（海洋生物学专业论文）牙鲆免疫相关基因的克隆与表达分析.pdf

牙鲆( p a r a l i c h t h y so l i v a c e u s ) 免疫相关基因 的克隆与表达分析 摘要 实验室前期以我国重要海水经济养殖鱼类牙鲆( p a r a l i c h t h y so l i v a c e u s ) 为 实验材料，利用m r n a 差异显示技术( m r n ad i f f e r e n t i a ld i s p l a y ，d d ) 获得了 一些在鳗弧菌( v i b r i oa n g u i l l a r u m ) 刺激前后差异表达的基因片段，本研究通过 r a c e ( r a p i da m p l i f i c a t i o no fe d n ae n d s ，r a c e ) 技术克隆得到了三个差异片 段的全长e d n a ，利用生物软件对基因的生物信息学进行了预测分析，并借助于 半定量r t - p c r 技术对基因的时空表达进行了较为详细的研究，并构建了2 拿新 基因的大肠杆菌表达系统，重组基因在大肠杆菌系统中得到了高水平表达，为其 进一步研究奠定了基础。现将主要的研究结果分述如下： 1 牙鲆f i b r i n o g e n 口基因全长e d n a 的克隆及分析 通过d d p c r 和r a c e 技术，拼接得到了长度为1 8 5 6 b p 的牙鲆纤维蛋白原 d ( f i b r i n o g e n1 3 , e f 5 8 1 8 9 5 ) 基因全长c d n a ，其中5 u t r 为6 0 b p ，o r f 为1 4 7 9 b p ， 3 u t r 为3 1 7 b p ，可编码4 9 2 个氨基酸，预测的分子量约为5 5 7 2 k d ，等电点为 6 7 9 。它含有一个1 6 个氨基酸组成的信号肽，并含有f i b f i n o g e n1 3 的c 末端签名 序列( s i g n a t u r e ) 。二级结构分别表明它属于b e t a 型蛋白，空间结构预测显示它 与鸡的f i b r i n o g e np 晶体结构模型高度相似。同源性分析表明该基因的氨基酸序 列与鱼类以及哺乳动物类的都具有高度的相似性，其中与黄鱼、斑马鱼的相似性 分别为8 1 4 、6 8 0 ，与小鼠和人的相似性分别为5 5 5 和5 3 8 。基因时空表 达分析表明，f i b r i n o g e n 只在牙鲆对照组的肝脏、肾脏、小肠中表达：注射鳗 弧菌后的6 小时，在脾脏、心脏和肠中开始表达；注射后的9 小时，在鳃中也出 现了表达；该基因在各组织中的表达呈现出随注射后时间的延长表达量逐渐增加 的趋势，显示其诱导型表达特点。推测该基因在牙鲆鳗弧菌病中一方面起凝血和 促进伤口愈合的作用，另一方面可能通过和其他细胞因子的结合在防御细菌的侵 染中发挥免疫调节作用。 2 牙鲆免疫相关基因l ( po l i v a c e u si m m u n e r e l a t e dg e n e1 ，p o l r l ) 的克隆及分 析 通过d d p c r 和r a c e 技术，拼接得到了长度为9 9 7 b p 的牙鲆免疫相关基 因l ( e u 2 2 4 3 7 3 ) 全长c d n a ，其中5 u t r 为5 2 3 b p ，o r f 为3 0 0 b p ，3 u t r 为 1 7 4 b p ，可编码9 9 个氨基酸，预测的分子量约为1 0 4 6 k d ，等电点为8 1 4 。基因 组d n a 序列共含有2 个内含子，3 个外显子。编码的蛋白含有一个1 9 个氨基酸 组成的信号肽，为分泌型蛋白。通过结构功能域的查找，发现此蛋白一个原核生 物膜脂蛋白的附着点。经n c b i 数据库比对后并没有发现与之相似的序列，因此 给此基因命名为牙鲆免疫相关基因1 ( po l i v a c e u si m m u n e r e l a t e dg e n e1 ，p o l r l ) 。 半定量r t - p c r 结果表明，对照组中，在所有的组织器官( 肝脏、肾脏、脾脏、 鳃、小肠、心脏、肌肉) 中均未检测到p o l r l 的表达。鳗弧菌注射后，在所有的 组织中均检测到了p o l r l 的表达，且随着时间的延长，表达量有明显上升的趋势。 推测该基因的编码产物可能是抗菌肽类似的小分子直接参与消灭病原生物或者 作为信号分子通过与病原生物的膜结合识别出外界的入侵从而引起机体内部的 级联免疫反应。以p e t 3 2 a 为表达质粒，将p o l r l 的成熟肽基因序列插入其中构 建了p e t - 3 2 a - p o l r l 重组质粒，并在b l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s 中进行融合表达。 s d s p a g e 蛋白电泳和w e s t e r nb l o t 分析发现重组质粒在相对分子量2 9 k d a 处出 现一条特异条带，正好是标签蛋白t r x t a g 相对分子质量( 2 0 k d a ) 与p o l r 2 的 成熟肽相对分子质量( 9 k d a ) 的总和，与预期融合蛋白相对分子质量相符，表 明成功构建了t r x p o l r l 融合蛋白重组原核表达系统，且大部分以可溶性蛋白形 式存在，为进一步从分子水平探讨新基因p o l r i 成熟肽的研究奠定了基础。 3 牙鲆免疫相关基因2 ( po l i v a c e u si m m u l a e r e l a t e dg e n e2 ，p o l r 2 ) 的克隆及分 析 通过d d p c r 和r a c e 技术，拼接得到了长度为1 0 6 1 b p 的牙鲆免疫相关基 因2 ( e u 2 2 4 3 7 2 ) 全长c d n a ，其中5 u t r 为1 6 9 b p ，o r f 为3 3 6 b p ，3 u t r 为 5 5 6 b p ，可编码1 l1 个氨基酸，预测的分子量约为1 3 8 4 k d ，等电点为8 o l 。基 因组d n a 序列共含有5 个内含子，6 个外显子。编码的蛋白含有一个2 6 个氨基 酸组成的信号肽，为分泌型蛋白。经n c b i 数据库比对后并没有发现与之相似的 序列，因此给此基因命名为牙鲆免疫相关基因2 ( po l i v a c e u si m m u n e r e l a t e dg e n e l l 2 ，尸d 豫2 ) 。半定量r t - p c r 结果表明，在对照组中，在以下7 个组织器官( 肝 脏、肾脏、脾脏、鳃、小肠、心脏、肌肉) 中均未检测到p o l r 2 的表达。鳗弧菌 注射后，在所有的组织中均检测到了p o l r 2 的表达，且随着时间的延长，表达量 有明显上升的趋势。在脑组织中，对照组中有微弱表达，而在注射后表达量上升， 3 h 达到最大，6 h 后恢复至注射前水平。推测该基因为神经分泌肽，在牙鲆受到 鳗弧菌感染后的免疫反应中起到重要的作用。以p e t 3 2 a 为表达质粒，将p o l r 2 的成熟肽基因序列插入其中构建了p e t 3 2 a p o l r 2 重组质粒，并在b l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s 中进行融合表达，s d s p a g e 蛋白电泳和w e s t e r nb l o t 分析发现重组质粒 在相对分子量31k d a 处出现一条特异条带，正好是标签蛋白t r x t a g 相对分子质 量( 2 0 k d a ) 与p o l r 2 的成熟肽相对分子质量( 1 1k d a ) 的总和，与预期融合蛋 白相对分子质量相符，表明成功构建了t r x p o l r 2 融合蛋白重组原核表达系统， 且大部分以可溶性蛋白形式存在，为进一步从分子水平对新基因p o l r 2 的成熟肽 研究奠定了基础。 4 1 6 种鲽形目鱼类的系统关系分析 利用f i b r i n o g e n 基因的内含子7 ( f i b i n t 7 ) 、线粒体基因n d 6 、c o i l 对1 6 种鲽形目鱼类进行了分子系统学分析。木叶鲽的f i b i n t 7 序列因为小卫星的存在 而表现了很高的多态性，而其他1 5 种鱼的均获得单一目的条带，但种间f i b i n t 7 序列长度跨度很大，分布于8 1 b p 1 0 8 7 b p 之间，使得f i b i n t 7 不适宜用于分析鱼类 的系统进化关系。线粒体基因n d 6 、c o i i 的扩增中，除半滑舌鳎外的1 5 种鱼均 分别得到5 2 2 b p 和6 9 1 b p 的同源序列。根据n d 6 和c o i i 构建的系统发生树表明， 牙鲆科和菱鲆科首先聚在一起，再与鲽科聚为一支；与舌鳎科、鳎科相比，牙鲆 科、菱鲆科、鲽科的关联性更大一些。构建的2 个系统树中带纹条鳎均首先与木 叶鲽聚在一起，与形态分类学观点明显相悖，值得进一步研究。 关键词：牙鲆，鳗弧茵，纤维蛋白原p ( f i b r i n o g e np ) ，牙鲆免疫相关基因1 ( p o l r l ) ， 牙鲆免疫相关基因2 ( p o l r 2 ) ，鲽形目，纤维蛋白原p 内含子7 ( f i b i n t 7 ) ，n d 6 ， c o i i ，系统进化 m o l e c u l a r c l o n i n ga n da n a l y s i so fg e n e si n v o l v e di ni m m u n e r e s p o n s e l uj a p a n e s ef l o u n d e r ( p a r a l i c h t h y so l i v a c e u s ) a b s t r a c t w eh a v ei d e n t i f i e db yd i f f e r e n t i a ld i s p l a yan u m b e ro fn o v e lg e n e st h a ta r e e x p r e s s e d i n j a p a n e s ef l o u n d e r ( p a r a l i c h t h y so l i v a c e u s ) 洳e c t e d w i t hv i b r i o a n g u i l l a r u m t h r e eo ft h e s en o v e lg e n e sw e r er e p o r t e dh e r e b a s e do nt h et e c h n i c q u e s o fd da n dr a c e ，t h e i rf u l ll e n g t hc d n a sw e r ec l o n e d ，a n dt h e i rb i o i n f o r m a t i c sw e r e a n a l y z e db ys o f f w a r e s i na d d i t i o n ，ad e t a i l e di n v e s t i g a t i o nw a sm a d eo nt h e e x p r e s s i o np a t t e r n so ft h e s ed i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dc d n a s s y s t e m sf o rh i g h - l e v e l e x p r e s s i o n o ft h et w on e wi m m u n e - r e l a t e dg e n e si ne s c h e r i c h i at o l lw e r ea l s o c o n s t r u c t e d ，a n de x p r e s s i o nr e g u l a t i o nw e r ei n v e s t i g a t e d t h em a i nr e s u l t sa r e r e p o r t e da sf o l l o w s 1 c l o n i n ga n de x p r e s s i o na n a l y s i so ff i b r i n o g e npf r o mj a p a n e s ef l o u n d e r f i b r i n o g e npo ff l o u n d e rw a so b t a i n e du s i n gt h et e c h n i q u e so fd d p c ra n d r a c e t h ef u l ll e n g t he d n a s e q u e n c eo ft h ef l o u n d e rf i b r i n o g e npc o n t a i n e da 5 u t ro f6 0b p ，a3 u t ro f3 1 6 b p ，a n dap u t a t i v eo r fo f1 4 7 9 b pb ye n c o d i n ga p o l y p e p t i d eo f4 9 2a m i n oa c i d s 谢t ha ne s t i m a t e dm o l e c u l a rm a s so f5 5 7 2 k d a s e q u e n c ea n a l y s i sr e v e a l e dt h a tt h e r ew e r eac - t e r m i n a ld o m a i ns i g n a t u r ea n da p o t e n t i a l16 - a m i n oa c i ds i g n a lp e p t i d ei nt h ed e d u c e da m i n oa c i d s i na d d i t i o n ， b i o i n f o r m a t i ca n a l y s i si n d i c t e dt h a tt h ep r o t e i no ft h ef l o u n d e rf i b r i n o g e npb e l o n g e d t oak i n do fb e t ap r o t e i na n di t st e t i a r ys t r u c t u r ew a sq u i t es i m i l a rt ot h ec r y s t a l s t r u c t u r eo fc h i c k e n t h ed e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c eo ff l o u n d e rf i b r i n o g e np s h o w e d8 1 4 ，6 8 0 ，5 5 5 a n d 5 3 8 i d e n t i t yw i t ht h o s eo fp a r a l i c h t h y s o l i v a c e u s , d a n i or e r i o , m u sm u s c u l u sa n dh o m os a p i e n sr e s p e c t i v e l y t h et e m p r a l e x p r e s s i o n o ff i b r i n o g e n8w a sm e a s u r e db ys e m i - q u a n t i t a t i v er t - p c r i nt h e c o n t r o l l e df i s h ，t h em r n ae x p r e s s i o no f f i b r i n o g e n8c o u l do n l yb ed e t e c t e di nl i v e r a n dk i d n e y a f t e r6h o u r ss t i m u l a t e db yv i b r i o a n g u i l l a r u m , t h ef i b r i n o g e nb e x p r e s s i o nc o u l db ed e t e c t e di ns p l e e n ，h e a r ta n di n t 占s t i n e ，a n d9h o u r sl a t e r v e x p r e s s i o nc o u l da l s ob ef o u n di ng i l l m o r e o v e r , t h el o n g e ra f t e rs t i m u l a t i o n ，t h e h i g h e rm r n ae x p r e s s i o nl e v e l so ff i b r i n o g e nbc o u l db e d e t e c t e di nl i v e ro f c h a l l e n g e df i s h t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a to no n eh a n df i b r i n o g e nph e l p e ds t o p b l e e d i n gb ya s s i s t i n gb l o o dc l o t st of o r m ，o nt h eo t h e rh a n di tm i g h tb ea s s o c i a t e d 、析t i lo t h e rc y t o k i n e sa n d p l a ya c r i t i c a lr o l ei nt h eh o s t - p a t h o g e n 2 c l o n i n ga n de x p r e s s i o na n a l y s i so fp o l r l ( p a r a l i c h t h y so l i v a c e u si m m u n e - r e l a t e d g e n e1 ) p o l r l ( 尸o l i v a c e u si m m u n e r e l a t e dg e n e1 ，g e n b a n ka c c e s s i o nn u m b e r ： e u 2 2 4 3 7 3 ) w a so b t a i n e du s i n gt h et e c h n i q u e so fd d - p c ra n dr a c e t h ec o m p l e t e e d n ac o n t a i n sa5 2 3b p5 u t r ，a3 0 0b po p e nr e a d i n gf r a l l l e ( o r e ) e n c o d i n g9 9 a m i n oa c i d sa n da17 4b p3 u t r t h r e ee x o n sa n d t w oi n t r o n sw e r ei d e n t i f i e di nt h e p o l r l g e n e b l a s t ps i m i l a r i t yc o m p a r i s o n s s h o w e dp o l r lh a dn os i g n i f i c a n t s i m i l a r i t yt ok n o w np r o t e i ns e q u e n c e si nt h er i gd a t a b a s e t h ep r i m a r ys t r u c t u r e a n a l y s i si n d i c a t e dt h a tt h eg e n ep r o d u c tc o n t a i n e dat y p i c a lp r o k a r y o t i cm e m b r a n e l i p o p r o t e i na t t a c h m e n ts i t e ，s u g g e s t i n gt h a ti tc o u l db el i p i dm o d i f i e da n da n c h o r e dt o t h eb a c t e r i a lm e m b r a n e r t - p c rd e m o n s t r a t e dt h a tt h ee x p r e s s i o no fp o l r lw a s q u i c k l yi n d u c e da n dd r a s t i c a l l yi n c r e a s e di nl i v e r , k i d n e y , s p l e e n ，g i l l s ，i n t e s t i n e ，h e a r t , s k e l e t a lm u s c l ea f t e rc h a l l e n g e 、 ，i t h a n g u i l l a r u m t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e p o l r lp l a y e da ni m p o r t a n tr o l ei nj a p a n e s ef l o u n d e ri m m u n er e s p o n s e t h em a t u r e p o l r lp e p t i d ew a se x p r e s s e di nt h ef o r mo ff u s i o np r o t e i nu s i n gp e t 3 2 aa s e x p r e s s i o nv e c t o r sa n db l 21 ( d e 3 ) p l y s sa se x p r e s s i o nh o s t 15 s d s p a g ea n d w e s t e r nb l o t t i n ga n a l y s i ss h o w e da ne x p r e s s i o np r o t e i nb a n do f2 9 k dc o r r e s p o n d i n g t ot h er e c o m b i n a n tm a t u r ep e p t i d e t h ef u r t h e ra n a l y s i sp r o v e dt h a tag r e a tp a r to ft h e r e c o m b i n a n tm a t u r ep e p t i d ee x i s t e da ss o l u b l et y p e 3 c l o n i n g a n d e x p r e s s i o na n a l y s i s o f p o l r l ( p a r a l i c h t h y s o l i v a c e u s i m m u n e - r e l a t e dg e n e2 ) p o l r 2 ( 尸o l i v a c e u si m m u n e r e l a t e dg e n e2 ，g e n b a n ka c c e s s i o nn u m b e r ： ( e u 2 2 4 3 7 2 ) w a so b t a i n e du s i n gt h et e c h n i q u e so fd d - p c ra n dr a c e t h ec o m p l e t e o d n ac o n t a i n sa16 9b p5 u t r ，a3 3 6b po p e nr e a d i n gf r a m e ( o r f ) e n c o d i n g1 ll a m i n oa c i d sa n da5 5 6b p3 u t r s i xe x o n sa n df i v ei n t r o n sw e r ei d e n t i f i e di nt h e v 1 p o l r 2g e n e b l a s t p s i m i l a r i t yc o m p a r i s o n ss h o w e dp o l r 2h a dn os i g n i f i c a n t s i m i l a r i t yt ok n o w np r o t e i ns e q u e n c e si nt h e 刀rd a t a b a s e ( c u t o f fe - v a l u e = 0 o o o1 ) r t - p c rd e m o n s t r a t e dt h a tt h e e x p r e s s i o no fp o i r 2w a sq u i c k l yi n d u c e da n d d r a s t i c a l l yi n c r e a s e di nl i v e r , k i d n e y , s p l e e n ，g i l l s ，i n t e s t i n e ，h e a r t ，s k e l e t a lm u s c l e a f t e rc h a l l e n g e dw i t h 矿a n g u i l l a r u m t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ep o l r 2 p l a y e da n i m p o r t a n tr o l ei nj a p a n e s ef l o u n d e ri m m u n er e s p o n s e t h em a t u r ep o l r 2p e p t i d ew a s e x p r e s s e di nt h ef o r mo ff u s i o np r o t e i nu s i n gp e t 3 2 aa se x p r e s s i o nv e c t o r sa n d b l 2 1 ( d e 3 ) p l y s sa se x p r e s s i o nh o s t 15 s d s - p a g ea n dw e s t e r nb l o t t i n g a n a l y s i ss h o w e da ne x p r e s s i o np r o t e i nb a n do f31k dc o r r e s p o n d i n gt ot h e r e c o m b i n a n tm a t u r ep e p t i d e t h ef u r t h e ra n a l y s i sp r o v e dt h a tag r e a tp a r to ft h e r e c o m b i n a n tm a t u r e p e p t i d ee x i s t e da ss o l u b l et y p e 4 p h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i po f1 6p l e u r o n e c t i f o r m e sf i s hs p e c i e s t h eu t i l i t yo ft h es e v e n t hi n t r o no fs i n g l e c o p y f i b r i n o g e ng e n e ( 1 b - c h a i n ； 1 3 - f i b r i n o g e ni n t r o n7 ，f i b i n t 7 ) h a sb e e ns u c c e s s f u l l ye x p l o r e da td i f f e r e n tt a x o n o m i c l e v e l si ns t u d i e so f b i r d s 、r e p t i l e sa n dm a m m a l s ，h o w e v e r ，s t i l ll a c ki nt h o s eo ff i s h e s o u rw o r ki st h ef i r s tt oe x p l o r et h ep o t e n t i a lo ff i b i n t 7a sag e n e t i cm a k e ri n p l e u r o n e c t i f o r m e ss y s t e m a t i c s w e a l s o s e q u e n c e d t w o c o m p l e t e n a d h d e h y d r o g e n a s e ( n d 6 ) a n dc y t o c h r o m eo x i d a s es u b u n i t si i ( c o i i ) g e n e sf r o mm t g e n o m e ，g i v e nt h eg e n e r a lt h o u g h tt h a ta n a l y s i so fm u l t i p l ei n d e p e n d e n t l yi n h e r i t e d g e n e si se s p e c i a l l ye f f e c t i v ei nt e s t i n gf o rc o n g r u e n c ea n de s t i m a t i n go r g a n i s m a l p h y l o g e n y t h ef i b i n t 7s e q u e n c e so fp l e u r o n i c h t h y sc o r n u t u sh a dah i g h p o l y m o r p h i s mb e c a u s eo ft h em i n i s a t e l l i t es e q u e n c e w eo b t a i n e das i n g l eo b j e c t i v e b a n di nt h e a m p l i f i c a t i o n i nt h eo t h e r s p e c i e s t h el e n g t h o ff i b i n t 7o f16 p l e u r o n e c t i f o r m e sf i s hs p e c i e sr a n g e df r o m81b pt o10 8 7 b p ，t h u sm a k e df i b i n t 7a sa n i n a p p r o p r i a t em a k e rf o rp h y l o g e n e t i ca n a l y s i s w ea l s og o th o m o l o g o u sc o m p l e t e s e q u e n c eo fn d 6a n dc o i li n16f i s h e se x c e p tc y n o g l o s s u ss e m i l a e v i s ，5 2 2 b pa n d 6 91b pr e s p e c t i v e l y t h eg e n e t i cd i s t a n c e sa n dp h y l o g e n e t i ct r e e sc o n d u c t e db yn d 6 a n dc o i lw e r ec o n s i s t e n tw i t ht h et r a d i t i o n a lr e l a t i o n s h i po ft h e15f l a t f i s h e si nt h e r o u g h i nb o t ht r e e s ，z e b r i a sz e b r aa n dp l e u r o n i c h t h y sc o r n u t u sc l u s t e r e df i r s t l y , w h i c hw o r t hf u r t h e rs t u d y v l l k e yw o r d s ：p a r a l i c h t h y so l i v a c e u s , i i b r i oa n g u i i l a r u m , f i b r i n o g e np ， p o l r l ，p o l r 2 ，p l e u r o n e c t i f o r m e s ，f i b i n t 7 ，n d 6 ，c o h ，m o l e c u l a rp h y i o g e n y v i l l 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得或 其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的 任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：彦找签字日期：奶q 年b 月f o 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公 众提供信息服务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 苍抛 签字日期：1 年6 月加 导师擗绐磊在 签字目期：狮巾( 7 年6 月f o 日 第一章文献综述昴一早义i 颞琢尬 牙鲆( p a r a l i c h t h y so l i v a c e u s ) 俗称比目鱼、牙片、偏口，主要分布于我国、 日本、韩国沿海水域，是一种冷水性、底栖的鱼类，以其肉质细嫩、味道鲜美， 高蛋白低脂肪，富含丰富的维生素b 1 、维生素b 2 和维生素u ，深受消费者青睐， 是我国黄、渤沿海重要的经济鱼类( 鲍宝龙，1 9 9 9 ) 。随着牙鲆养殖业在我国的 蓬勃发展，特别是高密度集约化养殖的发展，牙鲆疾病日趋严重，成为制约养殖 发展的重大障碍。各地养殖场每年都因疾病发生造成很大的经济损失。生活在天 然海域中的牙鲆，由于环境条件优越，密度小，饵料鲜活，发生疾病并导致大量 死亡的情况很少见，但在人工养殖条件下，特别是在集约化养殖条件下，由于生 活环境、养殖密度、饵料的质量等因素都与天然环境差别很大，因此各种疾病就 随之发生。 牙鲆的细菌性疾病很多，有鳗弧菌病、腹胀病、链球菌症、滑走细菌病、诺 卡氏菌症、肠道白浊症、爱德华氏综合病、出血性败血病等( 周丽等，1 9 9 7 ) 。 其中鳗弧菌病( v i b r i oa n g u i l l a r u m ) 是一种危害性较大的细菌性疾病，致死率在 5 0 以上。鳗弧菌多为条件致病茵，是水环境微生物区系中的正常菌群，但当水 温较高、营养较丰富时数量急剧增加。因此在夏季特别是养殖密度、盐度和有机 物含量较高的条件下易诱发鳗弧菌病，而应激状态如寄生虫感染、机械损伤等会 加速疾病的发生。鳗弧菌也是健康鱼类消化道中微生物系统的重要组成部分，可 能是鱼类周期性爆发疾病的主要原因之一。到目前为止，已有1 0 多个国家的鱼类 养殖业遭到鳗弧菌的肆虐，4 0 多种海水鱼遭受鳗弧菌的侵袭，其中最重要的养殖 品种有鲑鱼、虹鳟、鳗鲡、香鱼、鲈鱼等。我国虽然没有大规模由鳗弧菌引起的 流行病的报道，但感染鲈鱼、牙鲆的事件时有发生，也造成较大损失，是危害多 种海洋经济鱼种的主要病害病原体( 孟庆显，1 9 9 6 ) 。 感染鳗弧菌的病鱼有多种病理表现，除慢性感染和皮肤溃疡外更多的是急性 和亚急性感染，主要是以全身出血为特征的败血症。疾病首先出现的第一个症状 是身体发黑、食欲减退、平衡失调，有的腹部肿大、皮下出血。典型的病理症状 为肝脏有淤血点、脾肿大、肾液化性坏死。慢性感染鱼的身体各部分肌肉出现肉 芽性坏死，眼部的损伤较普遍，如角膜水肿、溃疡，眼球突出等；腹腔出血，纤 维蛋白粘连。自然感染状态的养殖牙鲆和鲈鱼最明显的症状是严重出血、皮肤溃 烂( m o 等，2 0 0 1 ) 。 目前对海水养殖鱼类细菌性疾病的防治方法主要有免疫接种、免疫刺激剂、 抗菌素、藻类提取素等，现有的方法虽然对病害的防治取得了一定的效果，但是 长期的施药不仅会导致水体的污染，也会造成诸多耐药性病原体的产生，使进一 步的防治工作变得更为复杂。 对鱼类免疫系统的研究，不仅可以从系统发育角度研究脊椎动物免疫系统的 进化规律，也为研制鱼用疫苗来提高鱼体免疫机能抵抗病害发生、促进鱼类增养 殖提供理论依据。抗感染免疫是指鱼体抵御和清除病原微生物及其有害产物的一 种生理功能。病原微生物侵入鱼体后，可引起感染，同时也能够诱导机体对病原 微生物产生防御性应答。根据形成和作用特点的不同，鱼类的抗感染免疫可以分 为非特异性免疫和特异性免疫两大类。与哺乳类相比，因为鱼类的进化地位和它 的变温特性使鱼类的特异性免疫系统尚不够发达，特异性免疫机制还不完善。因 此，在鱼类对外界刺激及病原生物侵袭的防御反应中，非特异性免疫起着重要作 用。非特异性免疫有如下几个主要特点：首先，不依赖于对入侵病原体分子特异 结构的识别；其次，发挥作用没有或仅有很短时间的延迟，甚至对于依赖诱导产 生的防御反应如炎症反应，反应时间也相对较快( 1 - 2 天) ，几乎不给病原体以 定居的时间；第三，相对不依赖温度的特性，对于变温脊椎动物尤为重要。因为 获得性免疫应答防御机制不但非常依赖于温度，而且反应时间相对较长。对于温 水性的物种如鲑鱼，抗体的产生至少需要4 6 周，而在适宜的温度时，许多病原 体可在感染后的几天内就杀死鱼体，所以获得性免疫应答防御多半仅在预先免疫 过的鱼体中起着重要作用( e l l i s ，2 0 0 1 ) 。所以，在防御与抗击外来入侵的微生 物时，先天性免疫应答在鱼类中起主要作用。 机体屏障构成先天性免疫系统的外部组成，包括鱼鳞、皮肤、消化道、泌尿 生殖管道和腮表面的粘液和表皮，是抵御外来病原菌感染的第一道防线 ( s h e p h a r d ，1 9 9 4 ；e l l i s ，2 0 0 1 ) 。与先天性免疫系统外部组成相对应，细胞防 御组分和体液因子可归为先天性免疫系统的内部组成。鱼类具有复杂的内部防御 网络，可杀死突破了外部屏障的病原体。当病原菌入侵时，这些具有吞噬活性的 2 白细胞通过它们细胞膜上的受体与病原菌结合将其吞噬于细胞内，然后将其杀 死。体液因子可以是细胞偶联的受体，胞浆和其他体液内的可溶性分子，能非特 异性地抑制微生物病原体的生长。 鱼类先天性免疫防御机制的反应，包括在受感染的情况下产生大量抗菌物 质，产生急性期蛋白，非经典的补体被激活，释放细胞因子，发生炎症和吞噬作 用等。其大体的反应过程是，首先通过鱼体表面和体内管道的粘液干扰病原体定 居，捕获病原体，并阻碍病原体进入鱼体。粘液中的大量免疫组分抑制病原菌增 殖和杀死病原菌( z u o 等，1 9 9 7 ) 。当病原菌成功地穿过第一道机体屏障时，鱼 体内产生大量的血浆蛋白将阻止感染的进一步扩大。一些存在于粘液中的蛋白也 大量存在于血清中，如溶菌酶和凝集素等，然而血清中重要的防御成分可能是补 体系统，因为它能激活细胞防御( e l l i s ，2 0 0 1 ) 。 由于非特异性免疫在鱼类等水生动物的防御反应中所起的重要作用及其在 水产动物防病治病中的巨大应用潜力，随着近几年水产养殖生物功能基因组和分 子标记技术的迅速发展，有关鱼类非特异性免疫相关功能基因的克隆及免疫调节 机理的研究已引起科技界的高度关注，并成为当今世界鱼类分子免疫学和抗病机 理研究的热点课题。 第一节鱼类免疫相关基因的筛选 1 1 1 目的基因筛选常用的技术 克隆基因最直接的方法是利用己知的基因信息，通过p c r 扩增或者c d n a 文库筛选来实现。根据基因编码蛋白的同源性分析，找到保守区域，设计兼并引 物扩增基因部分片段。然后利用5 r a c e 和3 r a c e 技术，或者筛选e d n a 文 库得到基因全长。r a c e 简便快速，根据获得的基因片段序列，分别设计特异性 引物扩增基因3 末端和5 末端，可以在短时间内获得目的基因。而c d n a 文库 筛选可以有机会直接得到基因全长，和多基因家族的多个成员。即使没有获得基 因全长，也可以通过多个克隆的拼接分析，得到全长序列。但是筛选c d n a 文 库周期长，工作量大。 高等生物中含有大约1 0 0 0 0 0 个基因，但在某个特定的细胞中只有1 5 在表 达，而且在不同的发育阶段、不同的生理状