（森林培育专业论文）蒜头果组织培养体系的建立及细胞悬浮培养技术研究.pdf

论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得 的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其 他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它 教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名弛濠b o 们年 关于论文使用授权的声明 月n 日 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可 以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名和c 虬 导师签名：石胼 。，、。， 哆年，6 其弓b 沙p 寸 摘要 蒜头果( m a l a n i ao l e i f e r a ) 是我国特有的单种属植物。蒜头果种子富含油脂，其 中二十四碳一1 5 一烯酸是合成麝香酮( m 1 1 s c o n e ) 的理想原料，具有较大的开发价值。本 课题的研究为蒜头果组培苗的工厂化生产和利用愈伤组织或悬浮细胞进行工业化发 酵生产二十四碳一1 5 烯酸的应用提供理论依据。 本文对蒜头果无菌苗诱导、芽的直接诱导、茎段和下胚轴愈伤组织诱导及分化、 生根壮苗、炼苗与移栽、胚乳愈伤组织的诱导与增殖、胚乳愈伤组织的细胞悬浮培养 等方面进行了研究。试验结果如下： 8 月是蒜头果播种苗茎段取材的最适合季节，此时启动率高，为8 0 0 0 ，同 时污染率低，为3 6 6 7 。播种茁茎段的最佳消毒组合是7 5 乙醇1 0 s + l o n a c l o i o m i n + 0 i h g c l 28 m i n ；蒜头果种仁的最佳消毒组合是7 5 7 , 酵1 0 s + 1 2 n a c i o i o m i n + 0 i h g c l 23 0 m i n 。 适宜蒜头果种胚无菌苗的诱导的最佳配方为：m s + n a a 0 2 m # l 。 蒜头果种胚无菌苗的各部位以及实生茁带芽茎段都能直接诱导芽，其中带子 叶腋芽茎段是较好的用于芽诱导的材料，其最佳试验配方为：m s + n a a 0 1 + 6 b a l 0 * 玎1 0 m g l 。而无项芽茎段最佳试验配方为：m s + n a a 0 2 + k t l 0 m g l ；下胚轴最 佳试验配方为：m s + n a a 0 i + 6 - b a l 0 + k t 0 5 m g g ；实生苗带芽茎段的最佳试验配 方为：m s + n a a 0 i + k t l 0 m g l 。 最适宜下胚轴诱导愈伤组织的培养基为：m s + 2 ，4 d 2 0 + n a a l o + 6 - b a o 4 + k t 0 2 m g l ；最适宜茎段诱导愈伤组织的培养基为：m s + 2 。4 - d 2 0 + n a a l 0 + 6 - b a 0 2 + k t 0 2 m g l 通过茎段诱导得到的愈伤组织不能分化成苗；下胚轴愈伤组织诱导分化 的最适培养基为m s + n a a 0 2 + z t 3 0 + k t 2 0 m g l ，但也只有极少数转为嫩绿色愈伤组 织可分化出芽，并且芽长势不佳，最终很难成活下来。 进行健壮无菌苗的生根诱导时，采用间歇光照培养，发现无菌苗在培养1 0 d 后基部有膨大现象，继而有少量愈伤组织出现，6 0 d 后有少量细小根发生。 适宜蒜头果无菌苗移栽的基质是河沙，移栽成活率可达8 0 0 0 。 适宜蒜头果胚乳愈伤组织诱导的基本培养基为m s 培养基。5 个植株号的诱导率 及最佳诱导配方存在差异。在一定浓度范围内，高浓度的2 ，4 - 0 与低浓度的6 - b a 具有协 同作用，能有效的促进胚乳愈伤组织的诱导及增殖，适宜浓度的k t 和g a 3 可以促进愈 伤组织的生长。添加甘氨酸虽然能提高胚乳愈伤组织诱导率，但其诱导的愈伤组织不 适宜用于液体悬浮培养，椰乳则对胚乳愈伤组织的诱导有抑制作用。胚乳愈伤组织最 佳增殖培养基为：m s + 2 , 4 - d 2 0 + 6 - b a 0 2 + g a 3 0 4 m g l 。 适宜胚乳愈伤组织悬浮培养的条件为：最佳基本培养基是m s ；最佳激素配组： 2 , 4 - d 2 o + 6 b a 0 2 + g 舢0 4 m g l ；最佳的初始接种浓度是每1 0 0 m l 培养液中接种4 9 ；最 适p h 是5 8 ；最佳的培养温度为2 8 c ；最佳蔗糖浓度为4 0 9 l 。 胚乳、胚乳愈伤组织、悬浮培养液的二十四碳一1 5 烯酸含量分别为3 l 、 1 1 3 、2 9g l 。 关键词：蒜头果组织培养细胞悬浮培养二十四碳一1 5 烯酸 2 t h es t u d yo nt h et e c h n i c a ls y s t e mo ft i s s u ec u l t u r e a n dc e l ls u s p e n s i o nc u l t u r eo f m a l a n i ao l e 谚r a y i i lc h e n g y i n g d i r e c t e db yp r o f s h id a x i n ga n da s s o c i a t ep r o f j u a ij i a y e ( c o l l e g eo f f o r e 划a ya n dh o r t i c u l t u r e ，s i c h u a na g r i c u l t u r eu n i v e r s i t y , y a a n , s i c h u a n , c h i n a , 6 2 5 0 1 4 ) a b s t r a c t m a l a n i ao l e i f e r ai sap e c u l i a rs i n g l e - s p e c i e sa n ds i n g l e - c a t e g o r y # a n ti no i u c o u n t r y i t ss e e dh a sa b o u n do i l a m o n gw h i c h , z - 1 5 - t e n a c o s e n o i ca c i di sc o n s i d e r e dt o b et h ei d e a lp a wm a t e r i a l so fm u s c o n es y n t h e s i z e s ，s om a l a n i ao l e i f e r ah a sq u i t eg r e a t v a l u eo ne x p l o i t a t i o na n du t i l i z a t i o n t h es t u d yo f f e rt h e o r e t i c a lf o u n d a t i o nf o ri n d u s t r i a l m a n u f a c t u r eo ft i s s u e - c u i t u r e dp l 觚t sa n df o rt h er n _ 0 ( t u c i n gz - 1 5 - t e t r a c o s e n o i ca c i db y c a l l u sa n ds u s p e n s i o nc e l l t h i sp a p e rs t u d i e se o m p r e h e u s i v e l yo nt h ei n d u c t i o no fa s e p t i cs e e d l i n g s ，t h e i m m e d i a t ei n d u c t i o no fb u d , c a l l u si n d u c t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o nf m ms t e r n sa n d h y l x x t y l s ,r o o t i n ga n di x a u s p l a n t i n go ft i s s u ec u l t u r es h o o t s ，c a l l u si n d u c t i o na n d m u l t i p f i c a t i o nf r o ma l b u m e n a n dt h ec e l ls u s p e n s i o nc u l t u r ee r e o f m a l a n i ao l e i f e r a t h e p r e l i m i n a r ye x p e r i m e n t s l 燃u l t s 嬲f o l l o w s ： a u g u s ti sc o n s i d e r e dt ob et h eb e s t $ e a s o nt od r a wm a t e r i a l s ，i nw h i c ht h e g e r m i n a t i o nr a t ei s8 0 0 0 a n dt h ec o n t a m i n a t e dr a t ei so n l y3 6 6 7 t h es u i t a b l e d i s i n f e c t i o nm e t h o do f s e e d i n gp l a n t ss t e i ni s7 5 e t h a n o l l 0 s + i o n a c l 0 1 0 m i n + o 1 h g c l 2 8 r a i n t h es u i t a b l ed i s i n f e c t i o nm e t h o do f k e r n e li s7 5 e t h a n o l l 0 s + 1 0 n a c l 0 1 0 r a i n + 0 1 h g c l 2 3 0 m i n t h eo p t i m u mr e c i p eo ft h ei n d u c t i o no fa s e p t i cs e e d l i n g sf x o me m b r y o i s m s + n a a 0 2 m g l ) e v e r yp a r to fa s e p t i cs e e d l i n gf r o me m b r y oa n dt h es t e mw i t hb u do fs e e d l i n g s c a l li m m e d i a t e l yi n d u c tb u d ，a m o n gw h i c h ，t h eb e s tm a t e r i a li ss t e m 埘t l lc o t y l e d o n s a x i l l a r yb u d ，o f w h i c ht h eo p t i m u mr e c i p ei sm s + n a a 0 i + 6 - b a i o + k t i o m g & t h e o p t i m u mr e c i p eo fs t e mw i t h o u tt o p - b u d h y p o c o t y l sa n ds t e r nw i t hb u do fs e e d l i n g sa r e j m s + n a a 0 2 + k t i 0 m g l ，m s + n a a 0 1 + 6 - b a l 0 + k t 0 5 m g l a n d m s + n a a 0 i + k t 1 0 m g lr e s p e c t i v e l y mo p t i m u mr e c i p eo fc a l l u si n d u c t i o no fh y p o c o t y l sa n ds t e ma r c m s + 2 4 - d 2 0 + n a a l o + 6 - b a 0 4 + k t 0 2 m g la n dm s + 2 , 4 - d 2 0 + n a a l 0 + 6 - b a0 2 + k t 0 2 m g lr e s p e c t i v e l y t h ec a l l u s i n d u c e df r o m s t e mc a n td i f f e r e n t i a t e t h e o p t i m mr e e i p eo fd i f f e r e n t i a t i o nf r o mh y p o c o t y l sc a l l u si sm s + n a a 0 2 + z t 3 0 + k t 2 0 m g l h o w e v e r , j u s ta l i t t l eo f p e a kg r e e nc a l l u sc a l ld i f f e r e n t i a t e , a n dt h eg r o w t h o f b u di ss ot h i nt h a tc a n ts m - - v l v e ( 勘f h eb o t t o mo f a s e p t i cs e e d l i n g sb e c o m e se x p a n d e da f t e r1 0d a y s , a n dt h e nal i t t l e o fc a l l u sa p p e a r s ，a n dt h i n - r o o ti sp r o d u c e da f t e r6 0c l a y s ，t h ei n d u c i n go fr o o tb y i n t e r m i t t e n ti l l u m i n a t i o n t h eb e s tt r a n s p l a n tm e d i u mi ss a n d , w h i c ht h er a t eo f s u r v i v a li s8 0 o o m si sc o n s i d e r e dt ob et h eb e s tb a s i cm e d i u mf o rc a l l u si n d u c t i o nf r o ma l b u m e n t h ei n d u c t i o nr a t ea n dt h eo p t i m u mr e c i p eo fd i f f e r e n t p l a n ti s v a r i e d i ng i v e n c o n s i s t e n c y , 2 , 4 - dw i t hh i g hc o n s i s t e n c yc o o r p e r a t e dw i t h6 - b aw i t hl o wc o n s i s t e n c y c 缸p r o m o t ee f f i c a c i o u s l yt h ei n d u c t i o na n dp r o p a g a t i o no fc a l l i k ta n dg a 3w i t h s u i t a b l ec o n s i s t e n c yc a np r o m o t et h eg r o w t ho fc a l l i , a d d e dw i t h 出y c i nc a l le n h a n c et h e r a t eo f i n d u c t i o n , b u tt h ec a l l u si si l l f i t t e dt ot h ec e l ls u s p e n s i o nc u l t u r e c mi si n h i b i t i n g f o rc a l l u si n d u c t i o nf r o ma l b u m e n t h eo p t i m u mr e c i p e so fc a l l u sm u l t i p l i c a t i o ni s m s + 2 4 d 2 0 + 6 - b a 0 2 + g a 3 0 4 m g l ms u i t a b l ec u l t u r ec o n d i t i o na r ef o l l o w i n g ：t h eb a s i cm e d i u mi sm s ，t h e h o r m o n ec o m b i n a t i o ni s 2 ，4 d 2 伊卜6 b a 0 2 + g a 3 0 4 m g l ，t h e i n i t i a li n o c u l a t i o n c o n c e n t r a t i o ni s4 1 0 0 m l ，t h ep hv a l u ei s5 8 ，t h ec u l t u r et e m p e r a t u r ei s2 8 ( 3a n dt h e s u c r o s ec o n c e n t r a t i o ni s4 0 9 l mc o n t e n to f z - 1 5 - t e t r a c o s e n o i ca c i di na l b u m e n 、c a l l u si n d u c t i o nf i o ma l b u m e n a n ds u s p e n d e ds o l i d sa l ef o l l o w i n g ：3 1 、1 1 3 a n d2 9g l k e y w o r d s ：m a l a n i a o l e i f e r a ；t i s s u e e u l t m e ；c e l ls u s p e n s i o n e u l t m e ；z - 1 5 - t e w a c o s c n o i c a c i d 4 1 前言 在世界范围内，植物是自然界留给我们的一笔丰厚财产。新的研究和探索使我 们经常能够发现新的物种，为已经众多的生物类群增添新的成员，王青锋等首次发 现的“东方水韭”引起国际社会的广泛关注。然而，在所有植物种群中，有一些 少数物种正因为环境的改变和来自于自身和外界的影响而逐渐的走向消亡。中国是 世界上生物种类最丰富的国家之一，也是北半球国家中生物多样性最为丰富的国 家。但至2 0 世纪末，在我国3 万种高等植物中，至少有3 千种处于濒危境地嘲不 仅在中国，在世界范围内很多珍贵植物也面临着同样问题。至2 0 世纪末，世界将有 5 6 万种植物受到不同程度的威胁，以美国加利福尼亚州为例，大约有1 5 0 0 种植物 处于濒危状态，几乎占当地植物物种总数的2 5 ，如今该州已经成为美国濒危植物 保护的热点地区。 大多数珍稀濒危植物都或多或少存在生殖障碍，或者在其生长的天然群落中受 到竞争而被抑制的现象十分明显，同时由于这些植物的自我更新的能力相对较弱， 更主要的是人类介入他们的生活环境以后，原有植被受到破坏而失去了适生的自然 条件，在多种因素的影响下，种群数量和种群内个体数量都大大的减少。 因此，保护珍稀濒危植物一直受到人们的高度重视。常用的保护方法有：就地 保护、迁地保护、利用分子生物学手段进行保护和利用离体保护的方法进行保护。 其中，人工繁育是现阶段扩大物种的有效方法。主要人工繁育方法有：组织培养、 扦插、人工授粉、嫁接、分株等，或对一些种子休眠期很长的物种通过人工调控或 者人工破壳等方法来解决它们繁殖困难的问题。因很多濒危植物有着很高的利用价 值( 材用、药用、脂类及观赏植物资源) ，利用人工繁育的方法不仅仅能够起到保 护濒危植物的目的，而且将一些濒危植物作为经济作物进行繁育还可以改善经济发 展与自然环境之间的矛盾问题，让有限的资源为人类永续利用。到目前为止，我国 已经成功地繁育了金花茶( c a m e l l i ap e t e l o f 功铷、珙桐( d a v i d i a i n v o l u c r a t a ) “、银杉 ( c a t h a y a a r g y r o p h y l l a ) 嘲、格木( e r y t h r o p h l e u mf o r d i i ) 嘲、见血封喉( a n t i a r i s t o x i c a r i a ) m 、猪血木( e u r y o d e n d r o ne x c e l s u m ) 等百余种珍稀濒危植物，有些种类已 拥有较大的人工种群，并得到广泛引种栽培。同时利用组织培养的方法达到保存物 种的目的也是现在的研究热点。应用植物组织培养生产植物具有不受地区，季节与 气候限制，便于工厂化生产等优势，同时组织培养中的细胞生长速度要比植物正常 5 生长速度快，接近于分生组织的生长速度，因此利用组织培养快速繁殖种苗，或者 通过组织或细胞大量培养直接生产次生物质便随之日益发展 3 1 。现已对土沉香 ( a q u i l a r i as i n e n s i s ) 叫n 们、苦丁茶( r e xk u d i n g c h a ) n 1 1 、蒜头果( m a l a n i ao l e i f e r a ) “4 、 金花茶( c a m e l l i ap e t e t o t i i ) o ”、海南粗榧( c e p h a l o t a x u sm a n n i i ) “o 、银杉( c a t h a y a a r g y r o p h y l l a ) n 目、南方红豆杉( t a x u sc h i n e n s i sv a r m a i r e i ) 埘等珍惜濒危植物的组织 培养技术进行了初步探讨。组织培养可快速扩大物种数量，保持物种品质，对珍惜濒 危植物的种质资源保存更是作用重大。 蒜头果( m a l a n i ao t e i f e r c lc h u r le ts kl e e ) ，又名山桐果、马兰后、猴子果，常绿 乔木，属铁青树科，蒜头果属，为国家二级保护珍惜植物，是我国特有的单种属植物 o “。蒜头果分布极其狭窄，仅自然分布于云南东南部和广西西部的狭窄区域“制。 蒜头果固有的生物学特性不利于其种群的发展，动物对蒜头果果实的取食和危害使得 本来就有限的种子数量大为减少，人类活动的破坏不仅直接减少了蒜头果资源，也破 坏了蒜头果的适生环境，从而不利于蒜头果的生长和天然更新，致使其处于濒危境地。 蒜头果在形态解剖上既具有原始性状，又具有进化的特征，对研究铁青树科的分 类系统有重要意义哪一。蒜头果种仁胚乳富含油脂，其, 9 - - 十四碳一1 5 一烯酸是合成麝 香酮( m u s c o n e ) 的理想原料嘲，具有较大的开发价值。通过对愈伤组织或悬浮细胞的 大量培养直接提取油脂是工业化开发蒜头果的一个新方向，不仅可满足麝香酮长期稳 定的工业化生产，解决当前存在的合成生产中的原料短缺问题，还能减少对蒜头果资 源的过度开发和破坏。另一方面，蒜头果是优良石山绿化树种。随着近几年来国家对 西部大开发和生态环境建设的重视，对兼具经济和生态效益的蒜头果进行组织培养研 究，可通过快速繁殖获得大量基因型一致的优良茁木，满足人工栽培的需求，丰富石 山地区造林树种，对广大石山区群众脱贫致富和生态环境保护有着重要意义。 2 文献综述 2 1 蒜头果的研究概述 2 1 1 蒜头果的生物学特性 蒜头果( m a l a n i ao l e i f e r ac h u r le ts kl e e ) ，又名山桐子、马兰后( 壮语) 、 猴子果。常绿乔木，植株高可达2 5 m ，胸径可达6 0 e m ；树皮灰褐色。叶互生，薄 革质，长圆形或长圆状披针形，长7 1 5 e m ，宽2 5 , - 4 ( - - 6 ) e m ，嫩叶两面有棕色粉 状微柔毛；叶柄长1 - 2 e r a ，基部有关节。花小，1 0 - , - 1 5 朵排成伞形花序状或总状 6 花序状的聚伞花序，花序腋生，单序或2 3 序集生在短 枝上端或小枝枝梢，总花梗纤细，长1 8 - - 2 3 锄；花萼深 4 裂；花瓣4 ( 5 ) 片，分离，镊合状排列；雄蕊8 枚， 偶l o 枚；子房上位，下部2 室，上部1 室，每室有l 枚 悬垂胚珠。浆果状核果扁球形，直径3 3 5 e m ，基部稍收 狭。种子球形，直径约1 g e m 1 7 18 】。 2 1 2 蒜头果的核型 杨鲁红等报道了蒜头果的染色体数目及核型分析结果，得知其体细胞染色体 数目为2 6 条，为二倍体，核型为1 a 型，是一种很原始的类型。 2 1 3 蒜头果的分类地位和保护状况 蒜头果是在2 0 世纪7 0 年代被发现的，并被列为铁青树科蒜头果属，为我国 特有的单种属植材切。蒜头果分类地位一度混乱，曾被置于樟科、茶茱萸科，分 别被定名为s y n d i c l i s o l e i f e r ae h t m e t l e e ，i n e d 和m e l a n h o n i a o l e i f e r a ( c h u n e t l e e ) i g , l o 。直到1 9 7 9 年，我国植物分类学家李树刚先生才将之置于铁青树科 ( o l a c a c e a e ) ，并认为其为一新属一一蒜头果属( m a l a n i a ) 。从此，蒜头果学名及 分类地位一直沿用至今。1 9 8 7 年，蒜头果经国家环保局等部门审批，被列为国家 二级保护植物，1 9 9 1 年收入中国植物红皮书“。刎。1 9 9 9 年进入国务院公布的 国家重点保护野生植物名录( 第一批) ，仍处于二级保护等级。 2 1 4 蒜头果的地理分布及资源状况 蒜头果地理分布极其狭窄，仅自然分布于云南东南部和广西西部的狭窄区域。 大致在北纬2 2 0 2 3 1 2 4 0 4 8 1 ，东经1 0 5 。3 0 - 1 0 7 0 3 0 1 区域内。在广西分布海拔为 3 0 0 1 0 0 0 m 处，在滇东南则为3 0 0 1 6 4 0 m 。据资料记载，蒜头果主要产于我国 的广西西南部右江、大新、龙州、隆安、靖西、德保、平果、马山、田东、田阳等 县( 区) 至西北部隆林各族自治县、凌云、田林、乐业、风山县，向西延伸到云南东 南部的富宁、广南、文山县一带“4 别。在其天然分布区，蒜头果多见于山谷底部及 石灰岩石山中下坡位置，喜肥沃较湿润石灰岩土，且四周常有山地作屏障，性喜水 湿。 根据近几年的调查，蒜头果的分布已有逐渐减少之势，广西境内分布的面积已 大大的减少。上述资料记载的百色、平果、田东、田阳及龙州等县己无蒜头果分布 7 剐，在德保、靖西亦仅见孤立单株的蒜头果。据近年来的调查资料表明，蒜头果 的现存资源量稀少，分布呈严重片段化零星状态。广西区林业局组织林业勘测设计 院对蒜头果进行样方调查及对部分的分布点进行资源调查，初步表明目前广西蒜头 果分布面积为2 0 1 4 2 h m 2 ，5 0 8 5 株，木材蓄积量1 8 甜网。云南省由于开矿和发展 烤烟种植业，也使得大面积的蒜头果受到污染或遭受砍伐，造成蒜头果资源量锐减 2 1 5 蒜头果资源的利用研究 在蒜头果利用方面，蒜头果种仁胚乳富含油脂，油棕红色，含油量6 0 以上，其 油为制皂和机械润滑油及其它重要的工业用油原料，油饼可作肥料。我国民间素有榨 取蒜头果油食用的习俗1 2 9 ，但一直未见有关食用开发的报道。 1 9 8 1 年欧乞缄等首先对蒜头果的油脂进行分析和鉴定，发现在蒜头果种仁胚乳 油脂中存在含量高达6 7 的二十四碳1 5 烯酸【2 3 捌，是天然存在的内含二十四碳 1 5 烯酸的少数几种植物之一。二十四碳1 5 烯酸是一种长链单不饱和脂肪酸，在一 定程度上不仅具有活跃脑细胞、治疗身体免疫缺乏性疾病、心血管疾病的功用，而 且还是合成高价值的麝香酮所需的廉价理想原料 2 3 , 3 0 , 3 。随后，李用华等利用该 脂肪酸经过5 步合成制得麝香酮( 十五内酯) 1 3 2 1 ，化学名为3 一甲基环十五烷酮( l 一3 一m e t h y l c y c l o p e n t a d e e a n o n e ) 。麝香又名寸香、当门子，具有很高的经济价值， 目前国际市场麝香价格大约为每千克5 7 万美元。天然麝香具有特殊的芳香气，是 麝科动物成熟雄体麝腺香囊中的分泌物的干燥品，具有芳香开窍、通精活血、消炎 止痛三大功效。麝香的主要香气成份为麝香酮。麝香酮是一种带优雅麝香气味、价 格昂贵的高级香料，主要用于高档香水、化妆品的制造，可作为高级化妆品的定香 剂；其亦在医药工业上使用，在治疗肝病、癌症、心肌梗塞方面显示了很好的作用， 8 其疗效迅速，是临床上惟一可用作急救药的中药，另外在藏医药、蒙医药中也被广 泛运用。因此，寻找麝香的生产途径，已是我们面临的一个迫切而又艰巨的课题 口3 川。 2 0 世纪9 0 年代末，周永红【3 卯、黄品鲜1 3 6 1 、李伟光口刀等开始采用现代技术进 行蒜头果油的分离、脂肪酸的测定等研究。在此基础上，王立升等呻1 对除去二十 四碳- 1 5 - 烯酸后剩余的混合脂肪酸经皂化制备出质量达到国家标准的钙基润滑 脂。刘雄民等 3 8 1 利用化学方法和生物技术法对合成麝香酮工艺进行了改造并取得 突破性进展。目前部分研究成果已经转化并进入实施阶段。最近，刘雄民等发现 在蒜头果果皮中存在着天然苯甲醛( 已申请专利) 。并且由刘雄民教授为课题负责 人承担的孵化项目开发蒜头果生产神经酸新产品的应用开发，已经顺利通过 了鉴定，技术水平处于国内领先水平。 2 1 6 蒜头果育苗造林进展与迁地保护研究 刘钊权在对云南广南分布的野生蒜头果生态特性、生长结实特性、生物学特 性调查的基础上，首先进行了人工育苗及造林试验，并总结出一套种植技术和采 收加工技术 3 9 1 。1 9 8 1 和1 9 8 2 年在云南广南采用直播造林方式完成石山造林试验， 试验面积分别约为2 0 3 h m 和4 6 7 h m ，并取得初步成功1 4 0 1 。同一时期，伍春魁在 广西河池进行过育苗、造林等方面进行了初步的研究和实践【4 1 1 。遗憾的是上述两 次造林试验未见有后续报道。 肖来云等1 9 9 6 年报道称，对气候相似区的蒜头果进行多次引种，但未获成功， 并认为可能是适应性太弱，生态环境与遗传性不协调所致【4 2 】。潘晓芳于1 9 9 9 年进 行了蒜头果就地育苗和异地育苗的试验，试验分别在广西巴马和广西大学林学院 进行，采用果实直接播种和种子随采随播或砂藏催芽后再播种做对比试验，结果 表明，果实直接播种的发芽率极低( 仅4 ) ，而种子随采随播或砂藏催芽后再播种 却分别达到8 7 和9 5 4 3 1 。去掉果皮的蒜头果种子虽然具有较高的萌发率，而且 幼苗在第一年的生长也表现良好，但第二年后幼苗出现了大量死亡的现象。异地 ( 土山) 营造实验林至今为止尚未成功，一年生苗木移栽种植后，成活率极低， 几乎1 0 0 死亡。另外，陈强等试验也证实，蒜头果在石山造林中的表现极差1 4 4 。 果实直接播种出现萌发率低这一现象据认为可能是在果皮中含有抑制性的物质， 具有自毒现象。这在近期进行的果皮浸提液对萝卜、马尾松、任豆及其本身种子 的发芽试验中得到了证实【4 5 1 。一 9 李先琨、王才明、黄仕训、李光照等对蒜头果的观赏特性、迁地保护和开发 利用进行了研究 4 6 - 5 ”。熊英等也多次对蒜头果的种腐病发病症状及制病原因进行 了研列5 2 卅。 2 1 7 蒜头果组织培养研究 尽管蒜头果在生态、营林、综合利用等方面取得了一定的成绩，但有关蒜头果 组织培养方面的研究在国内外一直尚属空白。直到2 0 0 4 2 0 0 5 年，赖家业等才对 蒜头果的组织培养再生系统、细胞悬浮培养体系的建立进行了初步探索【1 2 5 1 ，认为 带适量胚乳的胚能正常出苗，获得的无菌苗的最佳的芽苗继代增殖配方是 m s + 6 - b a l 0 + n a a 0 2 m g l ，在进行胚乳愈伤组织诱导时，认为高浓度的2 ，4 - d 与 低浓度的6 - b a 具有协同作用，c o a 3 对愈伤组织的生长无明显作用，适宜浓度的k t 可以促进愈伤组织的生长。但是他们在对胚轴、茎段等进行直接分化试验中没有获 得有效芽、诱导得到的愈伤组织未能分化，试管苗在生根率、移栽成活率以及细胞 悬浮培养时次生代谢产物的积累及其提取等方面都未见报导。 2 1 8 蒜头果濒危原因探究 按照世界保护联盟新制定的物种受威胁的分类系统标准，蒜头果应属于易危 种1 5 6 1 。引发植物种群走向濒危境地的是种群内在与外界各种不利因素综合作用的 结果。并逐步认识到在植物生活史中存在脆弱环节或者多个脆弱环节整合是植物 致危的主要内在机制。一些地方性特有植物种群，尤其是属级水平上的地方性特 有植物类群容易灭绝【5 7 1 。蒜头果作为易危树种，除本身内在的生物学方面的因素 外必然受到外部环境因素的制约。 1 9 9 4 1 9 9 7 年，王才明、李光照、李先琨等1 4 7 5 l 】在对广西珍稀濒危植物种质 资源状况、区系基本特征、优先保护评价等方面的研究中报道了蒜头果的一些现 状。蒜头果落花落果现象很普遍且落果率很高；蒜头果果实颗粒大，因而种子主 要靠重力传播，传播距离小且种实脱落常暴露于岩石或表土上；蒜头果落果期为 9 下旬到1 0 月上旬，而分布区在此期及以后降水较少，累计值仅介于1 9 4 7 2 9 6 9 m m 。蒜头果外种皮坚硬，骨质，多数年份难以满足种子发芽所需要的水分； 由于植物种子富含蛋白质和脂类等营养物质，因此常常成为许多动物取食的对象。 据调查，蒜头果果实受到鼠害的危害较为严重。 赖家业等从蒜头果的叶片形态学、解剖学及生理学等角度对蒜头果濒危原因 i o 进行了研究，排除了现有的蒜头果受到石灰岩生境胁迫的可能。主要原因是蒜头 果对生长的土壤环境要求较高，蒜头果较适应碱性石灰岩石山特定的气候和土壤 环境，而在土山环境较有利于细胞分裂而不利于细胞的扩张生长，蒜头果叶片细 胞小型化，叶绿素含量较低，不利于光合作用，因而对于蒜头果的正常生长也会 有不利的影响【5 8 5 9 】。梁月芳等也对天然蒜头果的资源、生物学和生态学特性等进 行了初步分析讨论，揭示蒜头果致濒原因 6 0 1 。吴彦琼等研究了蒜头果的花粉活力、 种子活力和幼苗生长特性等生殖生物学习性，从生殖生物学的角度来找出种群衰 退的部分原斟6 1 】。主要原因是蒜头果花粉的活力较低导致授粉障碍、果实成熟脱 落后不易萌发、以及茁木生长易受多种病虫危害。蒜头果的种群稀少和分布范围 的缩小而产生的遗传漂变和近交作用，这些都是导致其濒危的重要原因。 2 2 林木组织培养研究概述 植物组织培养是指在无菌条件下，将离体的植物器官( 如根尖、茎尖、叶、花、 未成熟的果实、种子等) 、组织( 如形成层、花药组织、胚乳、皮层等) 、细胞( 如体 细胞、生殖细胞等) 、胚胎( 如成熟和未成熟的胚) 、原生质体( 如脱壁后仍具有生活 力的原生质体) ，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱发产生愈伤 组织，或潜伏芽等，或长成完整的植株，统称为植物组织培养由于是在试管内培养， 而且培养的是脱离植株母体的培养物，因此也称离体培养或试管培养根据外植体 来源和培养对象的不同，又分为植株培养、胚胎培养、器官培养、组织培养、原生 质体培养等 6 3 1 。 植物组织培养的依据是植物细胞4 全能性”及植物的“再生作用”。1 9 0 2 年， 德国著名植物学家g h a b e r l a n d t 根据细胞学理论，大胆地提出了高等植物的器官和 组织可以不断分割，直到单个细胞，即植物体细胞，在适当的条件下，具有不断分 裂和繁殖，发育成完整植株的潜力的观点。g h a b e r l a n d t 因而被誉为“植物组织培 养之父”1 6 2 1 。 利用组织培养再生植株的木本植物已达到1 0 0 多种阱l ，某些种类已得到广泛的 应用。近二十年来，木本植物的组织培养技术取得了巨大成就，如花药培养、茎尖 与嫩叶培养、幼胚培养、原生质体培养、体细胞杂交、突变体筛选、去病毒，人工 种子等方面进展都十分迅速1 6 5 - 6 6 。一些发达国家，如美国、法国、德国、加拿大、 新西兰等国就一些主要造林树种，如火炬松( p i n u st a d e a ) 、挪威云杉( p i c e aa b i e s ) 、 和花旗松( p s e u d o t s u g am o n z i e s i i ) 、辐射松( p i n u sr a d i a t a ) 等开始了大规模工厂化 育苗生产，并大批量应用到生产实践中去，取得了良好的经济效益和生态效益。此 外，德国，法国、巴西等在三倍体山杨、云杉、杨树、桉树等树种的快繁体系进行 了较为系统的研究，使林木组培苗进入工厂化和适用化阶段7 删。我国涉及的树种 有、马尾松( p i n u sm a s s o n i a n a ) 、桉树( e u c a l y p t u s ) 、桃树( p n m u s p e r s i c a ) 、杨树 ( p o p u l u s ) 、枫香( l i q u i d a m b a rf o r m o s a n a ) 、鹅掌楸( l i r i o d r o nc h i n e n s e ) 和杉木 ( c u n n i n g h a m i al a n d e o l a t a ) 等 6 e j l 。 2 3 植物细胞悬浮培养研究概况 植物的很多次生代谢物质是药物、染料、香精和色素的重要来源，只是这些天 然产物的数量太少，难以满足人类的需要，大规模人工合成又存在很多困难。不过， 鉴于在整体植物中存在的某些这类化合物，在培养的细胞中也同样存在，因此，随 着细胞培养技术的发展，人们正在探索借鉴微生物发酵的方法，运用植物细胞的大 量培养来生产这些化合物，或是利用培养细胞对外供的前体化合物或中间产物进行 生物转化嘲。 植物细胞悬浮培养是指把离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行的无菌培 养。它是应用细胞全能性原理，从植物愈伤组织的液体培养技术基础上发展起来的 一种新的培养技术，具有细胞繁殖速度快，培养规模大，培养物均匀一致等特点， 在植物产品工业化生产上有巨大的应用潜力。它一般可分为两类，一类是以获得再 生植株为目的的细胞悬浮培养，另一类是以获取植物细胞中有效成分为目的的细胞 悬浮培养【7 0 】。 以获得再生植株为目的的细胞悬浮培养，其技术要点是：用植物的外植体诱导 产生脆散愈伤组织并建立起细胞悬浮体系，通过悬浮培养产生大量的体细胞胚状 体，从而产生再生植株。由于利用该方法可在短时间内获得大量具有再分化能力的 胚性细胞，从而诱导成苗生产大量植株，这对扩大珍稀濒危植物资源和大量生产人 工林，经济林苗木具有重要的意义。目前，国内外研究者已对枸杞( l y c i u mb a r b a r u m l ) 7 0 1 ，桉树( e 1 e i z h o u n o i ) 7 1 1 ，谷子( s e t a r i a i t a l i c a ) 7 2 1 ，青扦( p i c e a w i l s o n i l ) 1 7 3 ，甘薯( 1 p o m o e ab a t a t a sl l a m ) 1 7 4 等植物进行了细胞悬浮培养诱发胚状体发生 进而形成再生植株的研究，部分已应用于生产实践。 国外利用植物愈伤组织和悬浮培养细胞获取植物次生代谢产物的研究始于 1 9 4 2 年，g a u t h e r e t 发现植物细胞培养可以生产次生代谢产物( 7 卯。以获取植物细胞 中有效成分为目的的细胞悬浮培养，使培养物中的有效成分渗入培养液中，分离提 1 2 取所需的各种代谢产物。由于细胞代谢产物的获得可越过植物栽培、管理、采收以 及加工等大田生产环节，这对于以获取植物代谢产物为目的的医药工业生产和化学 工业生产而言，无疑具有特殊的重要意义。因此，植物细胞悬浮培养技术自出现以 来，就受到国内外研究者的极大重视，并迅速成为植物科学研究的热点。目前，国 内外研究者已对东北红豆杉( t a x u sc u s p i d a t e ) 7 6 1 、人参( e a n a xg i n s e n g ) 叨、三七 ( e a n a xn o t o g i n s e n g ) 【7 8 1 、紫苏( p e r i l l af r u d e s c e n s ) 嗍、硬紫草( l i t h o s p e r m u m e r y t h r o r h i z o n ) s o l 、黄连( c o p t i sc h i n e n s i s ) 【8 l j 、杜仲(