（微生物学专业论文）kdr酪氨酸激酶的表达及其抑制剂筛选模型的建立.pdf

摘要 摘要 jiiii l i l ll l l l l l l j i iii x l llljlll1n ll 1 18 8 9 3 91 血管内皮生长因子受体2 ( f l k 1 i c d r ) 胞内酪氨酸激酶段具有较强的磷酸化活性，成 为血管内皮生长因子( v e g f ) 介导新生血管形成的重要特异性受体。新生血管的形成对恶 性肿瘤的生长是必不可少的因素，因而以k d r 酪氨酸激酶为靶点迸行药物设计和筛选已 成为抗肿瘤血管生成的重要方略。 本研究主要目的是在原核体系中表达k d r 酪氨酸激酶，并进行纯化，在此基础上以 纯化的重组蛋白为靶位，采用免疫学方法建立k d r 酪氨酸激酶抑制剂筛选模型并进行初 步应用。首先，以p q e 3 0 为载体，在e c o l im 1 5 中成功表达了k d r 酪氨酸激酶。研究结 果表明，可溶性重组蛋白的最适诱导表达条件为诱导温度2 2 c ，诱导时间3 h ，i p t g 浓度 为0 5 m m o l l 。采用n i - n t a 亲和层析对其进行了纯化，其纯度和浓度均达到了实验要求。 s d s p a g e 分析表明重组蛋白分子量约为3 6 k d a ，与预计的一致。w e s t e r nb l o t 鉴定分析 结果表明它与抗f l k - 1 和抗h i s 抗体均发生特异反应，说明该重组蛋白为k d r 酪氨酸激酶。 w e s t e r nb l o t 进- - 步分析表明本研究表达的k d r 酪氨酸激酶具有自磷酸化活性。以纯化 的k d r 酪氨酸激酶为靶位，采用酶免方法及光激化学发光技术建立药物筛选模型，并对 其反应条件进行优化。在此基础上选取文献已报道的k d r 酪氨酸激酶抑制剂s u l 12 4 8 和 p t k 7 8 7 作为对照，验证了所建立的药物筛选模型的可行性。同时对两种不同方法建立 的药物筛选模型进行反应动力学及相关性的比较，结果表明两种方法相关性较好，但采 用a l p h a s c r e e n 方法建立的模型采用均相反应系统，反应速度较快、免洗、误差小等，更 适用于高通量药物筛选的应用。最后选取具有抗肿瘤活性并由本实验室合成的某含钴元 素的化合物对a l p h a s c r e e n 方法建立的模型进行应用，结果表明该化合物对k d r 酪氨酸激 酶抑制作用良好。 关键词：可溶性k d r 酪氨酸激酶；表达；药物筛选；模型建立 a b s t r a e t a b s t r a c t f l k 一1 k d ri st h em o s ti m p o r t a n ts p e c i f i cr e c e p t o ro fv a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r , w h i c hc a nm e d i a t eb i o l o g i c a lf u n c t i o n sa n de f f e c t so fv a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l lp r o l i f e r a t i o n 1 1 l ef o r m a t i o no fn e wv a s c u l a ri st h ee s s e n t i a lf a c t o ro fm a l i g n a n tt u m o rg r o w t h , s ou s i n g k d r t y r o s i n ek i n a s ea sat a r g e tf o rd r u gd e s i g na n ds c r e e n i n gh a sb e c o m ea l li m p o r t a n t s t r a t e g yo f a n t i - t u t o r 1 1 1 em a i no b j e c t i v eo ft h i ss t u d yi st oe s t a b l i s hah i g h t h r o u g h p u ts c r e e n i n gm o d e lf o r i n h i b i t o r so fk d rt y r o s i n ek i n 雒ew i t hp u r i f i e dk d rt y r o s i n ek i n a s ef r o mr e e o m b i n e dec o l i t h ek d rt y r o s i n ek i n a s ew a se x p r e s s e di nec o l im15b yp l a s m i dp q e 3 0a sv e c t o r t h e s o l u b l ee x p r e s s i o nl e v e lo fk d r t y r o s i n ek i n a s ec o u l db ep r o m o t e dw h e nc e l l sw e r ec u l t u r e d a t2 2 f o r3 ht oi n d u c ew i t hi p t go f0 5 m m o l l t h er e c o m b i n a n tp r o t e i nw a sp u r i f i e dw i t h a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y ( n i - n t a ) ，t h ep u r i t ya n dc o n c e n t r a t i o no fr e c o m b i n a n tp r o t e i nh a d r e a c h e de x p e r i m e n t a lr e q u i r e m e n t s s d s p a g ea n a l y s i ss h o w e dt h a tt h em o l e c u l a rm a s so f e x p r e s s e dk d rt y r o s i n ek i n a s ew a sa b o u t3 6 k d aa se x p e c t e d w r e s t e r nb l o ta n a l y s i si n d i c a t e d t h a tt h er e c o m b i n a n tp r o t e i nc o u l dr e a c ts p e c i f i c a l l ya g a i n s tb o t ha n t i f l k - 1a n da n t i h i s a n t i b o d y f u t u r ea n a l y s i ss h o w e dt h a tt h er e c o m b i n a n tp r o t e i nh a da u t o p h o s p h o r y l a t i o n a c t i v i t y u s i n gt h el rt y r o s i n ek i n a s ea st a r e 吒t h es c r e e n i n gm o d e l sf o re n z y m a t i c i n h i b i t o r sw e r ec o n s t r u c t e db ye l i s aa n da l p h a s c r e c n s u l12 4 8a n dp t k 7 8 7 t h ek n o w n k d r t y r o s i n ek i n a s ei n h i b i t o r , w e r eu s e da st h ep o s i t i v ec o n t r 0 1 ，n l er e s u l t sd e m o n s t r a t e d t h a tt w om o d e l sb o t he f f e c t i v e l yi d e n t i f i e dk n o w nk d r t y r o s i n ek i n a s ei n h i b i t o r s n ea s s a y c o n d i t i o n so ft w om e t h o d sw e r eo p t i m i z e da n dt h e yw e r ec o m p a r e dw i t hr e s p e c tt ok i n e t i c s a n dc o r r e l a t i o n 。刃砖d a t as h o w e dt h a tt h et w om o d e l sh a ds i g n i f i c a n tc o r r e l a t i o n , b u t a l p h a s c r e e nw a ss h o r tt i m ec o n s u m i n g f i n a l l y ，ac o b a l t - c o n t a i n e dc o m p o u n dw h i c hh a d a n t i - t u m o ra c t i v i t yw a ss e l e c t e dt ot e s tt h em o d e la n df o u n dt h a tt h ec o m p o u n d sc o u l di n h i b i t k d r t y r o s i n ek i n a s ee f f e c t i v e l y k e y w o r d s ：s o l u b l ek d rt y r o s i n ek i n a s e ；e x p r e s s i o n ；d r u gs c r e e n i n g ；m o d e le s t a b l i s h i n g i i 目录 目录 摘要i a b s t r a c t i i 第一章绪论1 1 1 受体酪氨酸激酶家族的结构及分类1 1 2k d r 酪氨酸激酶简介2 1 2 1k d r 结构及功能2 1 2 2k d r 酪氨酸激酶信号传导机制3 1 3 酪氨酸激酶抑制剂研究进展5 1 3 1 酪氨酸激酶抑制剂发展中的里程碑g l e e v e gt m 5 1 3 2 靶向k d r 酪氨酸激酶的抑制剂6 1 4 建立药物筛选模型的免疫学方法一7 1 4 1r i a 和e l i s a 7 1 4 2a l p h a s e r e e n 8 1 5 本课题的立题目的、意义和研究内容8 1 5 1 目的和意义9 1 5 2 研究内容9 第二章材料与方法1 1 2 1 实验材料与仪器。1 1 2 1 1 主要试剂1 1 2 1 2 实验使用溶液1 1 2 1 3 主要仪器设备1 2 2 2 实验方法1 2 2 2 1k d r 酪氨酸激酶基因在e c o l im 1 5 中的克隆表达1 2 2 2 2 可溶性重组蛋白诱导表达条件的初步优化1 4 2 2 3 重组蛋白提取、纯化及鉴定1 4 2 2 4e l i s a 方法建立k d r 高通量药物筛选模型及验证l5 2 2 5a l p h a s c r e e n 方法建立k d r 高通量药物筛选模型及验证。17 2 2 6 方法学的比较1 9 2 2 7 采用a l p h a s c r e e n 方法建立筛选模型的初步应用2 0 第三章结果与讨论2 3 3 1k d r 酪氨酸激酶基因在e c o l im 1 5 中的克隆表达2 3 3 1 1 目的基因片段t k 的p c r 扩增2 3 3 1 2 重组质粒p q e 3 0 t k 的构建及酶切鉴定2 3 3 1 3 重组质粒测序结果。2 4 3 1 4 重组质粒诱导表达2 4 目录 3 2 可溶性重组蛋白诱导表达条件的初步优化2 4 3 2 1 诱导表达时间的初步优化2 4 3 2 - 2 诱导表达温度的初步优化2 5 3 2 - 3 诱导表达i p t g 浓度的初步优化2 5 3 3 重组蛋白提取、纯化及鉴定2 6 3 3 1 细胞破碎条件的初步优化。2 6 3 3 2 重组蛋白纯化。2 7 3 3 3 纯化重组蛋白定量2 7 3 3 4 重组蛋白w e s t e r nb l o t 鉴定。2 7 3 3 5 重组蛋白自磷酸化活性2 8 3 4e l i s a 方法建立k d r 高通量药物筛选模型及验证一2 8 3 4 1e l i s a 方法建立药物筛选模型2 8 3 4 2 反应底物浓度的优化2 9 3 4 3 小鼠磷酸化酪氨酸的单克隆抗体p y 9 9 工作浓度的选择3 0 3 4 4 离子缓冲液浓度的优化。3 0 3 4 5e l i s a 方法建立的药物筛选模型验证31 3 5a l p h a s c r e e n 方法建立k d r 高通量药物筛选模型及验证31 3 5 1a l p h a s c r e e n 方法建立药物筛选模型。：3 1 3 5 2 反应底物p o l y ( g l u , t y r ) 4 。l 一发光微粒工作浓度的选择3 2 3 5 3 小鼠磷酸化酪氨酸的单克隆抗体p y 9 9 工作浓度的选择。3 2 3 5 4a t p 及缓冲液离子强度的优化3 3 3 5 5a l p h a s c r e e n 方法建立的药物筛选模型的验证：3 4 3 6 方法学的比较3 4 3 6 1 方法学反应条件的优化3 4 3 6 2 反应动力学比较。3 5 3 6 3 相关性比较3 5 第一章绪论 第一章绪论 血管内皮生长因子受体2 ( f l k - 1 k d r ，f e t a ll i v e rk i n a s e 1 k i n a s ei n s e r td o m a i n - c o t a i n - i n gr e c e p t o r ，又称v e g f r - 2 ) 属于受体型酪氨酸激酶家族中的一员，与肿瘤的发生、发 展及转移有着密切的关系1 1 1 。 肿瘤，作为威胁人类健康的重大疾病之一，其如何治疗一直受到全世界医学研究者 的密切关注。最先采用的方法是传统的化学药物治疗，其作用机理是非特异性地阻断细 胞分裂从而引起细胞死亡，但是同时也破坏了人体正常细胞，并且许多细胞毒性药物治 疗范围有限，很容易引起治疗相关的不良反应，因此靶向于特异性通路的药物治疗逐渐 受到关注。近年来，肿瘤的治疗已逐渐从传统的化学药物治疗转向靶向于特异性通路的 药物治疗，同时抗肿瘤药物的开发也随之发生改变，逐渐转向根据作用机制，靶向于特 异细胞功能异常的药物开发【l j 。 随着对肿瘤病灶部位分子水平研究的深入，发现了许多新的治疗靶点，k d r 酪氨 酸激酶抑制剂( r i x i s ，r e c e p t o rt y r o s i n ek i n a s ei n h i b i t o r s ) 就是这种发现的成果之一，它对 肿瘤的治疗提供了新的希望，为开发新型的抗肿瘤药物提供了可能 2 2 】。因此，建立针对 k d r 酪氨酸激酶为靶点的高通量药物筛选模型具有重要的意义。 目前，国外的c e l ls i g n a l i n g 公司在药物筛选试剂盒领域具有垄断地位，k d r 酪氨 酸激酶抑制剂的药物筛选试剂盒也是它的产品之一，由于其具有垄断地位，因此价格昂 贵，大大提高了药物筛选方面的成本。而国内具有巨大的化合物资源库，对于价格低廉 且快速高效的高通量药物筛查试剂盒有着巨大的需求。针对这种情况，计划建立以k d r 酪氨酸激酶为靶点的高通量药物筛选模型，并研制具有我国自主知识产权的快速检测试 剂盒。 1 1 受体酪氨酸激酶家族的结构及分类 受体酪氨酸激酶( r 1 隈，r e c e p t o rt y r o s i n ek i n a s e ) 家族是一类具有内源性蛋白酪氨酸激 酶( p t k ，p r o t e i nt y r o s i n ek i n a s e ) 活性的细胞表面受体，主要参与调控细胞的生长与分化， 存在于所有的多细胞动物中，与人类的肿瘤疾病的发生、发展有着极为密切的关系【4 5 1 。 通过对r t k 的c d n a 序列的研究表明，它们的氨基酸序列都表现出高度的保守性，其a t p 结合部位氨基酸序列的同源性很高，通过对受体结构域的比较分析表明，其分子具有相 似的拓扑结构，均分为胞外段、跨膜段和胞内段三部分，其中胞外段主要与配体结合， 呈现配体特异性，胞内段含有酪氨酸激酶活性中，l , t 6 。研究还发现胞内的酪氨酸激酶结 构域具有较高的同源性，它们的主要差异在于胞外配体结合区【7 1 。 目前研究者们将该家族分成2 0 多个不同的亚类，其主要依据是胞外配体结合区单位 结构【8 】，见图1 1 。以表皮生长因子受体( e g f r ，e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o rr e c e p t o r ) 为代表 的r t k 属于第一亚类，这一亚类的胞外段具有2 个半胱氨酸丰富区，可以结合具有激动 功能的多种配体 9 1 。第二亚类包括胰岛素样生长因子1 口g f 1 ) 受体、胰岛素受体等，这 一亚类的r t k 是由a 和d 两个亚基通过二硫键连接而成，形成1 个具有p a a p 结构的异源 江南大学硕士学位论文 四聚体。其中q 亚基中包含1 个半胱氨酸丰富区，具有配体结合位点，而p 亚基则提供了 跨膜区和胞内的酪氨酸激酶区【l o l 。血管内皮生长因子受体( v e g f r ，v a s c u l a re n d o t h e l i a l g r o w t hf a c t o rr e c e p t o r ) 属于第三亚类的r t x ，这一亚类的r n ( 胞外段又分为7 个结构区， 而在胞内酪氨酸激酶区则含有一段亲水插入序列【1 1 j 2 】。近年来，血管内皮生长因子受体 酪氨酸激酶逐渐成为研究课题中有吸引力的研究对象【1 3 】。 图1 - 1 受体酪氨酸激酶家族【1 4 1 f i g 1 1t h ef a m i l yo f t y r o s i n ek i n a s er e c e p t o r 1 2k d r 酪氨酸激酶简介 1 2 1k d r 结构及功能 人体肿瘤多为实体瘤，在肿瘤在发生和发展过程中需要获取营养物质和排泄代谢产 物，生长前期主要是通过周围组织的弥散作用获取营养物质，因此肿瘤的生长比较缓慢， 到后期肿瘤病灶内出现新生血管，新生血管为肿瘤提供了丰富的营养物质，加速了肿瘤 的生长并发生快速转移。因此，肿瘤的生长、侵袭、转移及演进过程中血管的生成起着 非常重要的作用。其中血管内皮生长因子c q e g f ) 是血管内皮细胞特异的有丝分裂原，直 接参与血管形成，促进内皮细胞分裂增殖，促进新生血管的形成，同时还能有效提高血 管的通透性【1 5 j 8 】。v e g f 的这些生物学功能是通过和其特异性受体结合来发挥作用的 1 1 9 。与v e g f 结合的酪氨酸激酶受体主要有v e g f r - i ( f l t - 1 ，f m s 1 i k et y r o s y lk i r l 雏e 1 ) 和v e g f r - 2 ( f l k - 1 k d r ，f e t a ll i v e rk i n a s e - 1 k i n a s ei n s e r td o m a i n - c o n t a i n i n gr e c e p t o r ) 。 它们都是糖基化的跨膜受体，均直接参与了v e g f 胞内的信号传导【2 0 】。研究表明， v e g f r - 1 是v e g f 的高亲和性受体，k d 为1 0 2 0 p m o l l ，存在于造血干细胞、血管内 皮细胞、巨噬细胞和单核细胞表面，可以介导内皮细胞中组织因子的产生，以及v e g f 刺激的单核细胞和巨噬细胞的游走，而k d r 与v e g f 结合能力较弱，k d 为 2 7 5 1 2 5 p m o l l ，但在调节内皮细胞增殖中最为重要，具有很强的磷酸化活性，同时起到 增加血管通透性，促进新生血管形成等的作用，是内皮细胞v e g f 信号传导的主要执行 者，主要存在于淋巴管内皮细胞和血管内皮细胞表面1 2 1 j 2 1 。当k d r 与v e g f 结合，v e g f 可以强烈诱导k d r 酪氨酸自动磷酸化，使内皮细胞增殖，而v e g f r - 1 却没有显现出 v e g f 诱导的酪氨酸磷酸化作用，也不直接参与内皮细胞的有丝分裂。 k d r 相对分子质量为1 9 万，基因全长5 8 2 1 b p ，编码基因定位于染色体4 q 1 2 ，编码区 为4 0 6 8 b p ，编碉j 1 3 5 6 个氨基酸1 2 3 , 2 4 1 。它由三部分分别为7 个类i g 结构域组成的胞外区，一 个跨膜结构区和胞质内酪氨酸激酶结构区组成。k d r 胞内区有5 6 5 个氨基酸组成，可分 为激酶功能区、6 8 个氨基酸的酪氨酸激酶插入区和c 末端。通过对蛋白分子结构的研究 表明，k d r 与v e g f r - 1 结构组成相似，但两者还是存在差异，其中蛋白氨基酸序列同源 性为4 3 2 ，胞外区同源性为3 3 3 ，胞质内酪氨酸激酶结构区同源性为5 4 6 ，激酶区 域同源性达到7 0 1 ，但是胞质内c 末端同源性仅为2 8 1 ，见图1 - 2 。在k d r 酪氨酸激酶 催化域有6 个自磷酸化位点：t y r 9 5 1 ，t y r 9 9 6 ，t y r l 0 5 4 ，t y r l 0 5 9 ，t y r l1 7 5 ，t y r l 2 1 4 ， 其中1 0 5 4 和1 0 5 9 两个残基位于酪氨酸激酶区域的活性环上，另外在第9 5 1 和9 9 6 号氨基酸 位置上的两个氨基酸磷酸化位点位于相对不利的区域，也即在酪氨酸激酶插入环上，自 磷酸化位点参与调节受体的激酶活性，可以在没有加入外源a t p 的条件下，k d r 利用胞 内自身的的a t p 发生自磷酸化反应，激活下游信号传导通路【2 5 刁2 】，见图1 3 。 f 4 3 2 1 5 4 e l 。由 i ：审 i l v e g f r - ( f l t - 1 ) 图1 - 2v e g f r - 1 和k d r 结构及相应结合配体图 f i g 1 - 2s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f v e g f r - 1 ，k d r a n dt h e i rc o r r e s p o n d i n gl i g a n d s 注：t m ：单跨膜区；j m ：近膜域；k d ：激酶结构域 图1 - 3k d r 酪氨酸激酶空间结构图 f i g 1 - 3s t r u c t u r eo f t h ep r o t e i nk i n a s e c a t a l y t i cc o r eo fk d r g - k b 1 2 2k 1 ) r 酪氨酸激酶信号传导机制 通过研究k d r 结构发现，其受体酪氨酸激酶结构域与配体结合区分别位于细胞膜 的两侧，这样，激活胞内的激酶结构域进行信号传导就受到细胞膜的阻碍，位于膜外的 k d r 胞外段具有7 个免疫球蛋白样的结构域，可以与配体v e g f 紧密结合，进而激活 膜内的激酶活性中心，实现了下游一系列的信号途径的传导，调节血管内皮细胞的增殖 iil i 2 t 2 l 1，jf131j 江南大学硕士学位论文 和分化。大量研究表明配体介导的k d r 酪氨酸激酶活化是通过其受体二聚化实现的。 k d r 胞外段与配体v e g f 结合，导致构象发生改变，胞外段第4 7 区对二聚化位点的 抑制作用解除，形成二聚化受体。k d r 二聚化以后，a t p 上的磷酸基团转移到许多重 要的酪氨酸残基上，胞内激酶结构域被活化，同时为胞内的信号传递分子提供锚点，信 号从胞质传递到细胞核内，这样就将k d r 和信号传导途径紧密联系在了一起【3 3 1 ，见图 1 4 。 参与信号传导的传递分子本身或者是酶，具有酶催化活性，如s r e 激酶( s a r c o m a t k ) 、磷脂酶c - t ( p l c - ? ) 等；或者是调节因子，仅起连接作用，如生长因子受体结合蛋 白2 ( o r b 2 ) 等；还有一类，如磷脂酰肌醇3 激酶( p 1 3 k ) 的p 8 5 亚基，不仅具有酶催化活 性同时还起到连接作用【3 4 】，它们共同调控细胞的生长和增殖过程。 k d r 酪氨酸激酶胞内信号传导过程复杂，各通路间频繁交叉，相互作用，其中最 主要的途径为r a s r a f m a p k ( 丝裂原活化蛋白激酶) 信号转导途径【3 5 】。其具体传导过程 为：活化的k d r 磷酸化位点结合g r b 2 的s h 2 s h 3 蛋白并激活，此时有活性的g r b 2s h 3 蛋白结合s o s 蛋白并激活，活化的s o s 促使无活性的g d p r a s 变为有活性的g t p r a s ， 后者迸一步激活r a t ( 也称m a p kk i n 舔e ，m e k k ) ，启动m a p k s 级联反应【3 6 如，见图 1 5 。激活后的m a p k 进入细胞核，使核内多种与d n a 连接的基因调节蛋白磷酸化， 从而影响基因的合成、转录。在肿瘤细胞，主要是增加细胞周期素( c y c l i n ) 的基因转录， 导致细胞周期素依赖性蛋白激酶( c y c l i n - d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e s ，c d k s ) 激活，随后 c d k s 激活细胞周期前进基因( c e l lc y c l ep r o g r e s s i o ng e n e s ) ，最终导致细胞周期缩短、增 殖加速【3 8 1 。 调节血管内皮细胞增殖的另一重要的途径是p 1 3 k a k t ( 蛋白激酶b ，p k b ) 途径【3 9 1 。 k d r 被配体v e g f 激活后，结合大量的下游信号蛋白g a b l ，该蛋白的c 端被磷酸化后 与p 1 3 k 的p 8 5 亚基结合激活p 1 3 k ，并产生磷脂酰肌醇三磷酸酯( p i p 3 ) ，g a b l 的n 端 p h 结构域结合膜上的p i p 3 ，依次激活下游的a k t 途径，然后将信号转移至细胞核，通 过对多种转录因子( f k h r l l ，b e l 2 ) 等的调控抑制凋亡基因的表达，加速细胞增殖速度， 最后形成肿瘤。k d r 酪氨酸激酶还可以通过r a s 途径激活p 1 3 k a k t 通路。但该途径 在k d r 对h u v e c s 的增殖作用存在争议，有研究者认为它是k d r 对h u v e c s 的增殖 作用所必需的，有的认为该途径有抑制作用。 k d r 还可以激活细胞质中的s r c 非受体酪氨酸激酶途径，活化的c s r c 接着磷酸化 一系列蛋白底物，如转录激活因子( s t a t ) ，活化后的s t a t 与受体分离，形成二聚体， 转至细胞核，调节细胞凋亡、增殖、分化和细胞周期循环【钟】。s t a t 信号途径的研究为 人类肿瘤的治疗提供新的分子靶点。此外，k d r 的胞内信号转导m a p k 途径还可以通 过p l c - t p k c 激活，一氧化氮( n i t r i co x i d e ，n o ) 也参与了v e g f 介导的m a p k 信号转 导途径【4 。 在细胞内的信号转导中k d r 酪氨酸激酶起着十分重要的作用，它处于所有信号传 导的最上游，同时参与调节正常细胞及肿瘤细胞的增殖、分化和迁移。k d r 酪氨酸激 酶功能的失调，会导致细胞的生长调控失去控制，始终处于增生状态，最终导致肿瘤形 4 第一章绪论 成【4 2 】。因此选择以k d r 酪氨酸激酶为治疗靶点具有重要意义。细胞内信号转导远比上 述过程复杂，并且不同类型的细胞，传导机制可能存在差异。由单一因素的过表达来判 断是否有肿瘤的生长也许并不全面，试图通过抑制单一信号传导往往也不足以遏制肿瘤 的发展，并且很容易引起耐药性，因此今后肿瘤治疗和药物开发可能会向多靶点联合阻 断信号传导的方向发展。 图l - 4 k d r 二聚化 f i g 1 - 4k d rd i m e r i z a t i o ni n i t i a t e s i n t r a c e l l u a rs i g n a l i n g 图1 5k d r 酪氨酸激酶下游信号传导机制 f i g 1 - 5m e c h a n i s mo fh o r m o n es i g n a l i n g i n v o l v i n gt h ek d rt y r o s i n ek i n a s es y s t e m 1 3 酪氨酸激酶抑制剂研究进展 1 3 1 酪氨酸激酶抑制剂发展中的里程碑g l e e v e ct m 格列卫( g l e e v e c ) ，由瑞典诺华( n o v a r t i s ) 公司研制，是人类第一个分子靶向肿瘤生成 机制的抗癌新药，属于2 苯基氨基嘧啶类化合物，其结构是根据结构一活性关系设计的， 与a b l 蛋白的晶体模型有很好的契合性，可以特异性抑制b c r - a b l 酪氨酸激酶【4 3 j 。 2 0 0 1 年，g l e e v e c 首先被批准用于治疗慢性粒细胞白血病。不受控制的细胞分裂和 细胞长期存活是恶性肿瘤的主要标志，而这些正是慢性粒细胞白血病人血液中细胞的特 点。慢性粒细胞白血病的特征是一种染色体缺陷，分别位于2 2 号和9 号染色体上，b c r 和a b l 基因发生基因异位，由b c r 和a b l 融合基因编码的蛋白是一种具有持续活性的酪 氨酸激酶，正是这一蛋白导致病人特征性细胞增殖失控，通过a t p 分子与b c r - a b l 激酶 结合，产生细胞增殖信号的持续传导。g l e e v e c 可以寻找并选择性的结合到b c r - a b l 激 酶的a t p 结合位点，阻止它获得外来的活性磷酸基团，阻断下游信号传导，细胞停止 分裂并发生凋亡【4 3 朋】。在y l i 期临床实验中疗效显著，成为治疗慢性粒细胞白血病的一 线药物。在其后胃肠间质瘤的治疗中也取得了很好的疗效，2 0 0 2 年2 月美国f d a 批准 增加胃肠间质瘤为其适应症。 g l e e v e c 是第一个治疗恶性肿瘤的细胞信号转导抑制剂，它的开发成功具有重要意 义，不仅是酪氨酸激酶抑制剂发展中的里程碑，更是靶向治疗血液系统恶性疾病的一个 5 江南大学硕士学位论文 里程碑。 1 3 2 靶向i o r 酪氨酸激酶的抑制剂 1 9 7 1 年，f o l k m 觚【4 5 j 首次提出肿瘤的生长和转移具有血管依赖性，他认为是新生血 管的形成为肿瘤提供了充足的营养物质而使其迅速生长和增殖，并提出了“抗血管生成” 的假说。随着对肿瘤分子靶向研究的深入研究，人们对这一领域的认识有了长足的进展， 抗血管生成策略成为肿瘤治疗的重点和热点。其中v e g f k d r 在肿瘤血管生成起主要 作用，成为研究的主要靶点。目前已进入临床研究的抑制剂有：重组人v e g f 单克隆抗 体、k d r 单克隆抗体、k d r 酪氨酸激酶抑制剂，如s u 5 4 1 6 ，s u l1 2 4 8 ，p t k 7 8 7 等。 下面将主要介绍靶向k d r 酪氨酸激酶的小分子抑制剂的研究进展。 ( 1 ) 单靶点k d r 酪氨酸激酶抑制剂s u 5 4 1 6 ( s e m a x i n i b t m ) s u g e n 公司( 现被p f i z e r 公司收购) 研发的s u 5 4 1 6 是最早进入临床试验的v e g f r 小 分子抑制剂，是重要的k d r 酪氨酸激酶抑制剂。但因在临床试验中发生严重不良反 应而终止研究。 s u 5 4 1 6 是f l k - 1 k d r 酪氨酸激酶的a t p 竞争性抑制剂( k = o 1 6 1 上f n o l l ) ，能自由通 过细胞膜，通过与a t p 竞争结合定位在k d r 酪氨酸激酶的腺嘌呤结合( a d e n i n e b i n d i n g p o c k e t ) ，抑制k d r 激酶活性，从而抑制k d r 的信号转导。其化学结构式见图1 6 m 。 s u 5 4 1 6 为k d r 酪氨酸激酶抑制剂，i c 5 0 为1 0 4 m o l l ，但对e g f r 、p d g f r l 3 及胰岛素 受体等的抑制作用较弱 4 7 , 4 s 】 一 临床实验表明，s u 5 4 1 6 对多种癌细胞的增殖具有明显的抑制作用，如黑色素瘤、 神经胶质瘤、肺癌、乳腺癌等，同时，s u 5 4 1 6 对胃癌肝转移具有一定的效果。而在体 外实验中，对肿瘤细胞的毒性作用很弱。因此说明了肿瘤与新生血管之间的密切关系， 同时说明药物不是直接杀死肿瘤细胞，而是通过抑制新生血管生成阻止肿瘤的恶性增殖 【4 9 j 。在已完成的实体瘤和k a p o s i 肉瘤的临床实验中，多名患者接受了剂量逐渐增大的治 疗，剂量范围为每天4 4 1 4 5 m g m 2 ，结果耐药性良好，不良反应轻。s u 5 4 1 6 的研发经 验为新一代抑制剂的研发奠定了良好的基础。 h 0 图1 - 6s u 5 4 1 6 化学结构式 f 逸1 - 6c h e m i c a ls t r u c t u r eo f s u 5 4 1 6 ( 2 ) 多靶点k d r 酪氨酸激酶抑制剂一s u l1 2 4 8 ( s u n i t i n i bt m ) 随着新一代多靶点酪氨酸激酶s u l1 2 4 8 问世，以k d r 为靶点抗肿瘤治疗有了新的 6 第一章绪论 进展。其化学结构图见1 - 7 5 0 1 ，属于吲哚酮类化合物，构效关系研究显示n 1 和乙烯基 是活性必需基团，c 3 位双键的顺式构象是药效构象，r 1 位引入吡咯环活性较高。2 吲哚酮骨架是模拟腺嘌呤结构，能与受体激酶域的a t p 结合位点结合，占据a t p 的腺 嘌呤位置，2 吲哚酮的3 位取代基延伸到a t p 高度保守的结合位点毗邻的疏水口袋中， 发挥对r t k s 中的酪氨酸激酶的选择性作用。 它能够抑制多种受体型酪氨酸激酶，如血管内皮生长因子受体( v e g f r - 1 、 v e g f r - 2 、v e g f r - 3 ) 、血小板衍生生长因子受体( p d g f r - a 、p d g f r - 1 3 ) 和其他酪氨酸 激酶。舒尼替尼在半抑制浓度时可抑制两种受体酪氨酸激酶即血管内皮生长因子受体 2 ( v e g f r - 2 ) 及血小板衍生生长因子受体p ( p d g f r b ) 磷酸化，抑制效应较其他药物强 1 0 3 0 倍。另外，舒尼替尼还可抑制v e g f 和碱性成纤维细胞生长因子( b f g f ) 对人脐静 脉内皮细胞的诱导增殖作用【5 1 1 。2 0 0 6 年，f d a 批准本品用于治疗胃肠道间质瘤和晚期 肾细胞癌。在乳腺癌、食管癌、胃癌等其他实体瘤的临床研究中，也观察到了可喜的结 果【5 2 5 3 1 。 r 。 图1 - 7s u l l 2 4 8 化学结构式 f i g 1 7c h e m i c a ls t r u c t u r eo f s u l1 2 4 8 1 4 建立药物筛选模型的免疫学方法 1 4 1r i a 和e l i s a 免疫分析技术是迈向2 1 世纪发展起来的重要检测方法之一，广泛应用于医学、食 品等领域。其作用机理是抗原抗体间的免疫反应，具有高度特异性和高亲和性两大特点 刚。1 9 5 9 年，b e r s o n 和y a l o w t 5 5 】首先将同位素分析的灵敏性和抗原抗体反应的这二个 特点结合起来，创立了一代新型的超微量分析方法放射免疫分析( r i a ，r a d i o i s o t o p i e i m m u n o a s s a y ) ，应用于糖尿病患者胰岛素含量的测定。随后，以结合蛋白为分析试剂的 竞争蛋白结合分析方法也建立起来【5 6 】。 放射免疫分析方法具有灵敏度高、特异性强、精确性好、样品用量少等优点，并且 不需要复杂的提纯步骤，但在操作过程中需要特殊的仪器设备和一定的防护措施，而且 有些同位素标记物的半衰期较短以及实验废弃物难以处理，但这些缺点并没有影响该方 法的应用，至今仍作为评价其它方法的“金标准”。2 0 0 7 年，j o n a t h a n 等人以k d rt k 为靶点，基于放射免疫法( 刚a ) 建立了简单的k d r 酪氨酸激酶抑制剂筛选模型【5 7 】。 7 江南大学硕士学位论文 e l i s a 是建立在r i a 基础上由过氧化物酶标记取代同位素标记的方法。由于酶的 高效催化作用，使得检测信号得到高度放大，灵敏度高，同时不具有放射性。基于此方 法，2 0 0 2 年，中国科学院的庄书斐等人用原核表达体系表达及纯化得到v e g f r - 1t k ， 采用酶联免疫法( e l i s a ) 建立了药物筛选模型【5 剐。但是随着e l i s a 的广泛应用，e l i s a 的一些缺点也日益显现，该技术中酶标记物具有不稳定性，重复性较差，因为是非均相 体系在操作中需要反复洗涤，容易造成较大的误差。但考虑到成本问题，该技术仍广泛 应用在临床检验及各种领域的高通量检测中。 1 4 2a l p h a s c r e e n 激发光( 6 8 0 h m ) 供体 发射光( 5 2 0 6 2 0 n m ) 激发光( 6 8 0 n m ) 珠 图1 - 8 光激化学发光检测原理示意图 f i g 1 - 8d e t e c t i o nt h e o r e mf o ra l p h a s c r e e n 光激化学发光免疫分析( a l p h a s c r e e n ) 是以纳米级高分子微粒为基础的新一代化学 发光技术。该技术最初由u l l m a n 等【5 9 】在1