（动物学专业论文）大仓鼠ssr座位的筛选及黑线仓鼠mhc基因的克隆与序列分析.pdf

摘要 大仓鼠( t s c h e r s k i at r i t o n ) 和黑线仓鼠( c r i c e t u l u sb a r a b e n s i s ) 在我国分布范围广，繁殖 力极强，是危害农业、传播疾病的有害动物，因此本论文主要针对这两类害鼠展开分子生 物学方面的研究。 微卫星是一种较好的分子遗传标记，在种群进化研究、种群结构分析、遗传多样性等 研究中得到了广泛的应用。大仓鼠( t s c h e r s k i at r i t o n ) 是广泛分布于我国长江以北的重要害鼠 之一。过去关于大仓鼠微卫星座位的筛选、利用其进行遗传多样性研究的报道较少。研究 一使用经典的酚氯仿抽提法从保存于7 0 的肝脏组织中提纯北京顺义、河北固安、饶 阳等地区大仓鼠的基因组d n a ，并利用大仓鼠近缘种一原仓鼠( c r i c e t u sc r i c e t u s ) 、金仓 鼠( m e s o c r i c e t u sa u r a t u s ) 和黑线仓鼠( c r i c e t u l u sb a r a b e n s i s ) 的1 0 对微卫星引物( l o c 1 至l o c 6 ；s s r l 至s s r f l1 ) ，通过p c r 扩增筛选大仓鼠的微卫星座位，并对可能含有微 卫星的阳性克隆进行测序，最终得到3 3 个微卫星序列。利用b l a s t 序列分析软件对 g e n b a n k 数据库进行检索，没有找到同源性一致的相应微卫星序列，表明3 3 个大仓鼠微 卫星序列都是首次发现的。注册序列的g e n b a n k 登陆号为e f 6 9 0 6 7 3 e f 6 9 0 6 9 3 ， e u l 4 0 8 2 5 - 一e u l 4 0 8 3 6 。这些微卫星序列可以分成三类：完美型占3 9 4 ，非完美型占 2 4 2 ，复合型占3 6 4 。另外可见重复次数在8 - 2 0 的微卫星序列最多，占6 0 6 ，重复 次数在2 1 次以上的占3 9 4 。大部分微卫星序列的二核苷酸重复次数均在1 2 以上，可以 进行后续大仓鼠微卫星引物设计和相应的种群多态性分析。 主要组织相容性复合体( m h c ) 是由紧密连锁、高度多态的基因位点所组成的染色体上 的一个区域，m h c 基因具有高度多态性，对于维持种属的生存与延续具有重要的生物学意 义。m h c 的突出特性及其重要的功能使其在免疫遗传学、群体遗传学和抗病育种学等领域 具有独特的效力。 研究二应用m h ci 类基因来探讨黑线仓鼠种群间的遗传结构，寻找分子遗传标记。根 据已报道的四个黑线仓鼠m h ci 类基因序列以及入、大鼠和小鼠的相应序列，设计了一 对特异性引物( s s l ) ，从临沂沂南、潍坊临朐及曲阜吴村三个种群的黑线仓鼠基因组d n a 中扩增了编码m h ci 类0 【2 结构域的基因片段，并进行测序，得到的g e n b a n k 序列登 录号为：f j 6 1 9 11 2 - f j 6 1 9 1 8 3 。结果表明：( 1 ) 黑线仓鼠m h ci 类砣结构域的序列多 态性较为丰富，2 5 5b p 长度中有4 1 个多态位点，多态位点百分率为1 6 0 8 ；( 2 ) 群体 间遗传多样性存在差异：多态位点百分率为吴村( 1 4 5 1 ) 临朐( 1 3 7 3 ) 沂南( 1 2 5 5 ) ； 核苷酸多样性指数( p i ) 为临朐( 0 0 5 2 7 8 ) 吴村( o 0 5 0 9 7 ) 沂南( o 0 4 8 8 4 ) ；平均核 苷酸差异数目( k ) 值为临朐( 1 3 4 5 8 ) 吴村( 1 2 9 9 8 ) 沂南( 1 2 4 5 4 ) ；单倍型多样 性指数( h d ) 都很高，说明编码m h ci 类分子0 l 2 结构域基因的核苷酸序列的变异较大； 基于单个多念位点的群体动态的遗传参数( 0 m ) 值则为吴村( o 0 3 5 7 5 ) 临朐( o 0 3 4 3 6 ) 沂南( 0 0 3 0 2 6 ) ；( 3 ) 三个地理种群的氨基酸序列中均存在与抗原多肽结合的位点， 且极其保守，序列编码区的蛋白质预测图均包含g t 螺旋和1 3 折叠，吴村种群a 螺旋略 有差异；( 4 ) 种群间的遗传分化指数接近，单倍型出现交叉，说明三个种群间的遗传分 化不明显；( 5 ) 多态性丰富的编码m h ci 类分子以结构域的基因序列，适宜作为黑线 仓鼠不同群体的分子遗传标记。 研究三对m h ci i 类d q a 基因的外显子2 进行克隆和序列分析。提取黑线仓鼠3 个群体( 吴村、沂南和临朐) 的基因组d n a 构建基因池，利用p c r 扩增得到2 4 9b p 的目 的片段，将该目的片段连接到p m d l 8 t 载体中，重组质粒转入大肠杆菌d h 5 a 后利用 蓝白斑法筛选阳性克隆，测序后得到该目的片段的核苷酸序列( g e n b a n k 登录号：f j 2 0 9 3 0 6 ) 并推导出氨基酸序列。结果表明：黑线仓鼠、人、大鼠、小鼠、猪、马、牛、兔之间d 鲥 基因外显子2 的核苷酸序列同源性为6 8 7 - - 8 5 ，氨基酸序列同源性为5 6 8 - - 8 3 5 ， 黑线仓鼠与大鼠、小鼠亲缘关系更近。测序得到的d 剑基因外显子2 序列具有丰富的种 间多态性，可以作为物种遗传分析的分子标记。 关键词：大仓鼠；s s r 座位；黑线仓鼠；m h ci 类0 【2 结构域； m h c i i 类；d 幽基因；遗传变异 a bs t r a c t t h el a n d s c a p e so ft s c h e r s k i at r i t o na n dc r i c e t u l u sb a r a b e n s i si nc h i n a a r ev e r ye x t e n s i v e t h e t w os p e c i e sh a v es t r o n gr e p r o d u c t i v ea b i l i t y , a n dc a nb ec o n s i d e r e da sd e l e t e r i o u sa n i m a l s f o ra g r i c u l t u r e i nt h e s ee x p e r i m e n t st h ea u t u o rp r o g r e s s e dm o l e c u l a rs t u d yo f t h e m m i c r o s a t e l l i t es e q u e n c ei sa ne f f e c t i v ek i n d a r ew i d e l yu s e di ne v o l u t i o ns t u d y 、s t r u c t u r e o fg e n e t i cm a r k e rf o rm o l e c u l a rr e s e a r c h t h e y a n a l y s i sa n dg e n e t i cd i v e r s i t y i np o p u l a t i o n s t s c h e r s l c i 口t r i t o n ，a so n ec a t e g o r yo fb a n d i c o o t s ，i se x t e n s i v ei nt h en o r t ho ft h ey a n g t s e r i v e r 1 1 1 e r ew e r el i t t l eo u t c o m eo fm i c r o s a t e l l i t ef i l t r a t i o n 、g e n e t i cd i v e r s i t yu s i n g i nt s c h e r s k i at r i t o n b e f o r e 。t h e r e f o r e ，t h ef i r s te x p e r i m e n tu s e dt h el i v e rs p e c i m e no ft s c h e r s k i at r i t o np r e s e r v e dm 7 0 。ca l sm a t e r i a l st oe x t r a c ta n dp u f f yg e n o m i cd n a w i t ht h ec l a s s i cp h e n o la n dc h l o r o f o r m e x t r a c t i o nm e m o d t h em a t e r i a l sw e r ec o l l e c t e df r o ms h u n y io fb e i ji n ga n dg u a n ，r a o y a n go f h e b e i a c c o r d i n gt ot h ep c ra m p l i c a t i o n ，u s i n gt e nm i c r o s a t e l l i t el o c u sp r i m e r sf r o m l o c - 1t o s s r f l1o ft s c h e r s k i at r i t o n 7 r e l a t e ds p e c i e s - - c r i c e t u sc r i c e t u s 、m e s o c r i c e t u sa u r a t u sa n d c ，f c e f “，嬲b a r a b e n s i st or e c l a i ms p e c i f i cs e g m e n t so fd n a a f t e rp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n c h o o s et h ew h i t es p o t s ，m a k eu s eo fp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o nt of i l t r a t ep o s i t i v ec l o n e s ，g e t t h e 3 3s e q u e n c e sa n ds u b m i tt h e mt og e n b a n ka tl a s t t h e r ew e r en oc o n s i s t e n ts e q u e n c e s i n g e n b a r l ku s i n gb l a s ts o f t w a r e t h es u b m i s s i o nn u m b e r w a sf r o me f 6 9 0 6 7 3t oe f 6 9 0 6 9 3a n d 舶me u l 4 0 8 2 5t oe u l 4 0 8 3 6 i nt h e3 3m i c r o s a t e l l i t e s ，p e r f e c to n e sw e r e3 9 4 ，i m p e r f e c t s w e r e2 4 2 c o m p o u n d sw e r e3 6 4 t h em o t i fn u m b e rf r o m8t o2 0i nm o s tm i c r o s a t e l l i t e s 、) r a s6 0 6 a n dt h en u m b e re x c e e d2 1w a sa c c o u n tf o r3 9 4 m o s tm i c r o s a t e l l i t es e q u e n c e s h a dt h em o t i fn u m b e re x c e e d i n g12 t ot h i se x t e n t , t h e yw e r ef e a s i b l ef o rp r i m e rd e s i g n i n ga n d p o p u l a t i o np o l y m o r p h i ca n a l y s i s t h em a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x ( m h c ) i sas p e c i f i cc h r o m o s o m er e g i o nw h i c h h a s t i g h tl i n k a g ea n dh i g hp o l y m o r p h i cg e n e s i t i se x t r a o d i n a r yi m p o r t a n ti n e x i s t a n c ea n d m a i n t e n a n c eo fs p e c i e s t h ep r o m i n e n tc h a r a c t e r sa n df u c t i o n so fm h c h a v em a d ei te f f e c t i v ei n i m m u n eg e n e t i c s 、c o l o n yg e n e t i c sa n db r e e d i n gf o rd i s e a s er e s i s t a n c e m h cw a su s e d t os t u d y t h es t n 比t u r ea sam o l e c u l a rg e n e t i cm a r k e ri nt h r e ep o p u l a t i o n so fc r i c e t u l u sb a r a b e n s i si nt h e s e c o n de x p e r i m e n t b a s e do nf o u rr e p o r t e dm h cc l a s sig e n es e q u e n c e so fc r i c e t u l u s 6 d ，口6 p 胛s i s ，s e q u e n c e so fh u m a n ，r a ta n dm o u s e ，ap a i ro fs p e c i f i cp r i m e r sw a sd e s i g n e d ，m h c c l a s s10 【2g e n ef r a g m e n t sw e r ea m p l i f i e df r o mt h r e ep o p u l a t i o n si ny i n a n ，l i n q ua n dw u c u n a r e a s s h a n d o n gp r o v i n c e ，c h i n a ，t h e nc l o n e da n ds e q u e n c e d t h eg e n b a n kn u m b e rw a sf r o m f j 619112t of j 61918 3 t h em a j o rr e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ep o l y m o r p h i s mo ft h eg e n ee n c o d i n g m h cc l a s sia 2d o m a i ni nt h r e ep o p u l a t i o n so fc r i c e t u l u sb a r a b e n s i sw a sr i c h ，w i t h4 1v a r i a b l e l o c i i n2 5 5b pi nl e n g t h t h ep e r c e n t a g eo fp o l y m o r p h i s mw a s16 0 8 t h ep e r c e n t a g eo f p o l y m o r p h i s ma n dt h e t a ( p e rs i t e ) f r o ms ( o ) o fw u c u np o p u l a t i o nw e r eg r e a t e rt h a nl i n q u p o p u l a t i o n , w h i l ey i n a np o p u l a t i o nw a st h el e a s t t h en u c l e o t i d ed i v e r s i t y ( p i ) a n da v e r a g e n u m b e ro fn u c l e o t i d ed i f f e r e n c e s ( k ) o fl i n q up o p u l a t i o nw e r eb i g g e rt h a nt h eo t h e r s t h e h a p l o t y p ed i v e r s i t y ( h d ) i nt h r e ep o p u l a t i o n sw a sv e r yh i 曲，i n d i c a t i n gr e l a t i v e l yh i g hd i f f e r e n c e a m o n gn u c l e o t i d es e q u e n c e s i tw a sm a d eu po fc o n s e r v a t i v el o c ii na m i n oa c i ds e q u e n c e st o c o m b i n ea n t i g e no ft h r e ep o p u l a t i o n s t h e r ew e r ea l p h ah e l i x e sa n db e t ap u c k e ri nt h ep r o t e i n s t r u c t u r e ，b u tw u c u np o p u l a t i o nh a das m a l ld i f f e r e n c e t h ef i x a t i o ni n d e x ( f s t ) w a sn e g a t i v e a n ds i m i l a ri nt h e s e p o p u l a t i o n s m e a n w h i l e ，t h eh a p l o t y p ew a sc r o s s e d t h i sr e s u l t d e m o n s t r a t e dt h a tt h ed i f f e r e n t i a t i o no ft h r e ep o p u l a t i o n sw a su n c o n s p i c u o u s t h er i c h p o l y m o r p h i s mo fe n c o d e dm h c c l a s sim o l e c u l a ra 2c h a i ng e n ei ss u i t a b l ea sam o l e c u l a r g e n e t i cm a r k e rf o rd i f f e r e n tp o p u l a t i o n so fc r i c e t u l u sb a r a b e n s 括 i no r d e rt or e s e a r c ht h es t r u c t u r ea n dr u c t i o no fm h ci ig e n ei nc r i c e t u l u sb a r a b e n s 西，t h e g e n o m i cd n aw a sa l s oa b s t r a c t e df r o mt h ea b o v et h r e ep o p u l a t i o n s t h e2 4 9b pf r a g m e n to f e x o n2o fd q ag e n ew a sa m p l i f i e ds u c c e s s f u l l yb yp c ra n dc l o n e di n t op m d18 - tv e c t o r t r a n s f e rt h er e c o m b i n e dc a r r i e r si n t oe c o l id h 5 aa f t e rr e c o m b i n a t i o n t h ep o s i t i v ec l o n e sw e r e f u r t h e ri d e n t i f i e db yp c r t h en u c l e o t i d es e q u e n c eo ft h i sf r a g m e n tw a sa c q u i r e da n dt h e p e p t i d es e q u e n c ew a sd e d u c e d t h eg e n b a n kn u m b e rf o rt h ef o r m e rs e q u e n c ew a sf j 2 0 9 3 0 6 h o m o l o g i e so fn u c l e o t i d es e q u e n c ea n da m i n oa c i ds e q u e n c eo fe x o n2a m o n gc r i c e t u l u s b a r a b e n s i s ，h u m a n ，r a t ，m o u s e ，p i g ，h o r s e ，e a r l ea n dr a b b i tw e r ef r o m6 8 7 t o8 5 a n df r o m 5 6 8 t o8 3 5 r e s p e c t i v e l y s oc r i c e t u l u sb a r a b e n s i si sm o r es i m i l a rt or a ta n dm o u s e t h i s f r a g m e n ti sv e r yp o l y m o r p h i ca m o n gs p e c i e s ，a n dc a nb eu s e da sam o l e c u l a rm a r k e rt os t u d yt h e g e n e t i cd i v e r s i t yo fd i f f e r e n ts p e c i e s k e y w o r d s ：t s c h e r s k i a t r i t o n ；m i c r o s a t e l l i t el o c u s ；c r i c e t u l u sb a r a b e n s i s ； m h cc l a s sia 2d o m a i n ；m h ci i ；3 l q ag e n e ；g e n e t i cv a r i a t i o n i v 曲阜师范大学博士硕士学位论文原创性说明 ( 在口划“”) 本人郑重声明：此处所提交的博士口硕士哕论文大仓鼠s s r 座位 的筛选及黑线仓鼠m h c 基因的克隆与序列分析，是本人在导师指导下，在 曲阜师范大学攻读博士口硕士酽季位期间独立进行研究工作所取得的成 果。论文中除注明部分外不包含他人已经发表或撰写的研究成果。对本文的 研究工作做出重要贡献的个人和集体，均已在文中已明确的方式注明。本声 明的法律结果将完全由本人承担。 作者签名： 得尊辫 日期： 娜9 ：占矽 f 曲阜师范大学博士硕士学位论文使用授权书 ( 在口划“ ) 大仓鼠s s r 座位的筛选及黑线仓鼠m h c 基因的克隆与序列分析系本 人在曲阜师范大学攻读博士口硕士函学位期间，在导师指导下完成的博士 口 硕士噼位论文。本论文的研究成果归曲阜师范大学所有，本论文的研 究内容不得以其他单位的名义发表。本人完全了解曲阜师范大学关于保存、 使用学位论文的规定，同意学校保留并向有关部门送交论文的复印件和电子 版本，允许论文被查阅和借阅。本人授权曲阜师范大学，可以采用影印或其 他复制手段保存论文，可以公开发表论文的全部或部分内容。 篡豸掰军 篡掰乙 1 文献综述 1 1 大仓鼠的研究进展 大仓鼠( t s c h e r s k i at r i t o n ) 属于啮齿目( r o d e n t i a ) 、仓鼠科( c r i c e t i d a e ) 、大仓鼠属 ( c r i c e t u l u s ) ，又名地搬仓、大搬仓。成体身体呈棕灰色，长约1 3 0 - 1 7 0 m m ，重约8 0 1 2 0 9 ， 背部呈深灰色，体侧较淡，耳长约1 5 - - 一2 0 m m ，尾短，约5 0 - - 一7 0 m m ，一般不超过体长的 1 2 。大仓鼠是广泛分布于我国长江以北的重要害鼠之一，数量约占野栖鼠总量的2 7 1 4 。 尤其在豫北、豫东等黄河流域地区的农田占绝对优势。除农田外，大仓鼠在阔叶林、草地、 灌木丛等也有分布。栖息地十分广泛，如棉田、麦田、豆地、花生地、地边林中、坟地、 山坡田埂、堤崖、路边荒地等生境【1 1 。按照大仓鼠在我国的分布范围可将其划分为5 个亚 种，即指名亚种( c t 伊i t o n ) 、东北亚种( ct f u s c i p e s ) 、山西亚种( cf i n c a n u s ) 、甘肃亚种( c l c a n u s ) 、秦岭亚种( c tc o l l i n u s ) 。生态寿命一般为一年左右，每年繁殖1 3 窝，繁殖 期在3 至9 月份之间，妊娠高峰期出现在6 月及8 月1 2 。 过去我国学者对大仓鼠的研究主要包括以下方面： ( 1 ) 生理生化研究主要是大仓鼠的食性、活动节律、繁殖特征、能量代谢、气味诱导 等方面。张健旭等( 1 9 9 9 ) 从胁腺的形态、组织结构和化学成分等方面揭示了胁腺在繁殖期 间具有性识别的功能，证明身体的气味有性吸引和性识别作用。并研究了陌生成年大仓鼠 之间在非繁殖期间的气味偏好、性别选择以及两鼠间的行为关系【8 j 例。王淑卿等( 1 9 9 9 ) 通过 对大仓鼠消化道内各器官的长度和重量进行测定，发现消化道的长度、重量和容量的调节 是消化对策中的一个重要方面【1 1 】。王德华等( 2 0 0 0 ) 澳t j 定了大仓鼠在5 - - 3 6 * ( 2 范围内的能量 代谢特征，结合大仓鼠在我国的分布特点，认为生理生态特征可能是限制大仓鼠地理分布 的重要因素【l 2 。 ( 2 ) 种群生态学研究主要是大仓鼠的种群年龄结构组成、季节动态、年际动态和数量 预测预报等方面【3 ，4 】。吕国强等( 1 9 8 8 ) 通过分期捕捉和解剖，获得该鼠日食量、季节和食物 对活动规律的影响l5 1 。张知彬等采用j o l l y s e b e r 法估算了大仓鼠的种群大小、种群存留率 等参数，初步探讨了种群季节存活率的估算方法【6 】。张知彬等( 1 9 9 0 ) 提出大仓鼠种群季 节动态的模拟模型，通过估计模型中的各种参数，分析了1 9 8 6 年河北饶阳县大仓鼠种群 的实际夹捕数据，较好地阐明了大仓鼠的种群繁殖与增长特性【_ 7 1 。 ( 3 ) 细胞生物学研究主要是针对染色体的研究。杨晓斌等( 1 9 9 7 ) 研究了大仓鼠山西亚 种的染色体组型、g 带和c 带，发现与指名亚种有明显差异【l3 1 。王金星等( 1 9 9 9 ) 发现大仓 鼠的b 染色体为c 带阴性，不携带核仁组织者。这种b 染色体c 带阴性的特征在赤狐 ( v u l p e sv u l p e s ) 、褐家鼠( r a t t u sn o r v e g i c u s ) 和大林姬鼠( a p o d e m u sp e n i n s u l a e ) 朝鲜 亚种中亦有报道训。 ( 4 ) 分子生物学研究汪永庆等( 2 0 0 1 ) 研究发现种群的遗传多样性与季节种群密度呈负 相关、不同地区种群的遗传多样性与该种群和边缘区之问的距离呈正相关的结论，认为边 缘效应和片段效应是造成这种差异的主要因素【l5 - 1 7 】。谢佳燕等应用r a p d 技术检测华北地 区大仓鼠种群的遗传变异，结果表明大仓鼠在不同空间分布区内存在遗传多态性，基因流 和遗传漂变对种群的分化产生一定的作用i l 引。宋铭晶等通过筛选适合d i g 标记的探针，发 现大仓鼠不同地理种群个体的指纹图谱有较高的个体特异性和种群多态性【l9 1 。郭俣掣2 0 j 通过构建部分大仓鼠基因组文库，刘娟等【2 l 】将r a p d 技术与微卫星标记相结合，赵庆华等 瞄j 应用s n p s 标记，分别探讨了大仓鼠种群遗传多态性的变化与种群数量波动之间的关系。 1 2 分子标记及微卫星的研究进展 随着对染色体结构与功能的深入研究以及分子克隆技术的发展，进行遗传多样性检测 的遗传标记主要有：限制性片段长度多态性( r f l p s ) 、扩增片段长度多态性( a f l p s ) 、 随机扩增多态性d n a ( r a p d ) 、多位点d n a 指纹图谱、微卫星序列( s s r ) 等。 微卫星序y l j ( m i c r o s a t e l l i t e ，d n a ) ，又称简单序列重复( s i m p l es e q u e n c er e p e a t s ，s s r ) 或 短串联重复( s h o r tt a n d e mr e p e a t s ，s t r ) ，是由1 - - 6 个核苷酸为核心组成的串联重复序列。 这些序列广泛存在于真核生物的基因组中，因串联数目的变化而表现出高度多态性。 微卫星序列又可分为完美型、非完美型和复合型i 驯。完美型是指核心序列以不间断的 重复方式首尾相连构成的d n a ；非完美型微卫星是指在微卫星的核心序列之间有3 个以下 的非重复碱基，但两端的连续重复核心序列重复数大于3 ；复合型微卫星是指2 个或2 个 以上的串联核心序列由3 个或3 个以上的连续的非重复碱基分隔开，但这种连续性的核心 序列重复数不少于5 。 微卫星作为分子标记，具有以下特征【2 3 , 2 5 - 2 7 】：广泛、随机、均匀的分布于高等真核 生物的基因组中。两侧序列非常保守，且在等位基因间一般相同。多数微卫星序列无 功能，减少与增加几个重复序列的重复数目不会影响生物的正常生长发育，因而在品种间 具有广泛位点变异，与r f l p s 及r a p d 分子标记相比更具多态性。尤其对于使用常见分子 标记技术检测不出很多d n a 片段多态性的物种来说，具有更大的研究意义和应用前景。 微卫星序列孟德尔式遗传，呈共显性，对个体的鉴定具有特殊意义。仅需微量组织即 可检测，即使d n a 出现降解，也能有效地进行分析和鉴定。虽然在开始筛选重复序列 和引物设计过程方面速度较慢，但是一旦得到特异性引物，扩增结果常比较稳定。 微卫星的应用主要包括以下几方面：( 1 ) 通过分析多个标记或基因之间的连锁关系， 可将各个基因归为不同的连锁群，通过计算同一连锁群中不同基因之间的重组值，可以得 到不同基因在染色体上的相对位置，即遗传连锁图谱f 2 睨9 1 。( 2 ) 与人类遗传疾病相关的微 卫星序列，其长度在正常个体中有一定的阈值，因此，可以借助于序列的长度来预测个体 可能患病的风险及病情，甚至还可以预测可能发病的年龄。目前已知至少有1 2 种人类遗 传疾病，如肌强直性营养不良、肯尼迪综合征、亨廷顿病【3 m 3 1j 、i 型脊髓小脑共济失调症 和脆性x 综合症等都与微卫星序列的突变有关。( 3 ) 在动物及人类的亲权分析法医鉴定中， 以多个微卫星位点在一定群体中各等位基因的频率为基础，计算排除概率进行亲子鉴定。 2 ( 4 ) 微卫星序列较高的多态性使其在种群遗传结构和生物进化领域也有广泛的应用价值。 1 3 黑线仓鼠的研究进展 黑线仓鼠( c r i c e t u l u sb a r a b e n s i s ) 属于啮齿目、仓鼠科、仓鼠属，俗称中国地鼠( c h i n e s e h a m s t e r ) ，是典型的古北界动物，在我国分布范围极广，繁殖力极强，是危害农业、传播 疾病的有害动物。我国的黑线仓鼠可以分为5 个亚种，即兴安岭亚种( c 6 x i n g a n e n s i s ) ， 三江平原亚种( c b m a n c h u r i c u s ) ，长春亚种( c b f u m a t u s ) ，宣化亚种( c 6 g r i s e u s ) 和萨拉齐 亚种( c 6 o b s c u r u s ) 3 2 】。黑线仓鼠的生态寿命仅为1 0 个月左右，每年3 - - - , 4 月份开始繁殖， 一年中平均繁殖3 , - - , 4 胎【3 3 1 ，成体体重一般在3 0 - - 一4 0 9 之间。黑线仓鼠的栖息环境非常广 泛，主要栖于平原、丘陵、山地等各类地形的农田、山区河谷，在接近农田的草原、沼泽 地、灌木丛及林缘地区也有分布，尤其喜欢栖息于砂质土壤中。黑线仓鼠可使小麦减产 1 2 6 1 6 5 ，豆类减产9 6 - - - , 1 5 6 ，果园减产9 o 。我国学者在黑线仓鼠研究中取得 的成果主要包括以下方面： 种群生态学主要是年龄鉴定、年龄组成、种群数量动态及预测预报方面。卢浩泉等 【3 4 j 利用右侧上臼齿磨损程度法，张洁等【3 5 】利用去除内脏后的胴体重量法作为年龄鉴定的标 准，将黑线仓鼠划分为5 个年龄阶段，为确定种群数量动态奠定基础。姜运良等 3 6 禾1 j 用逐 步回归分析法，以与种群数量变化密切相关的因子作为自变量，以被预报月份的种群数量 作为因变量，借助计算机数据处理预报了山东阳谷、薛城在1 9 9 3 年的不同月份黑线仓鼠 种群的可能数量。 生理生化主要是在食性、活动节律、繁殖特征等方面。徐承水等( 1 9 9 2 ) 通过形 态解剖和组织切片手段，发现黑线仓鼠的睾丸重量与其曲细精管的直径在不同季节呈现规 律性变化，显微结构及组织化学特征也具有季节性特点，由此可以预测黑线仓鼠在不同季 节繁殖能力的变化【3 7 】。 细胞生物学徐承水等( 2 0 0 0 ) 对山东生曲阜孔林中不同月份黑线仓鼠睾丸的形态结 构及质量变化进行了观察和比较研列3 8 l 。徐承水等( 1 9 9 6 ) 通过显微和组织化学手段及体 视学等方法发现肾上腺皮质的体积密度与种群密度呈现正相关的关系【3 9 1 。 分子生物学李传海等【4 0 1 ，高倩等【4 1 】分别构建了黑线仓鼠的小片段基因组文库，从中 筛选黑线仓鼠的微卫星座位，并对序列进行测序，根据测定的重复序列设计微卫星引物进 而对黑线仓鼠不同地理种群间的遗传多态性进行检测和统计分析。吴瑾等【4 2 】对黑线仓鼠的 线粒体d n a 控制区进行了全序列的s n p s 分析，发现黑线仓鼠种群的遗传结构相对单一，进 化速度较慢，核苷酸变异频率低于0 0 1 。 总体来说，目f j 对黑线仓鼠遗传多样性的研究较为初步，以往的研究主要集中在形态、 生理、行为、分布、防治对策、种群数量动态及预测预报等方面。 1 4m h c 的研究进展 2 0 世纪初即已发现，在不同种属或同种不同系的动物个体间进行正常组织或肿瘤移植 时会出现排斥反应，它反映了供者与受者组织的不相容。其后的研究证明，排斥反应本质 上是一种免疫反应，是由组织表面的同种异型抗原诱导的。这种代表个体特异性的同种抗 原称为组织相容性抗原( h i s t o c o m p a t i b i l i t ya n t i g e n ) 或移植抗原( t r a n s p l a n t a t i o na n t i g e n ) t 4 3 。 机体内与排斥反应有关的抗原系统多达2 0 种以上，其中能引起强而迅速排斥反应的抗 原称为主要组织相容性抗原，其编码基因是一组紧密连锁的基因群，称为主要组织相容性 复合体( m a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x ，m h c ) 。 m h c 是脊椎动物中发现的编码免疫球蛋白样受体的具有高度多态性的基因群，其表达 产物分布于各种细胞的表面，称为m h c 抗原或m h c 分子。m h c 编码的细胞表面糖蛋白能 够与抗原肽发生结合，通过与t 细胞的相互作用，诱导和调节机体的免疫应答，从而激发 机体的特异性免疫反应，在机体免疫系统中发挥着非常重要的抗原递呈作用1 4 4 。 对m h c 本质的探究开始于1 9 5 0 年g e o r g es h e l l 的研究工作。1 9 5 1 年，唯一知道的m h c 是小鼠的h 2 系统，后来发现人类的h l a 系列抗原也为m h c 。1 9 6 1 年，s c h i e r m a n 和n o r d s k o g 确定家禽的m h c 是一种红细胞抗原，命名为b 复合体。到了2 0 世纪7 0 年代，人们发现在遗 传上与h 2 同源的系统同样存在于其它动物中【4 5 1 。 哺乳动物具有m h c 基因是较为普遍的现象，随着研究的不断深入，近年来已确定几乎 所有的脊椎动物都存在m h c 基因【4 6 】，通常用动物的英文开头字母加上l a ( l e u k o c y t e a n t i g e n ，白细胞抗原) 来代表不同动物的m h c 系统，如小鼠( h 2 ) 、大鼠( r t l ) 、人( h l a ) 、 牛( b o l a ) 、马( e l a ) 、绵羊( o l a ) 、山羊( g o l a ) 、猪( s l a ) 、鸡( b 复合体) 、狗 ( d l a ) 、家兔( r l a ) 等，并对这些物种的m h c 均进行了广泛的研刭4 卜”】。 现有的研究结果表明：主要组织相容性复合体( m h c ) 是由紧密连锁、具有高度多态 性的基因位点组成的某一染色体上的一个区域，连锁于一条染色体上的m h c 基因构成一个 单倍型。目前已经确定小鼠的m h c 基因位于第1 7 号染色体上，人的h l a 定位于6 号染色体， 大鼠的r t l 复合体定位于2 0 号染色体，牛的位于2 3 号染色体，猪的定位于7 号染色体。m h c 基因的高度多态性，可能是高等动物抵御不利环境因素的一种适应性表现，从而对维持种 属的生存与延续产生重要的生物学意义【5 6 。 1 4 1 m h c 的结构与遗传特征 基因结构根据m h c 抗原结构与功能的不同，m h c 可以划分为c l a s si 、c l a s s i i 和c l a s s i i i 类基因。 m h ci 类基因由一条0 t 链( i 类基因编码的跨膜糖蛋白) 和一条d 链( p 2 微球蛋 白基因编码的多肽) 通过非共价键连接组成，其中0 【链含有3 4 6 个氨基酸残基，分为0 【1 、 a 2 、a 3 、跨膜区和胞浆区5 个部分，由m h ci 类基因编码；b 链游离于细胞外，不由m h c 基因编码1 57 。在不同的物种中，m h ci 类基因的命名各不相同，如小鼠的有h 2 k 、h 2 d 、 h 2 l 等，人类的m h ci 类基因有h l a a 、h l a b 、h l a c 等。 4 绷黼_ 嘲 静洲器_ 洲 m h c i i 类基因还可进一步分为a 、b 两个亚类，分别编码q 和1 3 多肽链而形成i i 类异 源二聚体( h e t e r o d h e r s ) 1 5 8 删】，这两个亚类基因参与形成成熟的m h ci i 类分子中多肽性最高 的区域一抗原结合部位( a b s ) 1 1 。m h ci i 类基因主要划分为d q 、d r 、d p - - 个基因区，又 可细分为d q a 、d q 8 、d r a ，d r b 等基因，并包含大量相应的等位基因。 m h c i i i 类基因主要编码补体成分c 2 和c 4 以及b 因子、肿瘤坏死因子和热休克蛋白等， 分泌到血清等体液中。 k i ai - e “s 肇o n 咿dl _ i 区_ - 一s 区_ 一 p 一d 五_ 团i 兵l 蘑日真l lm 4 t - l k i 小鼠、人类m h cc l a s si 、i i 和i 类基因的分布简图 基因长度与数量m h c 基因的数量在不同的物种间有很大差别。就整体来说，哺乳动物 的m h c 基因数量要比其它动物多一些。例如鸡的m h c 基因大约是l o o k b ，远比人和鼠的 m h c 基因( 大约4 m b ) 少 6 2 】。两栖类中也存在这一情况，非洲爪蟾( x e n o p u sl a e v i s ) 较为典型， 其m h c 也包括i 和i i 两类基因，但每一类基因的数目却相对较少【6 3 捌】。 基因多态性m h c 是一个多态基因家族，实验证明，许多不同种类的m h c 基因都 具有同源性，它们往往来自于同一原始基