缘类群的系统发生图。 在此之前，h e n n i g 已经将a n t h o m y i i n a e 和c o r d i l u r i n a e 排除在蝇科m u s c i d a e 之 外。h e n n i g 除了将厕蝇独立成科外，还对蝇科做了四点重大改变，其一是将他 在1 9 6 2 年按早产卵器具第六腹节气门而成立的族“a c h a n t h i p t e r i n a e ( s i c ! ) 提 升到亚科地位；其二是成立c y r t o n e u r i n i n a e 亚科( 即今天的r e i n w a r d t i i n a e ) ；其 三是将h y d r o t a e i n i 从p h a o n i i n a e 中分离出来( 列入家蝇亚科) ；其四是将 a t h e r i g o n a 属从c o e n o s i i n a e 中分出( 列入棘蝇亚科) 。这四点分别为以后确立 a c h a n t h i p t e r i n a e ，r e i n w a r d t i i n a e ，a z e l i i n a e ，a t h e r i g o n i n a e 各亚科所依从( 范滋 德，2 0 0 8 ) 。 目前大多数学者认为蝇科m u s c i d a e 隶属于双翅目d i p t e r a 环裂亚目 c y c l o r r h a p h a 有瓣蝇类c a l y p t r a t a e 中的蝇总科m u s c o i d e a 。该科与蝇总科 m u s c o i d e a 中的厕蝇科f a n n i i d a e 及花蝇科a n t h o m y i i d a e 等互为姐妹群。然而蝇 科的亚科级分类单元的划分长期以来都不统一，f o n s e c a ( 1 9 6 8 ) 将蝇科划分为 m u s c i n a e ，s t o m o x y i n a e ，p h a o n i i n a e ，c o e n o s i i n a e ，l i s p i n a e 和f a n n i i n a e 六个亚 科。s k i d m o r e ( 1 9 8 5 ) 在他的著作中，主要根据前成虫期及生态习性提出一个新 的分类系统，即将蝇科分为e g i n i i n a e ，r e i n w a r d t i i n a e ，a c h a n t h i p t e r i n a e ，a z e l i i n a e ， a t h e r i g o n i n a e ，m u s c i n a e ，s t o m o x y i n a e ，m y d a e i n a e ，c o e n o s i i n a e ，p h a o n i i n a e l 0 个亚科。随后c a r b a l h o ( 1 9 8 9 ) 以支序分类法得出蝇科分为7 亚科的结论，如图 2 基于四种基因的蝇科分子系统学研究 1 1 ，基本证实了s k i d m o r c ( 1 9 8 5 ) 分类系统的合理性，但将s t o m o x y i n a c 作为 m u s c i n a e 中的一族，将r e i n w a r d t i i n a e 作为a z e l i i n a e 中的一族。英国著名蝇类专 家p o n t 根据对蝇科m u s c i d a e 的分类研究，将蝇科分为m u s c i n a e ，p h a o n i i n a e ， m y d a e i n a e 和c o e n o s i i n a e4 个亚科( 1 9 7 2 ，1 9 7 7 ，1 9 8 6 ，1 9 8 9 ) ，如图1 2 。范滋 德( 1 9 9 2 ，2 0 0 8 ) 根据多年的研究，结合他人研究结果，曾经提出蝇科两种分类 系统，如图1 3 、1 _ 4 。在图1 3 中，将蝇科分为1 1 个亚科，在图l - 4 中，将蝇科 分为1 0 个亚科，两种分类方法最大的不同有两点：其一是将厕蝇独立成科，其 二是将芒蝇亚科与邻家蝇归为一个类群。现在大多数学者都认为应该将厕蝇独立 为科级单元，对夜蝇亚科与棘蝇亚科的单系性争论较少，但其他8 个亚科的分类 地位仍有争议( h e n n i g ，1 9 6 5 ，p o n t ，1 9 8 9 ，s k i d m o r e ，1 9 8 5 ，f a n ，2 0 0 8 ) 。薛 万琦等( 1 9 9 6 ) 根据形态学研究认为e g i n i i n a e 也应该为独立科。目前，有八个 亚科( a c h a n t h i p t e r i n a e ，a t h e r i g o n i n a e ，a z e l i i n a e ，c y r t o n e u r i n i n a e ，c o e n o s i i n a e ， m u s c i n a e ，m y d a e i n a e 和p h a o n i i n a e ) 的分类地位得到确认，但是亚科的亲缘关系 及一些族的归属仍不确定( k u t t y ，2 0 0 8 ) 。 图1 - 1 蝇科系统发育( c a r b a l h o ，1 9 8 9 ) f i g1 - 1t h ep h y l o g e n yo f m u s c i d a c ( c a r b a l h o ，1 9 8 9 ) 中山大学硕士学位论文 图l - 2 蝇科系统发育( p o n t ，1 9 8 9 ) f i g1 - 2t h ep h y l o g e n yo fm u s c i d a e ( p o n t , 19 8 9 ) 图1 - 3 蝇科系统发育( 范滋德，1 9 9 2 ) f i g1 - 3t h ep h y l o g e n yo f m u s c i d a e ( f a n , 1 9 9 2 ) 4 基于四种基因的蝇科分子系统学研究 图1 4 蝇科系统发育( 范滋德，2 0 0 8 ) f i gi - 4t h ep h y l o g e n yo f m u s c i d a e ( f a n , 2 0 0 8 ) 2 昆虫线粒体基因与核基因 2 1 昆虫线粒体基因 2 1 1 昆虫线粒体基因的组成 动物线粒体d n a ( m t d n a ) 是共价闭合环状结构。线粒体结构紧凑，除控 制区有非编码序列外，其余都为编码区。不同生物m td n a 大小有所差别，昆虫 的m td n a 大小为1 5 4 - 1 6 3k b ，包含1 3 个蛋白质编码基因、2 2 个转运r n a 基因、 2 个核糖体基因( 1 2 s 和1 6 s ) 、还有1 个包含复制起点的控制区( 又称为a + t 富含 区) 。其中1 3 个蛋白质编码基因用来编码以下几个基因：细胞色素b ( c y t b ) ，a t p 酶中的6 和8 亚基，3 个构成细胞色素氧化酶的亚基( c o i ，c o i i ，c o i i i ) ，7 个构 成n a d h 降解酶的基因( n d l n d 6 及n d 4 l ) ( 徐庆刚，2 0 0 1 ) 。 5 中山大学硕士学位论文 2 1 2 昆虫线粒体基因在昆虫系统发育分析中的应用 由于线粒体基因具有母系遗传特性、容易获取、结构简单、容易分析、具有 较宽范围的进化速率等优点，已经广泛应用到昆虫分子系统学研究中。据统计， 线粒体d n a 序列主要应用昆虫系统发育分析、种群的遗传变异和分化，还有一 些难以用外部的形态特征来分别的近缘物种以及种下分类单元鉴定等方面( 徐庆 刚，2 0 0 1 ) 。 线粒体d n a 不同组成部分进化速率是不同的。一般来说，r d n a 和t d n a 比 较保守，碱基替代率较低，而蛋白质编码基因相对进化要快一些。所以应根据不 同类群的系统发育分析，选择不同的目的基因，通常是选择进化速率快的基因用 于亲缘关系较近的类群，而进化速率较慢的用于亲缘关系较远的类群。在常用的 蛋白质编码基因中，c o i i 基因主要用于亚种、种级水平的系统发育分析；c o l 基因要l k , c o i i 基因保守，因为在种间表现较大的变异，所以适合更高阶元分析。 2 1 3 线粒体c o i 、c o i l 及1 6 sr d n a 基因特点及在系统学中的应用 2 1 3 1c o l 基因 细胞色素c 氧化酶亚基i 基因，编码细胞色素氧化酶亚基一，是细胞色素c 氧化酶的重要组成部分。昆虫中c o i 基因一般在1 5 0 0b p 左右，编码5 0 0 左右 氨基酸，并且c o i 基因被认为是线粒体蛋白质编码基因中进化速度最慢的一个 ( j a z z m i n ，2 0 0 3 ) 。b r o w e r 等( 1 9 9 4 ) 根据对风蝶科( p a p i l i o n i d a e ) 的研究，认 为c o i 基因比较适合用来研究该科种、属间关系；r a n d 等( 2 0 0 0 ) 用c o l 基因 研究了位于南非的灰蝶科a p h n a e i n i 族的2 6 个物种，其进化树与h e a t h 在1 9 9 7 年提出的依形态特征而制定的系统假说基本一致，原先确立的c h r y s o r i t i s 、 p o e c i l m t i s 和o x y c h a e t a 属应合并为c h r y s o r i t i s 属；方雪梅( 2 0 0 9 ) 通过对叶甲 科( c h r y s o m e l i d a e ) 昆虫3 亚科1 4 种的c o i4 6 2b p 序列片段进行分析，认为跳 甲亚科和叶甲亚科的亲缘关系更近，萤叶甲亚科与前两者的关系较远。 蝇类的c o l 通常为1 5 3 6b p ，与其他线粒体基因一样，也富含a + t ，还具有 6 基于四种基因的蝇科分子系统学研究 一个反常的起始密码子t c g ，该密码子编码丝氨酸，这是环裂亚目c o i 典型特 征之一。d eo l i v e i r am t ( 2 0 0 5 ) 等对h a e m a t o b i ai r r 妇n s ，s t o m o x y sc a l c i t r a n s 和 m u s c ad o m e s t i c a 的c o i 进行序列分析，证实c o l 基因可作为双翅目进化研究的 分子标记。c h e i l o s i a 是食蚜蝇科中变化最大的属，s t a h l s ( 2 0 0 0 ) 等通过测序c o i 1 3 4 1b p 序列，对该属的系统发生学进行研究，结果很好地支持c h e i l o s i a 是单系， 并支持形态学上将其分为n i g r o c h e i l o s i a 、n e o c h e i l o s i a 两个亚属。p r a m u a l ( 2 0 0 1 ) 等通过分析c o l8 0 0b p 的碱基序列，以此探讨泰国全境s i m u l i u mt a n i 不同地理 种群之间的进化关系以及物种形成的原因，认为中部、南部种群均起源于北部， 之所以形成新的地理种群与该地区的气候变化有关。b e m a s c o n i ( 2 0 0 0 ) 分析了 蝇总科c o i 、c o i i 部分序列和t r n a t 启u 基因，探讨了蝇总科的系统关系，发现 该序列适合于高的分类阶元( 如亚目) 、低的分类阶元( 如科内) ，但对科与科 之间不能明确区分。 目前，c 0 1 基因作为d n a 条形码( b a r c o d e ) 技术的标志基因已经得到广泛 的应用。d n a 条形码是一段特殊的d n a 序列，可以用于辨别物种，对物种进 行分门别类，许多时候还可以用于研究近缘种之间的进化关系。h e b e r t ( 2 0 0 3 ) 利用c o i 基因把若干物种归入所属门、目，并将若干鳞翅目昆虫个体归入所属 的种，都取得了成功。此外，越来越多的研究集中在利用c o i 基因快速鉴定物 种、保护濒危物种和外来入侵种的鉴定上( 陈念，2 0 0 9 ) 。 2 1 3 2c o i i 基因 细胞色素c 氧化酶亚基i i ( c o i i ) 是细胞色素c 氧化酶3 个亚基中最小的 一个。昆虫的c o i i 基因长度为6 7 0 - - 6 9 0b p 之间，一般编码2 2 6 2 2 9 个氨基酸， 其在线粒体基因组中位于两个t r n a 基因( t r n a l e u 和t r n a a s p ) 之间( f r a t i ， 1 9 9 7 ) 。在昆虫系统学研究中，c o i i 基因是一个理想的d n a 分子标记，常被用 来分析亲缘关系较近的物种、种下分类单元及地理种群之间的系统关系。王戎疆 ( 2 0 0 4 ) 等利用线粒体c o i l 基因分析中国尾蛱蝶属5 种蝴蝶的系统分化，将尾 蛱蝶属蝴蝶分为两大分支，并且认为大二尾蛱蝶和忘忧尾蛱蝶的亲缘关系较近， 而二尾蛱蝶较远。这些分子系统学的结果均与形态学的结果相一致，是对形态分 7 中山大学硕士学位论文 类的有力支持。 研究发现，c o i i 基因能够很好地解决双翅目昆虫属种间的系统发育及近缘 种鉴别等问题。b e c k e n b a c h a t ( 1 9 9 3 ) 等比较了d r o s o p h i l a o b s c u r a g r o u p1 3 个 个体的c o i l 序列，建立了它们的系统发生树，并推算出它们大致的歧化时间。 s z a l a n d k i ( 2 0 0 3 ) 通过分析h o u s ef l y ，m u s c ad o m e s t i c a ： f a c ef l y ，m u s c a a u t u m n a l i s ；s t a b l ef l y ，s t o m o x y sc a l c i t r a n s ；h o mf l y ，h a e m a t o b i ai r r i t a n s 和b l a c k g a r b a g ef l y ，h y d r o t a e aa e n e s c e n s 五个类群的c o i l ，发现h o r nf l y 和s t a b l ef l y 应 该是姐妹群关系。j a m e s ( 1 9 9 7 ) 分析了实蝇r h a g o 如t i s 属的c o i i 和相邻的 t r n a 岫忙0 i i 间隔序列，认为整个r h a g o 昆t i s 属不是单系，但是北美5 个优势种 群应该为一个单系。m a r q u e z ( 2 0 0 3 ) 等通过研究马来群岛家蝇( m u s c ad o m e s t i c a d i p t e r a ：m u s c i d a e ) c o i l 和1 6 s 的