（基础兽医学专业论文）抗新城疫病毒中药活性组分筛选的研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑j 量壅些态堂或其它教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论 文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：魂嘲 签字眺伽年月日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解塑j 匕壅些太堂有关保留及使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门( 机构) 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查( 借) 阅。 本人授权逦j 量壅些太堂可以将论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等方法加以保存或编成学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 学位论文作者签名： 傀香 签字日期：9 , o i f 年钿fe l 导师签名： 签字日期： 摘要 本研究探寻了中药抗新城疫病毒的有效组分，为开发新型、有效、环保的中药抗 病毒药物奠定基础。试验方法：收集治疗畜禽病毒病的中药处方，将出现频率高的4 种抗病毒中草药( 黄芪、黄芩、黄连、大青叶) 作为提取有效组分的试验材料。将中 药粉碎后用乙酸乙酯和乙醇浸提，提取物作为醇提物，将每种中药的醇提物浓缩干燥 后经过硅胶层析柱分离后，收集2 0 种不同极性的洗脱组分，再次浓缩干燥，作为抗 病毒所需筛选的药物。 利用m a r c l 4 5 细胞建立抗新城疫病毒的细胞筛选模型，设立预防组、治疗组、自 愈组和空白对照组。预防组：细胞培养2 0 h 后更换含适量预防药物的维持液，继续培 养8 h 后感染新城疫病毒，再培养2 2 h 后利用m t t 染色法测定结果；治疗组：细胞培 养2 8 h 后与预防组、自愈组同时感染新城疫病毒，继续培养8 h 后更换含治疗药物的 细胞培养液，再培养1 4 h 后测定结果：自愈组：在细胞培养2 8 h 后感染病毒，用维持 液代替用药处理；空白对照组：用维持液代替病毒感染和用药处理。观察细胞病变及 死亡状况，利用m t t 染色法测定结果。m t t 染色法能定量检测细胞的增殖活性，来 间接反应药物的抗病毒效果。为此我们将m t t 作为细胞培养物中病毒增殖情况的指 示系统。 试验结果如下： 1 中药活性组分的提取：使用2 0 0 - 3 0 0 目的硅胶进行硅胶柱层析，成功从黄芪、 黄芩、黄连、大青叶的醇提物中分离出共8 0 种不同极性的组分。 2 建立抗病毒模型：利用m a r e l 4 5 细胞感染新城疫病毒，感染后2 2 h 出现明显的 细胞病变，建立了抗病毒药物筛选模型。 3 活性组分的抗病毒效果： 黄芪提取物中预防组有4 种组分对病毒具有抑制作用，o d 值均与接毒对照组差 异极显著( p 0 0 1 ) 。治疗组中有5 种组分抑制效果明显，且o d 值均与接毒对照组 差异极显著( p 0 0 1 ) ，表明黄芪的醇提取物中有些组分有显著抗病毒作用。 黄芩提取物中预防组有5 种组分对病毒具有抑制作用，其中1 6 号组分o d 值与 接毒对照组差异显著( p 0 0 5 ) ，其它4 种组分o d 值与接毒对照组差异极显著 ( p 0 0 1 ) 。治疗组中7 号组分o d 值与接毒对照组差异显著，其他5 种组分抑制效 果更明显，o d 值与接毒对照差异极显著( p o 0 1 ) 。表明黄芩的醇提取物中有些组分 有显著的抗病毒作用。 黄连醇提取物中预防组有4 种组分对病毒具有抑制作用，其o d 值与接毒对照组 差异极显著( p o 0 1 ) 。治疗组中有3 种组分治疗效果明显，o d 值与接毒对照组差异 极显著( p o 0 1 ) 。表明黄连的醇提取物中有些组分有显著抗病毒作用。 大青叶醇提取物中预防组有3 种组分对病毒具有抑制作用，o d 值与接毒对照差 异极显著( p o 0 1 ) 。治疗组中有4 种组分对新城疫病毒有治疗效果，o d 值与接毒对 照组差异极显著( p 0 0 1 ) 。表明大青叶的醇提取物中有些组分有显著抗病毒作用。 试验结果表明，利用m a r e l 4 5 细胞所建立的筛选模型能够有效筛选出中药的抗病 毒有效组分，利用活性组分筛选模型分别从黄芪、黄芩、黄连、大青叶等中药醇提取 物中筛选出多种具有明显抗病毒作用的活性组分。 关键词：新城疫病毒；m a r c l 4 5 细胞；中药；抗病毒；筛选模型；活性组分 一 一 s c r e e n i n gt h ea c t i v ec o m p o n e n t si nt r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n ef o ra n t i - n e w c a s t l e d i s e a s ev i r u s m a s t e rc a n d i d a t e ：h u ox i a o q i n g s p e c i a l t y ：b a s i cv e t e r i n a r ys c i e n c e s a d v i s o r s ：p r o f e s s o rd o n gs h i s h a n a b s t r a c t t h i ss t u d ye x p l o r e st h ea c t i v ei n g r e d i e n t sf r o mt r a d i t i o n a lc h i n e s e m e d i c i n ef o r a n t i - n e w c a s t l ed i s e a s ev i r u s ，t od e v e l o pt h en e w ，e f f e c t i v ea n de n v i r o n m e n t a l l ya n f i v i r a l m e d i c i n e t e s tm e t h o d s ：c o l l e c t e ds o m ec h i n o s et r e a t m e n tm e d i c i n ef o ra n t i - v i r a l d i s e a s e sf r o ms o m ep r e s c r i p t i o nm e d i c i n e ，t h e ns e l e c t e d4k i n d so fh i g hf r e q u e n c y a n t i - v i r a lh e r b s ( r a d i xa s t r a g a l i ，r a d i xs c u t e l l a r i a e ，r h i z o m ac o p t i d i s ，f o l i u mi s a t i d i s ) a st h et e s tm a t e r i a l t h eh e r bw a sc r u s h e da n de x t r a c t e db ye t h y la c e t a t ea n de t h a n o la st h e a l c o h o le x t r a c t t h ea l c o h o le x t r a c tw e r ec o n c e n t r a t e db yr o t a r ye v a p o r a t i o nm e t h o da n d s e p a r a t e db y2 0 0 - 3 0 0 m e s h g e l s i l i c a c h r o m a t o g r a p h y a n dc o l l e c t e dt h e e l u t i n g c o m p o n e n t s t h e2 0d i f f e r e n tp o l a rc o m p o n e n t sw e r ec o n c e n t r a t e da n dd r i e da g a i n t h e a n t i - v i r a ld r u g sw e r es c r e e n e df r o mt h e s es a m p l e s m a r c l4 5c e l l sw e r eu s e da sas c r e e n i n gm o d e lb yi n o c u l a t i n gn e w c a s t l ed i s e a s ev i r u s ( n d v ) f o u rg r o u p sw e r ee s t a b l i s h e di nt h i se x p e r i m e n t p r e v e n t i o ng r o u p ：m a r c l 4 5 c e l l sw e r ec u l t u r e df o r2 0hi nt h ec u l t u r ep l a t e , a n dt h e na d d e dt h ed i f f e r e n tp o l a r c o m p o n e n t si n t h em e d i u m ，i n o c u l a t e d 谢t l lt h en d va f t e r8h o u r sc u l t u r e d t h e c y t o p a t h i ce f f e c t ( c p e ) w a s o b s e r v e da n dt h eo dv a l u e sw e r ed e t e r m i n e db ym t tm e t h o d 2 2h o u r sp o s ti n o c u l a t i o n t r e a t m e n tg r o u p ：m a r c l4 5c e l l sw e r ei n f e c t e db yn d va f t e r c u l t u r e d2 8 h ，a d d e ds a m p l e s8hp o s ti n o c u l a t i o n , c u l t u r e dc e l l sf o r1 4h o u r s ，a n dd e t e c t e d t h eo dv a l u e s s e l f - h e a l i n gg r o u p ：t h ec e l l sw e r ei n o c u l a t e dn d vb u tc u l t u r e di nt h e n o r m a lm a i n t e n a n c em e d i u m c o n t r o lg r o u p ：t h ec e l l sw e r ej u s tc u l t u r e di nt h en o r m a l m e d i n m r e s u l t s ： ( 1 ) t h e8 0c o m p o s i t i o n sw e r es e p a r a t e df r o m4k i n d so fc h i n e s eh e r b a lm e d i c i n eb y g e ls i l i c ac h r o m a t o g r a p h y ( 2 ) e s t a b l i s hac e l lm o d e lf o rs c r e e n i n ga n t i v i r u sm e d i c i n e ：m a r c l 4 5c e l l sw e r e i n f e c t e db yn d v t h ec p ew a so b s e r v e dc e l l sw e r eo b s e r v e da n dt h eo dv a l u e sw e r e d e t e r m i n e db ym t rm e t h o d2 2h o u r sp o s ti n o c u l a t i o n ( 3 ) f i n ds o m e a c t i v ei n g r e d i e n t sf o ra n t i - n d v ： r a d i xa s t r a g a l i ：t h e r ea r e4k i n d so fc o m p o n e n t sh a v et h ee f f e c to fi n h i b i t o r yn d v t h eo dv a l u e so ft h ef o u rc o m p o n e n t sw e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h es e l f - h e a l i n g g r o u p ( p o 01 ) f i v ek i n d so fc o m p o n e n t sh a v ea n t i - v i r a le f f e c ti nt r e a t m e n tg r o u p ，o d v a l u eo f t h ef i v ei n g r e d i e n t sw e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a ns e l f - h e a l i n gg r o u p ( p o 0 1 ) r a d i xs e u t e l l a r i a e ：t h e r ea l e5k i n d so fa n t i - v i r a la c t i v ei n g r e d i e n t si ns k u l l c a p p r e v e n t i o ng r o u p 1 1 1 eo d v a l u eo ft h e16 t hi n g r e d i e n t sw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h e s e l f - h e a l i n gg r o u p ( p 0 0 5 ) ，t h eo t h e r sw e r es i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n tw i t l ls e l f - h e a l i n g g r o u p ( p o 01 ) t h e r ea le6k i n d so f a n t i - v i r a la c t i v ei n g r e d i e n t si ns k u l l c a pt r e a t m e n t g r o u p t h eo d v a l u eo ft h e7 t hi n g r e d i e n t sw a ss i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n tw i t hs e l f - h e a l i n g g r o u p ( p 0 0 5 ) ，o t h e r sw e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a to f s e l f - h e a l i n gg r o u p ( p o 0 1 ) r h i z o m ac o p t i d i s ：f o u rk i n d so fc o m p o n e n t sh a v ea n t i - v i r a le f f e c ti nc o p t i s p r e v e n t i o ng r o u p ，t h eo dv a l u e s o fi n g r e d i e n t sw e r es i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n t w i t h s e l f - h e a l i n gg r o u p ( p o 0 1 ) t h r e ek i n d so fc o m p o n e n t sh a v ea n t i - v i r a le f f e c ti nc o p t i s t r e a t m e n tg r o u p ，t h eo dv a l u e so ft h et h r e ei n g r e d i e n t sw e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a n s e l f - h e a l i n gg r o u p ( p o 0 1 ) f o l i u mi s a t i d i s ：t h r e ek i n d so fc o m p o n e n t sh a v ea n t i - v i r a le f f e c ti nf o l i u m p r e v e n t i o ng r o u p ，t h eo dv a l u eo ft h et h r e ei n g r e d i e n t sw e r es i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n tw i t h s e l f - h e a l i n gg r o u p ( p o 01 ) f o u rk i n d so fc o m p o n e n t sh a v ea n t i v i r 面e f f e c ti nf o l i u m t r e a t m e n tg r o u p ，t h eo dv a l u e so ft h ef o u ri n g r e d i e n t sw e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a n s e l f - h e a l i n gg r o u p ( p 0 0 1 ) t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e s c r e e n i n gm o d e le s t a b l i s h e db ym a r c 14 5c e l lc a l l e f f e c t i v e l ys e r e e nt h ea n t i v i r a la c t i v ei n g r e d i e n t sf r o mc h i n e s em e d i c i n e t h e r ew e r es o m e a n t i - v i r a l c o m p o n e n t sh a v eb e e n f o u n df r o m r a d i xa s t r a g a l i ，r a d i xs c u t e l l a r i a e ， r h i z o m ac o p t i d i s ，f o l i u mi s a t i d i su s i n gt h i ss c r e e n i n gm o d e l k e yw o r d ：n e w c a s t l ed i s e a s ev i r u s ；m a r c l4 5c e l l s ；t r a d i t i o n a l c h i n e s em e d i c i n e ； a n t i - v i r u s ；s c r e e n i n gm o d e l ；a c t i v ei n g r e d i e n t s 目录 lj ；i 言1 1 1 抗病毒中药临床实验研究概况1 1 2 药物筛选模型研究进展3 1 3 黄芪的药理作用研究概况。5 1 3 1 黄芪具有抑菌和抗病毒作用5 1 3 2 黄芪对免疫器官的促进作用5 1 3 3 黄芪保护肝脏的作用6 1 3 4 黄芪具有保护心血管系统的作用6 1 4 黄芩药理作用研究概况7 1 4 1 抗病毒作用7 1a 2 抗菌7 ia 3 抗肿瘤作用。7 1 4 4 抗氧化作用8 1 4 5 对免疫功能的影响8 1 4 6 解热作用8 1 5 黄连药理作用研究概况9 1 5 1 抗菌消炎9 1 5 2 抗病毒作用9 1 5 3 免疫调节作用9 1 5 4 抗癌作用10 1 5 5 抗氧化作用l0 1 6 大青叶药理作用研究概况1 0 1 6 1 抗病毒作用ll 1 6 2 抑菌作用1 1 1 6 3 抗内毒素活性l l 1 6 4 免疫增强作用1 2 2 中药抗病毒组分的提取1 3 2 1 材料和仪器l3 2 1 1 试验材料1 3 2 1 2 中药提取试剂l3 2 1 3 试验仪器l3 2 2 试验方法l3 2 2 1 粉碎l3 2 2 2 浸提浓缩13 2 2 3 药物组分层析分离1 4 2 2 4 药物组分再浓缩1 4 2 ：ld 、结1 1 ； 3 建立药物活性筛选模型l6 3 1 材料和仪器1 6 3 1 1 试验材料16 3 1 2 试剂。l6 3 1 3 仪器设备1 6 3 2 试验方法l7 3 2 1 试剂的制备1 7 3 2 2 抗新城疫病毒中药筛选模型的建立1 7 3 3 结果。1 8 3 3 1 细胞培养结果1 8 3 3 2 毒价测定结果1 9 3 4 讨论：1 9 3 5d 、l 右：! ( ) 4 中药抗病毒活性组分的筛选2 l 4 1 黄芪抗病毒活性组分的筛选2 l 4 1 1 黄芪活性组分最大无毒性浓度试验2 l 4 1 2 黄芪组分抗病毒的筛选试验2 2 4 1 3 小结2 5 4 2 黄芩抗病毒活性组分的筛选2 6 4 2 1 黄芩活性组分最火无毒性浓度试验。2 6 4 2 2 黄芩组分抗病毒的筛选试验2 6 4 2 3 ，j 、结：1 9 4 3 黄连抗病毒活性组分的筛选2 9 4 3 1 黄连活性组分最大无毒性浓度试验。：一2 9 4 3 2 黄连组分抗病毒的筛选试验3 0 4 2 3 小结3 2 4 4 大青叶抗病毒活性组分的筛选3 3 4 4 1 大青叶活性组分最大无毒性浓度试验3 3 4 4 2 大青叶组分抗病毒的筛选试验3 3 4 a 3d 、结3 6 1 ；结论：；7 参考文献3 8 作者简介4 3 攻读学位论文期间发表论文情况4 4 致谢一4 5 抗新城疫病毒中药活性组分筛选的研究 1 引言 1 1 抗病毒中药临床实验研究概况 病毒是最微小的、结构最简单的一类非细胞型微生物，与疾病关系密切。人类的 传染病约有7 5 是由病毒引起的，许多病毒感染性疾病不仅传染性强，流行广泛，而 且病死率高。目前对病毒病的防治方法主要有疫苗防治，抗病毒的化学合成药物及外 源性细胞因子治疗等。疫苗预防为最常用的方法，但病毒种属多，血清型多，且变异 快为疫苗的使用带来困难；利用化工合成后再筛选有效药物的研究工作遭遇障碍，这 种研究方式具有很大的盲目性，需要设计合成大量的物质，最终确定的有效药物比例 很低，药物开发的风险很大，并且特异性差，副作用较多。医用外源性干扰素、白细 胞介素2 等虽然能抑制病毒复制，增强机体细胞免疫功能，但费用昂贵，且大量应用 尚有一定不良反应。而中药作为抗病毒药物具有临床效果好、毒副作用小、药源丰富、 价格低廉等优点成为近年来医学研究的热点。 中草药抗病毒的主要途径可分为直接抗病毒途径和间接抗病毒途径。 ( 1 ) 直接途径 主要是指对病毒直接杀灭，以及阻断病毒对正常细胞的吸附、穿入、复制等环节 而达到抗病毒的目的。杨海燕等人【l j 报道，中药中的多酚类物质，可以抑制流感病毒 蛋白质和r n a 的合成，同时也可以抑制流感病毒的吸附作用。c i n a t l 等 2 1 e g 较了利巴 韦林、每氮鸟苷、吡唑呋哺菌素、麦考酚酸酯和甘草甜素等5 种抗病毒药物对于2 例 传染性非典型肺炎病毒( s a r s ) 患者的抗病毒作用。结果显示，甘草甜素对s a r s c o v 复制的抑制作用最强，甘草甜素不仅可抑制病毒的复制，而且还在病毒复制的早期抑 制病毒的吸附和穿膜。另外，甘草甜素还可抑制病毒从感染细胞向未感染细胞的扩散 【3 】。许小琴等人报道，中药抗病毒活性成分中的黄酮类，多糖及其衍生物，三萜类化 合物及其衍生物( 如甘草甜素衍生物) 等，也都是通过阻止病毒颗粒对宿主细胞的吸附 过程，而发挥抗病毒作用的【训。 ( 2 ) 间接途径 有些中草药借助其免疫调节作用，间接地达到抗病毒的效果。中药可通过作用于 下丘脑垂体肾上腺皮质轴、植物神经、核酸代谢、提高t 细胞数量和功能来调节机 体的免疫机能。中药对免疫机能的影响具有双向调节作用“高者抑之，低者举之， 如黄芪、甘草等对免疫功能低者呈促进作用，对免疫功能高者呈抑制作用。另一方面， 黄芪多糖能直接作用于心肌，降低心肌的耗氧量，稳定缺氧心肌细胞膜，保护心肌细 胞，并能加强心肌收缩力，扩张冠状动脉，提升干扰素能力，促进抗体形成，具有免 疫调控作用【5 1 。 ( 3 ) 中药抗病毒感染的实验研究 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 近年来有关抗病毒中药的研究日益增多，不但用现代中药药理研究方法筛选出了 一些具有发展前景的单味中药和中药有效成分，而且还进行了抗病毒作用机制的研 究。以下介绍几种单味和复方中药抗病毒感染的实验研究近况。 穿心莲以i 型单纯疱疹病毒( h s vi ) 感染兔肾细胞，观察穿心莲提取物抗病毒 作用【6 j 。药物对病毒感染的预防实验结果显示，穿心莲提取物无明显阻断病毒侵入细 胞的作用，浓度在2 5 0 9 l 时能完全抑制病毒的复制，浓度为1 2 5 l 时能阻止7 5 的细胞出现致细胞病变作用( c p e ) 。与病毒混合液作用1 2 h 后，使病毒感染能力显著 减弱，而未加药物的病毒对照组细胞全部出现c p e 。药物阻止病毒复制的动力学测定 结果显示，4 8 h 后与对照组比较t c i d 5 0 滴度，结果下降2 个对数值，7 2 h 下降2 6 7 个对数值，说明药物有效地抑制了病毒的增殖，穿心莲提取物在体外有明显抗i 型单 纯疱疹病毒作用。另外，穿心莲提取物对甲型流感病毒h i n l 株也有抑制作用【| 7 1 。 鱼腥草王志杰哺j 用胚肾细胞实验证明，鱼腥草水煎剂对流感病毒亚洲甲型京科 6 8 2 1 株有抑制作用，对流感病毒感染小鼠有预防和保护作用，使用鱼腥草醇提取物 滴鼻或腹腔注射，对甲型流感病毒f n i 感染的小鼠均有明显的保护作用。挥发油以 及乙酸乙酯提取物体外有抗甲型和乙型流感病毒的作用，在鸡胚内对流感病毒有4 倍的抑制作用，随着药物质量浓度的降低，对病毒的抑制作用逐渐减弱。合成鱼腥草 素的衍生物亦有较强的抗病毒作用。临床观察证明，应用鱼腥草注射液治疗病毒感染 合并轻微细菌感染的急性上呼吸道感染有显著疗效，而且对于病毒或细菌感染引起的 高热，亦有良好的退热作用p j 。 甘草甘草皂苷可以提高流感病毒感染小鼠的生存率、延长生存时间、降低肺病 毒的滴度。张建军等【l o 】采用中性红实验和观察细胞病变法，证明甘草活性成分在体外 对呼吸道合胞病毒的复制有明显的抑制作用，且初步验证甘草活性成分不是甘草酸和 甘草多糖，可能是一种新的抗病毒物质，物质的性质及抑制机制有待于进一步的研究。 柴胡柴胡对鸡胚内流感病毒有显著的抑制作用，在动物实验中，柴胡能抑制流 感病毒所引起的小鼠肺重指数增高，阻止肺组织渗出性病变，降低病毒所致的死亡率。 北柴胡茎叶总黄酮对乙型流感病毒感染的小鼠亦有明显的保护作用【l l 】。 复方连翘复方连翘由连翘( 3 0 9 ) 、金银花( 3 0 9 ) 、黄芩05 9 ) 、黄芪( 3 0 9 ) 等按一定 比例组成的。复方连翘制剂主要由清热类和补益类中药组成，结合清热药的清热解毒 作用与补益药对正气虚弱的补助、扶持等作用。高海等研究复方连翘对法氏囊炎的抑 制作用时发现，中药复方连翘制剂能明显提高外周血中自细胞的吞噬能力和t 淋巴细 胞的转化率，提示复方连翘制剂可提高机体细胞免疫功能。另外，通过常规组织学和 超微结构的观察，发现传染性法氏囊炎病毒( i b d v ) 主要感染淋巴细胞滤泡髓质未 成熟淋巴细胞和网状内皮细胞，进而感染皮质未成熟的淋巴细胞。本试验结果表明， i b d v 可使外周血t 淋巴细胞百分率、t 淋巴细胞转化率、血细胞吞噬力、c d 4 + c d 8 + t 细胞比值及免疫器官指数等都明显降低，从而影响法氏囊、脾等免疫器官的发育。中 药复方治疗组与感染病毒组相比，能够明显提高上述免疫学指标活性，对免疫器官有 明显的改善作用l i 引。 升降散本方由僵蚕、蝉蜕、姜黄、大黄组成，原为温病学家杨栗山治疗瘟疫病 2 抗新城疫病毒中药活性组分筛选的研究 之名方，现用于治疗呼吸道感染效果尤为显著。僵蚕有良好的抗血栓作用，可以缓解 s i r s 时血液中的高凝状态，改善组织器官的供血功能，起到器官保护的作用；蝉蜕 和姜黄有有一定的抑菌效用，可以降低细胞因子的释放；大黄有降低t n f 等细胞因 子水平的作用。南淑玲等对升降散抗流感病毒作用进行了研究【l 引。先用家兔制备各组 血清做病毒血凝效价的增值，测定病毒半数感染率( 5 0 豇n b r y oi n f e c t i v ed o s e ，ei d 5 0 ) 和半数致死量( m e d i a nl e t h a ld o s e ，l d 5 0 ) 。将流感病毒在鸡胚内培养传代，效价增高， 给接种病毒的鸡胚注入抗病毒药物后，其血凝效价会降低。因此，以血凝效价为指标， 观察升降散体外抗病毒效果，结果升降散能降低流感病毒血凝效价，抑制流感病毒在 鸡胚内的增值( p o 0 5 ) ；且预防给药、感染后给药及混合后给药3 种方式均显示了其 具有抗病毒作用。以流感病毒鼠肺适应株滴鼻感染正常小鼠，建立病毒性肺炎模型， 观察药物治疗后小鼠肺的重量，计算肺指数和肺指数抑制率，试验结果显示应用升降 散的鼠肺指数显著降低( p o 3 i jm o l l 时，以一种时间和浓度依赖的方式抑制a p 1 活性。黄连素对a p 1 活性的抑 制作用可以进一步解释黄连素的抗肿瘤效应。黄连素抑制肿瘤细胞的生长、增殖的作 用，有可能是以插入双链结构如d n a 的方式，从而导致d n a 形态的变化【5 9 1 。 1 5 5 抗氧化作用 以黄连、黄柏为主组成的黄连解毒汤全方及单味药均有很强的抑制大鼠脑匀浆脂 质过氧化作用，而且单味药黄连、黄柏比全方的抑制作用强。黄连、黄柏均含有黄连 素，黄连素属于异喹啉生物碱的一种，有清除羟自由基的作用，从而实现其抗脂质过 氧化作用。王利津唧】等研究了黄连解毒汤的抗氧化作用，其着重研究了体外黄连解毒 汤抗氧化能力，发现黄连解毒汤对于红细胞的自氧化和h 2 0 2 所致的氧化均具有显著 抑制活性。红细胞膜易受到氧自由基的攻击发生脂质过氧化，而使红细胞膜完整性改 变，导致溶血。黄连解毒汤降低溶血度与抑制膜脂质过氧化有关。对脂质过氧化反应 的终产物丙二醛( m d a ) 的研究发现黄连解毒汤体外可显著降低肝匀浆m d a 的生成 【6 。以上结果表明，黄连解毒汤可显著抑制脂质过氧化反应，并有一定的清除羟自由 基活性，提示其对血细胞和组织细胞具有膜保护作用。黄连解毒汤的这种膜保护作用 很可能与其抗炎解毒作用有关。 1 6 大青叶药理作用研究概况 大青叶为常用清热解毒中药， 中国药典2 0 0 5 版一部收载为十字花科植物菘蓝 1 0 抗新城疫病毒中药活性组分筛选的研究 ( i s a t i si n d i g o t i c af o r t ) 的干燥叶l m j 。现代医学研究证明，传统的清热解毒中药是一 类针对机体为主的抗感染药物。临床运用大青叶单方治疗流感、单纯疱疹病毒性角膜 炎等病毒感染性疾病取得了良好的效果。随着人们对清热解毒类中药的广泛关注，关 于大青叶的药理活性的研究日益深入，并取得了一些积极的进展。 1 6 1 抗病毒作用 采用大青叶注射液做抗病毒实验，证明其对甲型流感病毒、乙型脑炎病毒、腮腺 炎病毒、流感病毒有抑制感染和增殖的作用。大青叶对柯萨奇病毒( c v b 3 ) 引起的 小鼠病毒性心肌炎( v m c ) 早期有一定的改善作用。在c v b 3 感染后第5 、第7 天，大 青叶治疗组的小鼠心肌病变积分较对照组明显减轻( p 5 0 的百分数 5 0 的百分数 l gt c i d 5 0 = - 5 + 0 2 3 x ( 1 ) = - 5 2 3 t c i d 5 0 = 10 5 2 3 0 1m l 5 7 1 4 - 5 0 = 一= 0 2 3 5 7 14 2 6 6 7 表l 新城疫病毒t c i d 5 0 测定结果 t a m eld e t e r m i n a t i o nr e s u l t so f n e w c a s t l ed i s e a s ev i r u st c l d 5 0 病毒稀释度 三警i n o 概c u l a 引t i o nh o o l e 霈嘶c 个， d i l u t i 彻 ，r j 累计总计( 个) 唑兰型 c p e + 率 c p e + c p e 百分比( ) p e r c e n t a g e lo 。88o3 803 8 3 81 0 0 l 8803 003 0 3 01 0 0 1 旷8802 202 2 2 29 5 4 5 l旷8621 421 4 1 68 7 5 l旷844868 1 45 7 1 4 1 旷83541 i4 1 52 6 6 7 lo 8l711 8l 1 95 2 6 3 4 讨论： 新城疫病毒可以在m a r c l 4 5 细胞上生长1 7 0 1 ，但是其不是新城疫病毒的敏感细胞， 因此为保证试验过程中病毒浓度的准确，试验过程中使用鸡胚感染大量扩增病毒，鸡 胚死亡后收集尿囊液，分装后冻存，尽量消除不同批次试验中因为病毒浓度不同造成 的误差。新城疫病毒在m a r c l 4 5 细胞上传代过程中毒力减弱，在第三代没有明显病变， 因此试验时候选择收集的尿囊液直接感染细胞。 m a r c l 4 5 细胞为上皮样细胞，来源于猴肾细胞，从母细胞( m a l 0 4 细胞) 克隆 而得到【7 。m a r c l 4 5 细胞为传代细胞，制备方便、快捷、成本也远低于使用鸡胚成纤 维细胞。有利于降低试验成本和节省人力，因此本实验选用m a r c l 4 5 细胞作为试验细 胞。 本研究用m a r c l 4 5 细胞接种新城疫病毒后出现明显病变，与参考文献所述症状相 符，为后续抗病毒药物的筛选建立了模型。 1 9 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 3 5 小结 利用m a r c l 4 5 细胞成功的建立了抗病毒中药筛选的模型，n d v 感染m a r c l 4 5 细 胞t c i d 5 0 = 1 0 5 筋0 i m l ，c p e 表现为：细胞肿大变圆、皱缩、细胞内颗粒性物质增 多，并有空泡出现，细胞变暗，病变晚期细胞大量脱落，出现融合灶及拉网现象。 抗新城疫病毒中药活性组分筛选的研究 4 中药抗病毒活性组分的筛选 利用建立的细胞筛选模型，在多种中药组分中筛选有效的抗病毒组分，首先要排 除中药组分对模型细胞的损伤作用，因此需要找出各种组分对模型细胞的最大无毒剂 量。然后使用对模型细胞的最大