（分析化学专业论文）一分钟整体蛋白液相色谱法的建立.pdf

摘要 蛋白质组学、蛋白药物和来自动植物等天然产物中的蛋白的分离和纯化的研究都需 要液相色谱法快速分离技术。p e t e rc a r r 小组最近提出快速分离的目标：一维液相色谱 分离要在1 1 0m i n 内完成，二维液相色谱分离要在1 0 1 0 0r a i n 内完成。尽管这个建 议是针对多肽提出的，但是也可以作为整体蛋白快速分离的目标。在本文中，利用蛋白 质在液固界面的不连续迁移和色谱饼这种柱技术，首次建立了一分钟整体蛋白液相色 谱法。一般的快速分离仅仅包含了蛋白分离过程，而一分钟整体蛋白液相色谱在1m i n 内完成分离过程和色谱饼再生过程。分别用标准蛋白检测了反相色谱法、离子交换色谱 法和疏水相互作用色谱法三种模式的一分钟整体蛋白液相色谱法，蛋白质分离度没有明 显地损失。除了分离速度快分离能力强，该技术还有负载量高的优点。 论文包括了以下6 个部分： 1 绪论 说明了色谱法快速分离的意义。介绍了一维快速分离蛋白质的方法，包括非多孔固 定相、整体固定相、灌注色谱法、高温快速液相色谱法和色谱饼法；还介绍了二维色谱 快速分离蛋白质的方法，包括了常规的使用多根不同机理色谱柱的二维液相色谱法 ( 2 d l c ) 和使用一根有两种正交分离能力色谱柱的单柱二维液相色谱法( 2 d l c 一1 c ) 。 2 多孔反相填料对整体蛋白的高速、高分离度和高负载量分离 使用侧孔装填技术把3 岬的c 1 8 反相多孔填料装填在超薄色谱饼( 1i t l l t l 1 0m m i d ，7 8 “l ) 中，用于7 种标准蛋白混合物的分离。首次比较了小柱床体积的色谱饼和 大柱床体积的色谱柱( 5 0i t l r n 4 6i i l i ni d ，8 3 0i l l ) 分离小分子和整体蛋白的效果。由 于小分子在色谱柱( 饼) 床上的迁移是连续的，导致色谱饼分离小分子的效果远远差于 色谱柱。而蛋白质在液固界面存在“粘附能”，使得蛋白质在色谱柱( 饼) 床上的迁移 是不连续，造成色谱饼分离蛋白质的效果与色谱柱相当。由于色谱饼内径大柱长短的特 殊结构，其动力学性质远好于色谱柱，可以在高达1 0m l m i n 的流速下使用。在优化条 件下用色谱饼在3 0s 内分离了7 种蛋白。在5m i n 内连续5 次快速分离蛋白质。表明当 固定相和蛋白质之间的作用力是非选择性作用力时，一分钟整体蛋白液相色谱法是可以 实现的。在1m i n 内还基线分离了总量是lm g 的7 种蛋白的混合物，实现了高速、高 分离度和高负载量的“三高”效果。该方法有希望用于临床例行分析。 3 多孔弱阳离子交换填料对整体蛋白的“三高 分离 t 比较了两种弱阳离子交换商品填料t s k g e lc m 5 p w 和p o l y c a t a 分离蛋白的效果， 填料p o l y c a t a ( 粒径，3 1 i m ；孔径，1 5 0n m ) 更适合实现一分钟整体蛋白液相色谱法。 p o l y c a ta 色谱饼( 1r n n l 1 0r a i ni d ) 和色谱柱( 5 0m m 4 6a i mi d ) 的分离能力 相当。然而，色谱饼的动力学性质更好。在优化的条件下，在1 8s 内分离了4 种标准蛋 白。分离速度比整体固定相和无孔填料都要快，分离效果也更好。在1 0m i n 内连续进 行了1 0 次的蛋白分离，证明了当固定相和蛋白质之间的作用力是静电相互作用力时， 也可以实现一分钟整体蛋白液相色谱法。另外用p o l y c a t a 色谱饼在1m i n 内快速分离 了总量lm g 的4 种蛋白混合物。 4 无孔疏水填料快速分离整体蛋白 用装填2 5 岫的无孔疏水填料的色谱饼( 1 0m i l l 1 0r a n li d ) 和色谱柱( 3 5i i i l t i 4 6n 1 1 1 1i d ) 来分离蛋白质。在优化的条件下，用色谱柱在3 5m i n 内可以分离7 种蛋 白的混合物，而使用色谱饼仅仅需要2 1m i n 就可以完成类似的分离。色谱饼的动力学 性质更好，可以在更大的流速下分离蛋白质，更适合快速分离。尽管得到的结果大于1 m i n ，但是比较接近一分钟整体蛋白液相色谱法的目标。 5 无孔反相色谱填料对整体蛋白的“三高 分离 用装有1 0g m 无孔反相填料色谱饼( 7 5n l l n 1 0m i i li d ) 首次在常规色谱条件下1 r a i n 分离1 嵋和4 0 鸺的7 种标准蛋白，并且在lm i n 内几乎完全分离o 5m g 该7 种蛋 白的混合物，达到高速、高分离度和高负载的“三高”效果。开辟了用常规液相色谱仪快 速分离高负载蛋白的新途径。 6 多孔二维色谱( s a x h i c ) 填料及其在疏水模式下的一分钟整体蛋白色谱法 与相应模式的一维色谱填料相比，二维色谱填料有改善分离选择性的优点，因此合 成了一种多孔强阴离子交换疏水相互作用二维色谱( s a x h i c ) 填料来改善填料在h i c 模式下的分离能力。用该填料装填的二维色谱饼( 1m l n 1 0m i l li d ) 在h i c 模式下分 离蛋白。在5m l m i n 流速下1m i n 内不仅快速分离了6 种蛋白质，还平衡了色谱柱。 其分离速度和效果是一般的疏水填料难以达到的。该结果证明了由疏水相互作用力控制 的疏水色谱完全可能实现一分钟整体蛋白色谱法。 关键词：快速分离，色谱饼，整体蛋白，多孔固定相，无孔固定相，不连续迁移，高负 载量 i i a b s t r a c t t h es t u d yo nt h es e p a r a t i o no fi n t a c tp r o t e i n si np r o t e o m i c s ，p r o t e i nd r u g sa n dt h e p u r i f i c a t i o n o fp r o t e i n si nn a t i v e p l a n t s a n da n i m a l sn e e dv e r yf a s t s e p a r a t i o nb y h i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) p e t e rc a r t sg r o u ps u g g e s t e d t h a t o n e - d i m e n s i o n a ll i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( 1d l c ) s h o u l db ea c c o m p l i s h e di n1 10m i n u t e s ， a n dt w o - d i m e n s i o n a ll c ( 2 d l c ) s h o u l db ea c c o m p l i s h e di n10 10 0m i n u t e s a l t h o u g hi t a i m e da tp e p t i d e s ，t h es u g g e s t i o nc o u l db ea l s ou s e da sa l li m p o r t a n tr e f e r e n c ec r i t e r i o no f p r o t e i ns e p a r a t i o n b a s e do nd i s c o n t i n u o u sm i g r a t i o no fp r o t e i n so nl i q u i d - s o l i di n t e r f a c ea n d n e wc o l u m nt e c h n o l o g yo fc h r o m a t o g r a p h i cc a k e ，o n em i n u t e - l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( o m l c ) o fi n t a c tp r o t e i n sw h i c hh a sb e e nad r e a mo fs e p a r a t i o ns c i e n t i s t sf o ral o n gt i m ei sf i r s t l y e s t a b l i s h e di nt h et h e s i s c o m p a r e dw i t hc o n v e n t i o n a lf a s ts e p a r a t i o no n l yi n v o l v i n gt h e p r o c e s so fp r o t e i ns e p a r a t i o ni t s e l f , t h eo m l ci n c l u d e st h et o t a lt i m eo fs e p a r a t i o na n d c o l u m nr e g e n e r a t i o n t h eo m l cw a st e s t e dw i t hr e v e r s e d p h a s el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( r p l c ) ，i o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y ( i e c ) ，h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o nc h r o m a t o g r a p h y ( h i c ) u s i n gs t a n d a r dp r o t e i n su n d e rt h ec o n d i t i o nt h a ti nc o m p a r i s o nw i t ht h e i rc o r r e s p o n d i n gt o c o n v e n t i o n a ll c ，t h er e s o l u t i o no fi n t a c tp r o t e i n si n t h i st h e s i sd o e sn o ts i g n i f i c a n t l yl o s e b e s i d e sh i g hs p e e da n dh i g hr e s o l v i n gp o w e r , t h et e c h n o l o g yh a st h ea d v a n t a g e so fh i g h l o a d i n gc a p a c i t y t h et h e s i si n c l u d e st h ef o l l o w i n gs i xs e c t i o n s ： 1i n t r o d u c t i o n t h es i g n i f i c a n c eo ff a s ts e p a r a t i o nb yl cw a sb r i e f l yi n t r o d u c e d o n e d i m e n s i o n a l m e t h o d so fr a p i ds e p a r a t i o no fi n t a c tp r o t e i n si n c l u d i n gn o n - p o r o u ss t a t i o n a r yp h a s e ， m o n o l i t h i c s t a t i o n a r yp h a s e ，p e r f u s i o nc h r o m a t o g r a p h y , h i g ht e m p e r a t u r e f a s t c h r o m a t o g r a p h ya n dc h r o m a t o g r a p h i cc a k ew e r es i m p l yi n t r o d u c e da n dr e v i e w e d b o t h c o n v e n t i o n a lt w o d i m e n s i o n a ll i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( 2 d l c ) a n dt w o - d i m e n s i o n a ll i q u i d c h r o m a t o g r a p h yu s i n go n l yas i n g l ec o l u m n ( 2 d l c 一1c ) w h i c he x h i b i t se x c e l l e n tr e s o l u t i o n i nt w om o d e sw e r ea l s oi n t r o d u c e da n dr e v i e w e d 2s e p a r a t i o no fi n t a c tp r o t e i n sw i t hp o r o u sr e v e r s e d - p h a s ep a c k i n g sw i t hh i g hs p e e d ， h i g hr e s o l u t i o na n dh i g hs a m p l el o a d i n g i i i u l t r a s h o r tc h r o m a t o g r a p h i cc a k e ( 1i n l n 1 01 1 1 1 1i d ，7 8p l ) p a c k e dw i t h3l m ap o r o u s c l sr e v e r s e d p h a s ep a c k i n g sf r o ml a t e r a lh o l eo ft h ec a k ew a se m p l o y e df o rt h es e p a r a t i o no f s e v e ns t a n d a r dp r o t e i n s t h er e s o l u t i o nf o ri n t a c tp r o t e i n sa n ds m a l ls o l u t e sb e t w e e ns u c ha s m a l lp a c k e db e dv o l u m eo fc h r o m a t o g r a p h i cc a k ea n dal a r g ep a c kb e dv o l u m eo fc o l u m n ( 5 0i t l l n 4 6i t l l ni d ，8 3 0 止) w e r ef i r s t l yc o m p a r e d c o n t i n u o u sm i g r a t i o no ft h es m a l l m o l e c u l e si nt h ep a c k e db e do fc o l u m na n dc a k er e s u l t e di nt h a tt h er e s o l u t i o no fs m a l l s o l u t e sw a se x t r e m e l yp o o r e r 、) i ，i t l lt h ec a k et h a nt h ec o l u m n , b u td u et ot h ee x i s t e n c eo f “a d h e s i v ee n e r g y ”o fi n t a c tp r o t e i n so nt h el i q u i d s o l i di n t e r f a c et h ed i s c o n t i n u o u sm i g r a t i o n o fi n t a c tp r o t e i n sr e s u l t e di na l m o s tt h ec o m p a r a b l er e s o l u t i o nb e t w e e nt h ec a k ea n dt h e c o l u m n h o w e v e r , t h ec a k eh a v i n gb e t t e rh y d r o d y n a m i cp r o p e r t yt h a nc o l u m ns h o w e d m o d e r a t eb a c kp r e s s u r ea th i g hf l o wr a t eu pt o10m l m i n u n d e ra no p t i m i z e dc o n d i t i o n , t h e m i x t u r eo fs e v e np r o t e i n sw a sc o m p l e t e l ys e p a r a t e di n3 0s f i v ec o n s e c u t i v es e p a r a t i o n s w i t h i n5m i n u t e sw e r ec a r r i e do u tw i t ht h ec a k ea l s o ，i n d i c a t i n go n em i n u t e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( o m l c ) o fi n t a c tp r o t e i n s c a nb ea c c o m p l i s h e dw h e nt h em o l e c u l a r i n t e r a c t i o n sb e t w e e np r o t e i na n ds t a t i o n a r yp h a s ei sn o n - s e l e c t i v ef o r c e t h eo m l ch a sb e e n ad r e a mo fs e p a r a t i o ns c i e n t i s t sf o ral o n gt i m en o wb e c o m e sr e a l i s m t h em i x t u r eo fs e v e n p r o t e i n sw a sw e l ls e p a r a t e dw i t h i n1m i n u t eu n d e rt h es a m p l el o a d i n go f1m ga n dt h u st h e s e p a r a t i o no fi n t a c tp r o t e i n si nt h i sc i r c u m s t a n c ea l s oa c h i e v e st h e t h r e eh i g h p u r p o s eo f 1 1 i g hs p e e d ，h i g hr e s o l u t i o na n dh i g hs a m p l el o a d i n g t h em e t h o di se x p e c t e dt ob eu s e di n c l i n i c a l l yr o u t i n ea n a l y s i s 3 s e p a r a t i o no fi n t a c tp r o t e i n su s i n gp o r o u sw e a kc a t i o n e x c h a n g ep a c k i n g sw i t h “t h r e e h i g h p u r p o s e t h ec o m p a r i s o no fs e p a r a t i o n so fi n t a c t p r o t e i n s 、析t h t w oc o m m e r c i a lw e a k c a t i o n - e x c h a n g ep a c k i n g s ，t s k g e lc m 5 p wa n dp o l y c a ta ，w a sc a r r i e do u t i tw a sf o u n d t h a tp o l y c a ta ( p a r t i c l es i z e ，3p a n ；p o r es i z e ，15 0n n l ) w a sm o r es u i t a b l ef o ra c h i e v i n gt h e o m l c t h er e s o l u t i o no ft h ep o l y c a ta c a k e ( 11 1 1 1 1 1 10r n r ni d ) w a sc o m p a r a b l e 晰t ht h e p o l y c a tac o l u m n ( 5 01 1 1 1 1 1 4 6n l mi d ) h o w e v e r , t h ec a k es h o w e db e t t e rh y d r o d y n a m i c p r o p e r t yt h a nt h ec o l u m n t h ec o m p l e t es e p a r a t i o no f4 s t a n d a r dp r o t e i n sw a sa c h i e v e di n18 su n d e ra l lo p t i m i z e dc o n d i t i o n 、 ，i n lt h ec a k e t h es p e e da n dr e s o l u t i o ni sb e t t e rt h a n n o n - p o r o u ss t a t i o n a r yp h a s ea n dm o n o l i t h i cs t a t i o n a r yp h a s er e p o r t e di nl i t e r a t u r e s t e n i v c o n s e c u t i v es e p a r a t i o n sw i t h i n10m i n u t e sw e r ec a r r i e do u tu s i n g t h e c a k e ，r e a l l y a c c o m p l i s h i n gt h eo m l c ，w h e nt h em o l e c u l a ri n t e r a c t i o nb e t w e e np r o t e i na n ds t a t i o n a r y p h a s ei se l e c t r o s t a t i cf o r c e a l s o ，f a s ts e p a r a t i o nw a sa c h i e v e di n1 m i n u t eu n d e rt h el o a d i n g o f1m gm i x t u r eo f4p r o t e i n s 4 f a s ts e p a r a t i o no fp r o t e i nw i t hn o n - p o r o u sh i cp a c k i n g s b o t ht h ec h r o m a t o g r a p h i cc a k e ( 1 0n l n l 1 0n l n li d ) a n dc o l u m n ( 3 51 1 1 1 1 1 4 6m n li d ) p a c k e dw i t h2 5g r nn o n p o r o u sh i cp a c k i n g sw e r ee m p l o y e df o rt h es e p a r a t i o no fs t a n d a r d p r o t e i n s u n d e ro p t i m i z e dc o n d i t i o n s ，t h em i x t u r eo f s e v e np r o t e i n sc o u l db es e p a r a t e dw i t h i n 3 5m i n 嘶t ht h ec o l u m n a n dac o m p a r a b l er e s o l u t i o nw a so b t a i n e di n2 1m i n 晰t ht h ec a k e t h ec a k e ，w h i c hc a nb eu s e da th i g h e rf l o wr a t e ，i sm o r es u i t a b l ef o rf a s ts e p a r a t i o nd u et oi t s b e t t e rh y d r o d y n a m i cp r o p e r t y a l t h o u g ht h er e s u l ti sm o r et h a no n em i n u t e ，i ti sc l o s e d ( 2 - 3 5 m i n ) t ot h eo m l c 5 s e p a r a t i o no fi n t a c tp r o t e i n sw i t h “t h r e eh i g h ”p u r p o s eu s i n gn o n p o r o u sr p l c p a c k i n g s a c h r o m a t o g r a p h i cc a k e ( 7 5t o n i 1 0n n n i d ) h a v i n gl a r g e rd i a m e t e rt h a ni t st h i c k n e s s i sf i r s t l ye m p l o y e dt oc o m p l e t e l ys e p a r a t e1 0g ga n d4 0g go ft h em i x t u r eo fs e v e ns t a n d a r d p r o t e i n sw i t h i n1m i n u t eu n d e rc o n v e n t i o n a lc h r o m a t o g r a p h i cc o n d i t i o n s a l s o ，0 5m g o ft h e m i x t u r ew a sa l m o s tc o m p l e t e l ys e p a r a t e dw i t h i n1m i n u t e t h em i x t u r eo fp r o t e i n sw a s s e p a r a t e dw i t hh i g hs p e e d ，h i g hl o a d i n ga n dh i g hr e s o l u t i o n an e wa p p r o a c hf o rr a p i d s e p a r a t i o no fp r o t e i n sw a sp u tf o r w a r du s i n gc o n v e n t i o n a lh p l c u n d e rh i g hl o a d i n g 6 p o r o u s2 d ( s a x - h i c ) p a c k i n g se m p l o y e df o rt h eo m l ci nh i cm o d e t a k i n gt h ea d v a n t a g eo ft w o d i m e n s i o n a lp a c k i n g s ( 2 d - p a c k i n g s ) h a v i n gab e t t e r s e l e c t i v i t y t h a ni t s c o r r e s p o n d i n g o n ed i m e n s i o n a l p a c k i n g s ，a k i n do f p o r o u s t w o d i m e n s i o n a lp a c k i n g so fs t r o n ga n i o n - e x c h a n g e ( s a x ) a n dh i cw a ss y n t h e s i z e d t h ep a c k e d2 d ( s a x - h i c ) c a k e ( 1m n l 10t o n ii d ) w a su s e dt os e p a r a t es t a n d a r d p r o t e i n si nh i cm o d e t h em i x t u r eo fs i xs t a n d a r dp r o t e i n sc o u l db ea l m o s tc o m p l e t e l y s e p a r a t e da n dt h ec a k ew a sr e g e n e r a t e dw i t h i no n e m i n u t eu n d e rt h ef l o wr a t eo f5m l m i n s u c haf a s ta n dg o o dr e s o l u t i o nc o u l dn o tb eo b t a i n e dw i t hn o r m a l l yc o m m e r c i a lh i c c o l u m n s t h i sf a c ti n d i c a t e st h a to m l ci sv a l i d l yc a r r i e do u tf o rt h er e t e n t i o nm e c h a n i s mo f p r o t e i nd o m i n a t e db yh y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o nf o r c e v k e y w o r d s ：f a s ts e p a r a t i o n ，c h r o m a t o g r a p h i cc a k e ，i n t a c tp r o t e i n ，p o r o u ss t a t i o n a r yp h a s e ， n o n p o r o u ss t a t i o n a r yp h a s e ，d i s c o n t i n u o u sm i g r a t i o n ，h i g hl o a d i n gc a p a c i t y v i 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。学校 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许 论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所等机构将本学位论 文收录到中国学位论文全文数据库或其它相关数据库。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：王垫指导教师签名：! j 迅h 主墨 如f o 年6 月f 6 日 狮年6 刖日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的 研究成果，也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同 工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：王楚 如f o 年6 月l6 日 西北大学博士学位论文 第一章绪论弟一早三百t 匕 快速高效液相色谱法已经广泛用于日常分析、方法的建立、过程监测和质量监控等 领域。分离的快慢很大程度上决定了它在这些领域的进一步发展。分析一个样品的流程 是先预处理样品；再色谱分析；然后数据处理；再传输信息；最后使用信息。在该流程 中样品预处理和色谱分析是整个流程的限速步骤。样品预处理可以采用平行处理大量样 品的方法来节约时间；对于色谱分析来说一次只能分析一个样品，因此色谱分析的快慢 决定了整个流程的速度。 快速的分析方法可以作为在线实时监测器，用来减少生产时间和成本【l 】。色谱法可 以同时进行多组分分析，因此比其它的在线监测方法，比如说光学方法和电化学方法， 更具优势。 快速高效液相色谱法在日常的实验室分析工作中具备很大的优势。色谱法已经越来 越多的用于获得蛋白质等生物大分子的结构、分子相互作用力和分子水平上色谱过程的 信息。通过加速分析的速度，提高仪器的利用率，增加工作量和效率。 对于复杂样品的分离来说，需要使用二维( 多维) 色谱，第二维的分离时间是由采 样速率和第一维的流速决定的。根据具体的应用，第二维的分离通常需要在2 0s 到几分 钟内完成【2 1 。因此，也需要发展快速分离方法。 c a r r 研究小组最近提出：考虑到样品的复杂性，一维梯度分离应该在1 1 0m i n 内完 成，二维梯度分离应该在1 0 1 0 0m i n 内完成【3 】o 虽然该建议并不完全适用于整体蛋白， 但是它可以作为整体蛋白快速分离的一个重要的参考标准。 在本章中，介绍了蛋白质色谱分离方法和计量置换理论、一维色谱法快速分离蛋白 质、二维色谱法快速分离蛋白质和本论文研究的内容。 1 1 蛋白质色谱分离方法及计量置换理论 1 1 1 蛋白质色谱分离方法 蛋白质分子量通常在几万到几十万道尔顿之间，有复杂的三级和四级结构。蛋白质 分子表面有疏水区域，也有羧基和氨基等亲水的氨基酸残基，因此可以有多种色谱方法 来分离蛋白质。常见的方法有反相色谱法( r e v e r s e d - p h a s ec h r o m a t o g r a p h y , r p c ) 、疏水 相互作用色谱法( h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o nc h r o m a t o g r a p h y , h i c ) 和离子交换色谱法 ( i o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y , i e c ) 等。r p c 是利用蛋白质表面的疏水区域和固定相 l 第一章绪论 上的疏水配基之间的强疏水相互作用力大小的差异来进行分离的，常使用有机相梯度洗 脱。由于和固定相之间有强疏水相互作用，并且在有机物环境中，因此蛋白质常变性。 h i c 也是利用疏水性的差异来分离的，但是疏水相互作用力小，使用盐水溶液梯度洗脱 分离，可保持蛋白质的活性。i e c 是利用蛋白质表面所带净电荷与固定相配基上所带电 荷的静电相互作用力的差异来进行分离的。 在理想情况下，蛋白质和色谱固定相的相互作用被认为是上述的单一的模式。事实 上，蛋白质和色谱固定相之间的相互作用涉及多种模式。比如说蛋白质与固定相的载体 或连接配基的空间臂之间存在相互作用力，有人把这种作用力叫做次级作用力。和次级 作用力不同的是，混合模式色谱( m i x e d - m o d ec h r o m a t o g r a p h y ) 有意使用含有多种结合 位点的配基来影响蛋白的分离过程。与单一色谱模式相比，混合色谱增强了选择性，减 少蛋白质纯化步骤，增加了负载量，解决原来一些难以解决的蛋白纯化和分离问题。已 有混合模式色谱的综述报道【4 ，5 】。 1 1 2 计量置换理论 对于每种色谱分离方法，都有相应的机理解释。比如说：反相色谱的疏溶剂化理论 【6 ，7 1 和溶解度参数模型引，疏水色谱的熵增原理吲和优先水化作用机理【l o 】，离子交换色谱 的静电作用模型。 计量置换保留理论( s t o i c h i o m e t r i cd i s p l a c e m e n tt h e o r y , s d t ) 认为每摩尔的溶剂化 溶质吸附在溶剂化固定相表面上，会计量置换出一定物质的量的溶剂。这种计量置换与 溶质分子同固定相间的相互作用力种类无关。因此，s d t 适合于r p c 、i e c 和h i c 这3 种机理的解释。最近的研究表明s d t 也适合于混合模式色谱【1 1 】。 s d t 有两组重要的线性方程： l o g k = l o g i z l o g d 】 ( 1 1 ) l o g = j z - l o g 妒 ( 1 2 ) k 是蛋白质的容量因子； 纠是流动相中置换剂的摩尔浓度。这两组线性方程中有4 个重要的参数：l o 矿、z 、j f 、l o g r p 。每个参数都有物理意义。l o 矿代表了蛋白质和固定相 的亲和势的大小；z 是计量置换出的溶剂的物质的量；，表示每摩尔溶剂对固定相的亲 和势；藏示柱相比。这4 个参数的大小与分子构象、溶质与固定相作用力以及色谱条 件有关，为蛋白质的色谱理论研究提供了丰富的信息。 2 西北大学博士学位论文 1 2 一维色谱法快速分离蛋白质 快速分离蛋白质的一维色谱方法主要有非多孔固定相( n o n - p o r o u ss t a t i o n a r y p h a s e ) 、 整体固定相( m o n o l i t h i cs t a t i o n a r yp h a s e ) 、灌注色谱法( p u r f u s i o nc h r o m a t o g r a p h y ) 、高 温快速色谱法( h i g ht e m p e r a t u r ef a s tc h r o m a t o g r a p h y ) 和色谱饼( c h r o m a t o g r a p h i cc a k e ) 。 1 2 1 非多孔固定相 非多孔固定相也叫微薄壳固定相( m i c r o p e l l i c u l a rs t a t i o n a r yp h a s e ) 1 1 2 】。早在2 0 世纪 8 0 年代中期，非多孔固定相就用于高效液相色谱法快速分离分析蛋白质。典型的非多孔 固定相包括两个部分，一个是流动相不能进入的载体，另一部分是吸附或键合在载体表 面的一层功能基团。非多孔固定相不存在固定相颗粒孔内的扩散传质，非常适合快速高 效高分离度分离蛋白质【1 3 】。由于固定相的非多孔结构，消除了蛋白质在固定相孔内扩散 造成回收率的损失，因此可以得到更好的质量和活性回收率。 1 1 1 1 硅胶基质非多孔固定相 硅胶的机械强度高，抗高压能力强，被广泛用作固定相的载体。从1 9 8 6 到1 9 8 7 年， u n g e r 小组把正十八烷基和正辛基键合在直径1 5p m 的非多孔硅胶颗粒上，分离了蛋白 质和多肽【1 4 。1 6 】。他们把这些非多孔固定相装填在色谱柱( 3 5n l n l 8m i l li d ) 中，有效 的分离了蛋白质混合物和多肽的混合物。由于使用了反相固定相和有机流动相，造成蛋 白质变性，损失生物活性。随后，他们在该颗粒的表面键合氨基和醚基，在5m i n 内快 速分离了蛋白质，同时得到高的活性回收率f 1 7 】。k a l g h a t g i 等在直径2i , t m 非多孔硅胶载 体上键合了十八烷基，用色谱柱( 3 0n l n l 4 6m n li d ) 在4m l m i n 流速下2 0s 内的 分离了5 种蛋白质的混合物，每种蛋白的量在2 5 5 0n g f 日- - j i s , 1 9 1 。b o n n 等把2p , m 的环 氧化非多孔硅胶与亚氨基二乙酸反应，合成了金属亲和色谱固定相并快速的分离了蛋白 2 0 1 。c h e n 等【1 2 】使用2 岬的非多孔固定相，在1 2 0 高温下，减小流动相的粘度，加速 了蛋白质的传质速率，在6s 内分离了4 种标准蛋白。1 9 9 9 年，i s s a e v a 等【2 1 】把1 5 岬 的非多孔反相硅胶填充在色谱柱( 1 5l r l l i lx4 6m l ni d ) 中，在4m l m i n 的流速下6s 内分离了6 种蛋白，这是目前文献记载的最快的分离方法。2 0 0 0 年，w a g n e r 等口2 1 用1 5 g m 的无孔填料装填的色谱柱( 1 4m l t l 4 6t o n ii d ) 在3 0s 内分离8 种蛋白，其中m y o 和c o n 的色谱峰重叠较明显，因此该色谱柱可以基线分离7 种标准蛋白，其色谱图如 1 1 所示。 3 第一章绪论 01 02 03 04 0 5 0 t i m