（药理学专业论文）camkⅡ抑制性磷酸化gsk3介导去极化依赖的神经元存活.pdf

目录 缩写词1 中文摘要2 英文摘要4 前言一6 曰u舌 材料与方法1 2 实验结果2 5 讨论4 9 参考文献5 5 附件一个人简历7 3 附件二发表的论文和论著。7 4 附件三在站期间获得的科研基金及承担的其它课题7 5 附件四在站期间承担教学和或工作情况7 6 致谢7 7 中山大学博士后出站报告 c a m k i i 抑制性磷酸化g s k - 3 介导去极化依赖的神经元存活 缩写词 a d c g n s c a m k s c o i p c k i d i v d m s o e i f 2 b 号 e r k g s k 3 h d a c i g f i l k l t p 啪 m a p k m p p + p d p k i r n a i a l z h e i m e r sd i s e a s e c e r e b e l l a rg r a n u l en e u r o n s c a z + c a l m o d u l i n d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e s c o - i m m u n o p r e c i p i t a t i o n c a s e i nk i n a s e 1 d a y si nv i t r o d i m e t h y ls u l f o x i d e e u k a r y o t i ci n i t i a t i o nf a c t o r2 b 芎 e x t r a c e l l u l a rs i g n a l r e g u l a t e dk i n a s e g l y c o g e ns y n t h a s ek i n a s e 一3 h i s t o n ed e a c e t y l a s e i n s u l i n - l i k eg r o w t hf a c t o r i n t e g r i n - l i n k e dk i n a s e l o n gt e r mp o t e n t i a t i o n ， l o n gt e r md e p r e s s i o n m i t o g e n - a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e 1 - m e t h y l - 4 一p h e n y l p y r i d i n i u m p a r k i n s o n sd i s e a s e p k ai n h i b i t o r r n ai n t e r f e r e n c e 阿尔茨海默病 小脑颗粒神经元 钙离子钙调蛋白依赖激酶 共免疫沉淀 酪蛋白激酶i 体外培养 二甲亚砜 真核起始因子2 b 芎 细胞外信号调节激酶 糖原合成激酶3 组氨酸脱乙酰基酶 胰岛素样生长因子 整合素连接激酶 长时程动作电位 长时程抑制 细胞分裂素活化蛋白激酶 1 甲基_ 4 苯基吡啶离子 帕金森氏病 p k a 抑制剂 r n a 干扰 中山大学博士后出站报告c a m k i i 抑制性磷酸化g s k - 3 介导去极化依赖的神经元存活 c a m k i i 抑制性磷酸化g s k - 3 介导去极化依赖的 神经元存活 中文摘要 神经元的存活凋亡在大脑发育过程建立正常的神经环路中发挥着关键作 用。已有报道表明，电活性对神经元存活至关重要。体外培养的小脑颗粒神经元 ( c e r e b e l l a rg r a n u l en e u r o n s ，c g n s ) 存活依赖于电活性，含有去极化浓度k c ik c l ( 2 5m mk c i ，2 5k ) 的培养基能够模拟电活性从而维持c g n 的存活，当培养基中 k c l 的浓度降低( 5m mk c l ，5 k ) 时，c g n s 发生典型的凋亡。这个过程模拟了新生 大鼠小脑中自然发生的神经元凋亡现象。此外，c g n s 的来源丰富，纯度高达9 8 以上，因此，体外培养的c g n s 被公认为是一个用于阐明去极化依赖的神经元存 活通路机制的好模型。 现已证明，去极化条件( 比如高浓度k c i ) 维持神经元存活的机制是诱导了l 型钙通道开放，从而导致钙离子内流，这说明钙离子是神经元存活信号中重要的 第二信使。当细胞内钙离子浓度增加后，钙钙调蛋白依赖的蛋白激酶 i i ( c a ? + c a l m o d u l i n d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s ei i ，c a m k i i ) 被激活，介导了多种神经元 的存活，包括c g n s 。然而，c a m k i i 通过什么底物发挥促神经元存活作用目前尚 不明确。 糖原合成激酶3 ( g l y c o g e ns y n t h a s ek i n a s e 一3 ，g s k 一3 ) 是一个广泛表达的丝 苏激酶，它包括两个亚型：g s k 3 a 和g s k 3 d 。g s k 一3 a 的s e r 2 1 和g s k 3 d 的 s e r 9 是影响其活性的关键磷酸化位点，当它被磷酸化时，g s k 一3 的活性被抑制。 许多激酶，包括a k t p k b ，p k a ，c g m p d e p e n d e n tp r o t e i n k i n a s e l ， i l k ( i n t e g r i n - l i n k e dk i n a s e ) 和p 9 0 r s k 都被证明能够磷酸化并抑制g s k 一3 。大量 报道表明，g s k 3 介导了多种刺激诱导的神经元凋亡发生，g s k 3 的活性异常 参与了与帕金森病和阿尔茨默病相关的神经元凋亡。虽然去极化介导了g s k 3 的抑制性磷酸化，但在去极化介导的神经元存活中，g s k 3 的磷酸化发挥什么作 用以及什么激酶介导了g s k 3 的磷酸化目前尚不明确。 2 中山大学博士后出站报告c a m k i i 抑制性磷酸化g s k 一3 介导去极化依赖的神经元存活 本论文采用可靠的手段证明了g s k 3 a 和g s k 3 d 对神经元凋亡均很重要； 组成性激活的g s k 3 质粒( g s k 3 as 2 1 a 和g s k 一3 ps 9 a ) 能促进神经元凋亡而一 个围绕g s k 3 ds e r 9 的肽段能够呈磷酸化依赖的保护神经元，说明g s k 3 0 1 3 ( s e r 2 1 9 ) 磷酸化对去极化依赖的神经元存活很重要。此外，我们还发现：去极化 时g s k 3 a 1 3 ( s e r 2 1 9 ) 磷酸化不是由a m p k b ，p k a 或p 9 0 r s k 介导，而是由 c a m k i i 介导的。进一步我们证明了c a m k i i 通过磷酸化并抑制g s k 3 的活性从 而介导了去极化条件下神经元的存活。上述结果阐明了钙钙调蛋白 c a m k i i g s k 3 通路在去极化介导的神经元存活中的作用。 3 中山大学博士后出站报告c a m k i i 抑制性磷酸化g s k - 3 介导去极化依赖的神经元存活 i n h i b i t o r yp h o s p h o r y l a t i o n o fg s k - 3 b yc a m k i ic o u p l e s d e p o l a r i z a t i o nt on e u r o n a l s u r v i v a l a b s t r a c t t h es u r v i v a lo rd e a t ho fn e u r o n si sc r i t i c a lt ot h ee s t a b l i s h m e n to fa p p r o p r i a t e n e u r a lc i r c u i t r yd u r i n gb r a i nd e v e l o p m e n t c o n s i d e r a b l ee v i d e n c es u p p o r t st h a t e l e c t r i c a la c t i v i t yp l a y sac r u c i a lr o l ei nn e u r o n a ls u r v i v a l s u r v i v a lo fr a tc e r e b e l l a r g r a n u l en e u r o n s ( c g n s ) i nc u l t u r ec a nb em a i n t a i n e db ye l e c t r i c a la c t i v i t ya n di s a f f e c t e db yd e p o l a r i z i n gc o n c e n t r a t i o n so fe x t r a c e l l u l a rp o t a s s i u m ( k c l o = 2 5m m ) l o w e r i n g k c l dt o5m mt r i g g e r st y p i c a la p o p t o s i s p r e s u m a b l y , t h i sr e c a p i t u l a t e s t h en a t u r a l l yo c c u r r i n gn e u r o n a ld e a t ht h a tt a k e sp l a c ei nt h en e w b o r nr a tc e r e b e l l u m t h e s ec h a r a c t e r i s t i c s , a l o n gw i t ha na b u n d a n tn e u r o n a lp o p u l a t i o na n du pt o9 8 h o m o g e n e i t y , m a k ec u l t u r e dc g n sa l le x c e l l e n ta n de x t e n s i v e l ys t u d i e dm o d e lf o r d e c i p h e r i n gt h es i g n a l i n gm e c h a n i s m st h a tu n d e r l i ed e p o l a r i z a t i o n - d e p e n d e n tn e u r o n s u r v i v a l i th a sb e e nw e l ld o c u m e n t e dt h a td e p o l a r i z i n gc o n d i t i o n s ( s u c ha se l e v a t e d i k c l o ) s u s t a i nn e u r o n a ls u r v i v a lb yc a u s i n gt h ei n f l u xo fc a 2 + t h r o u g hl - t y p ec a 2 + c h a n n e l s ，i m p l i c a t i n gc a 2 + a san e c e s s a r ys e c o n dm e s s e n g e rf o rs u r v i v a ls i g n a l i n g w h e na c t i v a t e db ye l e v a t e dc a 2 + ，c a 2 + c a l m o d u l i n d e p e n d e n tp r o t e i nl 【i n a s ei i ( c a m k i i ) h a sb e e nr e p o r t e dt om e d i a t ed e p o l a r i z a t i o n - d e p e n d e n ts u r v i v a lo fm a n y t y p e so fn e u r o n s ，i n c l u d i n gc g n s h o w e v e r , t h ep o t e n t i a ls u b s t r a t e so fc a m k i it h a t a c c o u n tf o ri t ss u r v i v a l p r o m o t i n ge f f e c ti nr e s p o n s et od e p o l a r i z a t i o nr e m a i nt ob e e l u c i d a t e d g s k - 3i sa u b i q u i t o u ss e r i n e t h r e o n i n ek i n a s ec o m p r i s e d o ft w od i s t i n c ti s o f o r m s ， g s k - 3 aa n dg s k 一3 p g s k - 3i si n h i b i t e db yn - t e r m i n a ls e r i n ep h o s p h o r y l a t i o n ( s e r 2 1i ng s k 一3 aa n ds e r 9i ng s k - 3 1 b ) m u l t i p l eh n a s e s ，i n c l u d i n ga k t p k b ，p k 气 c g m p - d e p e n d e n tp r o t e i nb n a s e1 ，i n t e g r i n l i n k e dl ( i n a s e ，a n dp 9 0 r s k ，h a v eb e e n 4 u s i n gs e v e r a la p p r o a c h e s ，w es h o w e dt h a tb o t hi s o f o r m so f g s k 一3a r ei m p o r t a n t f o r m e d i a t i n g n e u r o n a l a p o p t o s i s n o n - p h o s p h o r y l a t a b l eg s k 一3 a 1 3 m u t a n t s ( s 2 1 a s 9 a ) p r o m o t e da p o p t o s i sw h i l eap e p t i d ee n c o m p a s s i n gs e t 9 o fg s k 一3 p p r o t e c t e dn e u r o n si nap h o s p h o r y l a t i o n - d e p e n d e n tm a n n e r ；t h e s er e s u l t s i n d i c a t ea c r i t i c a lr o l ef o rs e r 21 9p h o s p h o r y l a t i o no nd e p o l a r i z a t i o n - d e p e n d e n tn e u r o ns u r v i v a l w ef o u n dt h a t s e r 21 9 p h o s p h o r y l a t i o n o fg s k 一3w a sm e d i a t e d b y c a 2 + c a l m o d u l i n - d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s ei i ( c a m k i i ) b u tn o ta k t p k b ，p k a ，o r p 9 0 r s k c a m k i ia s s o c i a t e d 、i t ha n dp h o s p h o r y l a t e dg s k - 3 a 1 3 f u r t h e r m o r e ，t h e p r o s u r v i v a l e f f e c to fc a m k i iw a sm e d i a t e db yg s k 一3p h o s p h o r y l a t i o na n d i n a c t i v a t i o n t h e s ef i n d i n g s i d e n t i f y an o v e lc a 2 + c a l m o d u l i n c a m k i i g s k - 3 p a t h w a yc o u p l i n gd e p o l a r i z a t i o nt on e u r o n a ls u r v i v a l 5 中山大学博士后出站报告c a m k i i 抑制性磷酸化g s k - 3 介导去极化依赖的神经元存活 c a m k i i 抑制性磷酸化g s k 3 介导去极化依赖的 神经元存活 - t 上- j o 刖吾 1 去极化与神经元存活 体外培养的高纯度( 9 5 呦的小脑颗粒神经元( c e r e b e l l a rg r a n u l en e u r o n s ， c g n s ) 是神经元凋亡及其信号转导机制研究最经典、最常用的细胞模型之一1 。 体内神经元存活有赖于“电活性”或神经营养因子的“营养”作用，体外原代培养的 神经元如c g n s 存活也必须得到类似的“营养”作用，如用去极化浓度k c i ( 2 5m m k c i ，2 5 k ) 模拟体内“电活性”，使c g n s 发生去极化，从而发挥维持神经元的存 活。将培养基中的去极化浓度k c i 换成低浓度k c l ( 5m mk c i ，5 k ) ，c g n s 则发 生典型的凋亡2 一。利用这一去极化存活撤钾凋亡模型，一些关键的调控细胞存 活凋亡的信号转导通路得以发现和阐明，如p i 3 k a k t 4 、a k t f k h r l l 5 、 肿 c j u n 6 和c a m p p k a g s k 3 8 7 等。 需要指出的是，去极化不仅能维持神经元的存活，还反映了兴奋性神经元多 种生物学效应，比如：神经元的发育、极性形成，树突生长，突触传递，长时程 动作电位( l o n gt e r mp o t e n t i a t i o n , l t p ) ，长时程抑$ i j ( l o n gt e r nd e p r e s s ) 、学习记 忆等8 。因此研究小脑颗粒神经元去极化模型的信号转导通路，不仅有助于阐明 神经元存活凋亡的机制，还能为明确上述生物学效应的本质提供科学依据。 2 g s k - 3 与神经元凋亡 g s k 3 既可以促进细胞凋亡也可以促进细胞存活9 。g s k 3 通过线粒体依赖 的内在凋亡通路促进细胞凋亡，此外，g s k 3 还促进了内质网应激导致的细胞凋 亡1 0 ，1 1 ，但是g s k 3 抑制死亡受体介导的外在凋亡通路的发生1 2 。 g s k 3 可以诱导多种刺激引起的凋亡9 ，如撤营养因子1 3 、抑制p i 3 一k 活性、 d n a 损伤1 4 内质网应激饵rs t r e s s ) 1 1 、氧化应激1 5 、缺血缺氧1 6 ，1 7 、谷氨酸兴 奋毒性1 8 ，1 9 、阿尔茨海默病和帕金森病相关毒素( p 淀粉样蛋白2 0 , 2 1 , m p t p a 2 ，2 3 等) 、热休克2 4h i v - 1 型蛋白2 5 线粒体毒性2 6 等等。 6 中山大学博士后出站报告c a m k i i 抑制性磷酸化g s k 3 介导去极化依赖的神经元存活 大量研究表明，g s k 3 可以促进神经元凋亡，包括m p p + 诱导了黑质多巴胺 神经元凋亡2 2 、撤b d n f 诱导的大脑皮层神经元凋亡2 7 、撤钾诱导的小脑颗粒神 经元凋亡7 。g s k 3 参与了神经退行性疾病的发生发展，如d 淀粉肽诱导的a d 模型2 8m p t p 以及6 羟基多巴胺诱导的p d 模型2 2 、多聚谷氨酰胺诱导的亨庭 氏综合症模型2 9 等。 我们实验室在g s k 3 与神经元凋亡及神经退行性疾病方面有较好的工作基 础。我们已经报道了g s k 3 抑制剂l i c l ，v a l p r o i ca c i d7 ，i n d i r u b i n 3 - o x i m e ， s b 4 1 5 2 8 6 3 0 可以保护性干预撤钾诱导的c g n s 凋亡，表明g s k 3 介导了小脑颗 粒神经元凋亡。此外，我们还报道了，g s k 3 抑制剂对m p t p 诱导的p d 动物 模型有很好的治疗作用2 2 ，说明g s k 3 与神经退行性疾病密切相关。 3 g s k - 3 的活性调控方式 1 ) g s k - 3 0 j l l s e r 2 1 9 抑制性磷酸化 g s k 3 a 的s e r 2 1 和g s k 3 p 的s e r 9 是g s k 3 活性的关键调节位点，该位点可以 被多种上游激酶磷酸化，如p k b a k t 3 1 、p k a 7 ，3 2 、p k c 、p 9 0 r s k 3 3 、p 7 0 s 6k i n a s e 3 4 、 i l k 3 5 等。磷酸化的s e r 9 s e r 2 1 形成一个预磷酸化的假底物，结合在g s k 3 的 a r 9 9 6 、a r g l 8 0 和l y s 2 0 5 的底物结合位点，使底物不能结合到催化区域，从而使 g s k 3 不能发挥激酶活性3 6 。8 。 已有报道，i g f 或n g f 等神经营养因子的抗凋亡作用主要是通过激活 p i 3 k a k t 通路，磷酸化g s k 3 0 1 3 ( s e r 2 1 s e r 9 ) 而抑制其促凋亡活性，从而保护神 经元。本课题组的前期工作报道，p k a 和a k t 类似，可以直接磷酸化g s k 3 bs e r 9 而发挥其抗神经元凋亡的作用1 。此外，p 9 0 r s k 也可抑制性磷酸化 g s k 3 a f l ( s e r 2 1 s e r 9 ) ，从而介导e g f 的抗凋亡功能3 3 。总之，g s k 一3 a f l ( s e r 2 1 s e r 9 ) 是调节其活性的重要抑制性磷酸化位点。 2 ) g s k - 3 a t p ( t y r 2 7 9 2 1 6 ) 磷酸化 和s e t 2 1 9 以及s e r 3 8 9 抑制性磷酸化不同，g s k 3 0 1 3 ( t y r 2 7 9 2 1 6 ) 磷酸化能够 促进g s k 3 的活性3 9 。在撤n g f 诱导的p c i 2 细胞凋亡和十字胞碱诱导的s h s y 5 y 细胞凋亡模型中，g s k 3 a 1 3 ( t y r 2 7 9 2 1 6 ) 磷酸化水平增高，并促进了细胞凋亡4 0 。 目前，对于g s k 3 a 1 3 ( t ) r r 2 7 9 2 1 6 ) 是g s k 3 自身磷酸化4 1 还是来自某个酪氨酸激酶 尚不明确4 2 。 7 中山大学博士后出站报告c a m k i i 抑制性磷酸化g s k 3 介导去极化依赖的神经元存活 3 ) g s k - 3 ps e r 3 8 9 磷酸化 除了s e r 2 1 s e r 9 之外，g s k 3 d 的s e r 3 8 9 也是其抑制性磷酸化位点。本论文正 在撰写的时候，2 0 0 8 年5 月的( ( s c i e n c e ) ) 报道，p 3 8m a p k 能够直接磷酸化g s k 3 d 的s e r 3 8 9 并抑$ 1 g s k 3 d 的活性，从而使d c a t e n i n 聚集，促进细胞存活4 3 。这是 g s k 3 d 抑制性磷酸化调控的新机制，也是p 3 8m a p k 促细胞存活的机制之一。值 得注意的是，g s k 3 a 并不能被p 3 8m a p k 磷酸化，这提示g s k 3 d 的s e r 3 8 9 的抑 制性磷酸化调控是亚型特异的。此外，p 3 8m a p k 磷酸化g s k 3 d 的s e r 3 8 9 有组织 选择性，在脑组织、脾脏和胸腺组织里可以检测到g s k 3 d 的s e r 3 8 9 磷酸化，但 在肾脏、肝脏和心脏中不能检测。然而，g s k 3 p 的s e r 9 磷酸化在上述组织中均 能检测到，这提示g s k 3 d 的s e r 3 8 9 磷酸化与s e r 9 磷酸化可能调控不同的生物学效 应。总之，g s k 一3 p 的s e r 3 8 9 抑制性磷酸化调控值得继续深入研究。 4 ) w n tp a t h w a y 调节g s k 3 活性的另一重要机制是g s k 3 蛋白质复合物的结合及解聚，最典 型的例子是w n t 通路4 4 。在没有刺激因子的作用下，骨架蛋白a x i n 与g s k 3 、酪蛋 白激酶i ( c k i ) 、p 连环素( 1 3 - c a t e n i n ) 及a p c 等其它蛋白结合形成复合物，使得c k i 将- c a t e n i n 的s e r 4 5 预磷酸化，接下来g s k 3 磷酸化1 3 c a t e n i n 的t h r 4 1 、s e r 3 7 和 s e r 3 3 ，最后导致1 3 - c a t e n i n 的降解。当有w n t 信号刺激因子作用的情况下， d i s h e v e l e d ( d v l ) 被活化并与g s k 3 结合蛋白f r a t 相结合，促使a x i n g s k 3 1 3 c a t e n i n 复合物解聚，这种分离妨碍y g s k 3 有效地磷酸化b c a t e n i n ，从而导致p c a t e m n 的积聚与活化。 值得注意的是，w n t 调控的g s k - 3 和s e r 2 1 s e r 9 调控的g s k 3 不是来源同一个 组分( p 0 0 1 ) 4 5 ，提示两种调控机制介导的g s k 3 生物学功能可能不同。在b 淀粉诱 导的大脑皮质神经元凋亡模型中，d i c k k o p f - 1 被诱导上调，抑制w n t 通路，解除 对g s k 3 的抑制从而介导凋亡发p 。在撤生长因子诱导的小脑颗粒神经元凋亡 模型中，w n t 调控的g s k 3 组分起关键作用4 7 。 5 ) c a i p a i n 切割g s k - a a i i 前面已经述及，位于g s k 3n 末端的s e r 2 1 s e r 9 是其关键的抑制性磷酸化位 点，说明n 末端对g s k 3 活性调节很重要。2 0 0 7 年，p f l o m ag o n i o l i v e r 报道了在 小鼠大脑皮质神经元中，钙内流激活c a l p a i n ，c a l p m n 切割了g s k 3 ( 包括g s k 3 a 8 中山大学博士后出站报告c a m k i i 抑制性磷酸化g s k 3 介导去极化依赖的神经元存活 和g s k 3 d ) 的n 末端，产生了约4 0k d a 和3 0k d a 的2 个新片段，并且这些切割 片段的活性比原型要增强4 8 。这是除s e r 2 1 s e t 9 磷酸化之外，g s k 一3 的n 末端抑制 性调控g s k 3 活性的新机制。但g s k 3 具体的切割位点尚待进一步明确。 6 ) g s k - 3 0 j i i 的亚细胞定位 g s k 3 传统上被认为是一个胞浆蛋白，但后续的研究发现g s k 3 还可以定位 在细胞核和线粒体4 9 ，作用于不同的底物，发挥不同的生物学功能。g s k 3 可以 作用于多种转录因子，因此它能够从细胞浆内转位到核内。细胞核内的g s k 3 水 平不是一成不变的，而是会因细胞内环境而改变。比如，在细胞周期中，s 期的 核内g s k 3 水平最高，并可以磷酸化c y c l i nd 1 5 0 。在凋亡刺激作用下，g s k 3 核 内水平会迅速升高，诱导多种转录因子表达，参与凋亡的调控”。在s h s y 5 y 细 胞，g s k 3 在胞浆、细胞核和线粒体均有表达，且细胞核和线粒体内的g s k 3 比 胞浆的g s k 3 具有更高的活性5 2 。此外，激活的a k t 还能够转位到线粒体，抑制 性磷酸化线粒体内的g s k 3 ，但不改变g s k 3 在线粒体内的含量4 9 。目前，对于 g s k 3 的亚细胞定位调控仍在继续深入研究之中。 4 c a m k i i 的基本特征 神经元发生去极化时，细胞内钙离子浓度升高时，钙调蛋白被激活，进而 激活了钙钙调蛋白依赖的蛋白激酶c a m k s ( c a 2 + c a l m o d u l i n - d e p e n d e n tp r o t e i n k i n a s e s ，c a m k s ) 5 3 ，5 4 0c a m k s 主要有以下成员：c a m k k 、c a m k i 、c a m k i i 、 c a m k i v ，介导了多种钙依赖的生物学效应5 5 c a m k i 、c a m k i i 和c a m k i v 均 具有自调控区域，当钙钙调蛋白不存在时，其活性处自抑制状态。当存在钙钙 调蛋白时，c a m k i i 的t 2 8 6 2 8 7 位点发生自身磷酸化，达到最大酶活性5 6 ；c a m k i 和c a m k i v 除了自身磷酸化之外，还需要上游激酶c a m k k 磷酸化其激活区域 的关键磷酸化位点t 1 7 7 和t 1 9 6 ，才能被完全激活5 7 。 c a m k i 主要分布在细胞浆内5 8 ，也有部分剪切本分布在核内5 9 或高尔基体 及细胞膜上。已有报道，c a m k i 介导了神经元轴突的生长和生长锥的运动6 1 。 c a m k i v 主要分布在细胞核内6 2 ，通过磷酸化转录因子c r e b 的s e r l 3 3 6 3 发挥功 能。c a m k i v 介导了神经元的存活“，l t p 的发生6 5 ，t 淋巴细胞的成熟6 6 等功 能。此外，c a m k i v 还报道在小脑颗粒神经元里被c a l p a i n 切割f 7 。 c a m k i i 有a 、d 、丫、6 四个亚型，每个亚型又有很多个转录本5 3 ，6 8 。其中 9 中山大学博士后出站报告c a m k i i 抑制性磷酸化g s k 3 介导去极化依赖的神经元存活 c a m k i i a 和c a m k i i f l 是神经系统特异的亚型，在脑组织的表达丰度较高，占脑 组织总蛋白量的1 - 2 ；c a m k i l 8 和c a m k i i y 在全身各组织都有分布，但在脑组 织内的表达丰度较低。在中枢神经系统里，c a m k i i a 主要分布在前脑组织，而 c a m k i i l 3 主要分布在小脑组织6 9 7 0 ，c a m k i b 分布大脑皮质，c a m k i l 8 分布在 小脑、丘脑和中脑7 1 。因此，在c g n s 里，主要是c a m k i i d 和c a m k i l 8 亚型表 达。 c a m k i i 蛋白是一个全酶，由6 1 2 个c a m k i i 单体分子组成。c a m k i i 单体 分三个区域，n 末端是催化区域，含有a t p 结合区域和底物结合区域；中间是 自调控区，含有自抑制区和c a l m o d u l i n ( c a m ) 结合区域；c 末端是自我结合区域， 是c a m k l l 分子间相互作用的基础。c a m k i i 的活性受位于自抑制区的关键磷酸 化位点t 2 8 6 2 8 7 ( a 为t 2 8 6 ，p 、丫、8 为t 2 8 7 ) 自身磷酸化调控。静息状态下， c a m k i i 的自抑制区封闭底物结合区域，起到假底物的作用，抑制c a m k i i 的活 性；当c a 2 + 浓度增高，c a m 激活，结合到c a m k i i 的c a m 结合区域，使c a m k i i 构象发生改变，自抑制区从底物结合区域解离，使底物能够进入，从而激活 c a m k i i 。这时t 2 8 6 2 8 7 发生自身磷酸化，使c a m k i i 一直处于底物结合区域打 开的状态，即c a m k i i 持续被激活。一旦c a m k i i 被激活，即便没有c a 2 + c a m ， c a m k i i 仍具有活性( c a 2 + - i n d e p e n d e n ta c t i v i t y ) 。c a m k i i 的t h r 3 0 5 3 0 6 也是其自 身磷酸化位点，一旦被磷酸化，便阻止了c a m 的继续结合。 c a m k i i 的底物谱很广5 6 ，可以分成以下几类：1 骨架蛋白，比如m a p 2 、 t a u ，m y o s i nl i g h tc h a i nk i n a s e 7 2 ，v i m e n t i n 7 3 ，s y n a p s i n1 7 4 ，d e n s i n 一10 0 ，a - a c t i n 7 5 等；2 膜受体蛋白或通道：g l u r l ，n r l 7 6 ，n r 2 8 7 7 ， n ac h a n n e l 7 8 ，g a b a a 7 9 ， k v 4 3 s o ，c a v 2 1 8 1 等：3 转录因子：c r e b ，c e b p b e t a s 2 ，n e u r o d ，a t f ，s t a t l 等；4 酶：g l y c o g e ns y n t h a s e 、c d k 5 s s , t y r o s i n eh y d r o x y l a s e 、n i t r i co x i d es y n t h a s e 8 4 、 h d a c ( h i s t o n ed e a c e t y l a s e s ) 8 5 等。通过作用这些底物，c a m k i i 参与了多种生物学 过程。 5 c a m k i i 与神经元存活 c a m c a m k s 一直被认为介导了钙离子内流促进的神经元存活。c a m k s 的抑 制剂k n 6 2 硒，8 7 或k n 9 3 可以抑制去极化介导的小脑颗粒神经元存活8 8 - 9 0 , 表明 c a m k s 是促神经元存活的激酶9 1 , 9 2 0 类似的，k n 6 2 还可以抑制去极化介导的交 1 0 中山大学博士后出站报告c a m k i i 抑制性磷酸化g s k 3 介导去极化依赖的神经元存活 感神经元存活9 3 ，9 4k n 6 2 还可以抑制去极化介导的蜗旋神经节神经元( s g n ) 存 活6 4 ，9 5 ，这些结果均表明c a m k s 可以促神经元凋亡。但由于k n 6 2 对c a m k i i 、 c a m k i v 或c a m k i 具有抑制作用，尚不能区分三者的各自作用。后续研究用 c a m k i v 负显性的质粒k 7 5 e 或c a m k i i 特异抑制质粒g f p a i p i i 均能够抑制去 极化介导的蜗旋神经节神经元的存活，表明c a m k i v 和c a m k i i 均可促进神经 元存活。 然而，另有报道认为c a m k i i 不促神经元凋亡。过表达组成性激活的c a m k k 或c a m k i v ( i 3 1 3 氨基酸) 可以抑制撤钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡，但过表达 组成性激活的c a m k i i ( 1 - 2 9 0 氨基酸) 不能保护9 6c a m k i v 负显性质粒能够抑制 去极化介导的小脑颗粒神经元存活，而c a m k i i 负显性质粒d n c a m k i i 不能抑 制去极化介导的小脑颗粒神经元存活9 7 。此外，在神经元过度去极化凋亡模型中， c a m k i i 被激活并介导了神经元凋亡粥。这些结果提示c a m k i i 不促进小脑颗粒 神经元的存活。 由于以上实验手段仍存在特异性不高的缺点，c a m k i i 对去极化介导的神经 元存活的作用目前尚不明确，有必要进一步澄清。 中山大学博士后出站报告 c a m k i i 抑制性磷酸化g s k - 3 介导去极化依赖的神经元存活 材料与方法 一、实验材料 1 实验动物 出生7 天的s p r a g u e d a w l e y ( s d ) 乳鼠，体重1 6 - 1 9g ，雌雄兼用，由中山大 学北校区实验动物中心提供。 2 试剂 1 ) 抗体 用途 名称 c a t n o 类型来源 w bi pi f p h o s p h o r - g s k - 3 r a b b i tc e l l s i g n a l l ：1 0 0 09 3 3 l o 1 3 ( s e r 21 9 )p a bt e c h n o l o g y p h o s p h o r - g s k 3 a r a b b i t c e l l s i g n a l 1 ：1 0 0 01 ：5 0 09 3 1 6 ( s e r 2 1 ) m a b t e c h n o l o g y p h o s p h o r - g s k 一3 d r a b b i tc e l l s i g n a l l ：1 0 0 09 3 3 6 ( s e r 9 ) p a bt e c h n o l o g y p h o s p h o r - g s k 一3 b 1 ：1 0 0 0 b db i o s c i e n c e s ( y 2 1 6 ) m o t l s e u p s t a t e g s k 一3 a 1 3 l ：l 0 0 00 5 4 1 2 m a b b i o t e c l m o l o g y a br a b b i t g s k - 3 a1 ：1 0 0 0l ：2 0 0a b e a m 4 0 8 7 0 m a b s c r a b b i t g s k 一3 p 1 ：1 0 0 0l ：2 0 0 s a n t ac r u z 9 1 6 6 p a b m o u s e g s k - 3 b l ：2 0 0 0l ：l o o6 1 0 2 0 2b db i o s c i e n e e s m a b p h o s p h o - c a m k i i r a b b i t u p s t a t e l ：1 0 0 00 6 8 8 1 ( t 2 8 6 t 2 8 7 )p a bb i o t e e h n o l o g y s c r a b b i t c a m l ( i il ：2 0 0s a n t ac r u z 9 0 3 5 p a b 1 3 m o u s e c a m k i i p l ：2 0 0 0l ：l o ol ：5 0 0 z y m e d 9 8 0 0m a b p h o s p h o - a k t r a b b i tc e l l s i g n a l 1 ：1 0 0 09 2 7 1 ( s e r 4 7 3 )p a bt e c h n o l o g y 中山大学博士后出站报告c a m k i i 抑制性磷酸化g s k - 3 介导去极化依赖的神经元存活 p h o s p h o a k t r a b b i tc e l l s i g n a l l ：1 0 0 0 9 2 7 5 ( t h r 3 0 8 )p a b t e c h n o l o g y p h o s p h o - e r k l 2 r a b b i tc e l l s i g n a l 1 ：1 0 0 0 4 3 7 0 ( t h r 2 0 2 t y r