（分析化学专业论文）人工分子伴侣离子交换色谱法辅助还原变性蛋白质的复性.pdf

西北大学硕士学位论文 摘要 高效且廉价的蛋白质复性方法的研究一直是生物工程下游技术中的一个热 点。本文将离子交换色谱法( i o ne x c h a n g ec h r o m a t o 争印1 1 y ，i e c ) 与人工分子伴侣 法( a n i f i c i a lm o l e c u l a rc h a p e r o n ，剐c ) 相结合，发展了人工分子伴侣离子交换色 谱法( a m c - i e c ) ，以脲变性二硫苏糖醇还原溶菌酶( 1 y s o 巧m e ) 为模型蛋自，研究 该方法用于蛋白复性的效率，并将此方法应用于重组人粒细胞集落刺激因子 ( r h g c s f ) 的复性。 本论文包括以下几个部分： 1 文献综述：对研究蛋白质复性的意义、蛋白复性方法及蛋白折叠液相色谱 法、重组人粒细胞集落刺激因子分离纯化等方面进行了综述。共包括文献 9 7 篇。 2 人工分子伴侣离子交换色谱法复性还原变性溶菌酶：将i e c 和a m c 相结 合，发展了a m c i e c ，并用于脲变性二硫苏糖醇还原溶菌酶的复性，对流 动相中脲浓度、流动相中p c d 浓度：流动相p h 、流动相流速、去垢剂与 溶菌酶摩尔比、去垢剂种类等进行了优化。与a m c 和i e c 相比，在实验考 察的初始蛋白浓度范围内，a m c i e c 所得的活性回收率更高，同时，该方 法对初始浓度很高的还原变性溶菌酶能得到较高的活性回收率。当溶菌酶的 初始浓度高达2 0 0m g m l 时，其活性回收率仍能达到6 3 。另外，在 w c i e c 复性过程中，色谱柱的使用寿命比通常i e c 方法更长。实验结果 表明这种方法是一种高效和廉价的蛋白复性方法。 3 一步人工分子伴侣离子交换色谱法辅助还原变性溶菌酶的复性：以月桂酰 基肌氨酸钠( s o d i 啪l a u r o y ls a r c o s i n e ，s a r k o s y l ，s l s ) 作为蛋白变性剂，发展 了一步人工分子伴侣离子交换色谱法，对还原变性溶菌酶进行了复性研究。 对流动相中脲浓度，流动相中p 环糊精( p c d ) 浓度，流动相p h ，流动相流 速等复性条件进行了优化。结果表明，当流动相中脲浓度为3 om o l l ，p c d 浓度为8m m 0 1 l ，流动相p h 为8 o 并且流速为1m l m i n 时，活性回收率 最高。 西北大学硕士学位论文 4 人工分子伴侣离子交换色谱法复性重组人粒细胞集落刺激因子：用不同提 取方式对m g c s f 包涵体进行了溶解，结果表明，用2 s 砌s y l 溶液能很 好的溶解r h g c s f 包涵体。以p - c d 为剥离剂，采用一步a m c i e c 和 a m c i e c 对s a r k o s y l 溶解的r h g c s f 进行了复性，结果表明这两种方法所 得蛋白质量回收率相当，且远高于i e c 方法所得质量回收率。 关键词：人工分子伴侣，离子交换色谱，色谱复性，溶菌酶，重组人粒细胞集 落刺激因子 霉遵蚕复翟羹妻型翼菱 鬟薤羹蓁善蓁蓊蓁 妻! 埏萋萋溪三三；誉程霉霎毒垂篓i 霎垂q j ；羹萼誊i 蟊i 鋈要蕊奏囊l 墓i 爹薹u 【i i 落蓑h 囔蓬二月i 霎l 妻霎i i 妻 妻蓁薹茎茎萎| 薹墓薹霎 碧磬n 霪c ! 酉萋亍菱釜圭冀妻咱妄鋈雾叁萎瑁髻萋蕈薹蓁薹 纂堇耄藿i i i j 妻j 蒌羽髫i 霎；! 蓁i 一| 辇耋垂l 茎j 薹妻室i i 妻! 壅l 蒌霎 薹囊蠢i 嗣章 崎罕m 善鐾莲藿i 蓁懿薹i 也；希i 强誊鬟鐾枣薹量差；萄塞塞囊薹鎏_ 萋l l 薹羹蚕蔓萎蓠薹! | 蓁萋l 鏊k i 薹薹；e 茎麴| 翥鏊；l f 曩量主 霪耋薹萋| 琴圄目l 蓁i 奏蠢鐾翼奏奏蠡i 霉蓄i i 螽薹i 篓! 雾霈i 萄叁塞l 型型掣垦霞j 麦离奇一l 戛 霪霪蓬薹堑耄| | 溶日蓄l l 蓁誊鬟主i 【j 星鋈蝰鲤g l 羹黧囊一l 疆鐾3 荔一 f 滞警譬瞎l e 霎蓍蓄：塑篓番差董摹骞| l 雾l 主捱萋薹塞雾塞茎甍 己d妻璺盼垡菱! 囊季曩l 驷 萋； 薹蚕r 戛i 膏基誊主主1 1 1 1 毒薰! l i i i x l 鋈i | 如il 美篓羹! 一誊羹堡誊萋量嚆i 亡鏊妻雾雾囊笋；l 藿秀l 固k i f 谨l ；翼墓雪哩季季薹；妻雾萋 霪霎薹冀竺；藩i 萋薹薹丐塑鋈翁 薰蓼蓁霪囊，鎏鍪冀! 委嚣芋1 蚕耄g l 哞 k 一薹爹! 藿薹l 萝 l 器掌掣掣葶i 茎差l 蓁曼鋈：霪事雾l 荔囊饕丞委l n 妻淳霎冀雾；i 县| 萋| 手鋈呈i 蠢霎蚤： 羹萋挈妻i 冀“奏蓁蓁冀萋呈麓爿i “l 蕈l ! i i _ 夔霎三l 蠢l l ： 囊掣l 要塞! 羹霎垂至至霎主雾目霎) | 刚基l 谨 f 囊葡篓垂l 雾謦髯堡薹c 毖l 。主薹譬茬| 喜j 薹耄蒌零姜姜i l 鍪1 i l l 薹薹峨塞蓦 ( 主 冀要霎l 薹! 萋薹毛蓍蓍l 蓄l 差蓁；翥芋羹i 萋l 警 i 妻摹蓁i 蔫l l 霭嚣垂蓁丝蓁；蓁1 蓁l 引l 蠹羹羹l 錾! 著z! l 竺羹l 霪 蕊蚕塑妻寒l 蠢霎羹琴菱是i 帮嗜“蠢蠢寒l i 霎孽羹! i 三萋萋茎l 委i _ 霎| i 量妻要蓁l 茎虱鼍囊矍i i k 薹| 墅霉矍耋胃蓁薹萋j j 霎i 鋈妻需两 洲霉l 雨葡霎；耋l l 坠鬲l 虱i | 囊霆磊磊连i 耋妻；l 铋莉萎鬻素i t 霪鞴甫塞曼：葡l 蜀蜀i ：塞委! r 雾i 薹耋至萏墅霎霎磊- 霉妻季i i 薹蓁i 蠡l 蓁l 塞 薹薹蕊斧g 霞爹i 羹； 霎著 j i ! 蓁l 薹翼 叉堑芏同鐾蠡i i 掣掣主i i i 量d 主季霎蚕 l 薹荔羹矍裂j墼蓁 灌譬l i i i 塞| l 鼙|藩萋；注霪兰i 蕊垂 嚣薹誊耄a 是善葡薹| r 妇逊孽霪季墓岂n 三羹j j 霪耋 气堡噫萄嵯嵯墅l 羹匡嚯耍| 殳圣写? 羔i 霪l 妻霉霉i 羹l i 毛薹霪篓萋l 霎姜霎j 墼譬雾；l 蓁薹? 蠢礓| l 譬锸翼掣l 割魏型璧霎葶：萋i 萋枣室；羹童霪髫引萄曼鱼g 囊雾；并l l 蓁鬟已蠢墓舳型引幕靠露 荔奏主f 薹矍l 薹奏| 建耄! 雾1 霎妻妻l 雾i 羹囊薹窆螽童 l | | 一羔至窭驰i 蓁i x 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版。本人允许论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权中国科学 技术信息研究所等机构将本学位论文收录到中国学位论文全文数 据库或其它相关数据库。 霎差蓑妻纂篓主要亍强指导教烦签名：边，学位论文作者签名：。缎珏指导教烦签名：! 丝彤 口易年乡月歹日 o8 年百月弓日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位沦文作青签名：参森铝 碉年爿! l j 西北大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 1 蛋白质复性的意义 基因工程和发酵工程等生物技术的迅速发展，使得人们可以根据需要来设 计和生产各种生物产品，特别是那些自然原料缺乏而又无法通过常规方法大量 获得的珍惜蛋白和多肽类产品，如干扰素( i n t e r f e r o n ) 、胰岛素( i n s u l i n ) 、集落刺 激因子( c o l o n ys t i m u l a t i n gf 撕o r ) 等。在已有的用于重组蛋白质生产的表达体系 中，大肠杆菌( 西c 乃p ，记向妇c d 绣ec o 哟表达系统是目前基因工程蛋白生产最常用 的表达体系。 但是，采用e z ；表达体系生产重组蛋白时经常遇到一个难题，即重组蛋 白在ec 础体系中的高水平表达经常导致蛋白质聚集而形成不溶性的无活性沉 淀一包涵体( i n c l u s i o nb o d y ) 【1 1 。为了获得具有天然构型和生物活性的目标产物， 必须在分离回收包涵体后，用高浓度的变性剂( 如8 m o l l 脲，7 m o l l 盐酸胍等) 溶解包涵体，然而所得溶解后的包涵体蛋白是无活性的，必须除去变性剂或者 降低变性剂的浓度使其恢复天然结构并获得天然活性，即使其复性。这一步通 常是重组蛋白生产中的一个最重要的限制性因素，因此研究变性蛋白的复性具 有非常重要的意义。 1 2 蛋白质的变性和包涵体的溶解 蛋白质的变性( d e n 删i o n ) 是指当蛋白质处在非生理条件下( 如热、酸、碱 及变性剂等的处理) ，其二、三级及以上的高级结构发生改变或破坏，从而引起 蛋白质的生物活性丧失。蛋白质变性时，维持其空间结构的次级键被破坏，整 个分子的形状由天然蛋白紧密的结构伸展为松散的，无一定空间结构的链状分 子。变性后的蛋白质溶解度降低，易形成聚集沉淀，这是由于其高级结构受到 破坏后，原来包藏在分子内部的疏水基团大量暴露在分子表面，使蛋白质很容 易引起分子间相互碰撞而发生聚集沉淀。 对于包涵体蛋自，由于是不溶于水的沉淀，要获得有用的活性蛋白必须首 先将包涵体溶解。目前常用的包涵体溶解方法有高浓度变性剂( 8 m 0 1 l 脲， l 西北大学硕士学位论文 7 m o l l 盐酸胍) 【2 吲，表面活性剂【7 _ 1 1 1 ( 如十二烷基磺酸钠( s d s ) ，月桂酰基肌氨 酸钠( s 砌s y l ) 等) ，极端p h 【1 2 】和含低浓度脲的碱性溶液等。 包涵体的溶解方法对重组蛋白的复性和纯化有很大的影响。研究表明，用 高浓度的变性剂溶解的重组蛋白会失去包涵体中本来存在的二级结构，呈现完 全无序的结构，通常较难复性【1 4 - 1 刀。而用表面活性剂和含低浓度变性剂的碱性 溶液溶解包涵体则能够保留包涵体自身含有的二级结构，有利于蛋白复性1 鼬o 】， 目前已被逐步广泛的应用于包涵体的溶解。 1 3 蛋白质复性技术 1 3 1 稀释和透析复性 将一定浓度的变性蛋白溶液通过稀释以降低变性剂浓度或者通过缓冲液的 透析交换除掉包涵体溶液中的变性剂，同时在缓冲液中加入巯基氧化还原剂， 即为蛋白稀释【2 1 】或透析2 2 刃1 复性法。稀释和透析复性简单易行且最为常用，但 蛋白复性效率较低，通常只有5 2 0 【2 4 】。 蛋白质的聚集是降低蛋白复性率的主要原因，近年来许多学者从抑制蛋白 聚集的角度出发，发展了多种较为有效的复性方法，如添加稀释复性法【2 5 黜】， 分子伴侣法【2 9 捌，人工分子伴侣法【3 i ，3 2 1 ，反相胶束法【3 3 3 4 1 ，蛋白折叠液相色谱 法【3 5 。8 】等。其中人工分子伴侣法和蛋白折叠液相色谱法是发展较快的两种方法。 1 3 2 蛋白质折叠液相色谱 蛋白折叠液相色谱( p r o t e i i lf o l d i n gl i q u i dc h r o m a t o 黟叩h y ，p f l c ) 法，即用 液相色谱进行变性蛋白的复性是近年来发展较为迅速的一种复性方法。g e n g 等 瞰1 对蛋白折叠液相色谱及其最新进展进行了综述。 在色谱过程中，蛋白质首先以单分子状态被可逆地吸附在固定相上，实现 了单个蛋白分子相互分离，从而抑制了聚集的产生。两合适的流动相又可以将 蛋白分子可逆地从固定相上洗脱下来。而且利用色谱复性蛋白质的另一优势在 于梯度洗脱过程能够缓慢改变变性蛋白所处的环境，从而限制错误折叠和聚集 沉淀【3 9 1 。同时液相色谱是最有效的分离纯化蛋白质的方法之一【4 0 】，所以在复性 过程中，复性的目标蛋白质还可以与大部分杂蛋白进行分离，实现了一步的分 离纯化与复性。 2 西北大学硕士学位论文 ( 1 ) 疏水相互作用色谱( h y d r o p h o b i ci n t e r a c t i 蚰c h r o m a t o g r a p h y ，h i c ) 耿信笃教授将h p h i c 用于重组人干扰素吖( r h i f n - 丫) 的复性及同时纯化【4 l 】， 使r i f n 吖复性在4 0 分钟内完成，其活性回收率是稀释法的2 3 倍，纯度大于 8 5 ，大大简化了r i f n i 丫下游生产工艺。1 9 9 2 年他们又将h p h i c 用于其它几种 蛋白质的复性3 5 1 ，取得了非常好的效果。近年来，疏水色谱法用于蛋白复性得 到了较大的发展。 g e n g 等【4 2 1 使用一种装填疏水作用色谱填料的蛋白复性及同时纯化装置( 1 0 3 0 0m mi d ) 对重组人干扰素吖( r h i f n 吖) 进行了复性，获得了纯度为9 5 ， 活性为8 7 1 0 7i u m g 的d 1 i f n 吖。他们还对h i c 复性蛋白的机理进行了详细的 论述【4 3 1 。w a n g 等删使用h p h i c 对ec d ，f 表达的重组人干细胞因子( r e c o m b i n a n t h u m a ns t e mc e u l c t o r ，r h s c f ) 进行了复性及同时纯化。获得了纯度9 4 ，活性为 1 2 1 0 6 i u m g 的r h s c f 蛋白。吴丹等f 4 5 】使用端基为p e g 2 0 0 的疏水作用色谱 对重组人干扰素丫( r h i f n 啪进行了复性，考察了流动相组成，流动相p h ，梯度 洗脱模式以及流速对d l i f n 丫复性质量回收率的影响，获得了9 0 的质量回收率 和4 1 1 0 7 砌m g 的活性。“等【4 6 1 用一种键合了p e c 2 0 0 0 0 的中等疏水性琼脂 糖基质h i c 柱，采用8 m 脲脉冲梯度，对重组金黄色葡萄球菌延长因子 ( r e c o m b i n a n ts t 印h y l o c o c c u sa u r e u se l o n g a t i o nf a c t o rg ，e f g ) 蛋白成功进行了 复性，获得了8 8 的质量回收率和8 0 的正确构象。l i 等【4 7 1 使用一种结合了甘 油和脲梯度的疏水相互作用色谱对盐酸胍还原变性溶菌酶进行了复性，该方法 能够获得8 6 3 的活性回收率和8 5 的质量回收率。w 抽g 等【4 8 】使用结合了胍梯 度和p e g 梯度的疏水相互作用色谱对胍还原变性干扰素c o n ( c i f n ) 进行了复 性，与传统稀释法比较，双梯度疏水色谱复性c 。i f n 其活性增加了2 6 倍，质 量回收率增加了3 0 。 ( 2 ) 体积排阻色谱( s i z e - e x c l u s i o nc h r o m a t o g r a p h y s e c ) 自1 9 9 4 年w e n l e r 【3 6 】用s e c 复性了重组人e t s 1 蛋白，牛核糖核酸酶和i h f ( i n t e g r a t i o nh o s tf a c t o r ) 以来，已经有很多蛋白质使用s e c 成功被复性【4 9 税】。g u 等使用s u p e r d e x7 5 排阻柱结合脲梯度对变性溶菌酶进行了复性，获得了9 0 的活性回收率。王骊丽等【5 4 1 采用脲梯度s e c 对重组人干细胞因子( r h s c f ) 进行了 复性及同时纯化，与普通排阻色谱法相比，用脲梯度s e c 复性r h s c f 能够使复 3 西北大学硕士学位论文 性产率提高，其质量回收率从3 5 2 提高到5 1 4 。w a n g 等【5 l 】使用s u p e r d e x7 5 排阻柱结合脲梯度对重组人粒细胞集落刺激因子( r h g c s f ) 进行了复性，通过考 察流动相中脲浓度，p h ，流速，谷胱甘肽浓度和上样量等因素优化了复性条件， 获得了纯度为8 3 ，质量回收率为3 0 ，活性为1 2 1 0 8 m g 的r h g c s f 。 w r 孤g 等【5 5 】通过研究还原变性溶菌酶在体积排阻色谱复性过程中定量环( s a m p l e l o o p ) 规格对复性效率的影响发现，大进样体积和低蛋白浓度有利于获得更高的 复性效率，采用逐步改变流速的方法也能够提高s e c 对蛋白的复性效率【5 6 1 。f a n 等【5 7 】使用s e c 法，对一种新型溶血剂伴侣蛋白( n t a ) 进行了复性，在n t a 蛋白 浓度达到2 0 m g m l 时，能够获得3 7 的复性效率。 与传统的稀释法相比，虽然体积排阻复性能够获得较高的蛋白浓度，但是 其缺点是柱负载量低和分离效率差f 5 8 】。研究人员将连续环状色谱【5 9 删以及模拟 移动床( s m b ) 技术【5 2 6 1 】等与s e c 结合可以提高蛋白处理量和复性率，有望用于 大规模的蛋白复性。 ( 3 ) 离子交换色谱( i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y ，i e c ) 1 9 8 6 年c r e i g h t o n 首次将离子交换色谱用于牛乳球蛋白和溶菌酶的复性中 【3 7 1 。随后捷克科学家s u _ t t n a rj 等使用了强阴离子交换色谱法对h p v l 6 e 7 m s 2 融合蛋白成功实现了复性【6 2 1 。i e c 是蛋白折叠液相色谱法中应用最为广泛的一 种，已经用于多种蛋白的复性。刘红妮等【6 3 】用高效弱阳离子交换色谱对脲还原 变性溶菌酶进行了复性研究，优化了色谱复性条件，当蛋白初始浓度为2 0 m 幽n l 时，溶菌酶的质量回收率和活性回收率分别为9 7 8 和9 5 4 。b a i 等【6 4 j 使用强阴离子交换色谱对重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子( r h g m c s f ) 进行 了复性，对影响复性效率的因素进行了优化，复性后的r h g m c s f 活性为 1 6 6 1 0 7i u m g ，纯度为9 6 2 ，质量回收率为5 8 8 。m a c h o l d 等对不同类 型离子交换填料辅助还原变性0 【乳球蛋白复性进行了研究，考察了5 种不同的 阴离子交换色谱填料对复性的贡献，表明填料的种类对复性效果有很大的影 响。l a i l g e n h o f 等【2 】以脲还原变性牛血清白蛋白( b s a ) 为模型蛋白，用h 汀r a p q s e p h a r o s e 离子交换柱对其进行了复性，获得了5 5 的复性率。f r a n z m 籼等 6 叼使用q s e p h a r o s e 阴离子交换色谱对一种热休克蛋白h s p 2 6 成功进行了复性， 作者将脲溶解后的抽提液进样至已用5 m o 儿缓冲液平衡的色谱柱中，然后将缓 4 西北大学硕士学位论文 冲液中脲浓度从5 m o 儿降低到3 m o l l 以诱导蛋白复性，最后再以低离子强度 缓冲液对复性蛋白进行洗脱得到复性后的蛋白。w 锄g 等【6 7 1 使用qs e p h 踟s ef f 离子交换色谱柱对重组人粒细胞集落刺激因子( r h g c s f ) 进行了复性，考察了 脲浓度，p h 值，流动相流速和氧化还原谷胱甘肽浓度等影响复性效率的因素， 在最优复性条件下，获得了活性为3 o 1 0 8i u ，m g ，纯度为9 4 ，质量回收率 为4 9 的r h g c s f 。l i u 等【6 8 】用s ps e p h a r o s eh i t r a p 阳离子交换色谱结合脲梯度 和p h 梯度对ec d ，f 体系表达的谷氨酰胺转移酶( t g a s e ) 进行了复性，获得9 5 的纯度，5 3 的回收率和2 1 u m g 的活性。m a c h o l d 等【6 9 】将一种结合超滤装置的 连续环状离子交换色谱应用于还原变性溶菌酶的复性过程，对复性过程中产生 的聚集沉淀经分离后，用2 m o l l 盐酸胍再溶解，超滤降低盐浓度后再次进样至 离子交换色谱，使得复性效率从2 5 提高到3 0 。另外，膨胀床吸附( e b a ) 技 术与离子交换色谱相结合【7 0 7 1 1 也已被用来辅助蛋白复性。c a b a l l n e 等明使用阴 离子交换e b a 色谱体系对e ，f 表达的高效绿色荧光蛋白( e g f p ) 进行了复性及 纯化，获得了9 0 。3 的回收率。 ( 4 ) 亲和色谱( a m n 姆c h r o m a t o g r a p h y a f c ) a f c 是利用配体与目标蛋白之间特异性的亲和作用，使变性蛋白分子保留 在色谱柱上，将其与变性剂分离，避免了分子间相互作用的产生，提高了复性 产率。a l t 锄i r 趾。等【3 8 】使用一种同时固定了分子伴侣，二硫键异构酶和脯氨酸p p i 的基质对使用其他方法无法复性的蝎毒素c n 5 进行了复性，质量回收率和活性回 收率分别为8 7 和1 0 0 。k i m 等f 2 9 】用ec d 疗体系表达了一种m i n i e l r l o 的小分子 伴侣蛋白，并用离子交换色谱将其分离纯化后，固定于离子交换基质( s p s e p h a r o s ef f ) 上应用到重组环糊精糖基化转移酶( c g t a s e ) 的复性过程中，结果显 示该亲和基质能够显著提高c g t a s e 蛋白的复性效率。g u a n 等【3 0 】将一种小分子伴 侣s h tg r o e l l91 3 4 5 固定于n h s a c t i v a t e ds e p h a r o s ef a s tf l o w 基质上，对重组人 干扰素吖进行了复性，其质量回收率和活性分别为7 4 2 5 和6 7 4 1 0 6i u m l 。 m u r o n e t z 等【7 3 】将蛋白二硫键异构酶( p d i ) 固定于c n b r a c t i v a t e ds e p h a r o s e 基质上， 并用其对溶菌酶进行了复性，获得了8 0 9 0 的活性回收率。 m a 劬e w 等【7 4 】利用镍离子金属亲和色谱柱对组氨酸标记的谷胱甘肽转移酶 g s t ( h i s 6 ) 进行了复性。与传统的稀释复性相比较，在高蛋白浓度时，利用亲和 西北大学硕士学位论文 吸附复性可以减少蛋白折叠中间体之间的相互作用从而提高复性效率。g u o 等【7 5 】 使用n i c h e l a t i n gh i s t r a p 柱对重组丘m c t i o n a li p l o s c f v 融合蛋白进行了复性，复 性率为4 5 。l i 等【7 6 】表达，并用n i 2 + 离子金属亲和色谱纯化并同时复性了重组人 干扰素吖l ( i f n 吖1 ) ，结果显示，从1l 的发酵液中可以得到8 6m g 的活性i f n - 丫l 。 w 缸g 等【7 刀使用c u 2 + 亚氨基二乙酸s 印h a r o s e 固定化金属亲和色谱，在低脲浓度下 采用眯唑为洗脱剂，线性梯度洗脱对重组人粒细胞集落刺激因子( r h g c s f ) 进行 了复性。复性后r h g c s f 纯度为9 7 ，比活性为1 8 1 0 8i u m g ，质量回收率为 3 2 。 1 3 3 人工分子伴侣 ( 1 ) 分子伴侣简介 在生物体内存在一类叫做分子伴侣( m o l e c u l a rc h a p e r o n e ) 的蛋白质，其在 体内和体外均可辅助蛋白质折叠成正确的天然态。目前，对c h a p e r o n 家族中源 于大肠杆菌的舶e 蛋白研究较多，也较全面。觚e 蛋白由锄e l 和g r o e s 组 成。g r o e l 分子可通过疏水性作用捕获变性蛋白质，诱导蛋白质的折叠。同时， 在e s 和三磷酸腺苷( a t p ) 的共同作用下，部分或完全折叠的蛋白质被释放到 溶液中，未完成折叠的蛋白质可被g m e l 重新捕获，直至复性完全为止。目前 利用分子伴侣已经对各种模型蛋白进行复性，均取得了显著效梨7 8 。8 1 】。 该方法的缺点是分子伴侣价格昂贵，有时比被复性的蛋白本身贵好几倍， 因此限制了此方法的应用。 ( 2 ) 人工分子伴侣 为了克服分子伴侣体系存在的缺陷，i b z e m a 和g e l l m a i l 【3 l 3 2 1 模拟分子伴侣 体系的原理，发展了人工分子伴侣系统。该体系由去垢剂和环糊精组成，其中 去垢剂分子( 模拟e l 分子) 先与变性蛋白通过疏水相互作用结合，抑制蛋 白聚集产生，这一过程称为捕获阶段，即去垢剂分子作为捕获剂与蛋白形成蛋 白去垢剂复合体；第二步，环糊精分子( 模拟g r o e s 和a t p 分子) 通过与去 垢剂分子作用，将去垢剂从蛋白去垢剂复合体上逐步剥离，从而实现蛋白复性， 这一过程是剥离阶段，环糊精被称为剥离剂。此方法操作方便，添加剂成本低 廉，复性效率较高，有广泛的应用前景。 r o z e m a 等p 1 1 研究了人工分子伴侣辅助胍还原变性溶菌酶的复性，并对人工 6 西北大学硕士学位论文 分子伴侣复性的机理进行了探讨，当溶菌酶最终浓度为lm 咖l 时，可以获得最 高为9 1 的活性回收率。他们还对热变性的碳酸酐酶b ( c a b ) 进行了研究【3 2 】，当 c a b 热变性时加入十六烷基三甲基溴化铵( c t a b ) ，可以明显抑制沉淀产生，同 时在稀释复性过程中加入d 环糊精可以获得8 1 的活性回收率。w a i l g 等【s 2 】对 c t a b 辅助蛋白复性的机理进行了研究。作者以还原变性溶菌酶为模型蛋白，在 复性缓冲液中加入低浓度c t a b 以提高复性效率，同时与人工分子伴侣( 由c t a b 和d 环糊精组成) 法进行了比较，发现c t a b 溶菌酶复合体在复性开始阶段就能 够形成，从而证明c t a b 能够显著抑制蛋白聚集，p 环糊精的加入可以从上述复 合体中剥离c t a b 从而进一步增加复性效率。r a z i e h 等【8 3 】采用稀释复性法，对胍 变性0 c 淀粉酶进行了复性，在复性过程中，加入不同去垢剂和仅环糊精作为人 工分子伴侣体系，考察了不同种类去垢剂对复性效率的影响。发现c t a b 和仅 环糊精组成的人工分子伴侣体系对胍变a 淀粉酶复性效率最高。r a z i e h 等 8 4 j 在 用人工分子伴侣法对胍变性的碱性磷酸酶( a l p ) 进行复性时，也发现去污剂 的种类对复性结果有很大影响。d o n g 等【8 5 j 使用c n 镪p 环糊精人工分子伴侣体 系对ec d ，f 表达的苹果酸脱氢酶二聚体( e m d h ) 进行了复性。 r a z i e h 等【8 6 】发展了一种由反电荷去垢剂组成的新的人工分子伴侣体系，用 稀释法对脲变性碱性磷酸酶进行了复性。作者使用与捕获剂所带电荷相反的去 垢剂作为剥离剂，取代了通常人工分子伴侣体系中环糊精作为剥离剂的方式， 并对去垢剂分子结构和疏水链长度对复性的影响进行了考察，认为此人工分子 伴侣体系中去垢剂之间的电荷作用对蛋白复性有很大影响。a s a y a m a 等1 87 j 合成 了一种纳米凝胶微球( c h p ) ，结合甲基p ，环糊精组成一种新的分子伴侣体系， 将其应用于酸变性绿色荧光蛋白( g f p ) 复性中，结果发现作者所发展的新型分子 伴侣体系对g f p 的复性能够实现与研o e l e s 体系相同的效果。m o h a m m a d 等【8 8 】以c h a p s 为模板，合成了一种d 环糊精分子印记聚合物，并与c h a p s 组 成一种新的人工分子伴侣体系对变性碱基磷酸酯酶进行了复性，获得了7 9 的 复性效率。l u 等【8 9 】合成了一种键合p 环糊精的温度响应聚合物 ( p c d 分p n i p a a m ) ，将其与c t a b 组成一种人工分子伴侣体系对溶菌酶进行了 复性。另外，l i 等1 9 0 j 使用一种固定p c d 聚合物的凝胶基质，结合表面活性剂 ( t r i t o nx 一1 0 0 ) 对e f - g 蛋白进行了复性。作者先将蛋白与嘶t o n 溶液混合，使两 西北大学硕士学位论文 者结合为蛋白去垢剂复合体，然后上样至固定了d c d 的凝胶柱，使去垢剂剥 离，从而达到复性的效果。 1 4 重组人粒细胞集落刺激因子( r h g c s f ) 研究概述 造血生长因子是近年来人们研究的热点之一。临床上主要应用于肿瘤化疗 引起的中性粒细胞减少症，用于外周干细胞动员，与抗生素合用预防或治疗感 染等。粒细胞集落刺激因子是目前已知的血细胞集落刺激因子中特异作用于粒 系祖细胞，促进其向成熟中性粒细胞增殖、分化，并维持其功能和存活的造血 生长因子【9 。 粒细胞集落刺激因子( g c s f ) 属于造血生长因子【9 2 】。是一种糖蛋白，分子量 为1 9 6k d ，等电点约为6 0 ，分子中含有5 个半胱氨酸残基，可形成两个二硫 键，立体结构如图1 1 。 图1 - 1g c s f 的立体结构图( 蛋白质数据库1 r h g ) 近年来国内外众多实验室己成功将g c s f 基因重组到大肠杆菌内，并得到 了高效表达，获得了高纯度的活性蛋白陟9 5 1 。b o o n e 等将e ，f 表达的重组 人粒细胞集落刺激因子( r h g c s f ) 用月桂酰基肌氨酸钠( s a r k o s y l ) 溶解后，用二价 铜离子氧化稀释复性，然后使用强阴离子交换剂除去s a r k o s y l ，并依次用弱阴离 子交换色谱法( 删) 和弱阳离子交换色谱法( w c x ) 进行纯化。w a n g 等【5 l j 使用s u p e r d e x7 5 排阻柱结合脲梯度对重组人粒细胞集落刺激因子( r h g c s f ) 进 行了复性，将2 0 0 “l2 3m m l 的r h g c s f 抽提液经过s e c 复性后获得了纯度 为8 3 ，活性为1 2 1 0 8i u m g ，质量回收率为3 0 的r h g c s f 。w a n g 等7 7 1 使 用c u 2 + 亚氨基二乙酸s e p h a r o s e 固定化金属亲和色谱，在低脲浓度下采用眯哗 r 西北大学硕士学位论文 为洗脱剂，线性梯度洗脱，一步纯化和复性了r h g c s f 。结果显示，复性后 r h g c s f 纯度为9 7 ，比活性为1 8 1 0 8i u m g ，质量回收率为3 2 。w a n g 等叩 使用离子交换色谱法对r h g c s f 进行了复性，考察了复性过程中影响复性效率 的因素，在最优复性条件下，复性后r h g c s f 的活性为3 0 1 0 8i u m g ，纯度 为9 4 ，质量回收率为4 9 。z a v e c k a s 等【9 q 使用一种结合双水相体系的固定化 金属亲和色谱体系，对具有不同表面组氨酸残基的r h g c s f 进行了复性，作者 考察了固定不同金属离子c u ( i i ) ，n i ( i i ) ，h g ( i i ) 及不同组氨酸残基对r h g c s f 复性效率的影响。d a s 撕等【9 7 1 在ec d ，f 体系中表达了r h g c s f ，并对其复性和 纯化过程进行了优化。作者采用径向流过滤技术( t f f ) 对包涵体抽提液进行了复 性，优化了包涵体的清洗、溶解以及复性过程，最终得到回收率为6 9 和纯度 为9 9 的r h g c s f 。 1 5 本研究的目的和意义 综上所述，人工分子伴侣和离子交换色谱已分别被广泛应用于蛋白质的复 性，取得了良好的效果。将蛋白折叠液相色谱法与人工分子伴侣法结合，可以 提高蛋白质复性效率。作为蛋白折叠液相色谱法的一个重要分支，离子交换色 谱由于其柱负载量高，适用范围广且操作简便，被广泛用于蛋白复性及纯化过 程中。本文旨在将人工分子伴侣和离子交换色谱结合，发展一种新型高效复性 方法，以还原变性溶菌酶为模型蛋白，探讨其用于还原变性溶菌酶复性的可行 性，并用于重组人粒细胞集落刺激因子的复性，以期提高复性效率，降低生产 成本。 9 西北大学硕士学位论文 参考文献 【l 】 jk 鼬u e g e r ，ams t o c k ，ces c h u 仕，jbs t o c k i n ：l m g i e r a s c ha n dk k i n 甄e d s ) ，p r o t e i n f o l d i n g ，a m e r i c a na s s o c i a t i o nf o ra d v 锄c e si 1 1s c i e n c e ，w a s h i n 舀o n ，l9 9 0 ，p p ，13 6 14 2 【2 】ml a n g e n h o ssjl e o i 】_ 函lkpa _ n e n d 鹄甜以，j o 啪a lo f c h r o m a t 唧p h ya ，2 0 0 5 ，1 0 6 9 ： 1 9 5 2 0 1 【3 】 gk r a m e r ，ap a u l ，ai 【r e u s c h ，甜以，p r o t e i ne x p r e s s i o na n dp 嘶f i c a t i o n ，2 0 0 7 ，5 4 ： 1 4 7 1 5 6 【4 】zsz h a n g ，ysy 毗yww e n g ，酣口f ，j o 啪a lo fv i r o l o 西c a lm e m o d s ，2 0 0 7 ，1 4 3 ： 1 2 5 ，1 31 【5 】ge s 仃a d a big a r c 魄es c h i a v o i l ，甜口f ，b i o c h i m i c ae tb i o p h y s i c aa c 饥2 0 0 7 ，1 7 7 0 ： 1 1 6 1 1 1 6 8 【6 】 hlc 嬲h ，cvw h i t i l 锄，lvh 0 0 p e r ，p r o t e i ne x p r e s s i o na n dp u “f i c a t i o n ，2 0 0 6 ，4 8 ： 1 5 l 一1 5 9 【7 】 sms i n g h ，akp a i l d 巩j o 啪a lo fb i o s c i e n c ea i l db i o e n g i n e e r i n g ，2 0 0 5 ，9 9 ，3 0 3 3lo 【8 】aas i d d i q u i ，rj a l a l l ，yds h a n n a ，j b i o c h e m b i o p h y s m e t l l o d s ，2 0 0 7 ，7 0 ：5 3 9 5 4 6 【9 】 shk i m ，hmz h o u ，yby a i l ，j o 啪a lo fb i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e s ，4 0 ( 2 0 0 7 ) 7 6 8 2 【1 0 】atl e a l ，pcp o m ，casf e r r e i r a ，订a 正，p r o t e i ne x p r e s s i o na n dp u r i f i c a t i o n ，2 0 0 6 ，4 5 ： 1 0 7 1 1 4 【1 1 】tcb 0 0 n e ，alm i l l e r jw a n d r e s e n ，u n i t e ds t a t e sp a t e n t ，5 8 4 9 8 8 3d e c ，1 9 9 8 【12 】s0 k 哪u 吼hs a j t o h ，nw a s a l l o ，甜以，p r o t e i ne x p r e s s i o na 1 1 dp u r i f i c a t i o n ，2 0 0 6 ，4 7 ： 1 4 4 一1 5 1 【1 3 】刘家华，蛋白折叠液相色谱法中包涵体的碱溶法，西北大学硕士学位论文，2 0 0 6 年 【1 4 】sm i s a w 毛ik 啪a g a i ，b i o p o l y m e r s ，1 9 9 9 ，5 l ：2 9 7 - 3 0 7 【1 5 】edcb e m a r d e z ，es c h w a r z rr u d o i p h ，m e t h o d se m m 0 1 ，1 9 9 9 ，3 0 9 ：2 1 7 2 3 6 【1 6 】bb a t a s ，cs c h i r a l d i ，jbc h a u d h u r i ，jb i o t e c h n 0 1 ，1 9 9 9 ，6 8 ：1 4 9 1 5 8 【1 7 】cm u l l e r u 砌n 鹳，jc h r o m a t 0 舒a1 9 9 9 ，8 5 5 ：2 0 3 2 1 3 【1 8 】edcb e m a r d e z c u r r o p i n b i o t e c h n 0 1 ，1 9 9 8 ，9 ：1 5 7 1 6 3 【1 9 】akp 帆rm u l ( h o p a d h y a y ，rm u h h i j 巩酣以，p r o t e i ne x p r e s s i o na 1 1 dp u r i f i c a t i o n ，2 0 0 0 ， 1 8 ：1 8 2 1 9 2 2 0 】csk i m ，ekl e e ，p r o c e s sb i o c h e m ，2 0 0 0 ，3 6 ：1 l1 1 1 7 【2 l 】ho 西n o ，si r l o u e ，ra k a g i ，甜a 正，b i o c h e m i c a le n g i n e e r i n gj o 啪a l ，2 0 0 8i np r e s s 【2 2 】cav m e m e ，gam o n t e i r 0 ，jmsc a b r a j ，甜a 正，p r o t e i ne x p r e s s i o na 1 1 dp u r i f i c a t i o n ，2 0 0 6 ， 4 5 ：2 2 6 2 3 4 【2 3 】ym a e d 4 tu e d 如ti m o t o ，p r o t e i ne n g ，1 9 9 6 ，9 9 5 10 0 0 【2 4 】xdg e n g ，czw a n 舀j o u m a lo f c h r o m a t o g r a p h yb ，2 0 0 7 ，8 4 9 ：6 9 - 8 0 【2 5 】ta 冰a w 岛de j i m a ，kt s 啪o t o ，甜窃，b i o p h y s c h e m ，2 0 0 7 ，1 2 7 ：1 8 【2 6 】dbw e t l a u 蠡巩yx i e ，p m t e i ns c i ，1 9 9 5 ，4 ：1 5 3 5 1 5 4 3 1 0 西北大学硕士学位论文 【2 7 】ad i v s a l a r ，aas a b o u 口，aam o o s a v i m o v a h e d i ，甜口正，i n t e m a t i o n a lj o u m a lo f b i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e s ，2 0 0 63 8 ：9 17 【2 8 】de j i m 如ko n o ，kt s u m o t o ，甜口，p r o t e i ne x p r e s s i o n 锄dp u r i f i c a t i o n ，2 0 0 6 ，4 7 ：4 5 5 1 【2 9 】sgk i m ，jak i m ，hay u ，甜口正，e n z y m ea n dm i c r o b i a lt e c h n o l o g y ，2 0 0 6 ，3 9 ：4 5 9 - 4 6 5 【3 0 】yxg 啪，zzf e i ，ml u 0 ，甜醴，j o u m a lo f c h r o m a t o g r a p h ya ，2 0 0 6 ，11 0 7 ：1 9 2 1 9 7 【3 1 】dr o z e m shg e l l m a n ，b i o c h e m i s t 1 9 9 6 ，3 5 ：1 5 7 6 0 一1 5 7 6 4 【3 2 】dr o z e m a ，shg e l l m a n ，j a m c h e m s o c 19 9 5 ，1 17 ：2 3 7 3 2 3 7 4 【3 3 】jbc h a u d h 嘶，a l l l l n y a c a d s c i