（发育生物学专业论文）盐芥中win1同源基因的克隆及其rnai功能研究.pdf

山东师范大学硕士学位论文 盐芥中w i n l 同源基因的克隆及其r n a i 功能研究 摘要 陆生植物气生器官的表面覆盖着一层由蜡质和角质形成的脂膜，蜡质主要由长链疏水 物质组成，这些物质来源于含十六个碳或十八个碳的长链脂肪酸延伸复合物。蜡质在植物 的表皮上结晶形成表皮蜡质，内部的蜡质与角质等以聚合体形式存在，表皮蜡质的功能包 括调节表皮的渗透性、限制非气孔性失水、防止紫外线的照射、抵抗细菌、真菌病原菌的 入侵、阻止生殖后器官融合及花粉和雌蕊的相互作用等。角质是构成表皮细胞壁外保护层 的主要的物质。 对拟南芥进行大规模功能基因组学研究的过程中，分离到一个具有a p 2 结构域的乙烯 应答型转录因子( e r f 卜一把这个转录因子称为w 1 n 1 ( w a x l n d u c e r 砂7 s h n l ( a t l 9 1 5 3 6 0 ) 。 在拟南芥中过量表达w i n l 可提高参与蜡质合成途径中的基因的表达水平，从而显著提高 转基因植物蜡质的积累，引起营养器官和生殖器官中角质合成增加和成分改变，增强干旱 耐性及表皮渗透性。反之，下调这个基因则能引起相反的结果。其同源基因s h n 2 及s h n 3 与删的功能相似。 新的耐盐模式植物盐芥与拟南芥近缘，在遗传特征和生活习性上与拟南芥相似，如： 小的基因组，短的生活史，都是自花授粉，有丰富的种子等：在c d n a 水平上与拟南芥有 大约9 0 9 5 的同源性。同时，相比拟南芥，盐芥又有很多自身的优势特点，如有更强的耐 受性和更为丰富的表皮蜡质等。因此，盐芥是一种很有前景的植物蜡质研究材料。用基因 组学方法研究盐芥，可以鉴定和克隆在拟南芥中无明显性状的有价值的基因，特别是与植 物表皮蜡质合成有关的基因。 为了能更深一步的研究m n l 基因的作用机理，我们以盐生植物盐芥为材料，从中克 隆了其同源基因，分析了此基因的组织表达特异性，并构建了基因沉默及过量表达载体， 以分析此基因在盐芥蜡质及角质代谢中的作用及与耐逆性的关系，主要工作总结如下： 1 盐芥w i n lc d n a 的克隆及序列分析 根据g e n e b a n k 中已知的w i n l 类蛋白的c d n a 和蛋白序列寻找保守区并合成简并引物， 提取盐芥花的m r n a 并反转录成c d n a ，以此作为模板进行p c r 扩增，得到一条中间片 段，经过测序并进行b l a s t 分析，该片段与拟南芥w i n l 的同源性较高。根据已有中间片段 设计特异引物利用5 - r a c e 和3 - r a c e 分别合成其5 、3 端序列，最终得到w n 1 同源基 因t h w i n l 。t h l t , , t n l 的c d n a 序列全长8 4 6b p ，包括7 3b p 的5 非编码区和1 9 4b p 的3 山东师范大学硕士学位论文 非编码区。开放阅读框为5 7 9b p ，编码1 9 2 个氨基酸残基，b l a s t x 分析显示t h w i n l 氨基 酸序列与拟南芥w i n l 蛋白具有8 4 的同源性。 2 劢朋m 的r t - p c r 表达分析 提取盐芥幼苗、叶、根、茎、花、角果总r n a ，以内源a c t i n 为内标，设计特异引物 通过半定量r t - p c r ，研究了t h w i n l 在盐芥中的组织特异性表达。结果显示t h w l n l 在花 中表达量最高，在茎和角果中也有表达，在叶、幼苗、根中不表达或者表达量很低而没有 检测到。 3 t h w l n l 沉默载体的构建 将t h w i n l 基因的特异区段1 1 4 b p 测序正确后酶切连入p r t l 0 1 i 中间载体，用e c o ri 和b a m hi 双酶切重组质粒p r t l 0 1 i t h w i n l ，回收目的片段，连入同样双酶切的经过改 造的p c a m b i a 3 3 0 1 h 载体( 含有c a m v 3 5 s 启动子) ，得到t h w i n l 沉默表达载体 p c a m b i a 3 3 0 1 h t h w i n l 。将沉默表达载体导入农杆菌g v 3 1 0 1 ，p c r 鉴定挑选阳性克隆； 花序浸染法进行盐芥的基因转化，收获了大量的种子；以除草剂b a s t a 进行其转化子的筛 选，获得了1 4 株t h w i n l 基因沉默构建的盐芥转化子。目前已得到t l 代种子。 4 t h w i n l 过量表达载体的构建 特异引物p c r 多次测序正确后，将t h w i n l 的开放读码框用b a m h i 和砌仃酶切后连 入同样双酶切的植物表达载体p c a m b i a 3 3 0 1 h 中，构建成除草剂( b a s t a ) 作为筛选标记的 植物过量表达载体p c a m b i a 3 3 0 1 h t h w l n l 。将过量表达载体导入农杆菌g v 3 1 0 1 ，p c r 鉴定挑选阳性克隆；花序浸染法进行盐芥的基因转化，目前己获得t o 代种子。 5 利用酵母双杂交系统研究与t h w i n l 转录因子相互作用的蛋白 大量法高质量提取盐芥花总r n a ，纯化m r n a ，构建盐芥c d n a 文库，以t h w i n l 为诱饵蛋白，利用酵母双杂交体系研究与t h w i n l 转录因子相互作用的蛋白。目前已纯化 了高质量的m r n a ，后续工作正在进行。 本论文主要创新点： 1 、首次从盐芥中克隆了t h w i n l 基因，并对核苷酸、氨基酸序列进行了分析。 2 、首次在盐芥中分析了t h w i n l 的组织特异性表达。 3 、首次在盐芥中构建了t h w i n l 的沉默载体和过量表达载体。 4 、构建盐芥c d n a 文库，利用酵母双杂交体系研究与t h w i n l 转录因子相互作用的蛋白。 关键词：盐芥t h w i n lr t - p c r 基因沉默 分类号：q 7 8 2 山东师范大学硕士学位论文 c l o n i n g o fw i n la n df u n c t i o n a lr e s e a r c ho fr n a i i nt h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l a a b s 仃a c t w a x e sf o r mac o n t i n u o u sl i p i dm e m b r a n c ec o v e r i n gt h ee p i d e r m a lc e l l so fa 1 1a e r i a lp l a n t o r g a n s i tm a i n l yc o m p r i s e do fl o n g - c h a i na l i p h a t i cc o m p o u n d sd e r i v e df r o mv e r yl o n gc h a i n f a t t ya c i d st h a ta r ee n l o n g e df r o mc 1 6o rc 1 8l o n gf a t t ya c i d sb ym a n yf a t t ya c i de l o n g m i o n ( f a e ) c o m p l e x s w a x e sa r em o s te v i d e n ti nt h ef o r mo fe p i c u t i c u l a rc r y s t a l st h a ta r ee x p o s e do nt h e s u r f a c eo fc e r t a i no r g a n sa n ds p e c i e s c u t i ni st h em a j o rc o m p o n e n to ft h ec u t i c l et h a to v e r l a y s t h ec e l lw a l l so fe p i d e r m a lc e l l sa n df o r m st h ep r o t e c t i v et i s s u eo np r i m a r ya e r i a lo r g a n s t h e c h e m i c a la n dp h y s i c a lp r o p e r t i e so fc u t i c u l a rw a x e si n d i c a t et h a tt h e yh a v ev i t a lf u n c t i o n sf o r p l a n tl i f e i n c l u d i n gt h er e g u l a t i o no fe p i d e r m a lp e r m e a b i l i t ya n dn o n s t o m a t a lw a t e rl o s sa n d p r o t e c t i o na g a i n s ti n s e c t s ，p a t h o g e n s ，u vl i g h ta n dt h ep r e v e n t i o no fp o s t g e n i t a lo r g a nf u s i o n a n d p o l l e n - p i s t i li n t e r a c t i o n s w er e p o r th e r et h ei s o l a t i o no fa ne t h y l e n er e s p o n s ef a c t o r ( e r f ) t y p et r a n s c r i p t i o nf a c t o r t h r o u g has y s t e m a t i cf u n c t i o n a lg e n o m i c sa p p r o a c hi na r a b i d o p s i st h a l i a n a t h et r a n s c r i p t i o n f a c t o r ，b e l o n g i n gt ot h ep l a n t - s p e c i f i cf a m i l yo fa p 2 e r e b pt r a n s c r i p t i o nf a c t o r s ，w a st e r m e d w 1 n 1 s h n l 翻t 1 9 1 5 3 6 0 ) ，f o rw a x i n d u c e r1 ，i t sh o m o l o g o u sg e n es h n 2 a n ds h n 3h a v eas i m i l a r f u n c t i o n a lr o l ei na r a b i d o p s i s i tc a na c t i v a t ew a xd e p o s i t i o n ，e n h a n c ed r o u g h tt o l e r a n c e ，a n d m o d u l a t ec u t i c u l a rp e r m e a b i l i t yi nw i n l s h n lo v e r e x p r e s s i n gp l a n t s a n dt h a tt h ew a x a c c u m u l a t i o np h e n o t y p ei sc o m p a n i e db ya ni n d u c t i o no fs e v e r a lw a xb i o s y n t h e s i sp a t h w a y g e n e s w n 1o v e r e x p r e s s i o ni n d u c e sc o m p o s i t i o n a lc h a n g e sa n da no v e r a l li n c r e a s ei nc u t i n p r o d u c t i o ni nv e g e t a t i v ea n dr e p r o d u c t i v eo r g a n s ，w h i l ei t sd o w n r e g u l a t i o nh a st h eo p p o s i t e e f f e c t t h en e ws a l tt o l e r a n c em o d e lp l a n tt h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l a , ac l o s er e l a t i v eo fa r a b i d o p s i s t h a l i a n a , h a v es i m i l a rh e r e d i t yc h a r a c t e r i s t i c sa n dg r o w t hh a b i t sw i t ha t h a l i a n a ：s m a l lg e n o m e ， s h o r tl i f ec y c l e ，s e l f - f e t i l i z a t i o n ，a b u n d a n c es e e d s ，a n dh a v es e v e r a lp r o m i n e n n c e st oa t h a l i a n a ： h i g h e rt o l e r a n c ea n dm o r ew a xa m o u n t s ，e t c a tt h ec d n as e q u e n c el e v e l ，zh a l o p h i l aa r e p r e d i c t e dt ob e9 0 t o9 5 i d e n t i c a lt oa t h a l i a n aa l lo ft h e s eh a v er e v e a l e dt h ep o t e n t i a lo f n e wg e n o m i c s - b a s e da p p r o a c h e sw i t hzh a l o p h i l at oi d e n t i f ya n dc l o n ev a l u a b l en e wg e n e s c o n f e r r i n gt r a i t sn o ta p p a r e n ti na t h a l i a n a ，e s p e c i a l l yt h eg e n e si n v o l v e di nt h eb i o s y n t h e s i so f p l a n te p i c u t i c u l a rw a x f o rf u r t h e rs t u d yt h ef u n c t i o no fw i n l ，w er e p o r t e dt h ec l o n i n go fw i n lh o m o l o gf r o m t h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l a ( t hw i n l ) ，a n l y s i n gt h ee x p r e s s i o np a t t e r na n di t s f u n c t i o n su s i n g d i f f e r e n te x p r e s s i o ns y s t e m s 山东师范大学硕士学位论文 t h er e s u l t sw e r es h o w na sf o l l o w s ： 1 。e d n ac l o n i n ga n ds e q u e n c ea n a l y s i so f t hw n 1 w eo b t a i n e dt h ef l o w e rt o t a lr n ai nt h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l aa c c o r d i n gt ot h et h ed e d u c e d a m i n oa c i ds e q u e n c e so fw i n1f r o mg e n e b a n k ，d e g e n e r a t ep c rp r i m e r sw e r ed e s i g n e d r e v e r s et r a n s c r i p t a s ef r t ) 一p c ra m p l i f i c a t i o na n d5 ：a n d3 r a c ea m p l i f i c a t i o nw e r eu s e dt o o b t a i nt h ef u l l 1 e n g t ht r a n s c r i p ts e q u e n c e so ft hw i n lt h et hw _ n 1e d n aw a s8 4 6n u c l e o t i d e s l o n gi n c l u d i n g5 7 9b po r ff o ra19 2a m i n oa c i d sp e p t i d e t h ed e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c e o ft h w i n lw a s8 4 i d e n t i c a lt oa t w i n1 2 e x p r e s s i o na n a l y s i so ft h w n 1 t o t a lr n aw a se x t r a c t e df r o ms e e d l i n g s ，l e a v e s ，r o o t s ，f l o w e r s ，s t e m s ，s i l i q u e s r t - p c r a n a l y s i ss h o w e d t h a tt h v e t n lw a sm a i n l ye x p r e s s e di nf l o w e r st i s s u e sa n dt oal e s s e re x t e n t ， i ns t e m sa n ds i l i q u e st i s s u e s t hw i n lt r a n s c r i p tw a sn o td e t a c t a b l ei nr o o t sa n dl e a v e sb yu s i n g o u ra p p r o a c h 。 3 p r e p a r a t i o no fg e n es i l e n c i n ge x p r e s s i o nc o n s t r u c t s t h et hw n 1 g e n ef r a g m e n to f 114b pw a sp c ra m p l i f i e df r o mf l o w e re d n aa n d c o n s t r u c t e di n t ot h e p l a n te x p r e s s i o n v e c t o r p c a m b i a 一3 3 0 1h ，t h e n t r a n s f e r r e di n t o a g r o b a c t e r i u mg v 3 10 1 ；u s i n gf l o r a ld i pm e t h o d ，t h ef l o w e ro ft h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l ah a v e b e e nt r a n s f o r m e d s c r e e n i n gt h et r a n s f o r m e ds e e d sb yu s i n gh e r b i c i d ef i n a l ea n dh a v eg o t t e n a b o u t14b a s t a r e s i s t a n c ep l a n t so ft h eg e n es i l e n c eo ft hw n 1 t1t r a n s f o r m a n t sw e r e o b t a i n e d 4 p r e p a r a t i o no fg e n eo v e r e x p r e s s i o nc o n s t r u c t s t h ef u l l l e n g t h o ft hw i n io r fw a sc o n s t r u c t e di n t ot h ep l a n te x p r e s s i o nv e c t o r p c a m b i a - 3 3 0 1h a n dt r a n s f o r m e di n t oa g r o b a c t e r i u mg v 310 1 u s i n gf l o r a ld i pm e t h o d ，t h e f l o w e ro ft h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l ah a v eb e e nt r a n s f o r m e d s c r e e n i n gt h et r a n s f o r m e ds e e d sb y u s i n gh e r b i c i d e ，t ot r a n s f o r m a n t sw e r eo b t a i n e d 5 s t u d i e dt h ep r o t e i ni n t e r a c t i o nw i t ht h w i n lt r a n s c r i p t i o nf a c t o ru s i n g y e a s tt w o - h y b r i d s y s t e m a l a r g en u m b e ro fh i g h q u a l i t yt o t a lr n a w a se x t r a c t e d ，m r n aw a sp u r i f i c a t e d ，e d n a l i b r a r yw a sc o n s t r u c t e di nt h et h a l o p h i l a t h w i n i t r a n s c r i p t i o nf a c t o ra sb a i tp r o t e i n ，t h e p r o t e i ni n t e r a c t i o nw i t ht h w l n lt r a n s c r i p t i o nf a c t o ru s i n g y e a s tt w o - h y b r i ds y s t e mw a ss t u d i e d 4 t h em a i ni n n o v a t i o np o i n t so ft h i ss t u d yw e r eg e n e r a l i z e da sf o l l o w s ： 1 i tw a st h ef i r s tt i m et oc l o n et h e t h w i n lg e n ef r o mh a l o p h y t et h a l o p h i l a 2 f o rt h ef i r s tt i m et oa n a l y s i st i s s u e s p e c i f i ce x p r e s s i o no ft h w i n li nt h et h a l o p h i l a 山东师范大学硕士学位论文 3 i tw a st h ef i r s tt i m et oc o n s t r u c tt h et r a n s g e n i ct h a l o p h i l ap l a n t so v e r e x p r e s s i n ga n d s i l e n c i n gt h w i n lw e r eg e n e r a t e d 4 s t u d i e dt h ep r o t e i ni n t e r a c t i o nw i t ht h w i n1t r a n s c r i p t i o nf a c t o ru s i n gy e a s tt w o - h y b r i d s y s t e m k e yw o r d s ：t h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l a t hw i n lr e v e r s et r a n s c f i p t a s e ( r t ) 一p c r g e n es i l e n c i n g 5 山东师范大学硕士学位论文 英文缩略表 6 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如没有其他需要特别声 明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对 本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：耋猿电 刷程毛刁易声 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权上 盈可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：套乞、莲 签字日期：2 0 07 年占月t o 日签字日期： 7 年占月 日 导师答字：呷刀尹 签字日期：2 0 07 年石月矽日 山东师范大学硕士学位论文 第一部分文献综述 干旱、高盐、低温和氧化胁迫等非生物胁迫，严重威胁农作物的生长，是造成全世界 范围内粮食大量减产的首要因素。据统计，每年因为非生物胁迫因素所造成的粮食损失多 达5 0 t 1 ，2 1 。 在植物的生活史中，如何阻止植物体内可利用水的减少是植物能否在胁迫中生存下来 的关键因素3 一，植物表面的角质膜和蜡质可以减少非气孔性失水【5 1 。许多植物的蜡质缺失 突变体( 如拟南芥的c e r 突变体) 都表现出了对环境中水分含量的敏感性【5 】，这些说明表皮蜡 质在植物的耐早反应机制中起重要作用。近年来的研究表明，植物感受外界干旱、高盐、 激素、病害及体内细胞发育信号，通过一系列传递激发转录因子即反式作用因子。反式作 用因子与顺式作用元件相结合后，激活r n a 聚合酶i i 转录复合物，从而启动基因的转录 表达，最后通过基因产物的作用对外界信号在生理生化等方面做出适合的调节反应。由此 可见，转录因子在基因的表达调控中起关键作用。 本文主要介绍一些主要的转录因子，表皮细胞蜡质合成途径的研究进展，以及与蜡质 合成相关基因的研究。 一、转录因子的研究 1 转录因子的概念 基因转录有正调控和负调控之分。负调控机制是当一种阻遏蛋白( r e p r e s s o r p r o t e i n ) 结合在受调控的基因上时，基因不表达；而从靶基因上去除阻遏蛋白后，r n a 聚合酶识别受调控基因的启动子，使基因得以表达，这是正调控。这种阻遏蛋白是反 式作用因子。 转录因子( t r a n s c r i p t i o nf a c t o r ) 是起正调控作用的反式作用因子。是一群与启动子区 域中的顺式作用元件发生特异性结合，从而保证目的基因以特定的强度、在特定的时间与 空间表达的蛋白分子。当环境条件变化时，植物通过一系列信号传递并激发转录因子。转 录因子与相应的顺式作用元件结合后，激活r n a 聚合酶i i 转录复合物，从而启动特定基 因的转录表达，最后通过基因产物的作用对内、外界信号作出调节反应。植物许多基因的 表达都是由特定的转录因子与特定的瞬时作用元件相互作用调控的。 2 转录因子的结构和分类 7 山东师范大学硕士学位论文 对转录因子蛋白质结构分析表明，转录因子一般有4 个功能区即：d n a 结合区( d n a b i n d i n gd o m a i n ) 、转录调控l 叉 ( t r a n s c r i p t i o nr e g u l a t i o nd o m a i n ) 、寡聚化位点( o l i g o m e r i z a t i o n s i t e ) 以及核定位信号( n u c l e a rl o c a t i o ns i n g a l ，n l s ) 。d n a 结合区域是指转录因子识别d n a 顺式作用元件，并与之结合的一段氨基酸序列；核定位区是转录因子中富含碱性氨基酸的 结构域，该段控制转录因子进入细胞核；寡聚化位点是不同转录因子借以相互作用的功能 区，他们的氨基酸序列很保守，大多与d n a 结合区相连并结合成一定的构象。转录因子 的这些功能区决定转录因子的功能、特性、核定位和调控作用。真核生物基因在无转录 因子时处于不表达状态，r n a 聚合酶自身无法启动基因转录，只有当转录因子( 蛋白 质) 结合在其识别的d n a 序列上后，基因才开始表达。 目前，从高等植物中分离出的转录因子，根据它们保守d n a 结合区的不同可分为： m y b ，a p 2 e r e b p ，m a d s ，m y c ，h d ，c 2 h 2 ( z n ) ，b z i p ，a t - h o o km o t i f , t r i h e l i x ，h m g - b o x ， b 3 ，a b f 。 3 植物转录因子的抗逆性研究 近几年的研究发现，转录因子在植物防卫反应和逆境胁迫应答过程中的应用越来越广 泛8 1 。在逆境条件下，一些与逆境相关的转录因子能调节功能基因的表达和信号转导， 他们在转基因植物中的过量表达会激活许多抗逆功能基因同时表达，从而通过转化调节基 因来提高植物的耐逆性。与植物逆境抗性相关的4 个转录因子家族包括：b z i p 类、w r k y 类、a p 2 e r e b p 类和m y b 类，它们在逆境信号转导中的作用以及目前对它们在植物抗逆 基因工程改良中的研究热，揭示了这一类功能蛋白在植物抗逆中的潜在作用。 4 含有a p 2 结构域转录因子的研究【1 9 】 含有a p 2 结构域的转录因子最初发现于高等植物中【2 0 1 ，在高等植物中存在有几百个， 但在高等动物中并不存在。开花植物中大概有几百个含a p 2 结构域的转录因子，大致可分 为四类亚家族：a p 2 类、e r e b p 类、d r e b 2 类和r a v 类亚家族。 a p 2 转录因子家族成员的主要特征是含有由6 0 到7 0 个左右的氨基酸组成的高度保守 的、具有三个d 折叠结构的d n a 结合区，称作a p 2 结构域( a p 2d o m a i n ) 。在a p 2 结构域 中有两个保守区段，一个是碱性的y r g 区( y r ge l e m e n t ) ，由保守的1 9 2 2 个氨基酸组成， y r g 区高度保守，参与与d n a 的结合；另一个保守区是r a y d 区( r a y de l e m e n t ) ，由4 2 _ 4 3 个氨基酸组成，核心结构是一个由1 8 个氨基酸组成的高度保守的双亲性的a 螺旋结构【1 6 1 ， r a y d 元件可能参与蛋白与蛋白之间的相互作用。在y r g 和r a y d 保守区中，有几个氨 基酸残基是极度保守的，比如r a y d 保守区中第4 0 个氨基酸甘氨酸，存在于所有的a p 2 8 山东师范大学硕士学位论文 蛋白中，对于a p 2 蛋白发挥其生理功能起重要作用【1 6 】。序列分析显示，a p 2 蛋白至少含有 一个a p 2 结构域，其它氨基酸序列则高度不同。 二、植物蜡质的研究【1 6 】 1 植物蜡质组成和功能 陆生植物气生器官的表面覆盖着一层由蜡质和角质形成的脂膜【2 l 】。植物表皮蜡质是对 植物地上部分最外层不溶解于水而溶解于有机溶剂( 氯仿等) 的一类有机混合物的总称，是 植物抵抗外界环境刺激的第一道屏障，在植物生长发育过程中起重要作用。花粉、种子的 外被以及雌蕊的柱头上都有蜡质存在口2 二3 1 ，另外在受伤的组织和木栓的基质中也含有蜡质 成分【2 4 】。不同物种的蜡质含量、成分和形态结构都有差异，同一植株不同组织器官、不同 生长时期的蜡质分布和表达也会有所不同，环境因素也会使植物蜡质含量和成分发生改 变，诱导特异蜡质成分的生成【2 5 1 。目前，已用质谱气相色谱技术测定了许多物种的表皮蜡 质成分，总共鉴定出了1 0 0 多种组分，主要由特长链饱和脂肪酸( v e r yl o n gc h a i nf a t t ya c i d s n l c f a s ) 的衍生物如烃( a l k a n e s ) 、醛( a l d e h y d e s ) 、酮( k e t o n e s ) 、一级醇( p r i m a r ya l c o h o l s ) 、 酯( e s t e r s ) 、二级醇( s e c o n d a r ya l c o h o l s ) 等组成【2 1 】。碳链长度一般在1 8 3 6 个碳原子之间，最 少的仅为1 2 个碳原子，而蜡质酯类的碳链较长，有的甚至达到6 0 个碳原子。环状化合物 和甾醇类等有机物在植物表皮蜡质中比较少见，但在某些植物中是表皮蜡质的主要成分 【垌。这些蜡质成分分泌到植物器官表面后分为内外两层，内层位于表皮的基质内称为表皮 内蜡质；外层位于表皮外侧称为表皮外蜡质。表皮外蜡质可在表皮上形成不同形状的蜡质 晶体结构【2 1 】，柱状最多，还有棒状、管状、垂直板状、树枝状、伞状等。 植物表皮蜡质的化学组成及晶体结构如此复杂，决定了它在植物的生活过程中起着十 分重要的作用。除了防止非气孔性失水外，现已经证明表皮蜡质能为植物提供其它多方面 的保护【2 7 之9 】：( 1 ) 蜡质晶体可以反射紫外线，防止过量紫外线对植物的伤害【2 9 】：( 2 ) 防止机 械损伤；( 3 ) 防止低温冻伤；( 4 ) 抵抗植物病毒的侵害【3 0 】；( 5 ) 防止食草昆虫的伤掣3 1 】；( 6 ) 花粉表面的蜡质参与花粉与柱头之间的信号识别【2 3 翊，与植物的育性有关；( 7 ) 使水分不 能在植物表面过多的停留，防止水溶性有害物质在植物表面的沉积【3 3 】。 2 蜡质的合成途径 蜡质合成是在植物表皮细胞中进行的【3 4 1 ，这是一个在不同的细胞器中、由多个酶参与 的复杂过程。用同位素示踪和气相色谱质谱等技术，已经基本阐明了几个物种中表皮蜡质 合成的生物化学通路【2 。催化蜡质合成的酶大多都是膜结合蛋白，而且多数以多酶复合物 的形式存在，传统的方法很难分离纯化，再加上酶的底物( 长链的脂类物质) 不溶于水，不 山东师范大学硕士学位论文 易制成酶反应缓冲液，使得对蜡质合成途径中的酶的研究很难深入【3 5 】。目前应用遗传学和 分子生物学的方法对拟南芥及和拟南芥亲缘关系比较近的野甘蓝( b r a s s i c ao l e r a c e a e ) 进行 植物表皮蜡质合成及分泌相关基因的功能研究【3 6 1 ，对于阐明这一过程有很大的帮助。现在 普遍认为拟南芥和大多数植物表皮蜡质的合成是通过下列途径完成的。 2 1 脂酰链的合成途径 表皮细胞中的特长链饱和脂肪酸( v e r yl o n gc h a i nf a t t ya c i d ，v l c f a ) 是合成表皮蜡质的 直接前体，合成v l c f a 是个复杂的过程，需要在不同的细胞区域分两步完成【2 1 】： 第一步是c 1 6 或c 1 8 脂酰链的从头合成，这一过程与植物体内脂肪酸的合成途径相同， 在表皮细胞基质的质体中由可溶性的脂肪酸合成酶复合物( f a t t ya c i ds y n t h a s ec o m p l e x ，f a s l 催化完成的【3 6 ，3 7 1 ，合成的c 1 6 或c 1 8 酰基s a c p 由酰基a c p 硫酯酶( a c y l a c pt h i o e s t e r a s e ) 催化裂解酰基载体蛋i 刍( a c p ) ，释放游离的c 1 6 或c 1 8 饱和脂肪酸网。在质体中有三种不同 形式的脂肪酸合成酶复合体，它们是合成c 1 8 脂肪酸所必需的，它们对脂酰基链的长度有 一定的特异性，如k a s i i i 能合成c 2 c 4 链长的脂肪酸【3 9 】、k a si 能合成c 4 c 1 6 链长的脂肪 酸以及k a si i 能合成c 1 6 - c 1 8 链长的脂肪酸。 第二步是把c 1 6 或c 1 8 脂肪酸延伸成特长链脂肪酸( v l c f a ) 用来作为蜡质的直接前体物 质。这个过程是通过质体外和膜结合的多酶复合体完成的，该多酶复合体称为脂肪酸延伸 酶( f a t t ya c i de l o n g a s ef a e ) 【4 1 1 。由于蜡质组成成分的碳链主要集中在2 0 一3 4 个碳原子之间， 因此此步需要进行多次反应才能达到相应的链长。拟南芥和其它植物的突变体的研究提供 了许多证据证明许多脂肪酸延伸酶参与了特长链脂肪酸的延伸过程，单个基因的失活主要 影响单一的延伸步骤【4 2 - 4 4 。最新研究认为地进行c 1 6 或c 1 8 脂肪酸延伸成特长链脂肪酸 ( v l c f a ) 有三个关键酶：k c s ( i k e t o a c y l - c o as y n t h a s e ) 、k c r ( t h e1 3 - k e t oa c y l - c o ar e d u c t a s e ) $ f l lc e r ( t h ee n o y l c o ar e d u c t a s e ) 4 5 1 。 2 2 蜡质组成成分的合成途径 脂肪酸延伸酶产生的特长链脂肪酸作为蜡质的直接前体通过四条基本途径合成蜡质 的组成成分： 1 ) 饱和脂肪酸的产生【4 3 】：脂肪酸延伸酶产生的不同链长的特长链脂酰辅酶a 由酰基 辅酶a 硫酯酶( a c y l c o at h i o e s t e r a s e ) 去掉辅酶a 产生游离的特长链的饱和脂肪酸。 2 ) 酰基还原途型蛔：此过程包括两步不同的反应：由依赖于n a d h 的酰基辅酶a 还原酶( n a d h - d e p e n d e n ta c y l - c o ar e d u c t a s e ) 催化特长链脂肪酸生成醛；生成的醛依赖于 n a d p h 的醛还原酶( n a d p h d e p e n d e n ta l d e h y d er e d u c t a s e ) 催化生成一级醇。在此过程中即 1 0 山东师范大学硕士学位论文 使一级醇的产生经过个醛的中间过程，醛在酶的复合物中也不会被释放出来，而是直接 进行下一步反剧删。 3 ) 蜡酯的形成【2 4 】：酰基还原途径中产生的一级醇和饱和脂肪酸缩合形成蜡酯，此反应 由蜡质合成酶( w a xs y n t h a s e ，w s ) 催化。通过生化方法研究了植物蜡质合成酶的活性，发 现它是一个膜结合蛋白，但对其蛋白的组成和编码这些蛋白的基因并不清楚【4 7 1 。在拟南芥 中发现了该基因的1 2 个同源序列，这些序列编码的基因一部分在拟南芥的花序轴和种子 中有着不同的表达水平，另外有几个基因是拟南芥茎蜡质合成所必需的【4 7 】，因此可以推测 这些基因编码的蜡质合成酶参与了花粉外被蜡质、种子贮藏脂质和茎杆蜡质的合成。 4 ) 脱羰途径：此途径是从特长链脂肪酸被还原成醛开始的，催化此反应的酶是膜结合 的脂酰辅酶a 还原酶( f a r ) ，还原成的醛直接由醛脱羰酶( a l d e h y d ed e c a r b o n y l a s e ) 催化进行 脱羰生成奇数碳原子的脂肪烃，并释放一氧化碳【4 8 】。在拟南芥的茎中，脱羰途径产生的蜡 质成分占其蜡质总量的9 0 以上【2 5 , 3 8 ，其中脂肪烃是拟南芥茎中蜡质的主要成分，该合成 途径关键步骤的受阻将会导致拟南芥茎中蜡质总量明显下降，因此这样的突变体很容易鉴 定出来。脱羰反应生成的脂肪烃经羟化反应生成二级醇，二级醇经过醇氧化酶催化生成酮。 3 与蜡质合成有关的基因【4 9 】 迄今为止，有9 个与蜡质分布相关的基因已经从拟南芥和玉米中分离出来，其中三个 为调节基因( c e r 2 、c e r 3 、g l l 5 ) ；四个编码酶( c e r 6 0 、c e r 6 、k c s l 、g l 8 ) ；另外两个 可能与蜡质转运有关( c e r l 、g l l ) t 3 8 】。第一个从拟南芥和玉米中克隆出的蜡质合成基因分 别是c e r 2 和g l 2 ，它们编码有同源结构的蛋白，