（植物学专业论文）拟南芥液泡hatpase+c亚基基因功能的研究.pdf

摘要 植物液泡型h + - a t p a s e ( v - a t p a s e ) 是一类特殊的膜转运结合蛋白，其利用水解 a t p 产生的能量将质子泵入细胞区室内，通过调节细胞和细胞器的p h 值，产生跨膜 质子电化学势梯度，从而驱动离子与代谢物质的转运、调节细胞膨压、生长以及气孔 的开闭。同时，v - a t p a s e 在植物处于干旱、盐碱、低温等非生物胁迫条件下，起到 重要而积极的作用，但有关其机制尚不清楚。 拟南芥v - a t p a s e 由1 3 个亚基组成，包括v 。和v 。两个结构域。c 亚基是、k 域的 重要组成部分之一，现已踞确由五个同源基因编码，以6 拷贝的形式组成v - a t p a s e 离子进出的通道，是植物响应逆境胁迫中最为敏感的亚基。研究拟南芥v - a t p a s ec 亚基基因功能特别是其在植物抗非生物胁迫中的作用机理，具有重大的理论意义和实 践价值。 本文建立了脚1 基因功能的r t - p c r 鉴定体系，详尽研究了水分胁迫、盐胁迫、 外源植物激素( i a a 、g a 、s a 、m e j a 、a b a 、a c c 等) 对l q 别- c 基因的表达调节。结果 如下： 1 利用v e c t o r n t i 和p l a n t c a r e 软件对拟南芥聊4 1 基因家族5 个同源基因的基因 序列、基因编码序列、3 - u t r 序列及编码氨基酸序列进行了生物信息学分析。 证实了其基因编码序列具有高度的序列同源性，并且编码多肽非常保守，同源性 达到9 7 以上。而哪4 1 基因序列和37 - u t r 序列的同源性较低，这可能是植物 适应逆境环境的重要机制之一。 2 建立了拟南芥v h a - c 基因功能的r t - p c r 鉴定体系，证实了阳蜊叩基因对外源激素、 高盐及水分胁迫的响应。在逆境和外源激素作用下，删1 基因的表达水平明显 提高，且多在处理的1 2 小时内达到最大。外源激素i 从、g a 3 、s a 、m e j a 、a b a 、 a c c 对嘲呷基因的表达调节，推测脚 叩基因参与逆境信号转导，并在植物的 生命过程以及植物遭受机械伤害、病原菌侵染等逆境胁迫中起作用。脚t 基因 对水分胁迫和盐胁迫的响应，说明拟南芥嘲一亚基基因参与了植物抗非生物胁 迫过程。 3 v t i a - c 4 和v 翻- c 5 基因对i h h 、g 3 、s h 、m e j a 、a b a 、a c c 、渗透胁迫以及高盐胁 迫均有响应，而且f i m - c 4 和f i z 4 - c 5 基因的表达量受g 乜、s a 、m e 3 a 、渗透胁迫以 及高盐胁迫强烈诱导，推测- c 4 和f i b - c 5 基因在植物响应逆境胁迫中起主要 作用。 关键词：拟南芥；v - a t p a s e ；v h a 峨植物生长调节剂；盐胁迫；水分胁迫 s t u d yo nt h ef u n c t i o no fs u b u n i tcg e n e so f v a c u o l a rh + - a t p a s ei na r a b i d o p s i st h a l i a n a a b a t r a c t t h ep l a n tv a c u o l a rh + - a t p a s e ( v - a t p a s e ) i sam e m b r a n e - b o u n dt r a n s p q r t e rp r o t e i n ， i tu s e st h ee n e r g yr e l e a s e dd u r i n gc l e a v a g eo ft h et - p h o s p h a t eo fc y t o s 0 1 i ca t pt op u m p p r o t o n s i n t ot h ev a c u o l a rl u m e na n d a c i d i f y t h e v a c u o l e ，t h e r e b yc r e a t i n g a n e l e c t r o c h e m i c a ll - i + - g r a d i e mw h i c hi st h ed r i v i n gf o r c ef o rav a r i e t yo f t r a n s p o r te v e n t so f i o n sa n dm e t a b o l i t e sa n ds oi n f l u e n c i n gt u r g o r , c e l le x p a n s i o na n dg u a r dc e l lm o v e m e n t o nt h eo t h e r 士a n d ，u n d e rs t r e s sc o n d i t i o n ss u c ha sd r o u g h t ，s a l i n i t y , c o l d ，t h ev a t p a s e m a k eak e yr o l e h o w e v e r ，t h er e l a t e dm e c h a n i s m sa r eu n l m o w n e d v - a t p a s eo fa r a b i d o p s i sc o n t a i n s1 3d i s t i n c ts u b u n i t so r g a n i z e di n t ot w ol a r g e s u b c o m p l e x e s ：t h ec y t o s o l i cv 1a n dm e m b r a n ev 0 s u b u n i tcc o d e db yf i v eg e n e s ，i sa m a j o rc o m p o n e n to f v os e c t o r , f o r m st h ep r o t o nc o n d u c t a n c ep a t h w a y i na d d i t i o n , s u b u n i t ci sa l s ot h em o s ts e n s i t i v ec o m p o n e n tw h e np l a n t su n d e rs t r e s sc o n d i t i o n ss t u d yo nt h e f u n c t i o n sa n de s p e c i a l l yt h em e c h a i n i s m so fs u b u n i tco fv - a t p a s ei na r a b i d o p s i s , h a s s i g n i f i c a n ti m p o r t a n c ef o rt h e o r ya n dp r a c t i c e i nt h i sp a p e r , ar t - p c rs y s t e mf o ra s s a y i n gt h ee x p r e s s i o no fv - a - cg e n e s ，i s e s t e b l i s h e d w em a d ead e t a i l e ds t u d yo f ft h ev h a - cg e n e sr e s p o n s et ow a t e rs t r e s s ， s a l i n i t ya n de x o g e n o u sp h y t o h o r m o n e s ( i a a g s m e j a , a b aa c c ) o u rr e s u h s s h o w e dt l l a t ： 1 c o m p a r i n gt h eg e n es e q u e n c e s ，e d n as e q u e n c e s ，37 - u t ra n da m i n oa c i ds e q u e n c e s o ff i v e 明h g e n e sb yv e c t o rn t ia n dp l a n t c a r es o , w a r e w ef o u n dt h eg e n e s e q u e n c e sa n d3 - u t ro fv h a - cg e n e ss h a r i n gv e r yl o ws i m i l a r i t y , b u tt h ee d n a s e q u e n c e sh i g h l yc o n s e r v e d , a n dt h ep o l y p e p t i d e sc o d e db yv i - i a = gg e n e sh a v e9 7 s e q u e n c ei d e n t i t y , t h i sm a yb ea ni m p o r t a n ta d a p t i o nm e c h a i n i s mt os t r e s sc o n d i t i o n s i na r a b i d o p s i s ， 2w ee s t a b l i s h e dt h er t p c rs y s t e mt od e t e c tt h ee x p r e s s i o no fv h a - cg e n e s ，a n d v e r i f i e dt h er e s p o n s e so fv f - - cg e n e st op l a n th o r m o n e s ，s a l i n i t ya n dw a t e rs t r e s s u n d e rs t r e s sc o n d i t i o n s ，v - a cg e n e sh a v eh i g h e re x p r e s s i o n s ，a n dr e a c ht h eh i 【g h e s t e x p r e s s i o nl e v e la t1 2h o u r sa f t e rs t r e s s t h ee x p r e s s i o no f 删一cg e n e sa r er e g u l a t e d b ye x o g e n o u sp l a n th o r m o n e s t h i si n d i c a t e st h a ti h a - cg e n e sm a yb ei n v o l v e di n h o r m o n es i g n a lt r a n s d u c t i o n , a n dm a yh a v er o l e si np l a n tl i f e c y c l e , w o u n d i n ga n d p a t h o g e ni n f e c t i o n m o r e o v e r , v h a cg e n e s r e s p o n dt ow a t e rs t r e s s a n ds a l i n i t y ， i n d i c a t e dt h a ti tp a r t i c i p a t e di np l a n tr e s i s t a n c et oa b i o t i cs t r e s s e s 3 v h a - c 4a n dv h a c 5g e n e sr e s p o s et oi 她g a 3 ，s a , m e j a , a b aa c c ，w a t e rs t r e s s a n ds a l i n i t y m o r e o v e lv h a c 5g e n ei ss t r o n g l yr e g u l a t e db yg a 3 ，s a , w a t e rs t r e s s a n ds a l i n i t y t h e r e f o r ，w ep r e s u m et h a tv h a c 4a n dv h a c 5g e n e sa r ei n d u c i b l ea n d p l a ym a j o rr o l e si ns t r e s sr e s p o n s eo f a r a b i d o p s i s k e yw o r d s ：a r a b i d o p s i st h a l i a n a ；v - a t p a s e ；v h a c jp h y t o h o r m o n e ；s a l i n i t y ；w a t e r s t r e s s d ir e c t e db y ：p r o f l ig u o j i n g p r o l ：，s h a ojin w a n g a p p ii c a n tf o rm a s t e rd e g r e e ：d in a ( b o t a n y ) ( c o l l e g eo f a g r o n o m y ，i n n e r m o n g o l i a a g r i c u l t u r a l u n i v e r s i t y ，h o h h o t0 1 0 0 1 8 ，c h i n a ) v a t p a s e p 硎c ： i 从： g a a ： s a ： m e j a ： a b a ： a c c ： p e g ： d e p c ： a c t i n ： b r s ： c 0 1 ： m s ： p c r ： r t p c r ： u t r ： d c c d ： t r i z 0 1 ： 英文缩写 v a c u o l a rh + - a t p a s e 液泡型 r _ a t p a s e g e n eo fs u b u n i tco fv - a t p a s ev - a t p a s ee 亚基基因 i n d o l e 一3 一a c e t i ca c i d 吲哚乙酸 g i b b e r e l l i n 赤霉素 s a li c y l a t e 磺基水杨酸 m e t h y lj a s m o n a t e 茉莉酸甲酯 a b s c i s i ca c i d 脱落酸 l - a m i n o c y c l o p r o p a n e l c a r b o x y l i ca c i d 卜氨基环丙烷- 1 - 羧酸 p o l y e t h y l e n eg i y c o l 聚乙二醇 d i e t h y p y r o c a r b o n a t e焦碳酸二乙酯 肌动蛋白基因 b r a s s i n o s t e r o i d s 油菜素内脂 c o l u m b i a 拟南芥的一种野生生态型 m u r a s h i g ea n ds k o o gm e d i a t em s 培养基 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 r e v e r s et r a n s c r i p t i o np c r反转录p c r u n t r a n s l a t e dr e g i o n 非翻译区 州n7 一d i c y c l o h e x y l c a r b o d i m i d e 二环己碳二亚胺 用于r n a 提取的一种试剂 内蒙古农业大学硕士学位论文 1 引言 植物的生长发育依赖于对营养元素和代谢物质的选择、吸收、运输和利用，同时 植物还必须适应和抵抗各种逆境环境。研究表明，植物对营养与环境的改变是通过对 转运蛋白的调节来感知和响应的。其中，质子泵在转运蛋白中占极为重要的地位，没 有质子驱动力提供能量并与载体或质子通道偶联，所有其它的转运蛋白都将停止运转 1 o 质子泵是一种推动质子跨膜运动的能量系统，广泛存在于几乎所有的细胞中。1 。 目前已知的膜质子泵h t p a s e 分为三类：质膜上的p - a t p a s e ( p l a s m am e m b r a n e l f - h t p a s e ) ，叶绿体和线粒体上的f - a t p a s e ( 卜t y p ea t ps y n t h a s e ) 以及液泡膜上的 v - h t p a s e ( v a c u o l a ri - f - h t p a s e ) 4 ov - a t p a s e 是当前h * - h t p a s e 家族功能研究中的 一个十分活跃的分支，它在生命活动中的功能和可应用性日益引起人们的普遍关注 5 o v _ a t p a s e 广泛分布于液泡膜和其它各种内膜系统“3 ，包括高尔基体、溶酶体、内 质网、嗜铬颗粒、笼蛋白衣被小泡( c l a t h r i n c o a t e dv e s i c l e ) “1 等。液泡膜上的 v - h t p a s e 含量非常丰富，占液泡总蛋白含量的6 5 - 3 5 0 1 ，利用电子显微镜观察发现 每平方微米的液泡膜上有9 7 0 3 3 8 0 个v - a t p a s e 的全酶分子4 1 。同时，v - a t p a s e 也存 在于肾间质细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和破骨细胞中“1 ，并在其中起某些特殊功 能，如v - a t p a s e 使巨噬细胞具有杀菌、消灭肿瘤的作用。1 ，参与破骨细胞的骨吸收 和骨重建“”，以及为昆虫中肠原生质膜碱化和吸收氨基酸提供能量“。 针对v _ a t p a s e 的功能，已进行了大量研究o “”1 。目前已经明确了v - a t p a s e 是 利用水解a t p 释放出来的能量，将l r 泵到液泡中，从而维持胞质p h 的平衡，形成跨 膜的电化学势梯度。为细胞生理活动的正常进行以及各种离子和代谢物的转运提供了 必不可少的条件n 2 。在植物体中，v - a t p a s e 除了利用建立的跨膜电化学势梯度来 驱动离子及代谢产物的运输以外，在保卫细胞的运动、植物生长、发育以及植物对胁 迫的响应中也起到极为重要的作用“1 。因此，v - a t p a s e 十分重要，就像持家酶一样维 持细胞之中的离子稳定和细胞的代谢。另一方面，在环境胁迫条件下，v - a t p a s e 作 为胁迫响应酶会相应的改变亚基的表达和酶结构，以适应环境的变化。因此，v - h t p a s e 既不是一个真正的组成型表达的持家酶，也不是一个典型的、在胁迫来临时表达量发 生很大改变的胁迫诱导酶，因此被称为“生态酶”( e c o - e n z y m e ) “。 1 1v - a t p a s e 的结构和组成 v - a t p a s e 是一种多亚基寡聚酶，由1 3 个亚基组成，其分子量约为7 3 0k d am 3 ， 由v 。和v 。两大亚复合体构成“球茎”结构，这与线粒体和叶绿体上的f 型a t p 合成 酶( f - h t p a s e ) 的结构很类似。v 。域处于细胞内，分子量为5 7 0 k d a ，负责水解a t p 。 2 拟南芥液泡h 十- - a t p a s ec 亚基基因功能的研究 v 。域由8 个亚基组成，依次为a 、b 、c 、d 、e 、f 、g 、h “。a 亚基和b 亚基各三个拷 贝形成六聚物水解a t p ，其中a 亚基为催化亚基，b 亚基为调节亚基m “，其余亚基均 为单拷贝。v 。域镶嵌于膜内，分子量为2 6 0k d a ，负责质子的跨膜运输。v 。域由5 个 不同的亚基组成，分别为a ，c ，c ”，e 和一个亲水性的亚基d “3 。 图1 液泡型i r - a t p a s e 的结构模型“1 fg1am o d e lo ft h ev a c u o l a r t y p e 盯一a t p a s e 1 1 1v 广头部亚基 a 亚基：植物v - a t p a s e 的a 亚基与f - a t p a s e 的催化亚基1 3 具有序列同源性， 与酵母的v m a l p 蛋白同源。a 亚基含有一个核苷酸的结合位点，嘌呤类似物与a 亚基 结合则可以抑制a t p 的水解活性“o ，推测a 亚基为v - k t p a s e 的催化亚基。依氨基酸 序列推测，不同种间a 亚基的分子量在6 8 5 到6 8 8k d a 。 b 亚基：b 亚基与f - a t p a s e 的q 亚基具有序列同源性，与酵母的v m a 2 p 蛋白同 源，推测其分子量大小为5 3 7 5 4 7k d a 。它包含一个氨基酸结合位点，但是光活化 的a t p 类似物3 一氧一( 4 一苄基) 苄基腺苷一57 一三磷酸( 3 - 0 一( 4 - b e n z o y l ) b e n z o y l a d e n o s i n e 一5 一t r i p h o s p h a t e ) 与其结合，并不会抑制v - a t p a s e 的a t p 水解 活性眦1 。 已证明f - a t p a s e 的f 。由3 个拷贝的b 亚基和3 个拷贝的n 亚基组成。根据 v - a t p a s e 的a 、b 亚基与f - a t p a s e 的b 、t 1 亚基的同源性、二者结构上的类似性、 以及根据牛v - h t p a s e 的化学分子量得到的2 9 3 3 2 2 的a b 亚基的比率，推测v 广 头部也分别含有3 个拷贝的a 、b 亚基。 内蒙古农业大学硕士学位论文 1 1 2v 广柄亚基 c 亚基：c 亚基的分子量为3 7 - 5 2k d a 。功能尚不清楚，可能与v 。的稳定有关。 大麦( h o v u l g a r ) 和拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 的c 亚基已被克隆，并证明 其序列与酵母的v m a 5 基因相似。 d 亚基：拟南芥的d 亚基已被克隆m ，其分子量为2 9 1k d a ，与酵母的v m a 8 p 同 源。分析d 亚基的序列，发现其与f - a t p a s ey 亚基的序列没有同源性，但它们在结 构上很相似。d 亚基在v l - 头部与v 。的连接以及a t p 的水解与h 转运的偶联中具有很 重要的作用n ”。 e 亚基：植物v - a t p a s e 的e 亚基与酵母的v m a 4 p 蛋白具有序列同源性。不同植 物中，e 亚基的分子量在2 6 2 2 7 1k d a 之间，功能还不清楚，可能在完整的v 。域的 最后组装步骤中起关键作用。 f 亚基：f 亚基的分子量为1 3k d a ，与酵母的v m a 7 p 蛋白同源。f 亚基对于v t 域 的组装非常重要，也是v 0 的组装所必需的唯一来自v 。部分的一个亚基，因此认为f 亚基可能在v 。域与v 。域之间的稳定联结中起作用。 g 亚基：从植物中克隆的g 亚基与酵母的v m a l o p 蛋白同源，其分子量为1 2 5k d a ， 烟草的g 亚基基因可以使酵母的v m a i o 突变体恢复野生型表型“。虽然g 亚基基因序 列比f - a t p a s eb 亚基的短，在n 一末端也不含明显的跨膜域，但g 亚基基因序列与 f - a t p a s eb 亚基的序列具有明显的相似性。与f - a t p a s eb 亚基相似，g 亚基是v - a t p a s e 外周柄的主要组成部分，与a t p 水解与 r 一转运的偶联有关。有趣的是，燕 麦( 爿ns a t i v a ) 的v 。域与v 。域分离后，g 亚基仍保留在v 0 域上。冰叶日中花( 舱 c r y s t a l l i m u m ) 的v - a t p a s e 全酶中的g 亚基，在游离的v 。域中没有发现n ”。这些结 果说明g 亚基是与v 0 域紧密相连的。 h 亚基：从拟南芥中克隆得到的h 亚基分子量为5 0k d a ，类似于酵母的v m a l 3 p 。 酵母的v m a l 3 p 在v - h t p a s e 的组装中是必不可少的，并不在催化中起作用“。有研究 表明，h 亚基可能是连接v 。和v 。的，并激活v - a t p a s e 。 1 1 3v 0 一亚基 a 亚基：a 亚基的分子量在9 5 1 1 5k d a 之间，是v - a t p a s e 最大的亚基，与酵母 的v p h l s t v l 蛋白是否相似还不清楚。在f - a t p a s e 中没有发现与a 亚基的序列相似 的亚基，推测a 亚基是v - a t p a s e 所特有的，可能与v - a t p a s e 的组装并定位到液泡有 关w 。燕麦( ns a t i v a ) 游离的v 。域上发现了a 亚基，但v - a t p a s e 全酶中却没有 发现，这说明a 亚基在v - a t p a s e 的组装中起作用w 。 c 亚基：c 亚基与f _ a t p a s e 的c 亚基以及酵母的v m a 3 p 蛋白同源，是v 0 域的一 部分。已经从几种植物中克隆到c 亚基基因，根据氨基酸序列推测，其分子量为 】6 6 一】6 7k d a 。 4 拟南芥液泡h + 一a t p a s ec 亚基基因功能的研究 d 亚基：在几种植物v - a t p a s e 的v 。域均有发现，分子量约在3 2 3 6k d a ，可能 与酵母的v m a 6 p 蛋白相似。d 亚基与v o 内在蛋白部分的紧密联结是v - a t p a s e 活性所 必需的，它既参与v 0 的组装和稳定，又参与v 。与v 。的连接。 e 亚基：分子量为8k d a ，是v - a t p a s e 中最小的亚基。在酵母中未发现与其大小 和功能相似的多肽。 1 2v - a i p a s ec 亚基的结构和功能 v - a t p a s ec 亚基是目前研究得最为广泛的亚基之一 _ ，与酵母的y m a 3 p ( g e n e p r o d u c to fy e a s tv - a t p a s ecs u b u i n t ) 以及f - a t p a s e 的c 亚基同源“4 。c 亚基是一 个疏水亚基，参与质子通道的形成。由于它在不同种属问的同源性大大超过了6 5 ， 因此认为它是目前已知的最为保守的脂质蛋白“4 。 c 亚基是分子量约为1 6i ( d ，以6 拷贝对称排列，形成v d 的核心部分，构成质子 转运的通道。与v - h t p a s e 不同的是，f - a t p a s e 的f 0 由1 2 个拷贝的c 亚基构成。c 亚基中2 3 的氨基酸残基构成4 个跨膜的a 螺旋，并在第四个跨膜的n 螺旋上含有 一个高度保守的g l u 残基，推测它是质子的结台位点，同时也是v - a t p a s e 活性抑制 剂d c c d ( 二环己碳二亚胺) 的作用位点n “m 。有研究报道酵母v - a t p a s ec 亚基的第四 个跨膜的a 螺旋上的g l u ”对酵母v - a t p a s e 的活性很重要，替代g l u ”7 ( 除了天冬氨 酸) v - a t p a s e 的活性就会丧失n ”。 c 亚基作为v 。的主要组成部分参与了质子通道的形成，负责质子的转运，而且对 v l - v 。的装配也是必不可少的。缺少c 亚基的酵母突变体。虽然可以合成v 。部分，但却 不能被组装到膜上w 。同时有实验表明缺失v m a 3 基因的酵母，其v - h t p a s e 活性完全 丧失m 。此外，c 亚基还是细胞通讯中间隙联结的部分，也是神经递质释放介导体的 组分以及某种罕见的病毒癌基因产物的靶蛋白n 。 1 3v - h t p a s e 在响应逆境中的作用 在植物处于逆境条件下，v - a t p a s e 表现出高度的灵活性和可塑性，有关其响应 逆境的机理、功能及其利用已成为当前的研究热点之一。研究表明，在植物处于逆境 胁迫的条件下，如重金属、冷害、干旱和盐胁迫等，v - a t p a s e 都具有重要而特殊的 功能“m 。例如，植物处于冷害和盐胁迫条件下，v - a t p a s e 通过改变自身的结构、状态、 以及在植物体内的数量来适应环境的改变，从而使植物适应和抵抗逆境的伤害n 。 在研究植物响应盐胁迫的过程中，有人认为v - a t p a s e 促使过量的有毒离子在液 泡中富集，从而有助于植物适应盐胁迫。很多植物在盐胁迫下，v - a t p a s e 的转录水 平和活性都有所提高w 。如冰叶日中花在盐处理下，a 、b 、e 、c 亚基的转录水平均升 高m ，。在受盐胁迫和对盐适应的两种烟草悬浮细胞中也发现了a 亚基转录水平的增加 c m3 。在耐盐甜菜( b e t av m g a r i s 厶) 和它的悬浮培养细胞中，v - a t p a s e 的a 亚基和 内蒙古农业大学硕士学位论文 5 o 亚基受n a c l 刺激后其表达以协同的方式发生变化m 。这些研究结果都表明， v - a t p a s e 在渗透调节和盐胁迫中起作用。对v - a t p a s e 在干旱胁迫下的作用研究得很 少。y o s h i d a 比较了对骤冷敏感的绿豆和耐骤冷的豌豆的v - a t p a s e ，发现有两种类似 的v a t p a s e ，即“绿豆型”和“豌豆型”，后者是一个耐冷酶，在受到离液盐的 处理期间其v 。不发生解体。m ；相反，“绿豆型”的v a t p a s e 很容易解体，对冷胁 迫敏感。由于p h 值的稳定是功能细胞代谢的重要影响因子，而维持狭窄范围内的p h 值的稳定又直接取决于v - a t p a s e 的活性，因此，至少在某种程度上，v - a t p a s e 活性 的降低引起的细胞溶质酸化可以解释植物对冷胁迫敏感的原因。还有实验证明，将耐 高c o , 浓度的绿藻( c m o r o c o c c u n i t t o r a l e ) 从正常条件下转移到含有4 0 c 0 2 的 条件下生长，v - a t p a s e 的数量和活性增加了将近两倍，同时液泡的体积也增大了。 所有这些结果表明v - a t p a s e 在植物响应逆境胁迫中具有重要作用。 在研究v - a t p a s e 对逆境响应的过程中，发现c 亚基更为敏感，且其m r n a 水平显 著增加w 。n a c i 处理盐生植物碱蓬，也表现出其v - a t p a s e 水解活性和泵活性的明显 增加，且其a 、b 、c 亚基的转录及蛋白表达也明显增加m 。用w e s t e r nb l o t 证实， 燕子掌在逆境条件下v - a t p a s e 的三种主要亚基a 、b 、c 在膜上的蛋白含量也均有所 增加m ，。冰叶日中花叶片的c 亚基m r n a 呈昼夜节律性变化，在盐胁迫下也增大了变 化幅度m 。用n a c i 处理冰叶日中花后，其根和幼叶中v - a t p a s e 的a 、b 、c 亚基的m r n a 的量比对照大约增加了2 倍，而成熟的叶片中却只有c 亚基m r n a 的量有所提高。1 。 由此可见c 亚基对环境的变化较为敏感w 。由于盐胁迫可以改变v _ a t p a s e 的偶联率， 因此，盐胁迫下向日葵( h e l i a n t h u sh l l n u u s ) 的v - a t p a s e 的h 精运活性提高而水解 活性有所降低，推测偶联率的变化是由c 亚基的数量变化或不同表型c 亚基的表达差 异引起的m ，。这说明，c 亚基在植物响应胁迫过程中的确起到极为重要的作用。 1 4 拟南芥液泡h + - a t p a s ec 亚基的研究进展 目前，拟南芥基因组全序列已经测定m ，对v - a t p a s ec 亚基的分析发现其由五 个同源基因编码，即：删叩lg i n 一喝- c 3 , v h a - c 4 和v h a - c 5 , 证实了过去关 于c 亚基由多个基因编码的推测w 。 对拟南芥c 亚基基因表达的最初研究也发现，啪4 _ c ，v h a - c 2 和v i f a - c 3 在主要 的营养器官和生殖器官中均有表达，但在两周龄的植物中，其叶片中的表达水平明显 高于根组织，并且m 4 1 移v h a - c 2 的表达水平相对较高，而v h a - c 3 的表达水平则 较低m 。有研究表明，拟南芥的v h a - c l 和v r 捌- c 2 在各种组织中组成型表达，而删叩了 只在根和茎的顶端表达n n ，且v h a - c l 的表达受光和发育阶段的调节。s e n t h i l k u m a r p a d m a n a b a n 等的研究表明，删1 在光下生长的幼苗的扩展子叶中表达，尤其在维 管束中高表达；而在黑暗条件下生长的幼苗的未扩展子叶中g i d - c l 不表达，相反， 6 拟南芥液泡h + - - a t p a s ec 亚基基因功能的研究 却在黄化苗的下胚轴中表达m ，。有人用高盐培养基( 5 0 洲n a c l ) 和低营养培养基 ( 0 0 0 5 m s ) 培养拟南芥发现，v - a t p a s ec 亚基基因的转录水平明显提高c z “。 上述结果表明，拟南芥v - a t p a s ee 亚基基因的表达受营养和盐胁迫的影响。实 验也证明了营养消耗和高盐胁迫都会增加拟南芥v - a t p a s ec 亚基基因的表达水平w 。 拟南芥v - h t p a s ec 亚基由5 个同源性很高的基因编码，它们编码的多肽具有高达9 9 的同源性，这说明这5 条多肽是同一亚基的5 个不同亚型。那么，在逆境条件下， 这5 个基因是全部表达，还是部分表达? 它们编码的多肽是否都具有活性? 且各具有 何功能? 特别重要的是它们在植物抗非生物胁迫中到底扮演什么样的角色? 这些都 是有待阐明的问题。 基于此，本研究采用定量r t - p c r ( r e v e r s et r a b s c r i b e d - p o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n ) 技术全面研究t # i - 源激素处理和非生物胁迫条件下拟南芥五个删- c 基因 的表达量的变化，探讨了删t 基因对激素和非生物胁迫的响应，为阐明拟南芥 v - a t p a s ec 亚基基因在植物抗非生物胁迫中的功能、表达、调节及进一步为植物基 因工程提供基因源提供理论依据。 2 材料与方法 2 1 植物材料 试验材料为：野生型c o l u m b i a 生态型拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 。 2 2 植物培养 2 2 1 试剂配制 2 2 1 1 培养液的配制 m s 盐( s i g m a ) 2 1 5 9 0 2 5 蔗糖 2 5 9 0 0 2 5 9 轴也s 0 2 5 9 用0 i n 的n a o h 调p h 值至5 7 ，定容至l l ，高压灭菌。 2 2 1 2 植物生长调节剂的配制 ( 1 ) 生长素( i a a ) ：称取2 6 m gi a a ( 上海生工生物工程有限公司) 溶于少量无水 乙醇中，将充分溶解的i a a 逐滴加入4 0 m l 蒸馏水中，边加边混匀，定容至5 0 m l ， 过滤灭菌，避光保存。 ( 2 ) 赤霉素( g 如) ：称取3 5 m g6 a 。( 北京化学试剂公司) 溶于少量无水乙醇中， 将充分溶解的g a 。逐滴加入4 0 m l 蒸馏水中，边加边混匀，定容至5 0 m l ，过滤灭 菌。 内蒙古农业大学硕士学位论文 7 ( 3 ) 茉莉酸甲酯( m e j a ) ：吸取1 2 2 u1m e j a ( s i g m aa l d r i c h ) 溶于少量无水乙醇 中，将其逐滴加入4 0 m l 蒸馏水中，边加边混匀，定容至5 0 m l ，过滤灭菌。 ( 4 ) 水杨酸( s a ) ：称取0 8 9 水杨酸钠( f l u k ac h e m i eg m b hc h 一9 4 7 1b u c h s ) 溶 于5 0 m l 蒸馏水中，过滤灭菌。 ( 5 ) 脱落酸( a b a ) ：称取1 3 2 m ga b a ( s i g m aa l d r i c hc o m p a n y ) 溶于少量无水乙 醇中，将其逐滴加入4 0 m l 蒸馏水中，边加边混匀，定容至5 0 m l ，过滤灭菌。 ( 6 ) 卜氨基环丙烷一卜羧酸( a c c ) ：称取1 0 1 m ga c c ( f l u k ac h e m i eg m b hc h 一9 4 7 1 b u c h s ) 溶于5 0 m l 蒸馏水中，过滤灭菌。 2 2 2 种子无菌处理 拟南芥( c 0 1 ) 种子用7 0 7 , 醇处理l o 分钟，再用含0 0 5 的t w e e n 一2 0 的无水 乙醇灭菌l o 分钟，洁净室内晾干，置于1 5 m l 无菌e p 管中，加入l m l 无菌水，4 春化4 天。 2 2 3 植物培养 将野生型拟南芥种子撒在1 2 m s 液体培养基中，置于2 5 。c 、1 6 h 光照8 h 黑暗条 件下，培养2 周。 2 3 拟南芥总r n a 的提取 2 3 1 试剂的配置及器皿的处理 ( 1 ) d e p c 处理的水：三蒸水配制0 0 1 的d e p c ，搅动过夜，高压灭菌。 ( 2 ) t r i z o l ：购自于北京天为时代科技有限公司。 ( 3 ) 7 5 乙醇：用0 0 1 d e p c 水和无水乙醇配制7 5 乙醇。 ( 4 ) 器皿处理：所用的玻璃器皿均在1 5 0 。c 烘4 小时；枪头盒于0 5 n 的n a o h 中浸 泡2 0 分钟，再用0 0 1 d e p c 水冲洗干净；枪头及e p 管在0 0 1 d e p c 水中浸泡 过夜后，高压灭菌。 2 32 提取步骤 ( 1 ) 植物组织匀浆处理：取l o o m g 植物材料快速置于e p 管中，加液氮研磨成粉末 加l m lt r i z o l ，使之充分混匀。 ( 2 ) 室温下静置1 0 分钟。 ( 3 ) 加0 2 m l 氯仿，充分震荡1 5 秒，室温下静置3 分钟。 ( 4 ) 6 。c ，1 1 8 0 0 9 ，离心1 5 分钟。 ( 5 ) 吸取上清液至另一e p 管中，加入0 5 m l 异丙醇。 ( 6 ) 上下颠倒几次，混匀，室温下静置1 0 分钟。 8 拟南芥液泡h + - - a t p a s ac 亚基基因功能的研究 ( 7 ) 6 。c ，1 1 8 0 0 9 ，离心1 0 分钟。 ( 8 ) 弃上清，加入l m l7 5 乙醇充分洗涤沉淀。 ( 9 ) 6 。c ，7 0 0 0 9 ，离心5 分钟。 ( 1 0 ) 弃上清，离心3 0 秒，将残余液体除去。 ( 1 1 ) 室温下干燥，用2 0 “1d e p c 水溶解。 ( 1 2 ) 6 5 。c 水浴溶解1 0 分钟，离心3 0 秒。 ( 1 3 ) 吸lulr n a 样品，用1 琼脂糖凝胶电泳，检测r n a 质量。 2 4r n a 样品中d n a 的去除 2 4 1 试剂配制 ( 1 ) d n a s ei ( r n a s ef r e e ) ：购于宝生物工程( 大连) 有限公司。 ( 2 ) r n a s ei n h i b i t o r ：购于宝生物工程( 大连) 有限公司。 ( 3 ) s t o ps m u t i o n 母液的配置：5 0 0 m me d t a ( p l t = 8 o ) 将9 3 1 9e d t a 呻2 h 2 0 溶于d e p c 水中，用o h 调节p h 至8 0 ，d e p c 水定容至 5 0 m l ，高压灭菌。 ( 4 ) s t o ps o l u t i o n 工作液：取5 m l 母液，d e p c 水稀释至5 0 m l 。 2 4 2 步骤 ( 1 ) 在d e p c 处理过的e p 管中加入下列试剂，总体积2 0 u l 总r n a 样品 l o d n a s eib u f f e r d n a s ei ( r n a s ef r e e ，5 u u1 ) r n a s ei n h i b i t o r ( 4 0 u 1 21 ) d e p c 水 1 0 u1 2 ul o 7 5 u 1 0 2 5 u 1 7 ul ( 2 ) 混匀，3 7 。c 水浴中反应2 0 - 3 0 分钟。 ( 3 ) 加2 u1s t o ps o l u t i o n 工作液。 ( 4 ) 7 0 水浴中终止反应l o 分钟，然后立即置于冰上。 ( 5 ) 吸取1u 1 处理后r n a 样品，做1