（分析化学专业论文）谷胱甘肽分子印迹聚合物的合成及应用于荧光传感器膜的研究.pdf

中文摘要 谷胱甘肽分子印迹聚合物的合成 及应用于荧光传感器膜的研究 分析化学专业 研究生李琼导师教师李方教授 谷胱甘肽( g s h ) 是生物体内的主要抗氧化剂，在体内参与多种代谢过 程，能够保护生物体内细胞免受氧化和有毒物质的伤害，因而在生物学、医 疗、保健、美容、食品等方面正引起人们同盏广泛的重视【1 8 2 0 1 。我 f j n 用分 子印迹聚合物( m i p ) 所具有的特异性识别的功能制备了一种对g s h 具有分离 富集作用的m i p ，并结合谷胱甘肽的荧光检测方法，对所制备的m i p 的亲和、 选择性能进行了高准确度、高灵敏度的检测与评价。 本文以谷胱甘肽为模板分子，丙烯酰胺为功能单体，乙二醇二甲基丙烯 酸酯为交联剂，偶氮二异丁醇为引发剂，二甲亚砜为成孔剂，高压汞灯为能 量源合成了聚合物，经研磨、过筛、洗脱模板分子、沉降、干燥，最后得到 了g s h 的m i p 。 制备了单体模板摩尔数量比分别为4 ：l 、8 ：l 、1 2 ：i 、1 6 ：1 的 四种m i p 及相应四种空白聚合物( n m i p ) ，并用静态吸附法考察了这八种聚 合物在五种不同极性( 水和二甲亚砜体积比分别为4 ：9 6 、2 0 ：8 0 、4 0 = 6 0 、 7 0 ：3 0 、1 0 0 ：o ) 的g s h 溶液中的吸附性，选取最佳单体模板摩尔数量 比( 8 ：1 ) 的m i p 作为后续性质实验的对象。 研究了m i p 在0 1 珊o l l 5m m o l l 的“种不同浓度g s h 溶液中的 吸附性能，并根据这些数据绘制了吸附等温线，完成了s c a t c h a r d 分析。将 m i p 及相应n m i p 制成薄层色谱与商品硅胶色谱作平行实验，比较了4 种结构 相似的物质：谷氨酸、甘氨酸、谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽以四种不同组成 的混合溶剂为展开剂在其上的分离效果。 中文摘要 为寻求具有更佳性能的j 品，我们又用一种新方法一牺牲硅胶法，在 与本体聚合法相同实验条件f 制备了g s h 的m i p ，在相同环境中比较了两种 制各方法( 本体聚合法和牺牲硅胶法) 所获得的m i p 的性能。 基于分子印迹技术，我们还尝试用原位聚合法、三明治法、微孔滤膜 载体法制备了对g s h 具有分子识别作用的荧光传感器膜。研究了膜在g s h 溶 液中的荧光信号变化。 关键词：谷胱甘肽；分子印迹聚合物；本体聚合法；牺牲硅胶法；传感膜 i i 英文摘要 s y n t h e s i so fg s hm o l e c u l a r l yi m p r i n t e d p o l y m e r s a n dr e s e a r c ho nf l u o r e s c e n t s e n s o rm e m b r a n eb a s e do nt h em i p m a j o r ：a n a l y t i c a lc h e m i s t r y p o s t g r a d u a t e ：l io i o n g s u p e r v i s o r ：l if a n g g s hi sas o r to fa n t i o x i d a n ti no r g a n i s m sa n dp a r t i c i p a t e si n s e v e r a lm e t a b o l i s m s i ti sa r r e s t i n ga t t e n t i o n si nm a n yf i e l d s1 i k e b i o l o g y ，m e d i c a lt r e a t m e n t ，h e a l t hc a r e ，h a i r d r e s s i n g a n df o o d s t u f f b e c a u s eitc a np r o t e c tc e ll si no r g a n is m sf r o mb e i n go x i d a t e da n db e i n g h u t t e db yt o x i c a n t w ep r e p a r e dak i n do fm i pw h i c hh a ds e p a r a t i v ea n d e n r i c h e df u n c t i o n sf o rg s hd u et ot h ee x c l u s i v er e c o g n i t i o na b i l i t y o fm i pa n ds u r v e y e dc h a r a c t e r so fm i pe x a c t l ya n ds e n s i t i v e l yb y f l u o r e s c e n c em e a s u r a t i o n t h ep o l y m e r sw e r es y n t h e s i z e di nf o l l o w i n gc o n d i t i o n s t e m p l a t e w a sg s h 。f u n c t i o n a lm o n o m e rw a sa m ，c r o s s l i n k e rw a se d g m ，i n i t i a t o rw a s a i b na n dd m s oa c t e da sp o r o g e n h i g hp r e s s u r em e r c u r yl a m pm a k e a v a i l a b l ee n e r g yf o rt h es y n t h e s i so fm i p t h e n ，t h er e s u l t a n tr i g i d p o l y m e r sw e r eg r o u n d ，s i e v e da n dw a s h e dt or e m o v et e m p l a t em o l e c u l e a f t e rs e d i m e n t i n ga n dd r y i n g ，t h eg s hm o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r s w e r eg a i n e d w ep r e p a r e df o u rk i n d so fm i pi nw h i c ht h em o l a rr a t i o so fm o n o m e r s t ot e m p l a t e s w e r e 4 ：1 ，8 ：1 ，1 2 ：1 a n d1 6 ：l r e s p e c t i v e l y a n d c o r r e s p o n d i n gf o u rk i n d so fn m i p f o r b i n d i n ge x p e r i m e n t si ns t a t i cs t a t e ， e i g h tk i n d so fp o l y m e r sw e r e t e s t e df o rt h e i rb i n d i n gc h a r a c t e r si ng s h s o l u t i o n so fw h i c ht h e v o l u m er a t i o so f t w os o r t so fs o l v e n t sh 2 0 a n dd m s o w e r e u l 英文摘要 4 ：9 6 2 0 ：8 0 ，4 0 ：6 0 ：7 0 ：3 0a n d1 0 0 ：0 t h em i pi nw h i c ht h e m o l a rr a t i 0o fm o n o m e r st ot e m p l a t e sw a s8 ：1b e h a v e db e s ta n dw a s c h o o s e dt od o t h es u b s e q u e n tc h a r a c t e re x p e r i m e n t s w er e s e a r c h e dt h eb i n d i n gc h a r a c t e r so fm i pi ne l e v e nk i n d so f g s hs o l u t i o n so fv a r i o u ss o l u t ec o n c e n t r a t i o n sb e t w e e n0 1m m o l la n d 5m m o l l a c c o r d i n gt ot h e s ee x p e r i m e n t a ld a t a sd i dw ed r e wt h eb i n d i n g i s o t h e r m a l sa n da c c o m p l i s h e da n a l y s i so fs c a t c h a r dp l o t w em a d et l cu s i n gm i pa n dc o r r e s p o n d i n gn m i pt oc o m p a r ew i t h c o m m e r c i a ls i l i c ag e lt l ca n dc o m p a r e dt h e i rs e p a r a t i n ge f f e c t sf o r f o u rs p e c i e so fs t r u c t u r a l l ys i m i l a rm a t t e r sg l y ，g l u ，g s ma n dg s s gw i t h f o u rs o r t so fm i x e dd e v e l o p i n gs o l v e n t s t oo b t a i nas p e c i e so fm i pw i t hb e t t e rc h a r a c t e r s 。w ep r e p a r e d g s hm i pp o l y m e r i z e dw i t hs i l i c ag e la ss a c r i f i c i a lm a t e r i a l si n c o n d i t i o n ss a m et ob u l kp o l y m e r i z a t i o na n dc o m p a r e dp e r f o r m a n c e so f m i pp r e p a r e dw i t ht h et w os o r t so fp o l y m e r i z a t i o n si nt h es a m e e n v i r o n m e n t s ， b a s e do nm o l e c u l a ri m p r i n t i n gt e c h n i q u e ，w et r i e do np r e p a r i n g f l u o r e s c e n ts e n s o rm e m b r a n ew h i c hp o s s e s s e do fe x c l u s i v er e c o g n i t i o n a b i l i t y t og s h u s i n g i n s i t up o l y m e r i z a t i o n ，s a n d w i c hm e t h o da n d p o l y m e r i z a t i o n w i t h m i c r o p o r o u s f i l t e r m e m b r a n ea s u n d e r l a y m o r e o v e r ，w es t u d yo nt h ec h a n g e so ff l u o r e s c e n ts i g n a l so n m e m b r a n e sw h e nt h e yw e r ei ng s hs o l u t i o n s k e y w o r d s ：g s b ；m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r s ；b u l kp o l y m e r i z a t i o n ； p o l y m e r i z a t i o nw i t hs i l i c ag e la ss a c r i f i c i a lm a t e r i a l s ； s e n s o r m e m b r a n e i v 声明 声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中 不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川大学或其 他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 本学位论文成果是本人在四川大学读书期日j 在导师指导下取得的，论文 成果归四川大学所有，特此声明。 7 4 声明人：李琼痞谅 导师：李方李白 第一章分了日j 迹技术研究进展 第一章分子印迹技术研究进展 1 1 引言 分子印迹，又称分子烙印( m o l e c u l a ri m p r i n t i n g ) ，属超分子化学中 主客体化学范畴，是源于高分子化学、生物化学、材料科学等学科的一门交 叉学科。分子印迹技术是指为获得在空间和结合位点上与某一分子( 摸板分 子) 完全匹配的聚合物的制备技术。它可以被形象地描绘为制造识别“分子 钥匙”的“人工锁”的技术。实现分子印迹通常要经过如图一所示的三个步 骤：( 1 ) 功能单体和印迹分子在一定条件下形成某种可逆的复合物。( 2 ) 加 入交联剂将这种复合物“冻结”起来，制得高聚物。( 3 ) 将印迹分子抽取出 来，这样在聚合物的骨架上便留下了个对印迹分子有预定选择性的空间和 结合位点1 ”j 。 近十年来分子印迹技术得到了飞速发展，这是因为它具有三大特点：构 效预定性、特异识别性和广泛实用性。分子印迹技术的应用研究所涉及的领 域非常广泛，包括色谱、仿酶催化、固相萃取、传感技术等卜“l 。 l - 2 分子印迹技术的分类 按照单体与模板分子结合方式的不同，分子印迹技术可分为预组织法和 自组装法两种基本方法( 见图1 ) 。 预组织法( p r e o r g a n i z a t i o n ) 又称共价法，由德国的w u l f f 及其同事 在2 0 世纪7 0 年代初期创立【1 5 】。在此方法中，模板分子( 印迹分子) 首先通 过可逆共价键与单体结合形成单体一模板分子复合物，然后交联聚合，聚合 后再通过化学途径将共价键断裂而去除印迹分子。共价键作用的优点是聚合 中能获得在空间精确固定排列的结合基团，但由于共价键作用般较强，在 识别过程中结合和解离速度慢，难以达到热力学平衡，不适于快速识别，而 且识别能力与生物识别差别甚远，因此这种方法发展缓慢。 自组装法( s e l f - a s s e m b l i n g ) 又称非共价法，由瑞典的m o s b a c h 及其 同事在2 0 世纪8 0 年代后期创立【1 6 l 。在此方法中，模板分子与功能单体之间 自组织排列，以非共价键自发形成具有多重作用位点的单体一模板分子复合 第一带分子印迹技术研究进展 物，竟交联聚合后这种作用保存下柬，可实现分子谚i 剐。与预组织法相比， 自组装法简单易行，模板分子易于除去，其分子识别过程也更接近于那些天 然的分子识别系统，在印迹过程中还可以同时采用多种单体，以提供给模板 分子更多的相互作用，改善印迹效果，因此这种方法近几年发展迅速。 已r 食 叵叵 物理萃、，名掌革取 巴 图1 分子印迹过程示意图 t b ， 1 3 分子印迹聚合物制备过程 与通常的聚合物合成相比，分子印迹聚合物的合成有其独特之处，其中 最主要的有两点： 单体必须带有能与印迹分子发生作用的功能基，如能与印迹分子产生 共价键的基团，能与印迹分子产生氢键的基团或能与印迹分子发生离子交换 作用的基团等，而不是像其他聚合物那样先聚合再进行功能基化。 第一章分子印迹技术研究进展 这类聚合物般是高度交联的，以确保单体将有利于与印迹分子结合 的排列和构象固定下来，并保持对印迹分子起识别作用的位点在作用过程中 空间形状不发生变化，使特异性得以保留。这类材料的交联度通常高达 4 7 5 ：1 ( m o l 1 0 1 ) ，约为8 3 。 通常，分子印迹聚合物的制备包括：功能单体的选择、聚合反应、印迹 分子的去除、后处理等步骡。 1 3 1 功能单体的选择 根据印迹分子的性质以及单体与印迹分子作用力的大小预测，合理地设 计、合成或选择带有能与印迹分子发生作用的功能基的单体。单体的选择主 要由印迹分子决定，它首先必须能与印迹分子成键，且在反应中它与交联剂 分子处于合适的位置彳。能使印迹分子恰好镶嵌于其中。常用的共价单体主要 有含乙烯基的硼酸或二醇以及含硼酸酯的硅烷混合物等。常用非共价键单体 主要有羧类( 丙烯酸；甲基丙烯酸，m a a ：三氟甲基丙烯酸，t f i a a ；乙烯 基苯甲酸等) 、酰胺类( 丙烯酰胺：n ，n 一二甲基氨基丙基丙烯酰胺) 、磺酸 类( 如二丙烯酰2 一甲基一卜丙磺酸) 、杂环弱碱( 乙烯基吡啶；乙烯基眯唑 等) 、天然聚合物( 壳聚糖) 等。 1 3 2 聚合反应 在印迹分子和交联剂存在的条件下，在合适的溶剂中对单体进行聚合。 聚合方式有本体聚合、悬浮聚合、原位聚合、乳液聚合、表面印迹等。分子 印迹聚合物大都是通过自由基引发制备的，一般以偶氮二异丁腈( a i b n ) 或 偶氮二异庚腈引发剂，引发剂的引发有高温热引发和低温光引发两种形式。 低温光引发具有下述特点。 可稳定模板分子和单体所形成的复合物。 可印迹热不稳定的化合物。 可以改变聚合物的物理性能以获得更好的选择性。 因而低温光引发的应用更为广泛。 为保证特定空问构型的良好维持，一般需要控制较高的交联度( 通常高 第一幸分于印迹技束研究进展 达8 0 ) 。常用交联剂有二乙烯坫苯( d v b ) 、二甲基丙烯酸乙二醇酯( f g d m a ) 、 三丙烯酸季戊四醇四甲基丙烯酸酯、n ，n 一二亚甲基二丙烯酰胺、3 ，5 一二( 丙 烯酰胺) 苯甲酸、n ，o 一二丙烯酰一l 一氨酸等。 1 3 3 印迹分子的去除 采取萃取等手段将占据在识别位点上的绝大部分印迹分子洗脱下来。通 常采用乙腈、水、甲醇一乙醇( 或三氯乙酸) 、乙腈一乙酸等高极性溶剂反复 洗涤分子印迹聚合物以彻底除去印迹分子。洗涤过程通常非常缓慢，需要耗 费大量的溶剂。可使用索氏萃取器进行连续回流和萃取。寻求一种快捷、彻 底的洗涤方法对于简化分子印迹聚合物的制备过程非常重要。 1 3 4 后处理 在适宜温度下对印迹分子聚合物进行真空干燥和研磨等成型加工后处 理。 1 4 分子印迹聚合物制各方法 分子印迹聚合物制备方法的研究主要围绕着两个问题展开：一是对材料 的性能加以改善( 如提高交换容量、提高材料韧性) ，以适应大规模生产和 应用的需要；另一方面是在水溶液体系中进行分子印迹，以解决对水溶性分 子，特别是生物大分子的印迹问题，扩大分子印迹技术的应用领域。迄今为 止，分子印迹聚合物的制各方法主要有本体聚合、原位聚合、乳液聚合、悬 浮聚合、表面印迹等。 1 4 1 本体聚合 将功能单体在溶液中排列在印迹分子周围，交联干燥后将其研磨、筛分 得到一定粒径的分子印迹介质，最后洗脱除去模板分子。此方法设计简单， 但通常存在以下缺点：处理过程繁杂，费时、费力，产量小；柱效较低；大 规模生产有困难；由于网络交联度很高，模板的去除很困难，这对于以贵重 药品为模板的印迹来说成本过高；印迹位点在合成过程中被包埋在聚合物内 4 第一章分子印迹技术研究进展 部，使其利用率低，表现为低的吸附量；对于某些应用束说调节聚合物的物 理性能较困难，如h p l c 要求材料具有较大的硬度，但本体聚合的脆性高交 联网络很难做到。 1 4 2 原位聚合 由s v e c 和f r e c h e t 首先提出，在分子印迹聚合物应用的位置根据需要 直接聚合成棒状或膜状，不需要研磨、筛分。此方法大大简化了制备过程， 具有很强的实用性，特别适合制作h p l c ，但柱效和分辨率仍不够高。 1 4 3 乳液聚合 将模板分子、功能单体、交联剂溶于有机溶剂中，然后将溶液移入水中， 搅拌、乳化，最后加入引发剂交联、聚合，可直接制备粒径较均一的球形分 子印迹介质。此方法制备的成品颗粒均一，适合工业 化生产，粒径可以达到很小，比表面积大，印迹位点利用率高，可以印迹水 溶性分子。但针对不同的模板，印迹效果优劣不一。 1 4 4 悬浮聚合 悬浮聚合法是制备聚合物微球最简便、最常用的方法之一，通常使用的 单体是疏水性的，连续相常用水或高极性的有机溶剂，但对于分子印迹这些 溶剂是不适宜的，因为高极性溶剂会极大地降低功能单体与印迹分子问相互 作用的数量与强度，从而影响聚合物对印迹分子的识别能力：另一方面，酸 性单体在水中溶解度过高，使单体与交联剂无规共聚很难进行；并且水溶性 印迹分子会在水相中损失。所以很难用水相悬浮聚合制备分子印迹聚合物。 为克服水或高极性有机溶剂的干扰问题，人们提出了以全氟烃为分散相 的悬浮聚合法，即在液态全氟烃中形成非共价混合物乳液，采用氟化的表面 活性剂及其他含氟的表面活性剂作为稳定剂，德到稳定的含单体、交联剂、 印迹分子、致孔剂的乳液液滴，从而消除了非共价印迹中存在的不稳定的预 组织体。这种方法可以直接制得聚合物微球、不需研磨，提高了原料利用率； 作h p l c 填料，其选择性和分离度类似于本体聚合，且有柱压降低和快速扩 散的优点，低流速下分散效果良好。但此方法由于最终产物仍为高交联凝胶， 第一章分子印迹技术研究进展 其位点可接返性及印迹分子回收率仍不能令人满意；虽然可以控制微球的大 小和粒径分布，但很难控制聚合物的结构和交联度，不利于印迹分子的重新 结合，印逊效果仍然不满意。 1 4 5 表面印迹 此方法是在某种粒子的表面进行修饰、制备分子印迹聚合物材料，这种 方法的优点是：可以利用粒子的机械稳定性及通过对粒子本身性能的调节来 适应某些应用的需要；自己合成载体，可以通过控制条件而得到小粒径、窄 分布载体；应用于色谱柱具有低压、高流速的特点；由于载体具有较高的孔 度和表面积，可以使底物较易接近活性位点，因此有望实现大分子的印迹 1 1 8 也1 。目前，该方法还不够成熟。 1 4 6 其他方法 除了以上几大主流方法之外，现在还出现了一些新兴的制备方法，例如 电聚合、分层次印迹、抗原决定基法【2 3 - 2 6 、牺牲硅胶法等。 在实际应用中，由于对检测和分离用的分子印迹聚合物要求不同，所以 要综合分析研究的对象和目的，选择最佳的合成方案。 1 5 分子印迹聚合物性能及识别影响因素 w u l f f 认为一种理想的分子印迹聚合物应具有以下的性质： 聚合物的结构应具有一定的刚性以保证印迹孔穴的空间构型和互补 官能团的定位。 聚合物空间结构应具有一定的柔韧性以确保动力学平衡尽快达到，这 对于分子印迹聚合物模拟酶来说尤其重要。 亲和位点的可接近性，以提高分子识别过程的效率。 机械稳定性，以使分子印迹聚合物可以在高压下应用。 热稳定性，以便在高温下使用。 分子印迹聚合物性能的主要评价指标见表l ： 6 第一章分子印迹技术研究进展 表1 分子印迹聚合物的性能评价 评价指标 物理稳定性 化学稳定性 吸附容量 选择性 重复使用性 回收率 形状 尺寸 抗机械作用；耐高温、高压 耐酸碱、有机溶剂 至少要维持在0 1 l m g 印迹分子g 聚合物的水平 对目标分子具有独特的富集作用，能在与其结构相似物质的混合体系 中将其识别出来( 选择因子大于1 ) 能够多次( 1 0 0 次以上) 重复使用 9 9 根据应用的需要制成无定形粉末、棒状、球状、膜状等 毫米级一纳米级 分子印迹的机理目前已有一些报道，一般认为分子印迹聚合物对模板分 子的识别主要是由如下三方面的因素决定的： 1 5 1 分子印迹聚合物中功能单体上功能基与模板分子上功能基 的选择性反应( 印迹反应) 印迹反应包括两种：一是形成可逆性共价键的反应；一是形成非共价键 ( 包括氢键、离子键、会属配位键、静电作用力、疏水作用力和范德华作用 力) 的反应。 凡是能影响这些反应的因素都能影响分子印迹聚合物对模板分子的识 别。这些因素有以下几方面： 功能基的抑制剂。即能与功能基发生反应的物质，该抑制剂与功能基 发生反应后不仅使功能基丧失活性，而且占据了孔穴的空间，使模板分子不 能与分子印迹聚合物的功能基结合。 功能基空间取向的改变。某些物质和条件，比如温度和溶剂等可以使 功能基的空问取向发生改变。无论是形成共价键还是非共价键的反应都有一 定的方向性，如果印迹聚合物功能基的空问取向和模板分子功能基的空间取 向不匹配，就会影响两者的结合强度和速度，甚至会导致反应不能发生。 第一章分子目l 迹技术研究进展 静电斥力和空间位阻效应。溶液p l 等条件会引起分子印迹聚合物和 目标分子问产生静电斥力，s e l l e r g r e n 在利用以l - p a 为模板的分子印迹聚 合物分离对映异构体时发现，保留值( 膏) 以及分离因子( a ) 对于流动相的p h 值有很大的依赖性【矧。分子印迹聚合物是一种高度交联的共聚物，其聚合物 链以及链上存在的其他基团都可以阻碍模板分子和聚合物功能基发生印迹 反应，使分子印迹聚合物的选择性和亲和力降低甚至丧失。 溶剂的影响。溶剂的某些性质对印迹反应的发生有很大的影响，如溶 剂的极性、介电常数、质子化作用及络合作用等。这些因素是通过对聚合物 和底物的分子间作用来影响二者之问的选择性和亲和力的。溶剂对分子印迹 聚合物的影响可归于第一种情况：功能基的抑制剂。溶剂对底物的影响是通 过形成氢键等弱的作用力，使底物与功能基的反应活性受到影响。例如：y u 在研究以b o c 或c b z 保护的氨基酸作为模板分子的印迹聚合物的过程中发 现，用于分离的聚合物在极性乙腈溶剂中制备时，利用乙腈为主的流动相 对对映异构体的分离效果较好，而改用极性低的氯仿为主的流动相时，则无 法分开对映异构体1 2 9 】。这对分子自组装方法的影响尤其大，因为分子自组装 就是通过这些弱的相互作用实现的，底物分子一旦与溶剂形成氢键或其他类 型的键，就很难再与聚合物功能基发生作用，所以自组装分子印迹聚合物的 制备大都是在非极性有机溶剂中进行的。 1 5 2 分子印迹聚合物孔穴的空间结构与模板分子的构型、构象 的完美匹配 分子印迹聚合物孔穴的空间结构与模板分子的构型、构象的完美匹配有 利于分子印迹聚合物功能基与模板分子功能基的充分靠近并进行专一性结 合。聚合物孔穴的结构和形状并不是完全刚性和一成不变的，实际上在溶剂 中，无论是通过分子自组装还是分子预组织方法制备的分子印迹聚合物都存 在溶涨现象，这使得印迹聚合物孔穴的大小和形状都发生改变，从而使选择 性和亲和力发生不同程度的改变。 实验证明：聚合物构型、构象的改变是由于溶剂与聚合物链问的相互作 用引起的。预组织分子印迹聚合物功能基与模板分子之间的作用力强于溶剂 8 第一章分子印迹技术研究进展 与聚合物链的作用力：而分子自组装印迹聚合物功能基与模板分子之汹的作 用力弱于或最多等于溶剂与聚合物链之间的作用力，所以溶涨对分子自组装 比对分子预组织印迹聚合物影响更大。 1 5 3 印迹聚合物对底物分子的识别过程 无论是印迹聚合物被用于催化、被用于分离还是其他目的，被选择的底 物能否正确地进入聚合物孔穴都是很重要的。对于同一个聚合物来说，不同 孔穴的选择能力是不同的，他们对于聚合物分子识别能力的贡献也是不同 的，这是由于聚合物中孔穴结构及功能基与底物的匹配程度不同造成的。许 多实验证明：尽管印迹聚合物与原模板分子的专一性结合占绝对优势，但由 于功能单体在聚合过程中，有相当部分没有与模板分子结合的功能基存在 于聚合物表面，这些功能基可以和其他分子结合( 一般称这类结合为非特异 性结合) ，聚合物孔穴中的功能基也可以进行这种非特异性结合。另外，聚 合物链上还存在一些其他基团也可以和其他分子结合。这种非特异性结合对 印迹聚合物的分子识别造成了不良影响，例如，在色谱分析中造成峰的拖尾 现象；对于用做传感器敏感材料来说，则会造成干扰或误检。 1 6 分子印迹技术的应用 与常规和传统的分离或分析介质相比，基于分子识别的分子印迹聚合物 的突出特点是对被分离物或分析物具有高度的选择性，同时分子印迹聚合物 具有良好的物理化学稳定性，能够耐受高温、高压、酸碱、有机溶剂等，容 易保存，制备简单，易于实现工业化生产。因而，在色谱分析与色谱分离、 模拟酶、膜分离、固液萃取、药物分析、仿生传感器方面得到了日益广泛的 应用，展现出良好的前景。 1 6 1 色谱分析和色谱分离 分子印迹聚合物可用来制各色谱分离的固定相，以建立固相萃取、高效 液相色谱或毛细管电泳分析法进行手性物质的分离，也可用于样品的预处理 1 3 0 j 1 1 。 9 第一章分子印迹技术研究进展 1 6 1 1 样品预处理 分子印迹聚合物用于样品预处理的首例报道是s e l l e r g r e n 于1 9 9 4 年合 成出的以戊脒( 一种抗原虫菌药) 为模板的印迹聚合物，该聚合物作为吸附 剂完成了对生物液体试样尿中戊脒的提取、纯化和浓缩，使之达到能够直接 检出其浓度。 迄今为止，分子印迹技术结合固定相色谱对分析样品进行前处理的研究 已做了很多工作。目前的研究表明：分子印迹聚合物一固定相色谱完全能运 用于分析试样的分离、纯化和浓缩工作，但这方面的研究仍处于起步阶段， 尚有许多不完善的地方： 首先，许多研究表明分子印迹聚合物可以从有机溶剂和水中选择吸附分 析底物，但对于不同的物质、不同的溶剂( 极性、非极性) 其吸附条件和沈 脱条件迥异，尚没有找到一个普适性的规律，从这一点上讲不如传统吸附剂， 仍需要大量的研究工作。其二，虽然目前的研究工作涉及领域广，化合物种 类多，但大多数工作都集中在分离方法的建立，而对分离机制的研究涉及较 少，而事实上分离机制是应用研究的理论基础，是非常重要的环节，目l j i 印 迹技术在色谱工作中存在的问题，都可以归因于基础理论研究的缺乏。其三， 对于解决模板分予在印迹聚合物中的残留问题也将成为今后研究的一个重 点，因为这一问题的存在已阻碍了分子印迹聚合物在色谱分析中深入、广泛 的应用，特别是对于痕量分析。 1 6 1 2 用于手性拆分 大多数手性拆分的工作集中于药物手性分子的拆分【3 2 】。手性药物，分子 式完全相同、在非手性环境中其物理和化学性质大多相同，但其生物活性如 药效学和药代动力学却有很大的差别，如抗心律失常药物普萘洛尔 ( p r o p r a n o l 0 1 ) 的s ( 一) 一异构体的药理活性比r ( + ) 一异构体大1 0 0 倍。 氧氟沙星的左旋异构体的抗菌强度远大于右旋异构体。据统计，现有药物中 有6 0 具有一个或多个手性中心。1 9 9 2 年美国食品和药物管理局( f d a ) 要 求今后凡是研制具有不对称中心的药物，都必须先进行手性分离，分别测定 各个异构体药物动力学和毒理学的各项指标，这就给手性物质的分离提出了 1 0 第一章分了印透技术研究进展 新的要求。目前尽管已有直接的手性合成、酶拆分和其他一些分离技术，但 由于分子印迹聚合物与酶相比具有不受各种恶劣环境因素的影响而又具有 与酶相似的选择性，因此，分子印迹技术在手性物质分离方面具有一些独特 的技术优势。 1 6 1 。3 分子印迹聚合物用于色谱分析和色谱分离存在的问题 目前该工作存在的主要不足是聚合物容量太小。这主要是因为聚合物 中实际有效结合位点太少所致。 分子印迹聚合物手性固定相的选择性系数大都在4 5 5 之间，与其 他手性固定相相比，分子印迹聚合物固定相应有相当好的分离效果，但由于 结合位点的非均匀性以及可利用的官能团数量的限制，色谱峰拓宽及拖尾的 现象影响了其分离效果。需要进一步优化分子印迹聚合物颗粒的形状、大小 和填充柱性能。 分子印迹聚合物在制各前首先要纯的对映体分子，这就给一些用一般 方法难以拆分的消旋物的拆分工作带来了困难。理论上讲可以用分子类似物 作模板，实际上分子类似物的寻找也是一件非常困难的工作。近年来发展起 来的组合化学技术对于模板分子的快速筛选和合成提供了一条较为高效的 途径。 虽然已有报道在水相中进行了手性拆分，但也都是处于刚刚丌始阶 段，尚有待进一步去研究。 m i p 作为色谱固定相主要用于高效液相色谱，但是由于柱效较低的原因， 限制了它的发展。高效毛细管电泳( h p c e ) 是- - f l 新兴的分离技术，具有分 辨率高、分离时间短、消耗少、花费低等优点。把h p c e 与m i p 相结合，从 而克服高效液相色谱柱效较低的缺点，有望成为m i p 技术发展中的一项重要 发展方向1 3 3 - 3 5 1 。 1 6 2 模拟酶及辅助试剂 1 6 2 1 模拟酶 催化剂在化工生产中起着至关重要的作用，化学合成反应的发展很大程 第一辛分子印迹技术研究进展 度上依赖于催化剂的品质。自然界中的酶以其高效、专一、反应条件温和的 特点成为一类重要的催化剂。但天然酶提取困难、耐受性差、难以回收和重 复使用的缺点严重制约了它的生产和应用。将天然酶的催化原理运用到合成 催化材料的设计中是一种极具创新性和发展潜力的思想。分子印迹技术的出 现及其在模拟抗体方面取得的突破性进展启发人们利用分子印迹技术将识 别位点和催化基团引入聚合物内部用以制备模拟酶，或称塑料酶( p l a s t i c e n z y m e s ) 。 与天然酶相比，理想的模拟酶除具备可与之相匹敌的高的催化活性和选 择性外，还具有如下优点： 结构的可调控性，即可针对不同底物和反应需要设计不同结构的印迹 空腔。 结构和性能更稳定；耐温、耐酸碱、耐有机溶剂能力更强；适用性更 广、寿命更长。 材料易得，价格更宜，便于储存和规模化生产。 另外，通过改变或简化活性位点中的功能团，模拟酶还可帮助人们对整 个催化反应历程有更深入的了解。 目l j i ，研究较多的m i p 模拟酶催化反应主要有水解反应、合成反应、氧 化一还原反应、转移反应、脱h f 反应、异构反应等p 6 4 3 。印迹所用的模板 分子主要有底物类似物( s u b s t a t ea n a l o g u e ) 、过渡态类似物( t r a n s i t i o n s t a t e a n a l o g u e ) 和产物类似物( p r o d u c ta n a l o g u e ) 。底物类似物( s a ) 产物类似物( p a ) 是指与复合体( 底物一聚合物基质产物一聚合物基质) 相类似的化合物，通过印迹聚合物与实际底物产物的“咬合”起到催化作 用，由于s a 与任一底物产物都不相似，所以避免了底物产物抑制作用。 过渡态类似物( t s a ) 是指与中间产物相类似的化合物，这种印迹聚合物中 的识别位对反应过渡态起稳定作用，从而降低反应的活化能，提高反应速率， 另外，过渡态类似物比底物自身更能紧密地结合在活性位点上，因此t s a 是 目前应用最普遍的印迹分子。 1 6 2 2 辅助试剂 第一章分子印遮技术研究进展 m i p 除作为催化剂外，还可作为辅助试剂用来引导反应的发生或掩蔽某 一反应物，避免反应向不希望的方向进行，或利用其特异吸附作用，使热力 学不利的化学反应平衡向期望的方向移动。 1 6 2 3 展望 分子印迹技术为高效人工酶催化剂的开发带来了新的希望，分子印迹聚 合物在催化和有机合成领域中己初露锋芒。虽然从反应速率来看，效果还不 理想，但其反应选择性是相当高的。进一步的研究工作将主要集中在丌发具 有结构适应性的m i p 模拟酶。改变刚性聚合物的被动低效的识别过程，实现 诱导组装和对底物的主动捕捉：采用复合方法筛选基质，提高催化性能；减 少印迹聚合物粒子尺度，获得具有均结合位点分布的可溶性催化剂；拓展 应用领域，挖掘其在引导不对称催化和定位反应方面的潜力。 1 6 3 膜分离和固液萃取 1 9 9 0 年，p i l e t s k y 采用原位聚合法首次制备了m i p 膜，实现了对模板 分子腺苷酸( a m p ) 的特异识别和分离，开启了m i p 在膜分离和固液萃取方 面的应用。 在体内药物分析中，一般采用液一液萃取( l l e ) 或液一固萃取( s p e ) 对生物样品中目标物进行净化和浓缩。其中s p e 以其成本较低、需用样品量 较少以及操作简单被越来越广泛的使用。一般s p e 采用的固定相为c 1 8 ，c 8 、 硅胶或离子交换树脂。但m i p 对目标物分子的特异性吸附力以及良好的机械 强度使其成为s p e 固定相的最佳选择之一。基于分子印迹技术的固相萃取 【4 “_ 7 1 代替传统的液一液萃取，选择性好，操作简便，既可在有机溶剂中使用， 又可在水溶剂中使用；萃取过程的选择性可以通过对模板分子和印迹分子的 选择来灵活调变；高选择性使固相萃取可以用于痕量分析。该过程的主要缺 点是：印迹分子的泄漏有时会污染样品从而干扰测定的精确度，而且在生物 样品方面的研究工作不够系统化。 1 6 4 抗体和受体模拟物 配体结合( 1 i g a n d b i n d i n g ) 分析被用来临床测量血液中的痕量物质， 第一章分子印迹技术研究进展 这种分析方法需要一个能选择性地结合待分析物的受体，通常人们用抗体作 受体，但使用抗体操作上很不方便且费用高。 基于分子印迹的检验方法具有极高的灵敏度，能识别化合物的细微差 别。a n d e t s s o n 等用m i p 来模拟抗体的结合位，分析血液中药物的浓度。所 得结果与用免疫分析得到的结果相比较，表明m i p 具有同抗体相似的选择性 结合能力和交叉反应分布( c r o s s r e a v t i v i t yp r o f i l e s ) ，性能稳定，易制 各。 用分子印迹聚合物制备人工抗体和受体，从理论上来说是对生物抗体的 一种有益的补充，其前景是非常诱人的【船舯l 。在过去的几年中，许多研究表 明，分子印迹聚合物可以用作制备人工抗体，可以作为免疫试验的识别物质。 事实上，许多分子印迹聚合物的吸附试验都是基于竞争性放射配体结合这一 原理的。当这些印迹聚合物被用于竞争性实验时，对与模板分子结构相近的 物质的结合能力远低于对模板分子的结合能力。例如，抗茶碱 ( a n t i t h e o p h y l l i n e ) 印迹聚合物完全能够区分印迹分子和结构上非常相似 的咖啡因，而茶碱和咖啡因化学结构上只有一个甲基的差别，用一般的方法 是很难把两者分区开柬的。更惊人的是这些分子印迹聚合物的交叉反应 ( c r o s s r e a c i v i t y ) 与这些药物的单克隆抗体的交叉反应几乎是相同的。 抗茶碱分子印迹聚合物用于检测病人血浆样品中茶碱的含量是完全符合医 学检测要求的。这证明印迹聚合物抗体和受体完全可以作为生物抗体的理想 替代品和有益的补充。 分子印迹聚合物作为人工抗体和受体有以下几点好处： 制备容易。 稳定性好，适用于苛刻环境如高温、高压、强酸强碱及有机溶剂。 对于从自然界难得到或不能得到的抗体和受体人工制备的模拟物则 成为生物抗体和受体有用的补充。 造价低廉。 不需要大量动物试验。 不易受到生物降解的破坏。 1 4 第一章分子印速技术研究进展 1 6 5 仿生传感器 分子印迹聚合物用作传感器的敏感材料是分子印迹技术的一个重要研 究方向1 5 0 州。一般把这种以分子印迹聚合物作为敏感材料的传感器件称为分 子印迹聚合物传感器。分子印迹聚合物敏感材料与近年来研究较热的生物敏 感材料相比，具有耐高温、高压、酸、碱和有机溶剂，不易被生物降解破坏， 可多次重复使用，易于保存等优点，而且较生物材料易得，可以用标准的化 学方法合成出来。因此，分子印迹聚合物有希望成为取代生物材料的理想替 代品。 自1 9 8 7 年t a b u s h i 首次用分子印迹聚合物作为敏感材料，对维生素k 1 、 k 2 和e 进行了测定以来，分子印迹聚合物传感器引起了人们极大的兴趣，在 国外已成为传感器研究领域的一个新热点。用m i p 代替生物传感器的生物元 件能够得到刚性更好的传感器系统，而且用m i p 还可得到自然界中目前尚不 存在的合适生物选择性材料化合物的高选择传感器。最近几年，基于m i p 的 对质量变化敏感的化学传感器，如表面声波( s a w ) 震荡器、l o v e w a v e 震荡 器，以及石英晶体微震荡器( q c m ) 逐渐成为研究的热点。此外，也可以根 据m i p 结合分析物后其光学性质或电导率的改变来进行定量测量，比如在两 电极中间用一层分子印迹的集合物膜隔开，聚合物结合底物就会导致电导率 的变化，这种变化可用电信号的变化体现出来。 尽管理论上m i p 可制得许多化合物有专一选择性的传感器膜，但由于缺 乏将这种键合过程转化为可测量信号的传感机理和方法，目前大多数工作仅 局限于研究制各m i p 传感器的可能性上。 在m i p 传感器的设计中有三个问题至关重要： 开发能够对结合过程进行检测并将其转换为可处理信号的高灵感敏 度的转换器。 开发高性能印迹聚合物，在要求的条件下能够与被分析物作用并具有 所需的亲和力和选择性。 将m i p 与转换器结合成一体。 1 6 5 1 转换器 第一章分子印迹技术