（动物营养与饲料科学专业论文）谷氨酰胺对鲤鱼肠上皮细胞生长和代谢的影响.pdf

摘要本试验以原代培养的鲤鱼肠上皮细胞为研究对象，在确定细胞培养的重要参数基础上，研究了谷氨酰胺对鲤鱼肠上皮细胞生长和代谢的影响。研究共包括3 个试验：试验一、原代培养鲤鱼肠上皮细胞适宜的接种数量；试验二、原代培养鲤鱼肠上皮细胞的生长规律；试验三、谷氨酰胺对鲤鱼肠上皮细胞生长和代谢的影响。试验一结果表明：原代培养鲤鱼前中肠上皮细胞的接种数量对细胞碱性磷酸酶活力有显著的影响( p o 0 5 ) ，细胞碱性磷酸酶活力细胞m t t 吸光值与细胞接种数量呈显著的二次回归关系( p 0 0 5 ) ，根据直接法确定出细胞适宜的接种数量为3 5 0个c m 2 。试验二结果表明：细胞在接种培养1 4 3 h 时，大部分贴壁生长，形成小的细胞集落，少量细胞悬浮；培养至1 6 7 h 时，贴壁细胞生长成片，细胞呈典型上皮样，细胞单层生长，互不重叠，细胞多呈圆形：1 9 1 h 时，贴壁生长的细胞数量减少，细胞集落之间的空隙增多增大；2 3 9 h 时，细胞数量又开始增多，有些小细胞集落开始生长增大；2 6 3 h时，细胞数量继续增多，有些小细胞集落已经汇合成片，形成较大的成片单层细胞。回归分析表明：贴壁生长的细胞数量与培养时问呈显著的二次回归关系，y 一3 1 0 - 5 x 2+ 0 0 0 9 6 x _ o 6 7 5 1 ( r 2 一o 6 6 5 3 ，p 0 0 5 ) 。其中y 一鲤鱼前中肠细胞m t t 吸光值，x 一接种培养时间( h ) ，确定出在添加谷氨酰胺培养6 4 h ( 即在接种培养1 6 0 h ) 时，贴壁生长的细胞数量最多。试验三结果表明：谷氨酰胺对贴壁生长细胞的数量、增殖率、碱性磷酸酶活力、肌酸激酶活力、蛋白沉积量、蛋白沉积率、谷丙转氨酶活力等有显著( p o 0 5 ) 或极显著的影响( p o 0 5 ) 。随着谷氨酰胺浓度的增加，细胞贴壁生长的数量、增殖率、碱性磷酸酶活力、蛋白沉积量、沉积率等极显著升高( p o 0 1 ) ；贴壁生长细胞的数量、增殖率、碱性磷酸酶活力、蛋白沉积量和蛋白沉积率分别与谷氨酰胺水平呈显著或极显著的正相关( r t 一+ o 9 4 6 3 ，p 0 0 1 ；r 2 一+ o 9 8 2 3 ，p 0 0 1 ；n 一+ 0 9 2 0 1 。p 0 0 1 ：1 4 一+ 0 8 9 7 8 ，p o 0 5 ：r 5 一十0 9 3 7 1 p 0 0 1 ) ；肌酸激酶活力、谷丙转氨酶活力、氨产量谷氨酰胺消耗量分别与谷氨酰胺水平呈显著或极显著的负相关( n - - 0 8 9 8 3 ，p o 0 5 ：r i 0 8 5 0 2 ，p o 0 5 ；1 7 3 - - 0 9 9 3 0 ，p o 0 1 ) 。回归分析表明：添加谷氨酰胺培养细胞6 4 h ( 即细胞接种培养1 6 0 h ) ，谷氨酰胺促进细胞生长作用的剂量效应存在一个平台值，根掘折线法分析确定出谷氨酰胺的适宜用量为1 3 3 0 ，3 3 m g l ：根据细胞结构的完整性和细胞蛋白质消耗量与谷氨酰胺水平的二次回归曲线所确定出g l l l 适宜用量分别为：1 2 5 5 8 3 m g l 和1 2 0 4 6 9 m g l 。综上试验结果表明：在本试验条件下，原代培养鲤鱼前中肠上皮细胞的适宜接种数量为3 5 0 个c m 2 接种培养的鲤鱼前中肠上皮细胞能够较好的贴壁生长，贴壁生长细胞的数量在添加谷氨酰胺培养6 4 h ( 即细胞接种培养1 6 0 h ) 时最多；外源谷氨酰胺能够促进鲤鱼前中肠上皮细胞的增殖和分化有利于鲤鱼前中肠上皮细胞完整性的保持：鲤鱼前中肠上皮细胞在添加谷氨酰胺培养6 4 h ( 即细胞接种培养1 6 0 h ) 根据细胞生长确定出谷氨酰胺的适宜用量为1 3 3 03 3 m g l ，根据细胞结构的完整性和细胞蛋白消耗量所确定的谷氨酰胺适宜用量分别为：1 2 5 5 8 3 m r , l 和1 2 0 4 6 9 m g l ；鲤鱼前中肠上皮细胞能够利用一定量的葡萄糖，以维持其生存，能够大量利用谷氨酰胺，促进细胞的增殖和分化。关键词：谷氨酰胺鱼肠上皮细胞生长代谢e f f e c t so fg l u t a m i n eo nt h eg r o w t ha n dm e t a b o l i s mo fc a r pi n t e s t i n a le p i t h e l i a lc e l l si np r i m a r yc u l t u r ej i a n gj u n ( a n i m a ln u t r i t i o na n df e e ds c i e n c e )d i r e c t e db yp r o f e s s o rx i a oq i u - z h o ua b s t r a c tt h ec a r pi n t e s t i n a le p k h e l i a lc e l l si np r i m a r yc u l t u r ew e r es e l e c t e dt oe v a l u a t et h et r o p h i ca c t i o n so fg l u t a m i n e f i r s t l y ，t h ei s o l a t i o na n dp r i m a r yc u l t u r em e t h o do fc a r pi n t e s t i n a le p i t h e l i a lc e l l sw a sd e v e l o p e d t h ec a r pi n t e s t i n a le p i t h e l i a lc e l l si np r i m a r ys h o wan o r m a lc r y p tc e l lc h a r a c t e r i s t i cb ye x a m i n a t i o no fm o r p h o l o g i cc h a r a c t e r i z a t i o n a n dt h ec a r pi n t e s t i n a le p i t h e l i a lc e l l sg r o w t hc h a r a c t e r i z t i o nw a si n v e s t i g a t e d t h ep r i m a r yc u l t u r ec a r pi n t e s t i n a le p i t h e l i a lc e l l sa t t a c h e dw k h i n4 8 - 7 2 hp r o l i f e r a t e do b v i o u s l ya t1 2 0 - 1 6 8 h t h e s er e s u l t ss h o w st h a tt h i sc u l t u r ec o n d i t i o n si ss u i t a b l ef o rt h es t u d yo fe f f e c t so fg l u t a m i n eo nt h ec a r pi n t e s t i n a lc e l l s e c o n d l y ，t h ec e l lm m ta b s o r p t i o na t5 4 0n mw a v e l e n g t h ，a l k a l i n ep h o s p h a t a s ea c t i v k i e s ，c r e a t i n ep h o s p h o k i n a s ea c t i v i t i e s ，a l a n i n ea m i n o t r a n s f e r a s ea c t i v i t i e s ，g l u t a m i n eu t i l i z a t i o n ，a m m o n i ap r o d u c t i o n ，g l u c o s eu t i l i z a t i o n ，l a c t a t ep r o d u c t i o n ，p r o t e i nu t i l i z a t i o n ，p r o t e i nr e t e n t i o nw e r ei n v e s t i g a t i o nw h e nt h ec a r pi n t e s t i n a le p i t h e l i a lc e l l sw a sg r o w i n gm e d i u mo fc o n t a i n i n g0 ，3 0 0 ，7 0 0 ，8 0 0 ，1 0 0 0 ，1 2 0 0a n d1 4 0 0m g lg l u t a m i n er e s p e c t i v e l y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tm 订a b s o r p t i o n 缸5 4 0n mw a v e l e n g t h ( m t to d s 0 ) ，a l k a l i n ep h o s p h a t a s ea c t i v i t i e s ，g l u t a m i n eu t i l i z a t i o n ，p r o t e i nu t i l i z a t i o n ，p r o t e i nr e t e n t i o n ，c r e a t i n ep h o s p h o k i n a s ea c t i v i t i e sa n da l a n i n ea m i n o t r a n s f e r a s ea c t i v i t i e sw e r ev e r ys i g n i f i c a n t l ya f f e c t e db yg l u t a m i n ec o n c e n t r a t i o nf p o 0 5 ) t h em t to d 5 o ，a l k a l i n ep h o s p h a t a s ea c t i v i t i e s ，g l u t a m i n eu t i l i z a t i o n ，p r o t e i nu t i l i z a t i o na n dp r o t e i nr e t e n t i o nw e r ei n c r e a s e dw i t ht h eg l u t a m i n el e v e li n c r e a s i n g b u tt h ec r e a t i n ep h o s p h o k i n a s ea c t i v i t i e sa n da l a n i n ea m i n o t r a n s f e r a s ea c t i v i t i e sw e r ed e c r e a s e dw k ht h eg l u t a m i n el e v e li n c r e a s i n g t h er e s u l t so fc o r r e l a t i o na n a l y s i ss h o w e dt h a tt h e r ew e r es i g n i f i c a n tc o r r e l a t i o nb e t w e e nm t to d m a l k a l i n ei i ip h o s p h a t a s ea v i t b ，p r o t e i nu t i l i z a t i o n 。p r o t e i nr e t e n t i o n ，e r e a t i n ep h o s p h o k i n a s ea c t i v i t i e s a l a n i n ea m i n o t r a n s f e r a s ea c t i v i t i e sa n dg l u t a m i n eu t i l i z a t i o n ( r l 一+ o 9 4 6 3 ，p o 0 1 ；r 2 i 十o 9 8 2 3 ，p 0 0 1 ；r 3 - + o 9 2 0 1 ，p 0 o l ；r 4 - + 0 8 9 7 8 p 0 0 5 ：r 5 - + o 9 3 7 1 ，p ( 0 0 1 ，r l - 。0 8 9 8 3 ，p 0 0 5 ；r 2 - - 0 8 5 0 2 ，p 0 0 5 ；r 3 - - o 9 9 3 0 p o 0 1 ) t h er e g r e s s i o nr e s u h ss h o w e dt h a tt h e r ew e r ev e r ys i g n i f i c a n tq u a d r a t i cr e l a t i o n s h i pb e t w e e nm t to d s 4 0g l u t a m i n el e v e l ( r 2 - 09 7 6 2 ，p o 0 1 ) i ns u m m a r y ，g i n t a m i n ec o u l de n h a n c ep r o l i f e r a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o no ft h ec a r pi n t e s t i n a lc e l l si np r i m a r yc u l t u r e ，i m p r o v ep r o t e i nr e t e n t i o na n dd e c r e a s et h ea p p e a r a n c eo fe p k h e l i a ld e a t h s og l u t a m l n eh a sas t r o n g e re f f e c to nt h ec a r pe p i t h e l i a lg r o w t hi np r i m a r yc u l t u r ea n di sav e r yi m p o r t a n ts p e c i f i cn u t f i e n tt ot h ei n t e s t i h a lm u c 0 5 ao ff i s h k e yw o r d s ：g l u t a m i n e ，f i s hi n t e s t i n a le p i t h e l i a lc e l l s ，g r o w t h ，m e t a b o l i s mg l n正ca k pm a p kl d ha l tg l u符号说明( a b b r e v i a t i o n s )g l u t a m i n ei n t e s t i n a le p i t h e l i a lc e l l sa l k a l i n ep h o s p h a t a s em i t o g e n - a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s el a c t i ca c i dd e h y d r o g e n a s ea l a n i n ea m i n o t r a n s f e r a s eg l u c o s ev谷氨酰胺肠上皮细胞碱性磷酸酶丝裂源激活蛋白激酶乳酸脱氢酶谷丙转氨酶葡萄糖论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名劾芰幽时年静fo 同关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名导师签名箬爱灿s9 沁s年分月罗。同年月引同私目1 刖青早在1 9 5 5 年，e a g l e 就发现谷氨酰胺( g l u t a m i n e ，g i n ) 是哺乳动物细胞体外培养的一种重要营养素。随后的大量研究表明：g i n 对人和鼠i e c 具有特殊的保护作用，能够维持i e c 结构的完整性小c “，减少i e c 的损伤h 【”，延缓i e c 的衰老和死亡嗍。i l o 】；是人和鼠i e c 特殊的营养物质，能促进i e c 的增殖【1 1 】+ m 】，促进i e c 的分化成熟】【1 5 】，提高i e c 的消化吸收功能n 6 】 1 8 】。其作用的机制包括：g i n 是人、鼠和猪i e c优选利用的能量来源 ”2 “，能促进人和鼠i e c 基本组成物质蛋白质 1 ，】【2 1 1 【2 2 】和核酸【2 m【2 ”的合成；有利于人和鼠i e c 的细胞保护分子，如谷胱甘肽的合成【捌【2 7 1 和热休克蛋白的表达1 1 0 【2 ；调节人和鼠i e c 的细胞周期2 9 】l 划等。随着g l n 对i e c 有益作用研究的f 1 渐深入，g i b 在临床医学i 圳和猪禽养殖生产上旧i ”1 得到了广泛的应用。鱼类的肠道与人和鼠一样，是营养物质消化和吸收的主要场所m 】 “】，i e c 是小肠的主要功能性细胞删，小肠i e c 位于肠腔的内表面，为单层柱状极化上皮，这种细胞和哺乳动物肠粘膜的i e c 非常相似，在细胞的腔面具有刷状缘m 】。近年来，我所较多的研究表明：营养物质如维生素a 【，7 】、维生索e t ”1 和大豆蛋白】等对幼建鲤肠道发育有显著的影响，从而影响幼建鲤肠道的消化吸收能力和生产性能。但组织学研究表明：鱼类肠粘膜结构与陆生动物存在较大差异i ，5 i ，大多数鱼类粘膜层缺乏粘膜肌，粘膜皱折简单，只形成皱襞：而肠道重要的营养素g l n 对鱼类肠道生长发育的影响，至今未见相关研究报道。因此，研究g l n 与鱼类i e c 增殖和分化的关系。为进一步研究g i n 对鱼类肠道的营养作用提供依据，具有重要的学术意义。2 文献综述细胞是生物体形态结构和功能活动的基本单位】_ 哪】。细胞不同于非生命界的任何结构单位，其最独特的属性就是它是一个能独立生存，进行自我调节的开放体系，它同外界进行物质、能量、信息交换的条件下，处于动念平衡之中【2 。l 。因此，所谓生命实质上即是细胞属性的体现。生物体的一切生命现象，如生长、发育、繁殖、遗传、分化、代谢和应激等都是细胞这个基本单位的活动体现【”】【2 ”。由此可见，细胞是生命现象的物质结构基础，生命是细胞所独有的运动方式。所有生物体的细胞都具有随环境营养条件改变而做出适应性反应的能力c 2 | 1 。无论是单细胞生物还是多细胞生物，营养物质提供了细胞的基本组成成分，为合成细胞的必需分子和代谢提供能量瑚1 。因此，营养物质的有效性是细胞存活、增殖和生理功能所必需的口川：。动物对营养素的利用规律其实质是动物体组成细胞对营养索利用规律的整体体现。因此，研究细胞的生命活动规律，研究细胞如何从环境中摄取营养素，经过代谢获得物质和能量。以进行生长、分裂和分化，营养对细胞衰老、死亡和生理功能的影响，以及细胞如何对各种营养素和环境因素发生反应，而产生相适应功能活动的规律，是深入研究动物营养所必需的。单细胞生物其本身就是一个细胞，而脊椎动物由大量的细胞组成，多样化的细胞形成多种组织和器官，是机体复杂功能分工的基础，使机体能更好的适应变化的外界环境。多细胞生物在这种分工中，i e c 成为了消化吸收营养素的专职细胞，摄取的营养素仅有很少一部分供自身需要，其余大部分经运送系统，供给机体其余各种细胞的营养需要，从而为机体的代谢、生长、发育、繁殖、遗传和应激等一切生命活动提供物质和能量m 1 。如人体细胞总数约为1 1 0 “个，含有1 0 0 0 种以上的不同种类【2 6 】，而只有一种细胞一i e c 摄取营养，供自身和其余9 9 9 种以上细胞的营养需要。因此i e c 的增殖、分化、衰老和死亡，l e c 生理功能变化，直接影响生物体其它细胞的营养供给和生理功能。长期以来，i e c 在营养过程中的重要地位得到广泛的认同，但由于i e c 解剖的特殊位置，其自身的营养需要长时自j 没有引起人们的重视 1 1 1 ，随着营养学研究的不断深入，人们越来越认谈到i e c 自身的营养关系到机体整体的营养，因而相关的研究报道越来越多”】口1 】口2 】c 2 7 】。2 1g l n 与i e c 增殖2 1 1g l n 促进i e c 增殖细胞生长和细胞分裂是生命过程最基本且重要的特征。细胞的生长即为细胞大小的增加，蛋白质及核酸含量的增加均可作为其指标小”。随着细胞的不断生长，其表面积体积的比例变小，细胞表面不能适应细胞内外物质交换的需要，核质比失去平衡，从而使细胞处于不稳定状态，在此种情况下，细胞可以通过其分裂来恢复正常的表面与体积比例及核质之间的平衡研3 。】f ”】。因此，细胞分裂与细胞生长两个过程紧密相关，当生长到一定阶段，均可发生分裂，之后再生长。分裂和生长反复进行，其结果是导致细胞数量的增加，即细胞增殖。研究表明：g i n 毙促进人和鼠等陆生动物i e c 的增殖啪。”2 ”p ”。g l n 能够促进人结肠癌细胞( c a c o - 2 ) 口、鼠空肠上皮细胞( i e c - 6 )删、鼠原代培养小肠皿c 【硐、猪小肠正c 【2 ”的增殖。体内试验的研究报道也发现：g l n2能够促进鼠m 一、猪3 枷等小肠m c 的增殖。g l n 提高鼠结肠粘膜的有丝分裂活性。g i n 对鲤鱼等水生动物i e c 增殖的影响还未见相关的研究报道。2 1 2g i n 促进i e c 增殖的机制细胞增殖是指细胞数量的增加，是细胞反复生长和分裂的结果。因此，影响细胞生长和分裂的因素必然影响细胞的增殖。关于g i n 对鲤鱼i e c 增殖影响的机制，目前为止还未见相关的研究报道。但在陆生动物生有大量的相关研究报道】 t 3 i 州 2 4 】d 2 】d 1 4 0 1h ”，其作用途径包括：( 1 ) 促进i e c 蛋白质和核酸合成嘲f 删f i 】，从而促进 e c 生长，为细胞分裂奠定基础：( 2 ) 作为信号分予，调节i e c 分裂相关因子和细胞周期因子的活性，从促进i e c 生长和分裂i 嘲p h 删【”1 。细胞生长即细胞大小的增加，蛋白质和核酸合成是细胞生长分子生物学基础，因此，蛋白质和核酸含量的增加均可作为衡量细胞生长指标【2 9 】”。研究表明g l n f l 够促进i e c 核酸f z h 4 0 1 和蛋白质【l l 】 1 4 0 1 的合成，从而促进c 的生长。关于g i n 对鲤鱼和其它水生动i e c 蛋白合成的影响，目前为止相关的研究报道很少。陆生动物上已有一些相关研究报道表明：c a c o - 2 培养液中g l n 缺乏，细胞总蛋白的碎片合成率极显著降低( 4 6o 6 比2 0 2 0 8 d ) ( p o 0 5 ) ，而是提高o d cm r n a 的翻译水平或者是o d c 蛋白的稳定性。体内试验研究表明：短肠大鼠全肠外营养，添加g l n 能够极显著提高肠粘膜o d c 的活性( p 0 0 1 ) ，降低并发症的发生率；同时使用生长激素( g h ) 和g i n ，肠粘膜的o d c3活性进一步提高( p o 0 1 ) ，可见二者具有协同作用【”1 。其可能的原因是：g h 能够促进i e c 对g i n 的转运吸收。因此，g l n 可提高i e co d c 活性，促进i e c 中多胺的合成，通过多胺作用可增加核仁组成区银亲和蛋白和增殖细胞核心蛋白数量，促进i e c核糖体的组装和蛋白质合成，促进细胞生长【”】 ”】。核酸合成是细胞生长合成的另一重要生物大分子。关于g l n 对鲤鱼和其它水生动i e c 核酸合成的影响，目前为止还未见相关的研究报道很。陆生动物上的研究表明：g 1 n 促进i e c 嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的从头合成1 。c a c 伊2 细胞培养液中添加3 0 0 m g lg i n ，细胞的r n a 嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的碎片合成率分别提高2 0 和2 5 【”。猪结肠m c 的培养液q a 涮j f l 4 5 0 m g l g l n 其胸腺嘧啶核昔酸的掺入率提高2 倍】。g l n 是体外培养鼠小肠砸c 增殖必需营养物质，表皮生长因子( e g f ) 诱导刺激的d n a 合成，g i n 量需要大于0 5 m m o v l 诱导作用才表现出来 7 1 。体内试验研究表明：大鼠小肠移植手术后。附加丙氨酸l _ g i n 二肽的肠外营养可增加移植小肠粘膜i e cd n a含量，促进其分裂增殖f 4 ”。鼠补充含l - g i n 丰富的营养液，在受到5 氟尿嘧啶( 5 - f l u o r o u r a c i l ) 、甲氨蝶呤( m e t h o t r e x a t e ) 、放射暴露或肠切除的处理后，鼠肠道抵抗毒素和放射的剂量提高，切除后的代偿性恢复较好，粘膜的厚度增加，d n a 和整肠蛋白质的含量提高。张军民等在2 l 目龄断奶仔猪开粮中添加1 2 的g i n ，可显著增加试验组仔猪空肠d n a 含量 5 “。深入分析表明外源核苷酸不能代替c a c 伊2 细胞增殖对g i n 的依赖性口”。总之，g l n 促进i e c 核酸合成和d n a 复制是其促进i e c 增殖的途径之一。细胞生长积累起大量的生命物质核酸和蛋白质，构成了细胞分裂的基础。细胞生长分裂的周期即为细胞周期。细胞分裂的过程称为分裂期( m 期) ，细胞生长的过程则为分裂间期。在细胞周期中，细胞生长积累起的生命物质大量的核酸和蛋白，构成了细胞分裂的基础。细胞周期中发生的一系列有序的生化反应及细胞结构功能变化。要受到来自机体内外多种因素严格而精细的调节控制。大量的研究表明：g i n 可调节i e c 的周期，从而促进i e c 的生长和分裂2 川”】叫。细胞周期的进程中，基因有规律的、特异性的表达是周期调控的基础，许多调控因子在细胞周期中的作用，都直接或间接与此相关m ”。g 1 期细胞是调节细胞周期时间的关键，c - f o s 和c - j l i 1 基因都是原癌基因，其表达产物分别为j u n 和f o s 蛋白是碱性亮氨酸拉链( b a s i cl e u c i n ez i p p e r ) 转录因子a p - i 的组成成分。a p 1 转录因子鼬u n 蛋白和f o s 蛋白嵌合而成的二聚体复合物，其启动细胞相应的增殖周期蛋白基因的表达，使细胞由g t 期进a s 期，从而促进细胞的增殖【划【”】。短肠大鼠的全肠外营养液中添i j l l g l n ，小肠粘膜i e cc - f o s 和c i u nm r n a 表达量显著升耐蜘。r h o a d s 等在体外培养细胞的研究中观察到，l - g i n 可增强小肠粘膜细胞c l o s 、c - j u nm r n a 的转录生成。因此l - g i n 可增强小肠粘膜i e cc - l o s和c - j u n 基因的表达，从而促进肠粘膜细胞的分裂增殖，有效防止小肠粘膜萎缩的发生口进一步研究发现l g l n 是通过激活促分裂原激活的蛋白激酶( m i t o g e n - a c t i v a t e dp r o t e i n k i n a s e s ，m a p k s ) 信号途径，增强原癌基l 夭l c - f o s 和c j u n 的表达，促进肠粘膜细胞的分裂增殖【”l d o 。丝裂原活化蛋白激酶( m a p 凡) 是一类细胞内广泛分布的丝氨酸苏氨酸残基的蛋白激酶，是一族连接细胞膜表面受体与决定性基因表达之间的重要信号调节酶，m a p k 的调节涉及细胞生长、发育、分裂、死亡以及细胞间的功能同步化等多种细胞生理过程f ”】 s 日。研究发现g i n 确能刺激提高m a p 的活性，包括胞外调节激酶( e x t r a c e l l u l a r r e g u l a t e dk i n a s e s ，e r k s ) 和j u n 核激酶( j u nn u c l e a rk i n a s e s 。j n k s ) ，提高p 4 2 p 4 4m a p k 的活性，提高i e c 的增殖【】。e r k s 和j n k s 磷酸化能启动转录因子基因，包括c - f o s 帝l c - j u n 的转录n 1 “。b l i k s l a g e 等5 ，】研究表明：小猪肠道局部缺血后添加g i n 使肠细胞的e p k s 活性提高4 倍。r h o a d s 等的研究发现g i n 的浓度高于血浆中的浓度能够提高肠粘膜中e r k s 和j n k s 的活性p 2 】。i e c - 6 细胞包在含8 0 0 m g lg i n 的培养液中培养3 0 r a i n ，i e c 的e r k s 和j n k s 活性分别提高4 倍和6 倍旧。在缺乏g l n 的培养液中添加表皮生长因子( e g f ) 不能提高e r k s 和j n k s 活性只有g l n 的浓度达至, j 3 6 5 2 m g l 以上时，e g f 才能提高c - j u nm r n a 的水平眦】。由此可见，g l n 对于e g f 等生长因子促进i e c 增殖的重要性。激活的e r k s 磷酸化e l k 1 ，e l k 1 转移进细胞核而与结合原癌基因c - o s 的调控区，启动其转录生成转录因子组成蛋i ；i c - f o s 5 i 】i s 2 。综上所述，g i n 可以通过调节m a p k s 的活性，从而激活增强原癌基因c f o s 和c - j u s 的表达，聚合成a p 1 转录因子，其启动细胞相应的增殖周期蛋白基因的表达，使细胞由g - 期进入s 期，从而促进细胞的增殖p ”。g i n 酶是i e c 代谢利用g i n 的关键酶，肠粘膜对g l n 的代谢主要依靠粘膜细胞内高浓度的谷氨酸胺酶，调节该酶的活性即可调节g i n 的代谢【钏。研究表明g i n 可提高g i n 酶活力，从而提高i e c 对g i n 的代谢利用而促进i e c 的增殖阳【”。小香猪体表面积3 0 的背部i i 度烧伤后，补充g l n 明显提高其空肠和回肠粘膜组织i 内g i n 酶活力增强肠道对g i n 的利用，从而提高肠粘膜细胞的增殖，维持烧伤后肠道的结构和功能嘟】。短肠大鼠给予附力h g l n 的全肠外营养，其小肠粘膜g i n 酶活性显著增高。g i n 提高g i n 酶活性的机制之一在于其促进了肠粘膜细胞g i n 酶基因的转录。刘跃武等侧用大鼠化疗和肠外5营养模型研究g i n 对肠粘膜细胞增殖的影响，g i n 可显著增加鼠空肠粘膜细胞g i n 酶m r n a 的量，表明g i n 酶基因的转录增加或者m r n a 的稳定性提高。大鼠小肠大部切除后，以g l n 二肽作为g i n 供体的肠外营养增加小肠的g i n 酶m r n a 的含量，提示g i n可能通过刺激g i n 酶基因的表达，以促进小肠粘膜细胞利用g i n 支持小肠粘膜细胞的代谢和增殖【5 9 】。因此，g i n 发挥作用的机制之一可能是通过提高g i n 酶基因的表达而提高g i n 酶活力，增强肠细胞对g l n 的利用而支持肠粘膜细胞的代谢和增殖。动物细胞生命活动所需能量的8 0 由线粒体提高供【孙口”，是细胞的“动力工厂”。因此，线粒体的生长分裂和分化直接影响细胞的能量供应。出于线粒体的生长和分化阶段分别受到线粒体基因组和核基因组的控制【”】。绝大多数线粒体内参与电子传递的蛋白和构成线粒体内核糖体的蛋白都是核编码蛋白，而在这些核编码蛋白进入线粒体的过程中，需要分子伴侣蛋白( m o l e c u l a rc h a p e r o n e ) 熟休克蛋白( h e a ts h o c kp r o t e i n ，h s p ) 的协助下，才能进入线粒体内m 】。绝大多数的线粒体前提蛋白( p r e c u r s o r ) 在核糖体内形成后都要和h s p 7 0 结合。从而防止前体蛋白形成不可解开的构象和已松弛的前体蛋白聚集( a g g r e g a t i o n ) 瑚1 ，l 】。这种作用对于要进入线粒体的蛋白质是至关重要的，因为紧密折叠的蛋白质根本不可能穿越线粒体膜】d ”。当l i i 体蛋白到达线粒体表面时，在a t p 水解酶的作用下，前体蛋白分与h s p 分离，在与线粒体膜上的受体结合，进入线粒体外膜的输入通道州m 】。在与线粒体外膜和内膜通道发生作用进入线粒体的过程中，线粒体h s p 7 0 ( m t h s p 7 0 ) 可与进入线粒体腔的前导链交链，将其牵引进线粒体内p 。】。进入线粒体的多肽链又在m t h s p 7 0 的帮助下重新折叠最后的折叠还需要h s p 6 0 、h s p l 0 的协助p o l 】。因此，h s p 对于蛋白质顺利进入线粒体，并恢复其天然生理功能构象至关重要的，从而直接影响到线粒体的功能及其生长发育。研究发现g l n 是一种极有潜力的热休克反应促进剂，能够促进i e ch s p 的表达6 儿柚】【删 6 “。w i s c h m e y e 等叫首先发现：无应激状态下，添加g h 能促进鼠i e c ( i e c - 1 8 )h s p 的表达，g 1 n 浓度大- 于3 0 0 m g l 时，2 h 后即可显著提高h s p 7 2m r n a 和蛋白的生成，g i n 浓度为5 8 0 - 1 4 6 0 m g l 时，表达量最大。因此可以大胆的推测：g i n 促进i e c 的生长作用可能与其促进h s p 的表达和翻译，从而加速线粒体的生长分裂和分化成熟，进而优化肠细胞的能荷状态有关。相关的研究表明：补充外源性a t p 能明显促进肾【州和肝”钿! c 的d n a 合成及细胞分裂增殖，促进组织细胞增殖修复。在肠道组织休克和复苏早期，由于能量代谢障碍，a t p 水平降低，细胞增殖能力也随之降低：复苏6 h 后。能量代谢恢复6 0 以上，i e c 增殖能力也恢复接近正常 s 6 s r i 。62 2 g i n 与珏c 分化2 2 1g i n 促进i e c 分化i e c 的分化成熟是指i e c 表达合成与其消化吸收有关的酶类和载体蛋白。常用碱性磷酸酶、亮氨酸氨肽酶、二糖酶等活性作为i e c 的分化标识。研究表明：g i n 能促进i e c的分化成熟i i s l 。1 1 8 】【6 “。g l n f 毙够促进人结肠癌细胞( c a c o - 2 ) 0 s i t ”】平口鼠空i e c ( i e c - 6 )i 忉的生长分化。7 0 0 m g lg i n 能够显著提高c a c o 2 细胞蔗糖酶、乳糖酶和a k p 酶活性，促进c a c o - 2 细胞的分化成熟f ”。g i n ( 6 5 0 r a g l ) 能够显著提高i e c - 6 细胞蔗糖酶、乳糖酶和a k p 酶活性，促进i e c 6 细胞的分化成熟【6 7 1 。g i n 能够显著提高原代培养鼠小i e ca k p 的活力，3 4 0 m g l 时a k p 活力显著提高( p 0 0 5 ) ，6 0 0 m g l - 2 7 0 0 m g l 时a k p活力极显著升高( p o 0 1 ) 6 s 】。a l i a g a 等( ”1 的体内荧光标记试验表明：g l n f l 显著提高鼠空肠粘膜中二糖酶和a k p 的活性，促进肠粘膜细胞的分化成熟。日粮添加1 g l n 能显著提高仔猪空肠粘膜细胞乳糖酶的活性呻】。由此可见：g l n 能够促进i e c 的发育成熟。2 2 2g l n 促进i e c 分化的机制细胞生长是细胞分化的基础。研究发现在大多数生物中，细胞分化机制是类似的，即由基因直接控制细胞特异性蛋白的合成，承担起细胞分化的“开关”和“管理者”的功能洲。i e c 的分化伴随着与i e c 消化和吸收相关的酶和载体蛋白的表达提高，是i e c 固有基因的正常，严格有序的表达的结果 1 4 1 ”m 。研究表明：g i n 主要是通过m a p k信号途径的e r k i e r k 2 通路、j n k s a p k 通路和p 3 8 通路来影响i e c 的分化成熟 1 6 1 1 7 1 6 1 1 。特异性基因的表达和蛋白抑制细胞进入细胞周期而诱导细胞的分化成熟【e 7 】【m 。细胞周期的第一个间期( g 1 ) 是控制细胞继续生长分裂，还是丌始分化的关键点 3 0 】d ”。研究表明：g i n 能够持续活化e r k l 和e r k 2 ，促进i e c 分化成熟标志蛋白的表达，并维持这些分化标识【l b 】”。这年 i g l n 促进i e c 增殖一样，都以正调节m a p k s 的活性，激活细胞内信号途径而导致细胞的增殖和分化【，2 l 【瑚。e r k 激活后发生核移位，磷酸化转录 子c - m y c 、e l k - 1 和c r e b 等，磷酸化细胞骨架蛋白和膜结合底物，包括细胞基质磷脂酶a 2 ( c p l a 2 ) 、微管相关蛋白m a p 2 和表皮生长因子受体等，还可以反馈性调节其上游激酶c - r a f - t ，m e k t 2 和下游激酶p 9 0 r s k ”】0 0 1 3 1 1 川。因此。e r k 可调节基因蛋白表达、介质释放、细胞骨架蛋白合成和细胞内其它信号通路咖d i 7 1 1 。i e c 的增殖和分化均e r k l 和e r k 2 的磷酸化作用进行调节，二者是如何协调的昵? 研究发现e r k l和e r k 2 的磷酸化水平的高低和亚细胞分布起着重要的作用m 】 7 z l 【，j l ：( 1 ) e r k 2 活性7升高显著促进i e c 的增殖，抑制e r k l 和e r k 2 的活性，i e c 游留于g l 期；( 2 ) 细胞由增殖转入分化状态，e r k l 和e r k 2 的磷酸化水平降低，特别是e r k 2 降低更多；( 3 )e r k 2 主要分布于i e c 胞核内，激活形式的e r k l 和e r k 2 仅存在于未分化i e c 的核中：( 4 ) e r k l 和e r k 2 的同型二聚体在m c 中的分布不同，e r k 2 主要分布于未分化i e c 的核中，分化i e c 的胞浆和胞核中都存在；e r k l 主要分布于分化i e c 的刷状缘膜下部。在砸c 细胞分化时，自h p d 9 8 0 5 9 ( a m k p s 的特异性乎申制剂) 干扰抑制e r k 2 活性，出现i e c 分化终末的标志酶一异麦芽糖酶( s i ) 表达，说明e r k 2 活性降低促进细胞分化【1 8 】 7 1 】。在人肠上皮组织冰冻切片研究中发现，尽管在肠绒毛顶部和隐窝细胞内都有e r k i表达，但e r k l 有活性形式仅表达在未分化m c 中，隐窝未分化i e c 是肠道最具增殖活力的细胞，表明e r k l 活性增加与调节m c 的增殖密切相关呻 ”。综上可见：g i n 可能通过调节e r k l 和e r k 2 活性升高刺激i e c 增生，当细胞增生到一定程度后，e r k l 和e r k 2 活性逐步降低，处于低水平状态，细胞增殖停止转向分化，可见终末分化标志酶异麦芽糖酶表达。i e c 分化调节的第二条途径是通过j n k 途径调节i e c 的分化过程。研究发现j n k 通路对i e c 分化有调控作用，用n a b t ( - - 甲基溴钠) 促进肠细胞株c a c o 2 和h t 2 9细胞分化，j n k 活性增加，j n k 的底物基 c - j u n 磷酸化水平增加，加快i e c 分化过程。g i n 促进i e c 的分化可能是通过增加多胺合成的途径来实现的。r a y 等口1 在研究多胺对肠部膜正常生长和损伤后就膜修复影响过程中，发现用特异性多胺合成限速酶鸟氮酸脱羧酶( o d c ) 的抑制剂d l - c t 一二氟甲基鸟氨酸( d f m o ) 耗竭细胞内多胺，可诱导j n k 活化，使j n k 活性增力n 1 5 0 ，引起细胞周期抑制因子p 2 l ( w a f t c i p l ) 、p 2 7 ( k l p l )和p 5 3 蛋白上调，细胞周期停滞【7 s 】，促进肠细胞分化。因此。g i n 可通过调节i e c 鸟氨酸脱羧酶的活性【”】【”】，从而调节i e c 的分化成熟。瑾c 的分化调节的第三条途径是通过p 3 8 途径调节m c 的分化过程。研究表明：p 3 8 m a p k 是肠道细胞分化的关键调控因素之一。应用隐窝绒毛轴组织切片技术研究发现，p 3 8 m a p k 磷酸化形式( 活化形式) 主要存在于已分化i e c 的胞核1 ； 6 1 。培养的c a c o - 2 细胞融合形成单细胞层时，p 3 8 m a p k 的活性明显增加，在c a c o - 2 细胞分化时，加p 3 s m a p k 抑制剂s b 2 0 3 5 8 0 可明显减少i e c 分化标志物s i 基因的转录和蛋白的表达，绒毛紊蛋白和a k p 酶蛋白的表达洲。p 3 8 m a p k 抑制剂s b 2 0 3 5 8 0 明显减少同源框转录因子c d x 2 与s i 酶基因顺式作用元件结合，从而减少c d x 2 转录活性v 6 ) 。因此，p 3 8 m a p k通路与i e c 分化密切相关，p 3 8 m a p k 可通过调节c d x 2 转录因子的活性，参与肠细胞b的分化调控州m 。但关于g l